CN101918584A - 脂蛋白表面活性剂 - Google Patents
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Abstract
一种用于测定样品中甘油三酯和/或胆固醇量的传感器，所述传感器包括：(a)式(1)的表面活性剂其中每个Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为-OH、C1-C4烷氧基或式-OCONH(CH2)m′-CH3、-OCO(CH2)m′-CH3、O(CH2)m-CH3、-S(CH2)m″-CH3、-O(CH2)n-A、-S(CH2)n-A、-OCO(CH2)m-CH3或-NHCO(CH2)m-CH3的基团，其中m为4至20，m′为4至20，m″为4至6或8至20，n为0至10，且A为C3-C8环烷基或苯基，条件是Ra、Rb、Rc、Rd和Re基团中的至少一个不为-OH或C1-C4烷氧基；和(b)用于测定甘油三酯的酶试剂和/或用于测定胆固醇的酶试剂。
Description
技术领域
本发明涉及用于测定样品中甘油三酯或胆固醇量的传感器和用于进行此测定的方法。
背景技术
甘油三酯和胆固醇是血液中脂蛋白的主要组分。甘油三酯大量存在于极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)中，而胆固醇大量存在于高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)中。在血液的全部脂蛋白成分中都存在一定程度的胆固醇和甘油三酯。
因此，为了对血液或血浆样品进行有效测试，首先必须将脂蛋白分解以释放甘油三酯和胆固醇(包括游离胆固醇和胆固醇酯)。这通常使用表面活性剂来实现。然而，许多表面活性剂以不同的速率作用于不同的脂蛋白成分。因此，为了确保甘油三酯或胆固醇测试可检测样品中存在的全部分析物，必需使表面活性剂与样品反应足够的时间，以释放出全部可用的甘油三酯或胆固醇。
随着使胆固醇和甘油三酯测试可在家中进行或由临床执业医生进行的试剂盒的出现，对这些测试中快速得出结果的要求显著地增加。理想地，试剂盒可在几秒钟或几分钟内给出正确的结果。为了实现此目的，需要能够迅速将血液中全部脂蛋白成分分解的速效表面活性剂。
发明内容
本发明的发明人已经发现了对进行胆固醇和甘油三酯测试特别有用的一组表面活性剂。这些表面活性剂具有对全部脂蛋白颗粒中的胆固醇、胆固醇酯和甘油三酯的响应特别快速的动力学。因此结合这些表面活性剂的胆固醇或甘油三酯传感器在短时间内提供了样品中总胆固醇或甘油三酯含量的可靠测定结果。
因此，本发明提供了用于测定样品中甘油三酯和/或胆固醇量的传感器，所述传感器包括：
(a)式(1)的表面活性剂
其中
每个Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为-OH、C1-C4烷氧基或式-OCONH(CH2)m′-CH3、-OCO(CH2)m′-CH3、O(CH2)m-CH3、-S(CH2)m″-CH3、-O(CH2)n-A、-S(CH2)n-A、-OCO(CH2)m-CH3或-NHCO(CH2)m-CH3的基团，其中m为4至20，m′为4至20，m″为4至6或8至20，n为0至10，且A为C3-C8环烷基或苯基，
条件是基团Ra、Rb、Rc、Rd和Re中的至少一个不为-OH或C1-C4烷氧基；和
(b)用于测定甘油三酯的酶试剂和/或用于测定胆固醇的酶试剂。
本发明还提供了用于测定样品中胆固醇和/或甘油三酯量的方法，所述方法包括：
-使样品接触上述表面活性剂；和
-测定存在的胆固醇和/或甘油三酯的量。
本发明的传感器是用于测定样品中甘油三酯和/或胆固醇的量。为了避免歧义，其是指传感器是用于测定样品中甘油三酯的总量和/或胆固醇的总量。总胆固醇包括在样品中以HDL和LDL成分存在的胆固醇(当然还包括游离胆固醇和在样品中以任何其它形式存在的胆固醇，例如胆固醇酯)。
