CN101921736A - 大规模工业化从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法及应用于该方法中的刀片式搅拌机 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大规模工业化从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法，其将新鲜的牛血液或羊血液经过抗凝、低渗溶血、超滤、通过带有热源/冷源的搅拌机快速升降温、沉淀、3级温度处理：第一级：45-55℃；第二级：55-60℃；第三级：60-65℃、盐析、超滤及浓缩、冷冻干燥等生产步骤处理后即可同时得到比活和纯度略有不同的两组超氧化物歧化酶成品，与现有技术相比，本发明具有工艺简单、生产周期短、产品收率及比活高、质量稳定、成本低等特点，经济效益好。

Description

大规模工业化从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法及应用于该方法中的刀片式搅拌机

技术领域

本发明涉及一种提取超氧化物歧化酶方法，尤其涉及大规模工业化从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)是一种能够催化超氧阴离子自由基歧化反应的金属酶，是一种极其有效的抗氧化剂，能抵御超氧阴离子自由基对细胞的破坏。研究显示：SOD可能是人体内塌重韭的酶之一，SOD从结构上可分成两族，Cu-Zn-SOD为第一族，Mn-SOD和Fe-SOD为第二族，而Cu-Zn-SOD是人们了解最多的一种SOD，是人们对SOD结构研究的突破口。随着SOD在医药临床、食品及化妆品中应用的深度拓展，SOD的需求量越来越大，牛血SOD的制备将从实验室走向规模工业化生产，其关键在于保证质量，提高酶的回收率并降低生产成本。

依照1969年McCord和Fridovioh的第一次从牛血中提纯Cu-Zn-SOD的方法，国际、国内多沿用该方法，并视为成熟技术，传统方式，其主要工艺过程为：

第一步：乙醇+氯仿除去血红蛋白；

第二步：有机溶剂和硫酸铵分级沉淀；

第三步：离子交换层析精制。

随着近十年来用这种传统方法在不同版本的工业化生产的应用，发现有如下不足：

A、乙醇、氯仿等有机溶剂存在时Cu-Zn-SOD很容易变性，会促使 蛋自质的构象炷生变化。

B、有机溶剂会造成约8％的铜离子丧失，而如果去掉金属辅基其稳定性就要大大降低，影响SOD的酶活力。

C、该法消耗大量的有机试剂，增加生产成本，且污染环境。

D、昂贵的柱层析系统，柱填料和高速离心机.设备投入大，加之经过柱层析后，产品的收率大大降低，投入与产出比极不经济，无法实现规模化工生产。

即使在不应用有机溶剂来提取SOD的大规模工业化生产中，由于在较大容器中加热，直接热变性法工艺难点是“加热不均匀”，而且，对上清液的温度梯度处理时间过长，例如有些长达6级温度梯度处理，总计时间长达近二百个小时，这样的处理由于加热时间过长，不仅容易导致要提取的目的蛋白变性，而且由于不能“迅速”升降温，不能有效除去杂蛋白，导致目的蛋白的产率和比活下降。

发明内容

本发明的目的，就在于利用Cu-Zn-SOD是迄今发现最稳定球蛋向之一，具有的对pH、热和蛋白酶水解比一般酶稳定的特性，化解传统工艺中各种不足，强化利用Cu-Zn-SOD的特殊性能(热稳定性差异)建立细胞连续分离技术，提供一种大规模工业化工艺简单、生产周期短、成本低、产品收率及比活高的方法。

本申请提供的大规模工业化从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法包括以下步骤：

1)在牛血液或羊血液中加入占血液重量比0.3-0.6％的柠檬酸钠抗凝剂，在4℃的低温下静置30-60分钟，待溶液分层后，去掉大部分上清；

2)加入等量体积的蒸馏水，搅拌，低渗溶血30分钟，再放置40-60分钟，待溶液分层后，对上清液进行超滤，得上清液a；

对分层后的沉淀边加热(可以采用本技术领域公知的任何加热设备，例如电加热或锅炉加热)边用带热源的搅拌机搅拌，使其在5-10分钟内 迅速加温至40-50℃，保温10-30分钟后，边降温边用带冷源的搅拌机搅拌，使其在5-10分钟内迅速降至室温，4000-6000转/分钟离心15-20分钟后，在4℃的低温下静置10-30分钟后除去沉淀，得到上清液b；

