CN101918841A - 肽-脂构造及其在诊断和治疗用途中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开结构L-S-F的肽-脂构造，其中F是肽，S是通过乙二醇的低聚物共价连接F至L的间隔团，L是二酰基甘油酯或者二烷基甘油酯(包括甘油磷脂)。该间隔团理想地具有6至14乙二醇重复单元，相当于分子量接近250至600的PEG。本发明还公开了通过使血清接触经过改性以合并肽-脂构造的细胞，从而在血清中检测反应性抗体的方法，其中该肽是抗体的抗原决定簇，以及测定细胞凝集度的方法。

Description

肽-脂构造及其在诊断和治疗用途中的应用
技术领域
本发明涉及在细胞和多细胞结构表面表达的肽水平中实现性质和数量改变的方法，和用于这种方法的构造。
特别地，本发明涉及用于诊断和治疗用途的肽-脂构造，所述用途包括血清诊断。
背景技术
在细胞和多细胞结构表面表达的肽水平中实现性质和数量改变的性能可供许多诊断和治疗之用。
表面表达的肽水平的性质和数量改变可以改变跨膜转运，细胞-溶质和细胞-细胞相互作用，并由此改变该改性细胞或者多细胞结构的功能。
已知的引起这种改变的方法包括基因操纵、内源性膜肽的化学修饰和使用脂锚着点如GPI的“细胞表面涂料”。
国际申请PCT/NZ2005/000052(公开号WO 2005/090368)的说明书描述了水溶性碳水化合物-脂构造的制备，其用于在细胞和多细胞结构表面表达的碳水化合物水平中实现性质和数量改变。
国际申请PCT/NZ2005/000245(公开号WO 2007/035116)的说明书描述了另一种制备水溶性碳水化合物-脂构造的方法，其中该碳水化合物是透明质酸聚合物。描述了该构造用于改变胚胎和促进子宫内膜细胞结合。
相对少的工作已经进行于肽作为单一组分的位点导向耦合至磷脂，之后它们合并入自组装结构如脂质体，或者需要提供肽-脂结构用于在细胞和多细胞结构表面表达的肽水平中实现性质和数量改变的方法中。
对于肽共价耦合至脂质体表面，许多标准技术已有描述。
Martin等(1990)回顾了将包括肽的部分附着至脂质体表面的方法。
Blume等(1993)描述了用Kung和Redemann(1986)描述的方法将水溶性的Glu-血纤蛋白溶酶原耦合至脂质体。化学物质ECDI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸酯)被用于在用Glu-血纤蛋白溶酶原培育活化脂质体悬浮液之前激活脂质体。提供了Glu-血纤蛋白溶酶原共价附着于二硬脂醇磷脂酰乙醇胺(DSPE)-PEG-COOH末端的Proteo-PEG-包衣的脂质体。
Haselgrübler等(1995)描述了一种异型双功能交联剂，用于促进免疫脂质体的制备。该交联剂由聚(乙二醇)(PEG，平均分子量800道尔顿(18mer))的二胺衍生物合成。该交联剂具有官能团2-(吡啶基硫)丙酰基(PDP)和N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)。
Ishida等(2001)描述了带有聚乙二醇耦合铁传递蛋白的脂质体的制备。铁传递蛋白通过DSPE-PEG-COOH的末端羧基残基结合。该脂质体被认为在体内化疗剂或者质粒DNA胞浆靶向至靶细胞中具有效用。
Massaguer等(2001)描述了肽序列(GGRGRS)和疏水性衍生物结合至化学活化脂质体的表面。该结合通过N-戊二酰二棕榈酰基磷脂酰胆碱(NGPE)的羧基进行。
Massaguer等(2001)记录了考虑到可能的体内用途，当无菌和简易为某些首要需求时，基于脂质体表面上化学反应，包括额外步骤的工艺可能较难扩大化至工业水平。鉴定了肽序列的疏水性衍生物，以提供用于结合至脂质体表面的优化性质。
Chung等(2004)描述了合并入细胞膜的DOPE-PEG的抗原决定簇屏蔽效应，并推测了脂质-PEG(n)(s)调节生物细胞响应的可能性，以及延伸此概念以在PEG链尾端引入官能分子。
Kato等(2004)描述了一种用于锚定高分子蛋白进入活哺乳动物细胞膜的方法。与亲水性聚(乙二醇)(PEG 80)偶合的二油醇磷脂酰乙醇胺(DOPE)被用作合成膜锚。肽通过合成膜锚的氨基反应的N-羟基琥珀酰亚胺衍生物结合在PEG部分的末端。
PEG80部分促进该合成膜锚在水中的溶解。Kato等(2004)记录了如果该锚不溶于水，不合需要和复杂化的工艺如脂质体制备和用该细胞膜融合脂质体可能是需要的，以锚定轭合物入细胞膜。
Kato等记录的另一个优点是具有高亲水-亲油平衡值(归因于高氧乙烯单元数的PEG间隔团)的合成膜锚推断为不具有细胞溶解活性。然而，在使用包括高氧乙烯单元数的PEG间隔团的合成膜锚中出现困难。
首先，共轭肽或者其它内源性细胞表面肽的表达可能被PEG间隔团屏蔽。其次，高氧乙烯单元数的PEG间隔团可能引起蛋白质(包括某些个体的抗体)的非特异性粘附和/或补体级联反应的非特异性活化。
Winger等(1996)描述了溴乙酰化DSPE与硫醇结尾的十肽的共轭结合，所述十肽在其C-末端包括极小人凝血酶-受体肽激动剂(HS---SerPheLeuLeuArgAsn)。
Hashimoto等(1986)描述了碘乙酰化DSPE与硫醇化化合物的共轭结合。
需要有一种肽-脂构造，可用于在细胞和多细胞结构表面表达的肽水平中实现性质和数量改变。
本发明一个目的在于，提供满足此需要的肽-脂构造，或者至少提供一种有用的选择。
发明内容
本发明的第一方面提供了一种检测受试者血清中的反应抗体的方法，包括步骤：
●将血清样品与细胞悬浮液接触以提供一种混合物，所述细胞经过改性而合并结构为(L-S-)iF(-S-L)j的肽-脂构造；
●在足够容许凝集的温度培育该混合物一段时间；和
●测定该混合物中细胞的凝集度；
其中：
F是包括用于反应性抗体的抗原决定簇的肽；
S是共价连接F至L的间隔团；和
L是选自二酰基-甘油酯或二烷基-甘油酯的脂质，包括甘油磷脂；和
I和j各自为0或者1，
任选地，该方法包括预备步骤：
●添加一定量的该肽至该血清的样品；
其中该肽的量足够中和非特异凝集或者证实该反应性抗体的特异性。
任选地，该方法包括中间步骤：
●在测定该混合物的细胞凝集度之前，添加抗-受试者球蛋白抗体至混合物。
优选地，受试者是人类。
优选地，该细胞是红血球。
优选地，该抗-受试者球蛋白抗体是抗-人类球蛋白(AHG)抗体。
优选地，该反应性抗体相对于抗原呈反应性，所述抗原选自：血型糖蛋白A，血型糖蛋白B，或者其突变体(包括MNS血型系统)。
选择间隔团(S)，以提供水溶性的肽-脂构造。
优选地，S是通过乙二醇的低聚物共价连接F至L的间隔团。
优选地，该肽-脂构造的结构包括亚结构：
Figure GPA00001138555700041
其中M是一价阳离子(M+)，n是6至14，且*不为H。
更优选地，该肽-脂构造的结构是：
Figure GPA00001138555700042
或者
Figure GPA00001138555700051
其中M是一价阳离子(M+)，n是6至14，w是1或者2，x和y的和大于5，z大于5，且*不为H。
优选地，i和j之和为1。
任选地，F是肽，包括经过选择以促进该肽溶解度的近端序列(PTS)。
在一个优选的此方案中，该肽的PTS选自下组：
SerLysLysLysLysGly
AlaAlaAlaAla
GlySerGlySerGly
优选地，F是包括抗原的抗原决定簇的肽，所述抗原选自：血型糖蛋白A，血型糖蛋白B，或者其突变体(包括MNS血型系统)。
更优选地，F是选自肽目录的肽。
最优选地，F是选自下组的肽：