附图说明
图1(a)至图1(f)是描绘使用本发明的各种传感器对于多个血浆样品中传感器输出(测定电流，Iox(nA))与总胆固醇浓度([TC](mM))关系的图。
具体实施方式
本发明的传感器可以用于测定包含脂蛋白的任何样品中胆固醇或甘油三酯水平。通常，可以对人或动物的任何体液，通常如全血、血清或血浆样品进行分析。用于本发明的优选的样品为血清和血浆。当对全血进行测定时，方法可以包括过滤血液以去除红细胞的附加步骤。
表面活性剂为糖类，所述糖类可以为D-糖类或L-糖类，其中优选D-糖类。可以使用α和β异构体。在一个实施方式中，优选β异构体。
表面活性剂具有通式(1)：
在式(1)中，每个Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为-OH、C1-C4烷氧基或式-OCONH(CH2)m′-CH3、-OCO(CH2)m′-CH3、O(CH2)m-CH3、-S(CH2)m″-CH3、-O(CH2)n-A、-S(CH2)n-A、-OCO(CH2)m-CH3或-NHCO(CH2)m-CH3的基团，其中m为4至20，m′为4至20，m″为4至6或8至20，n为0至10，且A为C3-C8环烷基或苯基。基团Ra、Rb、Rc、Rd和Re中的至少一个不为-OH或C1-C4烷氧基。
优选地，基团Ra、Rb、Rc、Rd和Re中的一个或两个(最优选一个)为式-OCONH(CH2)m′-CH3、-OCO(CH2)m ′-CH3、-SCONH(CH2)m′-CH3、-SCO(CH2)m′-CH3、O(CH2)m-CH3、-S(CH2)m″-CH3、-O(CH2)n-A、-S(CH2)n-A、-OCO(CH2)m-CH3或-NHCO(CH2)m-CH3的基团，剩余的基团为-OH或C1-C4烷氧基，优选-OH。
优选通式(1)的表面活性剂具有通式(I)：
其中：
i)R1为式-CONH(CH2)m′-CH3或-CO(CH2)m′-CH3的基团，其中m′为4至20；且X为-OH或C1-C4烷氧基；或
ii)R1为氢或C1-C4烷基；且X为式-O(CH2)m-CH3、-S(CH2)m″-CH3、-O(CH2)n-A、-S(CH2)n-A、-OCO(CH2)m-CH3或-NHCO(CH2)m-CH3的基团，其中m为4至20，m″为4至6或8至20，n为0至10，且A为C3-C8环烷基或苯基。
在本发明的第一实施方式中，表面活性剂具有通式(I)，且R1为式-CONH(CH2)m′-CH3或-CO(CH2)m′-CH3的基团，其中m′为4至20，X为-OH或C1-C4烷氧基。在此实施方式中，m′优选为3至10，例如4至9。特别优选m′为6或7，最优选为6。此外，在此实施方式中，X优选为-OH或甲氧基，最优选为甲氧基。在此实施方式中，优选R1具有式-CONH(CH2)m′-CH3。在此实施方式中具体优选的表面活性剂为甲基-6-O-(N-烷基氨基甲酰基)-α-D-吡喃葡萄糖苷，其中烷基包含5至10个碳原子。这些表面活性剂可以作为Anameg-5、Anameg-6、Anameg-7、Anameg-8、Anameg-9和Anameg-10从Anatrace获得，其中指数是指烷基链(即基团(CH2)m′-CH3)的总长度。特别优选的表面活性剂为O-(N-庚基氨基甲酰基)-α-D-吡喃葡萄糖苷，即Anameg-7。
在本发明的第二实施方式中，表面活性剂具有通式(I)，且R1为氢或C1-C4烷基，X为式-O(CH2)m-CH3、-S(CH2)m″-CH3、-O(CH2)n-A、-S(CH2)n-A、-OCO(CH2)m-CH3或-NHCO(CH2)m-CH3的基团，其中m为4至20，m″为4至6或8至20，n为0至10，且A为C3-C8环烷基或苯基。在此第二实施方式中，R1优选为氢或甲基，最优选为氢。m优选为5至9，例如为6至8。此外，m ″优选为4至6。此外，n优选为0至5，例如为0至3。C3-C8环烷基可以为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基，优选环戊基或环己基，特别优选环己基。基团A优选为C3-C8环烷基，最优选为环己基。当A为环烷基时，n优选至少为1，例如为1至5。当A为苯基，n优选为0至3。