3)将步骤2)获得的上清液a、b混合，对混合后的上清液进行三级温度梯度处理：第一级：45-55℃；第二级：55-60℃；第三级：60-65℃；每一级梯度边加热(可以采用本技术领域公知的任何加热设备，例如电加热或锅炉加热)边用带热源的搅拌机搅拌，使其在5-10分钟内迅速升温到相应温度后，保温10-30分钟后，边降温(可以采用本技术领域公知的任何降温设备，例如制冷机等)边用带冷源的搅拌机搅拌，以使其在5-10分钟内迅速降温，4000-6000转/分钟离心15-20分钟后，在4℃的低温下静置10-30分钟后除去沉淀，得上清液；

4)对步骤3)中最后获得的上清液进行两级盐析：首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度50-60％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4-6℃下放置15-30小时后，4000-6000转/分钟离心15-20分钟后，在4℃的低温下静置10-30分钟后除去沉淀，得上清液；

5)在步骤4)获得的上清液中继续加入硫酸铵，使盐析液饱和度为90-95％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4-6℃的低温下静置20-30小时后，4000-6000转/分钟离心15-20分钟后，得沉淀一；对离心后的上清继续在4-6℃的低温下静置20-30小时后，经漏斗抽滤后，收集沉淀，得沉淀二；

6)用浓度0.1-0.3M，pH为7.0-7.5的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后，透析脱盐去除残留的硫酸铵，经超滤浓缩和冷冻，即可分别得到比活和纯度略有不同的两组超氧化物歧化酶成品。

具体地，步骤3)中所述的三级梯度温度分别为：第一级：45℃；第二级：55℃；第三级：65℃；或者：第一级：50℃；第二级：55℃；第三级：60℃；或者：第一级：55℃；第二级：60℃；第三级：65℃。

步骤2)和步骤6)中超滤时可以采用孔径为1-10μm的聚丙烯腈膜，本技术领域的技术人员还可以采用本技术领域公知的其它合适的超滤膜 来实现步骤2)和步骤6)的超滤，其同样属于本发明的保护范围。

步骤5)中抽滤时可以采用砂芯漏斗，本技术领域的技术人员还可以采用本技术领域公知的其它合适的漏斗来实现步骤5)的抽滤，其同样属于本发明的保护范围。

本发明提供的用于上述的大规模工业化从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法中实现快速升降温的刀片式搅拌机，包括搅拌杆、搅拌刀片，搅拌杆设置有热源/冷源结构，搅拌杆的一端连接热源/冷源，另一端连接搅拌刀片。

所述热源/冷源结构可以为设置于搅拌杆上的孔。

所述热源/冷源结构还可以分别为设置在搅拌杆中的加热棒、制冷棒。

所述加热棒、制冷棒可以由石英或半导体构成。

进一步地，搅拌刀片为三片式、四片式或螺旋式。

所述刀片式搅拌机，还可以包括固持部件，将刀片式搅拌机固定到支架上。

本申请提供的技术方案的优势是：

1)溶血时加入等置体积的蒸馏水，SOD存在于红细胞中，分子质摄大.不易透过细胞膜，加入蒸馏水，细胞在低溶液中由于渗透压的作用，溶胀裂碎，但红血球发生破壁溶血，适宜的水量是保证产率的重要因素，水量不足，细胞破碎不完全，水量过多，产品流失，降低产率。故取等量体积蒸馏水搅拌溶血30分钟，超滤后，剩余的大分子量蛋白质比较容易经热变性除去。

2)多级热变温度筛是依据SOD蛋白酶与其他杂蛋白不同稳定性的差异而采用将杂蛋白从酶溶液中去除的方法。本发明提供的方法是通过结合3个方面来提取Cu-Zn-SOD目标酶的。

①：机械法

对于大规模工业化生产，直接热变性法工艺难点是“加热不均匀”。

本方法经刀片式搅拌机(三片式、四片式或螺旋式)边加温边揽拌， 其作用是：A、使在前一步骤中未完全裂解的红血球进一步经机械搅动而破碎；B、使热变加热更均匀(周边与中心温度频繁交换)这种均匀加热，节省大量的热能，因而降低工艺成本。这种多次加热，多次搅拌.建立红细胞连续分离技术。

②：选择性热变性法

本方法的作用机理是依据SOD蛋白酶与其他杂蛋白不同稳定性的差异而采用的梯度温度筛分法，根据热力学第二定律，温度的升高，将导致整个体序(水和蛋白基聚合物)有序的降低，不同种类的蛋白在不同温度区因吸热而失水，因失水而沉淀。牛血Cu-Zn-SOD的Tmax为83℃，是至今为止发现热稳定性最高的球蛋白之一。在45-65℃范围内其活性基本无变化，表明它们在该温区不仅能抵抗不可逆的变性作用，而且酶分子结构构象也没发生改变。