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCys
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
GlnThrAsnAspMetHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
SerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrCys
ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCys
ProAlaHisThrAlaAsnGluValCys
SerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspCys
AlaAlaAlaAlaValMetTyrAlaSerSerGly
GlySerGlySerGlyValMetTyrAlaSerSerGly
优选地，L是甘油磷酯。更优选地，L是选自下组的甘油磷酯：1，2-O-二油酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2-O-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DSPE)。
优选地，该肽-脂构造是本发明第二或者第三方面的示范性实施方式。
本发明第二方面提供一种肽-脂构造，其结构为：
L-S-F
其中
F是肽；
S是通过乙二醇低聚物共价连接F至L的间隔团；和
L是脂，选自二酰基-甘油酯和二烷基-甘油酯组成的组，包括甘油磷脂。
优选地，该肽-脂构造的结构包括亚结构：
其中M是一价阳离子(M+)，n是6至14，且*不为H。
任选地，F是肽，包括经过选择以促进该肽溶解度的近端序列(PTS)。
在一个优选的此方案中，该肽的PTS选自下组：
SerLysLysLysLysGly
AlaAlaAlaAla
GlySerGlySerGly
优选地，该肽的末端序列选自下组：
GlyLysLysLysLysSerCys
AlaAlaAlaAlaCys
GlySerGlySerGlyCys
CysSerLysLysLysLysGly
CysAlaAlaAlaAla
CysGlySerGlySerGly
优选地，S通过该肽的Cys残基形成的硫醚键共价连接至F。
更优选地，S在该肽的未端或者接近末端处通过该肽的Cys残基形成的硫醚键共价连接至F。
最优选地，S在该肽的羧基未端通过该肽的Cys残基形成的硫醚键连接至F。
间隔团(S)具有结构S1-S2-S3，且经过选择以提供水溶性的肽-脂构造。S1是乙二醇的低聚物。
优选地，S2-S3选自下组：
Figure GPA00001138555700071
其中R1是S1的未端碳，R2是Cys残基的硫，且w是1或者2。
优选地，该肽-脂构造的结构为：
Figure GPA00001138555700072
其中M是一价阳离子(M+)，n是6至14，w是1或者2，x和y之和大于5，且*不为H。更优选地，n是6。最优选地，y是0。
优选地，F是包括抗原的抗原决定簇的肽，所述抗原选自：血型糖蛋白A，血型糖蛋白B，或者其突变体(包括MNS血型系统)。
更优选地，F是选自肽目录的肽。
最优选地，F是选自下组的肽：
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCys
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
GlnThrAsnAspMetHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
SerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrCys
ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCys
ProAlaHisThrAlaAsnGluValCys
SerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspCys
优选地，L是甘油磷酯。更优选地，L是选自下组的甘油磷酯：1，2-O-二油酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2-O-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DSPE)。
本发明第二方面的第一示范性实施方式提供了一种肽-脂构造，具有下列结构：
Figure GPA00001138555700081
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-1MUTK)(M1)。
本发明第二方面的第二示范性实施方式提供了一种肽-脂构造，具有下列结构：
Figure GPA00001138555700091
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-2MUTK)(M2)。
本发明第二方面的第三示范性实施方式提供了一种肽-脂构造，具有下列结构：
Figure GPA00001138555700092
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-3MUTK(M3)。
本发明第二方面的第四示范性实施方式提供了一种肽-脂构造，具有下列结构：
Figure GPA00001138555700093
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-13MUTK(M13)。
本发明第二方面的第五示范性实施方式提供了一种肽-脂构造，具有下列结构：
Figure GPA00001138555700101
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-18Mur(M18)(n＝6)。
本发明第二方面的第六示范性实施方式提供了一种肽-脂构造，具有下列结构：
Figure GPA00001138555700102
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-21MUTK(M21)(n＝6)。
本发明第二方面的第七示范性实施方式提供了一种肽-脂构造，具有下列结构：
Figure GPA00001138555700103
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-Hil3(M23)(n＝6)。
本发明第二方面的第八示范性实施方式提供了一种肽-脂构造，具有下列结构：
Figure GPA00001138555700111
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-Milt(K，M)。
本发明第二方面的第九示范性实施方式提供了一种肽-脂构造，具有下列结构：
Figure GPA00001138555700112
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K)(M00)。
本发明第二方面的第十示范性实施方式提供了一种肽-脂构造，具有下列结构：
Figure GPA00001138555700113