在本发明的第二实施方式中，表面活性剂的一个优选的基团为X是式-O(CH2)m-CH3、-S(CH2)m″-CH3、-OCO(CH2)m-CH3或-NHCO(CH2)m-CH3的基团。具体优选的表面活性剂为正烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷，其中烷基包含6至10个碳原子，如正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(称为OGP，可得自Anatrace)和正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷(称为NGP，可得自Anatrace)。其它具体优选的表面活性剂为正烷基-α-D-吡喃葡萄糖苷、正烷基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、正烷基-β-D-吡喃半乳糖苷和正烷基-β-D-吡喃甘露糖苷，其中烷基包含6至10个碳原子：例如，正辛基-α-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、正辛基-β-D-吡喃半乳糖苷和正辛基-β-D-吡喃甘露糖苷。
在本发明的第二实施方式中，表面活性剂的其它优选基团为X是式-O(CH2)n-A或-S(CH2)n-A的基团。具体优选的表面活性剂为3-环己基-1-甲基-β-D-葡糖苷(称为Cyglu-1)、3-环己基-1-乙基-β-D-葡糖苷(称为Cyglu-2)和特别地3-环己基-1-丙基-β-D-葡糖苷(称为Cyglu-3)，均得自Anatrace。当A为苯基时，n优选为0至8，例如为0至4。其它具体优选的表面活性剂为苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、苯基-β-D-吡喃半乳糖苷和苯乙基-β-D-吡喃半乳糖苷。
在本发明中，特别优选的表面活性剂为甲基-6-O-(N-庚基氨基甲酰基)-D-吡喃葡萄糖苷和3-环己基-1-丙基-D-葡糖苷。
表面活性剂优选为式(Ia)、(Ib)或(Ic)：
因此，式(Ia)的表面活性剂可以优选为吡喃葡萄糖(式(Ia))、吡喃半乳糖(式(Ib))或吡喃甘露糖(式(Ic))。
在本发明的另一个实施方式中，表面活性剂为式(Ix)或(II)
糖-O(CH2)NA (II)
其中R1′为式-CONH(CH2)M-CH3的基团，其中M为6至20，R2为氢或甲基，A为C3-C8环烷基，且N为1至10。
在此另一个实施方式中，表面活性剂可以为式(Ix)的6-O-氨基甲酰基糖。优选地，式(Ix)的表面活性剂为葡糖苷。M通常为6至10，例如6或7。优选的表面活性剂包括甲基-6-O-(N-庚基氨基甲酰基)-α-D-吡喃葡萄糖苷(Anameg-7，得自Anatrace)。
另外，在此另一个实施方式中，表面活性剂可以为式(II)，且因此可以衍生自糖类与式A-(CH2)N-OH的醇的反应。因此，式(II)的化合物由糖类分子构成，其中至少一个(如一个)-OH基团被-O(CH2)N-A基团取代。糖类可以为单糖、二糖或三糖，如葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖或蔗糖。优选单糖，特别是葡萄糖。表面活性剂优选为1-葡糖苷。环烷基A可以为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基，优选环戊基或环己基，特别优选环己基。N优选为1至8，特别为2至6。优选的表面活性剂包括3-环己基-1-丙基-β-D-葡糖苷(Cyglu-3，得自Anatrace)。