③：低温静置法

利用“低温”“离心”裂解后产生沉淀，蛋白基聚合物留在上清液中，当再一次加热后的相分离为弹性蛋白基聚合物所具有的逆温转变性质，迅速加温、降温是一种非常用的纯化方法。

3)热变性的温度和时间是影响产率和活性的重要因素，温度过低，不足以其他蛋白质变性，而使产品的比活下降，温度过高，又将导致SOD变性，从而降低其收率。本方法采用三级变温，最佳温度在45-65℃区，最佳提取时间在30-90分钟，控制温度和时间可以有效地减少生产周期及采收成本。

本方法免除使用氯仿和乙醇等有机溶剂，原因有二：A、当有机溶荆存在时，SOD很容易变性。因为加热时，有机溶剂促使蛋白质结构发生变化(参照图1)而不加有机溶剂有利于SOD的提取和比活毕和回收率(参照图2)；B、使用有机溶剂增加成本，增加回收设备及加工间期，不利于工业化，规模化生产。

相比较而言，本申请提供的方法，

A、用渗压法加大加快细胞的裂解。

B、在溶血上清液中用超滤技术，可以除去大量的小分子杂质，可以节省下道工序的大量热能，因而可以大大降低整个工艺成本。

C、用刀片式搅拌机，边加温边搅拌。建立连续血细胞分离技术，使热变性加热均匀，时问短，既节省能源，又提高酶活力与回收率。

关于迅速升、降温的方法：

在直接加热法中，迅速地加温及迅速的降温足一种非常有用的纯化方法。而如何做到“迅速”，是整个工序中工艺参数控制的关键点。在很多现有的提取超氧化物歧化酶的方法中，由于对上清液的温度梯度处理时间过长，例如有些长达6级温度梯度处理，总计时间长达近二百个小时，这样的处理由于加热时间过长，不仅容易导致要提取的目的蛋白变性，而且由于不能“迅速”升降温，不能有效除去杂蛋白，导致目的蛋白的产率和比活下降。本申请提供的方法中，除了采用普通的热源外，还采用带有热源/冷源的搅拌机来满足“迅速”加温及“迅速”降温的工艺要求。

A：“迅速加温”

对于大规模工业化生产，直接热变性提取超氧化物歧化酶(SOD)的工艺难点是“加热不均匀”，且加热时间过长，这样，势必要经过数次反复才能将杂蛋白去除，生产物在这个环节上因加温缓慢且不均匀停留时间过长，将会大大影响生产率及酶活力。

本方法中采用带有热源/冷源搅拌杆的搅拌机，可以有如下作用：

1、使在第一步骤中未完全裂解的红血球进一步经机械搅动而破碎。

2、搅动液体使周边与中心温度频繁交换，外围热源(热容器)与中心热源(带热源的搅拌杆)，多点同时加热，调节热源温度，使温度上升均匀，从室温升至该级的目标温度只需5-10分钟，达到加温迅速的工业化目的。

B：“迅速降温”

1、用带有冷源的搅拌杆搅动，使热溶液的热加快挥发，调节冷源温度从该级目标温度降至室温只用5-10分钟，可以达到迅速冷却目的。

2、裂解后细胞或失水后的杂蛋白在搅动作用下能很快地沉淀，使目标酶蛋白基聚合物能更快地留在上清液中，当再一次加热后的相分离为弹性蛋白基聚合物所具有的逆温转变性质。本方法采用的搅动式升温、降温法，使提取液温度均匀且快捷，十分有利于杂蛋白的去除。

关于温度梯度的级数的最佳确定：

采用温度热变提取超氧化物歧化酶是依据超氧化物歧化酶与其他杂蛋白不同稳定性的差异而采用的梯度温度筛分法，根据热力学第二定律，温度的升高，将导致整个体序(水和蛋白基聚合物)有序的降低，不同种类的蛋白在不同温度区因吸热而失水，因失水而沉淀。热变性的温度和时间是影响生产率和活性的重要因素，温度过低，不足以使其它蛋白质变性，而使产品的比活下降，温度过高，又将导致超氧化物歧化酶变性，从而降低其收率。本方法采用三级变温，建议红血球连续分离技术，第一级：45-55℃；第二级：55-60℃；第三极：60-65℃；这种工艺参数有两个明确的界定：