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(M)。
本发明第二方面的第十一示范性实施方式提供了一种肽-脂构造，具有下列结构：
Figure GPA00001138555700121
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K，M)。
本发明第三方面提供一种肽-脂构造，具有下列结构：
L-S-F
其中
F是肽；
S是通过乙二醇低聚物共价连接F至L的间隔团；和
L是脂，选自二酰基-甘油酯和二烷基-甘油酯组成的组，包括甘油磷脂。
优选地，该肽-脂构造的结构为：
Figure GPA00001138555700122
其中M是一价阳离子(M+)，n是6至14，z大于5，且*不为H。更优选地，n是14。
任选地，F是肽，包括经过选择以促进该肽的溶解度的末端序列。
在一个优选的此方案中，该肽的末端序列选自下组：
SerLysLysLysLysGly
AlaAlaAlaAla
GlySerGlySerGly
优选地，F是选自下组的肽：
(Xaa)zValMetTyrAlaSerSerGly；
其中z是整数4，5或者6。
优选地，F是选自下组的肽：
SerLysLysLysLysGlyValMetTyrAlaSerSerGly
AlaAlaAlaAlaValMetTyrAlaSerSerGly
GlySerGlySerGlyValMetTyrAlaSerSerGly
优选地，L是甘油磷酯。更优选地，L是选自下组的甘油磷酯：1，2-O-二油酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2-O-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DSPE)。
本发明第三方面的第一示范性实施方式提供了一种肽-脂构造，具有下列结构：
Figure GPA00001138555700131
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG14-Syph。
本发明第四方面提供一种制备本发明第二方面的肽-脂构造(F-S-L)的方法，包括步骤：
●通过将马来酰亚胺基供体试剂与结构为L-S1-NH2的前体构造反应，制备前体构造的马来酰亚胺基衍生物；和
●将该前体构造的马来酰亚胺基衍生物与包括Cys残基且溶解于溶剂中的肽(F)反应。
其中：
L是脂，选自二酰基-甘油酯和二烷基-甘油酯组成的组，包括甘油磷脂；和
S1选自乙二醇的低聚物组成的组。
优选地，该肽-脂构造的结构为：
Figure GPA00001138555700141
其中n是6至14，w是1或者2，x和y之和大于5，且*不为H。
优选地，该马来酰亚胺基供体试剂选自下组：马来酰亚胺丁酸的N-氧琥珀酰亚胺酯；和马来酰亚胺丙酸的N-氧琥珀酰亚胺酯。
优选地，S1是乙二醇的低聚物，选自6至14mer PEG(PEG6至PEG14)组成的组。最优选地，S1是PEG6。
优选地，该溶剂选自下组：三氟乙醇；DMSO；或者其混合物。
优选地，该Cys残基是末端Cys残基。
任选地，F是肽，包括经过选择以促进该肽在反应溶剂中溶解度的近端序列(PTS)。
在一个优选的此方案中，该肽的PTS选自下组：
SerLysLysLysLysGly
AlaAlaAlaAla
GlySerGlySerGly
优选地，该肽的末端序列选自下组：
GlyLysLysLysLysSerCys
AlaAlaAlaAlaCys
GlySerGlySerGlyCys
CysSerLysLysLysLysGly
CysAlaAlaAlaAla
CysGlySerGlySerGly
优选地，F是选自肽目录的肽。
优选地，F是选自下组的肽：
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCys
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
GlnThrAsnAspMetHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
SerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrCys
ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCys
ProAlaHisThrAlaAsnGluValCys
SerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspCys
优选地，L是甘油磷酯。更优选地，L是选自下组的甘油磷酯：1，2-O-二油酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2-O-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DSPE)。
本发明的第五方面提供了一种在细胞和多细胞结构表面表达的肽水平中实现性质和数量改变的方法，包括步骤：
●将该细胞或者多细胞结构与本发明第二或者第三方面的肽-脂构造的某一浓度的溶液接触，接触时间和温度足以容许该构造合并入该表面。
优选地，该肽-脂构造是本发明第二方面的构造。
优选地，该细胞或者多细胞结构选自下组：红血细胞；和胚胎。更优选地，该细胞或者多细胞结构是人类细胞或者多细胞结构。
优选地，该时间和温度不大于37℃下2小时或者4℃下24小时。
本发明的所有方面中，M典型地为H，但是可以被另一种一价阳离子例如Na+，K+或者NH4+取代。
在说明书和权利要求书中，以下缩写、短语和术语具有下列含义：
“诊断标记物”指一种分子，其在受试者体液中的存在对于受试者的显型或者病理性状况有诊断意义。
“MNS血型系统”指血型抗原或者那些抗原和突变体的抗原决定簇，其存在于任何一种血型糖蛋白A、血型糖蛋白B或者导致血型糖蛋白A/B杂化的突变体之上。
“近端序列”指邻近该肽(F)的氨基-或者羧基-未端的一部分肽序列。
“RBC”指红血细胞。
“反应性抗体”指一种免疫球蛋白，其在受试者体液中的存在对于受试者的显型或者病理性状况有诊断意义。
“通过乙二醇的低聚物”指由2至32mer组成的乙二醇的聚合物，特别排除通过由大于32mer组成的乙二醇的聚合物。
“水溶性的”指在不存在有机溶剂或者洗涤剂的情况下，该构造与水或者盐水(例如PBS)在至少100μg/ml的浓度接触时，形成稳定的单相系统，短语“水可分散的”具有相同含义。
参考随附的图页中的附图，以下将详细描述本发明的示范性实施方式。
附图说明
图1、命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K)(M13)的肽-脂构造的1H-NMR谱(5mg/ml于CD3OD/CDCl3/D2O/0.5M CF3COOD 60/20/10/1中，600MHz，30℃，δppm)。
图2、命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K)(M13)的肽-脂构造的MALDI TOF质谱(2856：肽-DOPE(M+H)；2878：肽-DOPE(M+Na)；2894：肽-DOPE(M+K)；2900：肽-DOPE(M+Na，Na盐)；2916：肽-DOPE(M+K，Na盐))。