此外，在此另一个实施方式中，用于本发明的表面活性剂可以为式(Ixx)的表面活性剂：
其中R11为式-CONH(CH2)M-CH3的基团，且R12为氢或甲基；或R11为氢，且R12为-(CH2)N-A，其中A、N和M定义如上。
在本发明中，优选表面活性剂具有特定的HLB值。HLB值是表面活性剂领域中公知的参数，且描述表面活性剂的亲水性。使用如Raboron等，International Journal of Pharmaceutics，Vol 99，1993，p23-36中描述的NMR方法学可以很容易地获得特定表面活性剂的HLB值。此文献显示HLB值的可以计算为：
其中
其中A亲水为亲水基团化学位移的NMR积分，且A总为表面活性剂中全部化学位移的NMR积分。
使用上述方法获得的本发明的某些具体表面活性剂的HLB值为：
| 表面活性剂 | HLB |
| Anameg-5 | 13.0 |
| Anameg-6 | 12.0 |
| Anameg-7 | 11.2 |
| Anameg-8 | 10.5 |
| Anameg-9 | 9.5 |
| Anameg-10 | 8.7 |
| β-Cyglu-1 | 11.0 |
| β-Cyglu-2 | 10.1 |
| β-Cyglu-3 | 9.5 |
| α-Cyglu-3 | 9.4 |
| 正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷 | 9.5 |
| 正辛基-β-D-吡喃甘露糖苷 | 9.5 |
| 正辛酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷 | 8.0 |
在本发明中，优选表面活性剂具有的HLB值为5至16，例如7至14。
本发明的表面活性剂可以为商购产品或可以由本领域技术人员使用标准合成技术制备。可以用于本发明的表面活性剂的其它实例和有关这些表面活性剂合成的细节可以参见US 5,223,411和US 5,763,586。
表面活性剂通常以这样的量提供，即当表面活性剂与测试的样品混合时，含有表面活性剂的样品和所用的任何其它试剂的混合物中表面活性剂的浓度为至少10mM，优选为至少20mM，例如至少25mM。
本文所述的表面活性剂可以单独使用或组合使用。因此，本发明的传感器可以包括作为单一的表面活性剂使用的式(1)的一种表面活性剂(如式(I)的表面活性剂)，或与一种或多种其它表面活性剂一起使用的式(1)的表面活性剂。上述一种或多种其它表面活性剂也可以落入通式(1)中。在一个实施方式中，传感器包括两种或更多种(如至多5种)表面活性剂，这些表面活性剂可以彼此不同，但是每个表面活性剂都具有通式(1)，且优选通式(I)。例如，传感器可以包括两个此类表面活性剂。优选的组合为：
-Anameg-7和正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NGP)
-Cyglu-3和正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NGP)
-Anameg-7和Cyglu-3。
还优选包含Anameg-7、Cyglu-3和OGP中至少两个的组合。
通过本发明的表面活性剂释放出的甘油三酯或胆固醇与酶试剂反应以定量测定样品中存在的甘油三酯或胆固醇的量。所用的酶试剂没有特别地限制，且可以使用适用于进行甘油三酯或胆固醇测试的任何酶。例如，在胆固醇的情况中，酶试剂可以包括胆固醇脱氢酶或胆固醇氧化酶。在甘油三酯检测中，可以使用的酶试剂的实例为甘油脱氢酶，以及甘油激酶与磷酸甘油氧化酶的组合。