1、减少两级温度的极差；

2、减少热变级数(确定为三级)，这种级数的确定是将超氧化物歧化酶的热变性控制在Cu-Zn-SOD的最佳温度区内，实现这种小温差，少级数的提取方法，是通过在加热过程中增加慢速搅动(60转/分钟)的途径实现的，这种搅动式加热，提取液由静态加热变成动态加热，加快杂蛋白的变性及沉淀，有效地提高生产率及酶活力。在这个“动态”下三级热变可以做到以“短(时)制”“高”(收率)，在工业化生产中，中间生产物占用设备较少，时间又较短，对于工艺精准、设备投资、过程控制、环境保护都有重要的意义。关键是工艺的省时，节能，可以有效地减少生产周期(72h)及采收成本。

关于温度与时间的控制：

1、温度的控制：

本方法控制超氧化物歧化酶(SOD)提取温度在45-65℃之间运行。热变性提取SOD的核心技术中，温度和时间是决定产品比活性和采收率 的重要指标。当温度小于45℃(相对低温)运行时，SOD难以游离，提取时杂蛋白偏多。当温度大于65℃(相对高温)运行时，金属辅基(Cu-Zn)就会离失，而金属辅基的存在，将决定产品的品质，具有高比活性，本方法的工艺控制在45-65℃(相对中温)运行，这个温区的SOD是酶分子的结构构象没有发生改变的最佳温度区，从而保证产品酶活力的品质及生产率。

2、加工时间的控制：

本申请提供的方法，生产周期约为72h，加工时间相对较短，可以大大降低设备等固定资产的投资，节省能源，提高生产效率。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是有机溶剂热变性对SOD纯化的影响；

图2是除去有机溶剂热变性对SOD纯化的影响；

图3是本申请提供的刀片式搅拌机的示意图；

图4是本申请提供的另一刀片式搅拌机的示意图。

具体实施方式

本申请提供的方法免除使用氯仿和乙醇等有机溶剂，原因有二：A、当有机溶荆存在时，SOD很容易变性。因为加热时，有机溶剂促使蛋白质结构发生变化(参照图1)而不加有机溶剂有利于SOD的提取和比活率和回收率(参照图2)；B、使用有机溶剂增加成本，增加回收设备及加工间期，不利于工业化，规模化生产。(图1和图2为仅考虑有机溶剂对SOD的影响)

因此，本申请进行工业化生产，基本流程为：

1、去血浆采用两次沉淀，第一次为自然沉淀(放置沉淀)，第二次为渗压沉淀(搅动溶血沉淀)。

2、在溶血上清液流程中，加超滤工序.剩余的大分子量蛋白质此较容易经热变性除去。

3、建立红细胞连续分离技术，三次热变性，其特点为：

(1)不加有机溶剂，保证SOD不发生构象变化和大约8％的Cu离子丧失，从而影响活力。

(2)搅动加热，迅速到达热平衡。

(3)经济没计热变性次数(最佳温度区内三次完成)减少能源，缩短生产周期，大大地降低生产成本。

4、采用超滤浓缩技术，可大幅度减少试剂用量，有利回收和环保，不用层析法，可以节约生产设备投入及运行费用。

5、一个生产周期应在72h完成，有利于实现工业化控制。

本申请超滤时采用的是聚丙烯腈膜；其孔径可以为1-10μm，其孔径足以截留蛋白质大分子化合物，聚丙烯腈膜截留分子量为2-3万。

本申请对三级温度梯度(第一级：45-55℃；第二级：55-60℃；第三级：60-65℃)及超滤进行了测试，详见表1：

表1牛Cu-Zn-SOD纯化表(2L血)

步骤	总体积(ml)	单位活力  (μ/ml)	蛋白浓度  (mg/ml)	总活力(μ)	比活(μ/mg)	活力回收(％)
							热变一	680	1330	2.56	684120	791.5	91.25
热变二	640	1210	2.02	652786	596.3	88.18
							热变三	620	1100	0.96	573865	1242.8	83.82
超滤	136	8052	0.83	524142	4540.0	75.73
							制品	350	1210	0.091	423657	6050	65

测试结果显示，采用所述三级温度梯度及超滤，活力回收高达65％。

请参照图3，其为本发明提供的用于在上述的大规模工业化从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法中实现快速升降温的一种刀片式搅拌 机1，其包括搅拌杆2、搅拌刀片3，搅拌杆1设置有热源/冷源结构-即设置在搅拌杆上的多个孔4，通过孔4，可以与外界的热源/冷源连通，例如可以通入热气或冷气，加速液体的升/降温，孔4的大小、数量、形状、在搅拌杆1上的位置不固定，可以为任意合适的大小、数量、形状，只要能够达到迅速升/降温的目的就是合适的。搅拌机1还可以设置固持部件(未示出)，以方便地将搅拌机1固定到支架上，以方便取用。搅拌刀片3不限于为三片式，还可以是四片式、螺旋式等，只要其适合用于快速搅拌液体即可。