图3、命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K)(M13)的肽-脂构造的肽SerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys的ESI质谱和HPLC分析。
图4、命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K)(M13)的肽-脂构造的肽SerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys的1H-NMR谱(4.5mg/ml于D2O中，600MHz，30℃，δppm)。
图5、通过将胚胎与M2肽-脂构造分散体在1mg/ml浓度接触2小时，以合并该构造而改性的无透明带(zona free)胚胎的显微照片。上面的显微照片是DIC图像。下面的显微照片是荧光图像，显示3.0+荧光性。
发明详述
总体而言，本发明提供具有结构(L-S-)iF(-S-L)j的肽-脂构造，其中：
F是肽；
S是共价连接F至L的间隔团；
L是脂，选自二酰基-甘油酯和二烷基-甘油酯组成的组，包括甘油磷脂；
i和j各自是0或者1；
以及这些肽-脂构造在诊断和治疗用途中的应用。
当i是0，j是1时，该肽-脂构造具有结构：
F-S-L
当i是1，j是0时，该肽-脂构造具有结构：
L-S-F
当S通过该肽的氨基未端连接至F时，该构造由结构或者亚结构L-S-F表示。
当S通过该肽的羧基未端连接至F时，该构造由结构或者亚结构F-S-L表示。
当S通过由该肽的Cys残基的巯基形成的硫醚键连接至F时，该残基以加下划线识别(Cys)。
当S通过由该肽的一个或多个Cys残基形成的硫醚键连接至F时，由结构L-S-F-S-L，L-S-F或者F-S-L表示的该肽-脂构造不意味着硫醚键唯一地由末端Cys残基形成。
参照包括以下亚结构的构造的应用，说明了该肽-脂构造在诊断用途中的应用：
其中M是一价阳离子(M+)，n是6至14，*不为H。该肽选自由肽目录所含的肽组成的肽组，其提供于下文中，其中z是从0至6的整数。
Figure GPA00001138555700181
Figure GPA00001138555700201
根据专利合作条约2007年2月7日版管理规程附录C的附件2的表3，以及根据惯例鉴定肽的氨基酸残基：
H2N-XaaXaaXaa......XaaXaaXaa-COOH
需要有便宜和低水平灵敏度的测试系统，在捐血、输血接受者、或者在胎儿患者(当未出生的胎儿可能有溶血性疾病风险时)中用于各种诊断标记物，例如梅毒标记物和MNS血型系统标记物。本发明提供的一种特别的优点是可以使用建立的血型鉴定平台来检测各种肽抗原-抗体的相互作用。因此可以避免与建立新的诊断分析法有关的投资成本。
一些临床显著的血型抗原是稀少的(或者在一些群体中是稀少的)。例如MNS血型系统突变体导致Miltenberger抗原在欧洲人中是稀少的，但是在亚洲人中是常见的。能产生抗体检测和鉴定要求这些抗原存在于诊断筛分细胞上。因此获得适于抗体筛选/鉴定的具有稀少抗原的细胞是成问题的。由此，能够将外源制备的稀少抗原加入细胞为主要优点。
根据本发明的方法，用于各种诊断标记物例如特定反应性抗体的包含肽序列的抗原决定簇，可以定位至红血细胞(RBC)表面。这些改性RBC可以用在已有的血型鉴定平台上，用于检测血液抗体或者病理。
尽管本发明是参考改性红血细胞和胚胎加以说明，其它细胞和多细胞结构的外表面可以预期。然而红血细胞优选用于诊断分析，因为其便利性，这些改性细胞可被用于血型鉴定实验室。
合并入红血细胞细胞膜的肽-脂构造的水平通过该构造在接触悬浮液的分散体中的浓度加以控制。可以通过直接的(通过细胞离心诱发)或者间接的(通过添加直接对抗受试者免疫球蛋白的抗体诱发)凝集测定诊断标记物的存在。可以采用其它测定方法，包括如玫瑰花环试验(rosetting)(Indiveri等人1979)和酶联免疫吸附分析法(ELISA)。
和官能团(F)是碳水化合物的构造的制备方法比较，官能团(F)是肽的构造的制备方法存在技术困难的组合。
首先，肽(F)需要连接至L-S或者S-L部分，以在用于连接化学反应的溶剂中可分散。克服此种困难可能需要选择近端序列(PTS)以提高溶解度，而不改变该构造所需的生物学特性。
其次，对于构造(L-S-F-S-L，L-S-F或者F-S-L)，可分散于水中或者至少一种生物相容的介质例如缓冲盐水中的是r，根据预计用途的需要(即，对于此处定义的该构造需要为“水溶性的”)。克服此种困难需要选择间隔团(S)以提高该构造的溶解度。
第三，当预计用途是该改性的细胞例如红血细胞(RBC)用于诊断用途时，包括用作血型鉴定或者存在于患者血清中诊断抗体检测的质量控制时，该构造需要是可分散的，而不参与对于诊断标记物非特异性的抗原-抗体交叉反应。满足此要求需要在后者存在时鉴定适宜的用于间隔团(S)和近端序列(PTS)的结构基元，或者开发中和或者至少基本上减轻不合需要的交叉反应和相似的假阳性的样品制备程序。
还应当注意的是，当该用途是用于细胞或者多细胞结构(例如胚胎)表面改性，为了促进该改性细胞或者改性多细胞结构与目标表面(例如子宫粘膜)的结合，将该细胞或者多细胞结构暴露至溶剂和保持该细胞或者多细胞结构处于成活状态是不相容的。
通过近端残基至任一该肽的N-或者C-未端将肽定位至细胞或者多细胞结构表面的性能还可以容许该肽序列的天然结构近似于细胞表面。因此可以模仿该肽序列的母体多肽(或者蛋白)结构的三级(或者四级)结构。
虽然在此没有证明，可以预期肽可以通过多个残基定位至细胞表面。例如，当接近氨基未端的残基和接近羧基未端的残基都用于定位该肽时，该肽的“环”结构可以在表面形成。
已知聚乙二醇(PEG)作为间隔团使用以提高溶解度。然而PEG聚合物可能干扰表面上该肽的表达和功能。在本发明的肽-脂构造中，选择乙二醇的低聚物(6到14mer)作为连接脂(L)和肽(F)的间隔团(S)的组分(S1)。
乙二醇低聚物使结构L-S-F的肽-脂构造的溶解度低于PEG聚合物。因此，当需要获得在生物相容的溶剂中可分散，并可被用于在细胞和多细胞结构表面表达的肽水平中实现性质和数量改变的肽-脂构造时，上述困难就会出现。
该肽-脂构造的性能必须为，它们可以在没有溶剂或者洗涤剂的情况下，在生物相容的介质中易于分散，但是当该构造的溶液与细胞或者多细胞结构的悬浮液接触时，合并入膜的脂双层中。
采用本文描述的结构基元组合制备具有这些潜在冲突性能的肽-脂构造。优选制备的肽-脂构造中，S通过该肽的末端Cys残基在该肽的羧基未端形成的硫醚键连接至F，因为该肽较不易于氧化。
采用本文提供的结构基元组合，可以将一系列肽制备为肽-脂构造，用于在细胞和多细胞结构表面表达的肽水平中实现性质和数量改变的方法中。
应当理解，对于非特异的相互作用，例如二酰基甘油酯或者二烷基甘油酯或者甘油磷脂和膜之间的相互作用，天然脂质的构型和立体异构体可以是功能等效的。例如，可以预期2-磷酸甘油二酯可以替代磷脂酸酯(3-磷酸甘油二酯)。此外可以预期，磷脂酸酯的绝对构型可以是R或者S。
DOPE-PEG6-NH2(7)的制备
通过方案1的方法制备DOPE-PEG6-NH2(L-S1-NH2)(7，800mg)。向搅拌的DOPE(5)(36mg，0.0484mmol)的干CHCl3(3ml)的溶液中，加入Fmoc-PEG-NOS(4)(237mg，0.0697mmol(包含约80％活性N-氧琥珀酰亚胺酯))的干CHCl3(1ml)和Et3NH(30ml)的溶液。
在20℃搅拌该溶液15小时，然后添加Et3NH(3ml)，混合物在20℃保持8小时。然后用甲苯(10ml)稀释该溶液，减压(10至15torr)蒸发并真空干燥。