可以使用任何商购形式的胆固醇脱氢酶或甘油脱氢酶。例如，胆固醇脱氢酶来自如诺卡氏菌属(Nocardia)物种，且甘油脱氢酶来自如纤维单胞菌属(Cellulomonas)物种。脱氢酶的用量可以为每ml样品0.1至100mg，优选为每ml样品0.5至45mg。
脂蛋白与表面活性剂的反应通常释放出游离形式和胆固醇酯形式的胆固醇。因此，在胆固醇检测中，酶试剂通常包括胆固醇酯水解试剂以将酯分解为游离胆固醇。胆固醇酯水解试剂可以为能够将胆固醇酯水解为胆固醇的任何试剂。这种试剂应该是一种不干扰胆固醇与胆固醇脱氢酶反应和试验中任何后续步骤的试剂。优选的胆固醇酯水解试剂为酶，例如胆固醇酯酶和脂肪酶。适合的脂肪酶为如来自假单胞菌属(Pseudomonas)或色杆菌属viscosum(Chromobacterium viscosum)物种的脂肪酶。胆固醇酯水解试剂的用量可以为每ml样品0.1至25mg，例如每ml样品0.1至20mg，优选为每ml样品0.5至25mg，如每ml样品0.5至15mg。
在甘油三酯测试中，甘油酶通常用于测定甘油三酯含量。因此，在与甘油脱氢酶反应前，从脂蛋白中释放出的甘油三酯必须首先被分解为甘油。这通常由酶试剂中所含的甘油三酯水解试剂来完成。任何将甘油三酯水解为甘油的试剂均可以使用，只要其不干扰脱氢酶的活性。脂肪酶和酯酶为甘油三酯水解试剂的适合实例。作为胆固醇酯水解试剂的上述脂肪酶也适用于水解甘油三酯。甘油三酯水解试剂的用量可以为每ml样品0.1至100mg，例如每ml样品0.1至70mg，优选为每ml样品0.5至25mg，如每ml样品0.5至15mg。在一个实施方式中，甘油三酯水解试剂的用量可以为每ml样品0.1至25mg，例如每ml样品0.1至20mg。
上述各种酶可以包含添加剂，如稳定剂或防腐剂。此外，上述各种酶可以经过化学修饰。
根据测定与酶试剂反应的胆固醇或甘油三酯的量的需要，本发明的传感器中可以存在其它试剂。也可以使用添加剂，如稳定剂、缓冲剂和赋形剂。也可以加入活化酶的试剂。例如，可以使用氯化铵来活化甘油脱氢酶。
可以在加入其它试剂之前或在加入其它试剂同时将表面活性剂加入到样品中。在优选的实施方式中，酶试剂和表面活性剂可以存在于在单一步骤中与样品结合的单一试剂混合物中。在特别优选的实施方式中，该方法包括使样品与试剂接触的单一步骤，使得仅需要提供单一的试剂混合物。
本发明的传感器可以通过任何适当的技术来测定样品中的胆固醇或甘油三酯含量。例如，可以使用过氧化物酶和成色剂来测定由分析物与氧化酶反应产生的过氧化氢。本领域的技术人员熟知这类方法。在利用氧化酶体系检测甘油三酯的传感器中，可以使用以下试剂：脂肪酶或胆固醇酯酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸氧化酶、过氧化物酶和介质(mediator)。在利用氧化酶体系检测胆固醇的传感器中，例如可以使用以下试剂：脂肪酶或胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶和介质。适用于此类传感器的这些试剂的特定实例将在下文中做更详细讨论。
在优选的实施方式中，使用电化学分析，且此实施方式在下文中详述。然而，应该理解本发明不限于电化学分析。
在电化学分析中，通过测定在电极处发生的电化学响应来确定已经与酶试剂反应的胆固醇或甘油三酯的量。在此实施方式中，样品通常与表面活性剂、酶试剂、能够与酶试剂相互作用的辅酶和能够被氧化或被还原以在电极处形成可被电化学检测的产物的氧化还原剂反应。使样品和试剂的混合物接触电化学电池的工作电极，以便可以检测氧化还原反应的发生。在电池两端施加电势，并测定产生的电化学响应(通常为电流)。
在此优选的实施方式中，根据以下试验测定胆固醇的量：
其中ChD为胆固醇脱氢酶。
类似地，对于甘油三酯传感器，可以根据以下试验测定存在的甘油三酯的量：
其中，GlyD为甘油脱氢酶。在试验中，通过电化学检测由试验产生的被还原的氧化还原剂的量。在需要时，此试验中也可以包括其它试剂。