请参照图4，其为本发明提供的用于在上述的大规模工业化从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法中实现快速升降温的另外一种刀片式搅拌机11，其包括搅拌杆22、搅拌刀片33，搅拌杆11设置有热源/冷源结构-即设置于搅拌杆内的加热棒44、制冷棒55，加热棒44、制冷棒55可以由石英或半导体构成，当然其并不限于这些材料构成，只要是易导温、耐腐蚀的材料均可。加热棒44、制冷棒55可以与外界的热源/冷源连通，其大小、数量、形状不固定，可以为任意合适的大小、数量、形状，只要能够达到迅速升/降温的目的就是合适的。搅拌机11还可以设置固持部件(未示出)，以方便地将搅拌机11固定到支架上，以方便取用。搅拌刀片33不限于为螺旋式，只要其适合用于快速搅拌液体即可。

上述示例并非穷举，也并非对本申请的限制，本技术领域的技术人员可以想到的任何合适的带有热源/冷源的搅拌机，只要能够实现快速升降温，其仍然属于本申请的保护范围。

使用刀片式搅拌机，能够在短时间内(5-10分钟内)实现迅速升降温的工业要求，从而能够大大提升提取的SOD的比活。具体请详见下述的实施例。

下述结合具体实施例，进一步说明本申请，但不应使其对本申请的限制，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，例如在加热升温/降温时，可以采用本技术领域的技术人员公知的任何加热/降温设备。因此本发明的保护范围当视权利要求 所界定者为准。

实施例1：大规模工业化从牛血中提取超氧化物歧化酶的方法

1、在10Kg新鲜的牛血中加入30g的柠檬酸钠抗凝剂。在4℃的低温下静置30分钟，待溶液分层后，去掉大部分上清。

2、加入等量体积的蒸馏水，搅拌，低渗溶血30分钟，再放置40分钟，待溶液分层后，对上清液进行超滤(采用孔径1μm的聚丙烯腈膜)，得2000ml上清液和6500ml沉淀；

对沉淀边加热边用带热源的搅拌机搅拌，使其在8分钟内迅速加温至40℃，保温20分钟后，边降温边用带冷源的搅拌机搅拌，使其迅速在6分钟内降至室温，4000转/分钟离心20分钟后，在4℃的低温下静置20分钟后除去沉淀，得到3000ml上清液；

3、将上述上清液混合，对这5000ml上清液进行3级温度梯度处理：(1)级：在5分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至45℃，保持20分钟后，在5分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，4000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置10分钟后除去沉淀，得4200ml的上清液一；(2)级：将上清液在5分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至55℃，保持15分钟后，在5分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，4000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置15分钟后除去沉淀，得3000ml的上清液二；(3级)：将上清液在5分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至65℃，保持30分钟后，在5分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，4000转/分钟离心20分钟后，在4℃的低温下静置30分钟后除去沉淀，得2000ml的上清液三；

4、对上清液三进行两级盐析：首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度50％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4℃下放置24小时后，4000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置10分钟后除去沉淀，得上清液A；

5、在上清液A中继续加入硫酸铵，使盐析液饱和度为90％，充分搅 拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4℃的低温下静置20小时后，4000转/分钟离心15分钟后，得沉淀一；对离心后的上清继续在4℃的低温下静置24小时后，经砂芯漏斗抽滤后，收集沉淀，得沉淀二；

6、用浓度0.1M，pH为7.0的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后，透析脱盐去除残留的硫酸铵，经孔径3μm的聚丙烯腈膜超滤浓缩和冷冻，即可分别得到比活和纯度略有不同的两组超氧化物歧化酶成品，酶比活为约8500U/mg，其总重约为20-25g，。

实施例2：大规模工业化从牛血中提取超氧化物歧化酶的方法

1、在10Kg新鲜的牛血中加入50g的柠檬酸钠抗凝剂。在4℃的低温下静置50分钟，待溶液分层后，去掉大部分上清。

2、加入等量体积的蒸馏水，搅拌，低渗溶血30分钟，再放置50分钟，待溶液分层后，对上清液进行超滤(采用孔径5μm的聚丙烯腈膜)，得2500ml上清液和6000ml沉淀；

对沉淀边加热边用带热源的搅拌机搅拌，使其在8分钟内迅速加温至45℃，保温10分钟后，边降温边用带冷源的搅拌机搅拌，使其迅速在8分钟内降至室温，5000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置10分钟后除去沉淀，得到3000ml上清液；