粗残余物溶解于H2O/MeOH/AcOH混合物(10∶5∶1(v/v/v)，3ml)中，该溶液缓慢加至反相C16柱(15ml，水)。用MeOH/H2O1∶2(v/v)(30ml)、1∶1(v/v)(15ml)和2∶1(v/v)(15ml)将盐、N-羟基琥珀酰亚胺和H2N-PEG-DOPE(7)洗出该柱，用MeOH(30ml)以及随后用MeOH至MeOH/CHCl3混合物(4∶1(v/v)，3∶1(v/v)，2∶1(v/v)和1∶1(v/v)；各30ml)将目标H2N-PEG-DOPE(7)洗出该柱。含H2N-PEG-DOPE(7)部分合并，减压(10至15torr)蒸发，真空干燥。
在烧瓶壁上获得的薄膜残余物用己烷(2x5ml)提取两次，真空干燥得到143mg白色固体H2N-PEG-DOPE(7)(基于DOPE为78％)。TLC：Rf＝0.62(乙醇/水/吡啶/AcOH；3∶1∶1∶1(v/v/v/v))。
1H-NMR(500MHz，CD3OD，30℃)：δ＝5.541(m，4H；2-CH＝CH-)，5.416(m，1H；OCH2CHCH2O)，4.624(dd，J＝12Hz，J＝3.2Hz，1H；CO-OCHCHCH2)，4.373(dd，J＝12Hz，J＝6.6Hz，1H；CO-OCHCHCH2)，4.195(t，J＝5.6Hz，2H；POCH 2CH2N)，4.117(m，2H；POCHCHCH2)，3.968(m，4H；OCH 2CH2O，OCH 2CH2N)，3.932(t，J＝6.2Hz，2H；OCH 2CH2CO)，3.827(m，272H；(-OCH 2CH2-)n，n＝68)，3.683(m，2H；OCH 2CH2O)，3.622(t，J＝5.6Hz，2H；OCH2CH 2 N)，3.397(t，J＝5.0Hz，2H；OCH2CH2N)，2.678(t，J＝6.2Hz，2H；OCH2CH 2CO)，2.519(m，4H；2CH2CO)，2.228(m，8H；2CH2CH＝CHCH2)，1.801(m，4H；2CH2CH2CO)，1.508(m，40H；-CH2-)，1.096(～t，6H；2CH3)ppm.
肽-脂构造的制备
DOPE-PEG6-NH2的马来酰亚胺基衍生物用于通过方案2的方法，由马来酰亚胺-硫醇Michael加成反应制备肽-脂构造(L-S-F)。
通过DOPE-PEG6-NH2的马来酰亚胺基衍生物的合成相对于通过碘醋酸盐衍生物的合成具有特别的优点，因为该肽的氢硫残基氧化和随后的二聚体形成导致困难和低产。还原剂(例如叔膦)可以在结合期间使用。
从马来酰亚胺丁酸和马来酰亚胺丙酸(8a，8b)的N-氧琥珀酰亚胺酯开始，合成马来酰亚胺基衍生物，产率65至70％。由于对马来酰亚胺官能显示高反应性的Bu3P的过量存在，出现了预料之外的困难。因此只在低于当量(0.1至0.2当量)下使用磷化氢。
方案1
Figure GPA00001138555700251
在肽是GlnThrAsnAspMetHisLysArgAspThrTyr-GlySerGlySerGlyCys的10bC制备中，三氟乙醇用作共溶剂，对于两种反应物显示高效的增溶作用。然而该溶剂也导致不需要的反应介质酸化，其可能抑制Michael反应。在此实验中，10bC的独立产率是～25％。肽是GlnThrAsnAspMetHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGly-Cys(DOPE-PEG6-βAla-Mal-3MUTM(M3))的10aC的制备采用DMSO为共溶剂进行更为成功，其产率43％。
在肽是GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrSerSerGlnThrAsn-AspMetHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaCys(DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-Milt(K，M))的10bC制备中，同样的溶剂策略失败，因为提供的肽显得非常酸性，导致增溶问题。在此实验中，10bC的产率仅为23％，约一半该肽被回收。
该肽脂构造的分子量测定为：
DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(M)-3029.48
DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K，M)-4591.12
正如所预期的，对于在N-未端带有谷氨酰胺残基的肽，由于NH3损失，全部制剂包含可变数量的相关焦谷氨酰衍生物，M-17于MS中。在具有N-末端Ser残基的肽中，相关焦谷氨酰衍生物的形成减轻。
参照血清诊断，对肽-脂构造在细胞和多细胞结构表面表达的肽水平中实现性质和数量改变的方法中的用途加以说明。
用肽-脂构造改性的红血细胞(一般方法)
混合1体积份的洗涤包装红血细胞与1体积份的以浓度10至1000μg/ml分散在细胞介质(CelpresolTM)中的肽-脂构造，对红血细胞进行改性。
悬浮液为任一项：
1.在洗涤和悬浮在细胞介质中用于血清学分析以前，在37℃培养2小时，浓度0.8至3％(方法1)；或者
2.在洗涤和悬浮在细胞介质中用于血清学分析以前，在室温下(大约25℃)培养3至4小时，随后在4℃培养18小时，浓度0.8至3％(方法2)。
用DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K)(M00)改性的红血细胞
4.7mg脂肽构造DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K)(M00)在0.47mlCelpresolTM中用超声重组10分钟，并容许其静置1小时，以提供澄清的10mg/ml储备溶液。
方案2
Figure GPA00001138555700281
该储备溶液稀释2倍，以得到5mg/ml的溶液和稀释系列，然后在以下浓度制备肽-脂构造：
1mg/ml(1∶5稀释于CelpresolTM)
0.5mg/ml(1∶10稀释于CelpresolTM)
0.25mg/ml(1∶20稀释于CelpresolTM)
200μl的Miltenberger阴性红血细胞(Milt-RBC)用PBS洗涤两次，用CelpresolTM洗涤一次。40μl经洗涤的摇实体积Milt-RBC与40μl稀释的肽-脂构造混合，并在37℃培养2小时。
然后用CelpresolTM洗涤该改性RBC，并存储在celpresolTM中，直至用于试管血清学测试(3天和24天)。
改性红血细胞的试管血清学测试
通过两种制定系统中的任一种分级或者评价血清学反应(0或者‘-’＝没有凝集，1+或者3＝非常弱的凝集，2+或者5＝弱凝集，3+或者8＝中等强度凝集，4+或者10/12＝强烈的凝集)
使用的血清学平台是试管(将试剂和反应物加入塑料或者玻璃血清学试管，经适当的培育、洗涤和离心后，通过肉眼和10X放大目镜观察反应并记录)，BioVueTM(将反应物加入含小珠的盒子(包括一些反应物)，经适当的培育和离心后，观察该凝胶基质内捕捉的反应图案。BioVue是Ortho-临床诊断学的血清学柱凝集平台。
从47名阴性抗体筛选状态的供血者获得血清样品。这些样品标示为“阴性样品”，但不确定为不具有抗-Miltenberger抗体)。
已知三份血清样品具有Miltenberger相关抗体T217，T6025，T5896。这些样品标示为“阳性样品”，但不确定为具有DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K)(M00)表示的构造的肽的抗-抗体。