3、将上述上清液混合，对这5500ml上清液进行3级温度梯度处理：(1)级：在8分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至50℃，保持10分钟后，在8分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，5000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置10分钟后除去沉淀，得4500ml的上清液一；(2)级：将上清液在8分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至55℃，保持15分钟后，在8分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，5000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置10分钟后除去沉淀，得3500ml的上清液二；(3级)：将上清液在8分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至60℃，保持30分钟后，在8分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，5000转/分钟离心20分钟后，在4℃的低温下静置30分钟后除去沉淀， 得2500ml的上清液三；

4、对上清液三进行两级盐析：首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度55％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为5℃下放置15小时后，5000转/分钟离心20分钟后，在4℃的低温下静置30分钟后除去沉淀，得上清液A；

5、在上清液A中继续加入硫酸铵，使盐析液饱和度为90％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为5℃的低温下静置30小时后，5000转/分钟离心20分钟后，得沉淀一；对离心后的上清继续在5℃的低温下静置20小时后，经砂芯漏斗抽滤后，收集沉淀，得沉淀二；

6、用浓度0.3M，pH为7.5的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后，透析脱盐去除残留的硫酸铵，经孔径1μm的聚丙烯腈膜超滤浓缩和冷冻，即可分别得到比活和纯度略有不同的两组超氧化物歧化酶成品，酶比活为约9000U/mg，其总重约为30-35g。

实施例3：大规模工业化从牛血中提取超氧化物歧化酶的方法

1、在10Kg新鲜的牛血中加入60g的柠檬酸钠抗凝剂。在4℃的低温下静置60分钟，待溶液分层后，去掉大部分上清。

2、加入等量体积的蒸馏水，搅拌，低渗溶血30分钟，再放置60分钟，待溶液分层后，对上清液进行超滤(采用孔径5μm的聚丙烯腈膜)，得3500ml上清液和5800ml沉淀；

对沉淀边加热边用带热源的搅拌机搅拌，使其在10分钟内迅速加温至55℃，保温30分钟后，边降温边用带冷源的搅拌机搅拌，使其迅速在10分钟内降至室温，6000转/分钟离心20分钟后，在4℃的低温下静置30分钟后除去沉淀，得到3000ml上清液；

3、将上述上清液混合，对这6500ml上清液进行3级温度梯度处理：(1)级：在10分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至55℃，保持20分钟后，在10分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，6000转/分钟离心20分钟后，在4℃的低温下静置10分钟后除去沉淀，得5500ml的上清液一；(2)级：将上清液在10分钟内由室温迅速升温(结 合应用带热源的搅拌机)至60℃，保持20分钟后，在10分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，6000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置10分钟后除去沉淀，得4500ml的上清液二；(3级)：将上清液在10分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至65℃，保持10分钟后，在10分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，6000转/分钟离心20分钟后，在4℃的低温下静置30分钟后除去沉淀，得3500ml的上清液三；

4、对上清液三进行两级盐析：首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度60％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为6℃下放置30小时后，6000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置20分钟后除去沉淀，得上清液A；

5、在上清液A中继续加入硫酸铵，使盐析液饱和度为95％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为6℃的低温下静置25小时后，6000转/分钟离心18分钟后，得沉淀一；对离心后的上清继续在6℃的低温下静置25小时后，经砂芯漏斗抽滤后，收集沉淀，得沉淀二；

6、用浓度0.1M，pH为7.5的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后，透析脱盐去除残留的硫酸铵，经孔径10μm的聚丙烯腈膜超滤浓缩和冷冻，即可分别得到比活和纯度略有不同的两组超氧化物歧化酶成品，酶比活为约9500U/mg，其总重约为35-40g。

实施例4：大规模工业化从羊血中提取超氧化物歧化酶的方法

1、在10Kg新鲜的羊血中加入30g的柠檬酸钠抗凝剂。在4℃的低温下静置30分钟，待溶液分层后，去掉大部分上清。

2、加入等量体积的蒸馏水，搅拌，低渗溶血30分钟，再放置40分钟，待溶液分层后，对上清液进行超滤(采用孔径1μm的聚丙烯腈膜)，得2200ml上清液和6000ml沉淀；

对沉淀边加热边用带热源的搅拌机搅拌，使其在5分钟内迅速加温至40℃，保温20分钟后，边降温边用带冷源的搅拌机搅拌，使其迅速在5分钟内降至室温，4000转/分钟离心20分钟后，在4℃的低温下静置20 分钟后除去沉淀，得到3000ml上清液；

3、将上述上清液混合，对这5200ml上清液进行3级温度梯度处理：(1)级：在5分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至45℃，保持20分钟后，在5分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，4000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置10分钟后除去沉淀，得4000ml的上清液一；(2)级：将上清液在5分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至55℃，保持15分钟后，在5分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，4000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置15分钟后除去沉淀，得3200ml的上清液二；(3级)：将上清液在5分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至65℃，保持30分钟后，在5分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，4000转/分钟离心20分钟后，在4℃的低温下静置30分钟后除去沉淀，得2400ml的上清液三；

4、对上清液三进行两级盐析：首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度50％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4℃下放置24小时后，4000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置10分钟后除去沉淀，得上清液A；

5、在上清液A中继续加入硫酸铵，使盐析液饱和度为90％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4℃的低温下静置20小时后，4000转/分钟离心15分钟后，得沉淀一；对离心后的上清继续在4℃的低温下静置24小时后，经砂芯漏斗抽滤后，收集沉淀，得沉淀二；

6、用浓度0.1M，pH为7.0的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后，透析脱盐去除残留的硫酸铵，经孔径3μm的聚丙烯腈膜超滤浓缩和冷冻，即可分别得到比活和纯度略有不同的两组超氧化物歧化酶成品，酶比活为约8800U/mg，其总重约为24-28g。

实施例5：大规模工业化从羊血中提取超氧化物歧化酶的方法

1、在10Kg新鲜的羊血中加入50g的柠檬酸钠抗凝剂。在4℃的低温下静置50分钟，待溶液分层后，去掉大部分上清。

2、加入等量体积的蒸馏水，搅拌，低渗溶血30分钟，再放置50分钟，待溶液分层后，对上清液进行超滤(采用孔径5μm的聚丙烯腈膜)，得3000ml上清液和6000ml沉淀；

对沉淀边加热边用带热源的搅拌机搅拌，使其在8分钟内迅速加温至45℃，保温10分钟后，边降温边用带冷源的搅拌机搅拌，使其迅速在8分钟内降至室温，5000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置10分钟后除去沉淀，得到400ml上清液；

3、将上述上清液混合，对这7000ml上清液进行3级温度梯度处理：(1)级：在8分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至50℃，保持10分钟后，在8分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，5000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置10分钟后除去沉淀，得6500ml的上清液一；(2)级：将上清液在8分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至55℃，保持15分钟后，在8分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，5000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置10分钟后除去沉淀，得5500ml的上清液二；(3级)：将上清液在8分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至60℃，保持30分钟后，在8分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，5000转/分钟离心20分钟后，在4℃的低温下静置30分钟后除去沉淀，得4500ml的上清液三；

4、对上清液三进行两级盐析：首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度55％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为5℃下放置15小时后，5000转/分钟离心20分钟后，在4℃的低温下静置30分钟后除去沉淀，得上清液A；

5、在上清液A中继续加入硫酸铵，使盐析液饱和度为90％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为5℃的低温下静置30小时后，5000转/分钟离心20分钟后，得沉淀一；对离心后的上清继续在5℃的低温下静置20小时后，经砂芯漏斗抽滤后，收集沉淀，得沉淀二；

6、用浓度0.3M，pH为7.5的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二， 完全溶解后，透析脱盐去除残留的硫酸铵，经孔径1μm的聚丙烯腈膜超滤浓缩和冷冻，即可分别得到比活和纯度略有不同的两组超氧化物歧化酶成品，酶比活为约9300U/mg，其总重约为40-45g。

实施例6：大规模工业化从羊血中提取超氧化物歧化酶的方法

1、在10Kg新鲜的羊血中加入60g的柠檬酸钠抗凝剂。在4℃的低温下静置60分钟，待溶液分层后，去掉大部分上清。

2、加入等量体积的蒸馏水，搅拌，低渗溶血30分钟，再放置60分钟，待溶液分层后，对上清液进行超滤(采用孔径5μm的聚丙烯腈膜)，得3500ml上清液和5000ml沉淀；

对沉淀边加热边用带热源的搅拌机搅拌，使其在10分钟内迅速加温至55℃，保温30分钟后，边降温边用带冷源的搅拌机搅拌，使其迅速在10分钟内降至室温，6000转/分钟离心20分钟后，在4℃的低温下静置30分钟后除去沉淀，得到3000ml上清液；