在PBS中制备3％改性RBC的悬浮液，并将30μl该悬浮液与30μl血清样品混合。然后在37℃培养该混合物45分钟。培育后在一ImmufugeTM(设置：“高”)中离心该RBC10秒，在用PBS洗涤三次前观察凝集。
洗涤后，加入一滴EpicloneTM抗-人类球蛋白(AHG)，然后在ImmufugeTM(设置：“高”)中离心该试管10秒，然后读出试管，记录血清学分数。
Figure GPA00001138555700301
表1、来自47名供血者，不预期有抗-Miltenberger活性的血清样品(“阴性样品”)的反应性摘要信息。AHG+表示样品在抗人类球蛋白试验起反应。AHG-表示样品不起反应。RBC用DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K)表示的肽-脂构造以显示的浓度改性。储存3天后，测试血清抗改性RBC。
表2、通过已知包含抗Miltenberger络合物抗原的抗体的3种血清的试管血清学方法结果。分数结果通过抗人类球蛋白试验显示样品反应性，1+＝弱，2+＝中，3+＝中/强，4+＝强，-表示样品不起反应。RBC用该肽-脂构造在指示的浓度改性。储存3天和24天后测试血清抗改性RBC。(n.t.表示未测试)。
Figure GPA00001138555700311
表3、通过已知包含抗Miltenberger络合物抗原的抗体的3种血清的柱直径血清学方法结果。分数结果通过抗人类球蛋白试验显示样品反应性，1+＝弱，2+＝中，3+＝中/强，4+＝强，-表示样品不起反应。RBC用该肽-脂构造在指示的浓度改性。储存3天和24天后测试血清抗改性RBC。
肽抑制
制备5mg/ml的肽GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrCys溶解于CelpresolTM中的储备溶液。将4μl(20μg肽)体积的该储备溶液加入30μl体积的各血清样品(测试)。将4μl体积的CelpresolTM加入30μl的各血清样品(对照)。然后在室温(RT)下培养血清样品(测试和对照)10分钟。
将30μl体积的该改性RBC的5％悬浮液加入各样品，在37℃培养45分钟。经培养的RBC在ImmufugeTM中用PBS洗涤3次。然后将一滴EpicloneTM抗人类球蛋白(AHG)试剂加入各样品，试管在ImmufugeTM(设置：“高”)中离心10秒。读出试管，记录血清学分数。
Figure GPA00001138555700321
表4、已知含抗Miltenberger络合物抗体并被肽抑制的3种血清的试管血清学结果。记录的分数通过抗人类球蛋白试验显示样品反应性，1+＝弱，2+＝中，3+＝中/强，4+＝强，-表示样品不起反应。RBC用该肽-脂构造在指示的浓度改性。
Figure GPA00001138555700331
Figure GPA00001138555700341
Figure GPA00001138555700351
Figure GPA00001138555700361
Figure GPA00001138555700371
大多数多克隆血清证明与一种或多种改性红血球群体呈交叉反应性(表8和9)。
当观察到假阳性时，它们基本上可以通过用该肽-脂构造(表10和11)的肽预处理样品血清而消除。
Figure GPA00001138555700381
表10、通过将细胞与500μg/ml(方法1)构造的分散体接触改性RBC以合并M1肽-脂构造或者M2肽-脂构造，用肽QTNDKHKRDTY“中和”该改性RBC的血清反应性，并重复测试抗该改性细胞。通过添加10μL的1mg/ml肽溶液至50μL体积的血清，并在37℃培育30分钟而中和血清。使用BioVue卡片进行测试。
Figure GPA00001138555700383
表11、通过将细胞与500μg/ml(方法1)构造的分散体接触改性RBCs以合并M13肽-脂构造，用肽SSQTNDKHKRDTY“中和”该改性RBCs的血清反应性，并重复测试抗该改性细胞。通过添加10μL的1mg/ml肽溶液至50μL体积的血清，并在37℃培育30分钟而中和血清。使用BioVue
Figure GPA00001138555700384
卡片进行测试。
用DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-Milt(K)(M2)表示的肽-脂构造改性的胚胎
在0.5％链霉蛋白酶(pronase)溶液中，37℃培育大约5分钟，去除制备为微滴的3.5天胚胎的透明带。将该去除透明带的胚胎转移至只含介质的微滴，与DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-Milt(K)(M2)表示的肽-脂构造的分散体在1mg/ml的浓度接触2小时。该肽-脂构造分散体包含叠氮化物作为抗微生物剂。
在处理介质中洗涤该培养胚胎4次，转移至含Gam单克隆抗体(见表8)的微滴，并在37℃培养40分钟。然后在处理介质中洗涤该胚胎4次，转移至含1∶50稀释的第二抗体(FITC抗鼠)的微滴。
在处理介质中洗涤4次之前，在室温下黑暗中培养该微滴30分钟，置于显微镜载玻片上，矿物油覆盖。该胚胎用OlympusTMBX 51荧光显微镜在200x放大倍数，用WIB过滤器550nm发射波长观察。梯度荧光性使用的级别是0至4+，其中0是没有荧光性，4+是非常鲜明的荧光性。该改性胚胎对于未改性胚胎的平均荧光性是2+比0。荧光性梯度记录在表12中。
Figure GPA00001138555700391
表12、通过接触DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-Milt(K)(M2)表示的肽-脂构造改性的胚胎的荧光性(10胚胎每组；级别为0至4+)。
对于改性以合并DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-Milt(K)(M2)表示的肽-脂构造，去除透明带的胚胎，观察到的平均荧光性为2+。对于对照胚胎没有观察到荧光性。经处理胚胎的振松(decompaction)归因于该肽-脂构造分散体中叠氮化物的存在。
尽管本发明已经通过示范性的实施方式进行描述，应当理解，在不脱离本发明范围的前提下可以作出变化和改进。此外如果有已知的等价物存在于特定的特征，此类等价物如同具体已有描述一般合并于说明书中。
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Claims (74)

1.一种检测受试者血清内的反应性抗体的方法，包括步骤：
-将血清样品与细胞悬浮液接触以提供一种混合物，所述细胞经过改性而合并结构为(L-S-)iF(-S-L)j的肽-脂构造；
-在足够容许凝集的温度培育该混合物一段时间；和
-测定该混合物中细胞的凝集度；
其中：
F是含有用于反应性抗体的抗原决定簇的肽；
S是共价连接F至L的间隔团；和
L是脂，选自二酰基-甘油酯和二烷基-甘油酯组成的组，包括甘油磷脂；和
i和j各自为0或者1。
2.根据权利要求1的方法，其中该方法包括预备步骤：
-添加一定量的肽至该血清样品；
其中该肽的量足够中和非特异凝集或者证实该反应性抗体的特异性。
3.根据权利要求1的方法，其中包括中间步骤：
-在测定该混合物中细胞的凝集度之前，添加抗-受试者球蛋白抗体至混合物。
4.根据权利要求1的方法，其中所述受试者是人类。