3、将上述上清液混合，对这6500ml上清液进行3级温度梯度处理：(1)级：在10分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至55℃，保持20分钟后，在10分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，6000转/分钟离心20分钟后，在4℃的低温下静置10分钟后除去沉淀，得5500ml的上清液一；(2)级：将上清液在10分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至60℃，保持20分钟后，在10分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，6000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置10分钟后除去沉淀，得4500ml的上清液二；(3级)：将上清液在10分钟内由室温迅速升温(结合应用带热源的搅拌机)至65℃，保持10分钟后，在10分钟内再迅速降至室温(结合应用带冷源的搅拌机)，6000转/分钟离心20分钟后，在4℃的低温下静置30分钟后除去沉淀，得3500ml的上清液三；

4、对上清液三进行两级盐析：首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度60％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为6℃下放置30小时后，6000转/分钟离心15分钟后，在4℃的低温下静置20分钟后除去沉淀，得上清 液A；

5、在上清液A中继续加入硫酸铵，使盐析液饱和度为95％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为6℃的低温下静置25小时后，6000转/分钟离心18分钟后，得沉淀一；对离心后的上清继续在6℃的低温下静置25小时后，经砂芯漏斗抽滤后，收集沉淀，得沉淀二；

6、用浓度0.1M，pH为7.5的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后，透析脱盐去除残留的硫酸铵，经孔径10μm的聚丙烯腈膜超滤浓缩和冷冻，即可分别得到比活和纯度略有不同的两组超氧化物歧化酶成品，酶比活为约8600U/mg，其总重约为30-35g。

Claims (10)

1.一种大规模工业化从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在牛血液或羊血液中加入占血液重量比0.3-0.6％的柠檬酸钠抗凝剂，在4℃的低温下静置30-60分钟，待溶液分层后，去掉大部分上清；

2)加入等量体积的蒸馏水，搅拌，低渗溶血30分钟，再放置40-60分钟，待溶液分层后，对上清液进行超滤，得上清液a；

对分层后的沉淀边加热边用带热源的搅拌机搅拌，使其在5-10分钟内迅速加温至40-50℃，保温10-30分钟后，边降温边用带冷源的搅拌机搅拌，使其在5-10分钟内迅速降至室温，4000-6000转/分钟离心15-20分钟后，在4℃的低温下静置10-30分钟后除去沉淀，得到上清液b；

3)将步骤2)获得的上清液a、b混合，对混合后的上清液进行三级温度梯度处理：第一级：45-55℃；第二级：55-60℃；第三级：60-65℃；每一级梯度边加热边用带热源的搅拌机搅拌，使其在5-10分钟内迅速升温到相应温度后，保温10-30分钟后，边降温边用带冷源的搅拌机搅拌，以使其在5-10分钟内迅速降温，4000-6000转/分钟离心15-20分钟后，在4℃的低温下静置10-30分钟后除去沉淀，得上清液；

4)对步骤3)中最后获得的上清液进行两级盐析：首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度50-60％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4-6℃下放置15-30小时后，4000-6000转/分钟离心15-20分钟后，在4℃的低温下静置10-30分钟后除去沉淀，得上清液；

5)在步骤4)获得的上清液中继续加入硫酸铵，使盐析液饱和度为90-95％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4-6℃的低温下静置20-30小时后，4000-6000转/分钟离心15-20分钟后，得沉淀一；对离心后的上清继续在4-6℃的低温下静置20-30小时后，经漏斗抽滤后，收集沉淀，得沉淀二；

6)用浓度0.1-0.3M，pH为7.0-7.5的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后，透析脱盐去除残留的硫酸铵，经超滤浓缩和冷冻，即可分别得到比活和纯度略有不同的两组超氧化物歧化酶成品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的三级梯度温度分别为：第一级：45℃；第二级：55℃；第三级：65℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的三级梯度温度分别为：第一级：50℃；第二级：55℃；第三级：60℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的三级梯度温度分别为：第一级：55℃；第二级：60℃；第三级：65℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)和步骤6)中超滤时采用孔径为1-10μm的聚丙烯腈膜。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中抽滤时采用砂芯漏斗。

7.一种用于权利要求1所述的大规模工业化从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法中实现快速升降温的刀片式搅拌机，包括搅拌杆、搅拌刀片，其特征在于，搅拌杆设置有热源/冷源结构，搅拌杆的一端连接热源/冷源，另一端连接搅拌刀片。

8.根据权利要求7所述的刀片式搅拌机，其特征在于，所述热源/冷源结构为设置于搅拌杆上的孔。

9.根据权利要求7所述的刀片式搅拌机，其特征在于，所述热源/冷源结构分别为设置在搅拌杆中的加热棒、制冷棒。

10.根据权利要求9所述的刀片式搅拌机，其特征在于，所述加热棒、制冷棒由石英或半导体构成。

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