5.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是红血细胞。
6.根据权利要求1的方法，其中所述抗受试者球蛋白抗体是抗人类球蛋白(AHG)抗体。
7.根据权利要求1的方法，其中所述反应性抗体对下列抗原呈反应性：血型糖蛋白A，血型糖蛋白B，或者其突变体(包括MNS血型系统)。
8.根据权利要求1的方法，其中S是通过乙二醇的低聚物共价连接F至L的间隔团。
9.根据权利要求1的方法，其中该肽-脂构造的结构包括亚结构：
其中M是一价阳离子(M+)，n是6至14，且*不为H。
10.根据权利要求1的方法，其中该肽-脂构造的结构为：
Figure FPA00001138555600022
或者
Figure FPA00001138555600023
其中M是一价阳离子(M+)，n是6至14，w是1或者2，x和y的和大于5，z大于5，且*不为H。
11.根据权利要求1的方法，其中i和j之和为1。
12.根据权利要求1的方法，其中F是肽，包括经过选择以促进该肽的溶解度的近端序列(PTS)。
13.根据权利要求12的方法，其中所述肽的PTS选自下组：
SerLysLysLysLysGly
AlaAlaAlaAla
GlySerGlySerGly。
14.根据权利要求1的方法，其中F是包括抗原的抗原决定簇的肽，所述抗原选自：血型糖蛋白A，血型糖蛋白B，或者其突变体(包括MNS血型系统)。
15.根据权利要求1的方法，其中F是选自肽目录的肽。
16.根据权利要求1的方法，其中F是选自下组的肽：
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCys
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
GlnThrAsnAspMetHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
SerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrCys
ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCys
ProAlaHisThrAlaAsnGluValCys
SerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspCys
AlaAlaAlaAlaValMetTyrAlaSerSerGly
GlySerGlySerGlyValMetTyrAlaSerSerGly。
17.根据权利要求1的方法，其中L是甘油磷酯。
18.根据权利要求1的方法，其中L是甘油磷酯，选自：1，2-O-二油酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2-O-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DSPE)。
19.一种肽-脂构造，具有结构：
L-S-F
其中
F是肽；
S是通过乙二醇低聚物共价连接F至L的间隔团；和
L是脂，选自二酰基-甘油酯和二烷基-甘油酯组成的组，包括甘油磷脂。
20.根据权利要求19的肽-脂构造，其中该肽-脂构造的结构包括亚结构：
Figure FPA00001138555600031
其中M是一价阳离子(M+)，n是6至14，且*不为H。
21.根据权利要求19的肽-脂构造，其中F是肽，其包括经过选择以促进该肽溶解度的近端序列(PTS)。
22.根据权利要求21的肽-脂构造，其中该肽的PTS选自下组：
SerLysLysLysLysGly
AlaAlaAlaAla
GlySerGlySerGly。
23.根据权利要求19的肽-脂构造，其中该肽的末端序列选自下组：
GlyLysLysLysLysSerCys
AlaAlaAlaAlaCys
GlySerGlySerGlyCys
CysSerLysLysLysLysGly
CysAlaAlaAlaAla
CysGlySerGlySerGly。
24.根据权利要求19的肽-脂构造，其中S通过该肽的Cys残基形成的硫醚键共价连接至F。
25.根据权利要求19的肽-脂构造，其中S通过该肽的Cys残基形成的硫醚键在该肽末端或者接近末端处共价连接至F。
26.根据权利要求19的肽-脂构造，其中S通过该肽的Cys残基形成的硫醚键在该肽的羧基未端处连接至F。
27.根据权利要求19的肽-脂构造，其中S的结构为S1-S2-S3，S1是乙二醇低聚物，S2-S3选自下列组：。
其中R1是S1的未端碳，R2是Cys残基的硫，w是1或者2。
28.根据权利要求19的肽-脂构造，其中该肽-脂构造的结构为：
Figure FPA00001138555600051
其中M是一价阳离子(M+)，n是6至14，w是1或者2，x和y的和大于5，且*不为H。
29.根据权利要求28的肽-脂构造，其中n是6。
30.根据权利要求28的肽-脂构造，其中y是0。
31.根据权利要求19的肽-脂构造，其中F是包括抗原的抗原决定簇的肽，所述抗原选自：血型糖蛋白A，血型糖蛋白B，或者其突变体(包括MNS血型系统)。
32.根据权利要求19的肽-脂构造，其中F是选自肽目录的肽。
33.根据权利要求19的肽-脂构造，其中F选自下列肽：
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCys
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
GlnThrAsnAspMetHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
SerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrCys
ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCys
ProAlaHisThrAlaAsnGluValCys
SerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspCys。
34.根据权利要求19的肽-脂构造，其中L是甘油磷酯。
35.根据权利要求19的肽-脂构造，其中L是甘油磷酯，选自：1，2-O-二油酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2-O-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DSPE)。
36.一种肽-脂构造，具有结构：
Figure FPA00001138555600061
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-1MUTK)(M1)。
37.一种肽-脂构造，具有结构：
Figure FPA00001138555600062
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-2MUTK)(M2)。
38.一种肽-脂构造，具有结构：
Figure FPA00001138555600063
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-3MUTM(M3)。
39.一种肽-脂构造，具有结构：
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-13MUTK(M13)。
40.一种肽-脂构造，具有结构：
Figure FPA00001138555600071
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-18Mur)(M18)(n＝6)。
41.一种肽-脂构造，具有结构：
Figure FPA00001138555600072
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-21MUTK(M21)(n＝6)。
42.一种肽-脂构造，具有结构：
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-Hil3(M23)(n＝6)。
43.一种肽-脂构造，具有结构：
Figure FPA00001138555600074
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-PTS-Milt(K，M)。
44.一种肽-脂构造，具有结构：
Figure FPA00001138555600081
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K)(M00)。
45.一种肽-脂构造，具有结构：
Figure FPA00001138555600082
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(M)。
46.一种肽-脂构造，具有结构：
Figure FPA00001138555600083
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K，M)。
47.根据权利要求19的肽-脂构造，其中该肽-脂构造的结构是：
Figure FPA00001138555600084
其中M是一价阳离子(M+)，n是6至14，z大于5，且*不为H。
48.根据权利要求45的肽-脂构造，其中n是14。
49.根据权利要求45的肽-脂构造，其中F是肽，其含有末端序列，该末端序列经过选择以促进该肽的溶解度。
50.根据权利要求47的肽-脂构造，其中该肽的末端序列选自下组：
SerLysLysLysLysGly
AlaAlaAlaAla
GlySerGlySerGly。
51.根据权利要求45的肽-脂构造，其中F是选自下组的肽：
(Xaa)z-7ValMetTyrAlaSerSerGly；
其中z是整数4，5或者6。
52.根据权利要求45的肽-脂构造，其中F是选自下组的肽：
SerLysLysLysLysGlyValMetTyrAlaSerSerGly
AlaAlaAlaAlaValMetTyrAlaSerSerGly
GlySerGlySerGlyValMetTyrAlaSerSerGly。
53.根据权利要求45的肽-脂构造，其中L是甘油磷酯。
54.根据权利要求45的肽-脂构造，其中L是甘油磷酯，选自：1，2-O-二油酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2-O-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DSPE)。
55.一种肽-脂构造，具有结构：
其中M是一价阳离子(M+)，该构造命名为DOPE-PEG14-Syph。
56.制备权利要求19至47的肽-脂构造(F-S-L)的方法，包括步骤：
-通过将马来酰亚胺基供体试剂与结构为L-S1-NH2的前体构造反应，制备前体构造的马来酰亚胺基衍生物；和
-将该前体构造的马来酰亚胺基衍生物与含有Cys残基且溶解于溶剂中的肽(F)反应。
其中：
L是脂，选自二酰基-甘油酯和二烷基-甘油酯组成的组，包括甘油磷脂；和
S1选自乙二醇的低聚物组成的组。
57.根据权利要求54的方法，其中该肽-脂构造的结构为：
其中n是6至14，w是1或者2，x和y之和大于5，且*不为H。
58.根据权利要求54的方法，其中所述马来酰亚胺基供体试剂选自下组：马来酰亚胺丁酸的N-氧琥珀酰亚胺酯；和马来酰亚胺丙酸的N-氧琥珀酰亚胺酯。
59.根据权利要求54的方法，其中S1是乙二醇的低聚物，选自6至14mer PEG(PEG6至PEG14)组成的组。
60.根据权利要求54的方法，其中S1是PEG6。
61.根据权利要求54的方法，其中所述溶剂选自下组：三氟乙醇，DMSO，或者其混合物。
62.根据权利要求54的方法，其中所述Cys残基是末端Cys残基。
63.根据权利要求54的方法，其中F是肽，其包括经过选择以促进该肽在反应溶剂中溶解度的近端序列(PTS)。
64.根据权利要求61的方法，其中所述肽的PTS选自下组：
SerLysLysLysLysGly
AlaAlaAlaAla
GlySerGlySerGly。
65.根据权利要求54的方法，其中所述肽的末端序列选自下组：
GlyLysLysLysLysSerCys
AlaAlaAlaAlaCys
GlySerGlySerGlyCys
CysSerLysLysLysLysGly
CysAlaAlaAlaAla
CysGlySerGlySerGly。
CysGlySerGlySerGly。
66.根据权利要求54的方法，其中F是选自肽目录的肽。
67.根据权利要求54的方法，其中F是选自下组的肽：
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCys
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
GlnThrAsnAspMetHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
SerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrCys
ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCys
ProAlaHisThrAlaAsnGluValCys
SerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspCys。
68.根据权利要求54的方法，其中L是甘油磷酯。
69.根据权利要求54的方法，其中L是甘油磷酯，选自：1，2-O-二油酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2-O-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DSPE)。
70.一种在细胞和多细胞结构表面表达的肽水平中实现性质和数量改变的方法，包括步骤：
-将该细胞或者多细胞结构与权利要求19至55任一项所述肽-脂构造的溶液在足以容许该构造合并入该表面的浓度、时间和温度下接触。
71.根据权利要求54的方法，其中所述肽-脂构造为权利要求19至47任一项的构造。
72.根据权利要求54的方法，其中所述细胞或者多细胞结构选自下组：红血细胞；和胚胎。
73.根据权利要求54的方法，其中所述细胞或者多细胞结构是人类细胞或者多细胞结构。
74.根据权利要求54的方法，其中所述时间和温度不大于37℃下2小时或者4℃下24小时。
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