通常，在单一步骤中使样品接触全部的试剂。因此，传感器通常包括试剂混合物，所述试剂混合物包含全部所需的试剂且易于与样品接触以进行试验。试剂混合物通常包括浓度为10至500mM的表面活性剂，优选为25至200mM，特别地至少为50mM或至少为75mM。水解试剂通常以每ml样品0.1至25mg的量存在，优选以每ml样品约0.5至20mg的量存在，且脱氢酶以每ml样品0.1至100mg的量存在，优选以每ml样品0.5至45mg的量存在。
在本文中，根据试剂混合物的浓度或根据每ml试剂混合物的质量来说明每种试剂的量。然而，不必需提供溶液形式的试剂混合物。其也可以以干燥形式提供，例如其可以为冻干的。在这些实施方式中，本文所述试剂的量是指干燥前在试剂混合物的溶液或混悬液中的浓度或质量。
通常，辅酶为NAD+或其类似物。NAD+类似物是与NAD+具有共同结构特征且同样起胆固醇脱氢酶或甘油脱氢酶辅酶作用的化合物。NAD+类似物的实例包括APAD(乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸)；TNAD(硫代NAD)；AHD(乙酰吡啶次黄嘌呤二核苷酸)；NaAD(烟酸腺嘌呤二核苷酸)；NHD(烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸)；和NGD(烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸)。辅酶通常以1至20mM的量存在于试剂混合物中，例如3至15mM，优选5至10mM。
通常，氧化还原剂应为在上述试验中可以被还原的试剂。在此情况中，氧化还原剂应为能够接受来自辅酶的电子(或来自下述还原酶的电子)并将电子转移至电极的试剂。氧化还原剂可以为分子或离子配合物。其可以为天然存在的电子受体如蛋白质，或合成分子。氧化还原剂通常具有至少两种氧化态。
优选地，氧化还原剂为无机配合物。该试剂可以包括金属离子，且优选具有至少两个化合价。特别地，该试剂可以包括过渡金属离子，且优选的过渡金属离子包括钴、铜、铁、铬、锰、镍、锇或钌。氧化还原剂可以带电荷，例如其可以为阳离子或阴离子。适合的阳离子试剂的实例包括钌配合物，如Ru(NH3)6 3+。适合的阴离子试剂的实例为铁氰化物配合物，如Fe(CN)6 3-。
可以使用的配合物的实例包括Cu(EDTA)2-、Fe(CN)6 3-、Fe(CN)5(O2CR)3-、Fe(CN)4(草酸盐)3-、Ru(NH3)6 3+、Ru(acac)2(Py-3-CO2H)(Py-3-CO2)(下文称为RuAcac)和其螯合胺配体衍生物(如乙二胺)、Ru(NH3)5(py)3+、铈铁(ferrocenium)和在其两个环戊二烯环的一个或两个环中具有一个或多个基团(如-NH2、-NHR、-NHC(O)R和-CO2H)取代的衍生物。优选地，无机配合物为Fe(CN)6 3-、Ru(NH3)6 3+、Ru(acac)2(Py-3-CO2H)(Py-3-CO2)或铈铁一元羧酸(FMCA)。优选Ru(NH3)6 3+和Ru(acac)2(Py-3-CO2H)(Py-3-CO2)。
氧化还原剂通常以10至200mM的量存在于试剂混合物中，例如20至150mM，优选30至100mM、或至多80mM。
在优选的实施方式中，电化学试验中所用的试剂混合物还包括还原酶。还原酶通常转移来自还原型NAD或其类似物的两个电子，并将两个电子转移至氧化还原剂。因此使用还原酶可以提供快速的电子转移。
可以使用的还原酶的实例包括心肌黄酶和细胞色素P450还原酶，特别是来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的细胞色素P45cam酶体系的假单胞氧还蛋白还原酶、来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的P450BM-3酶的核黄素(FAD/FMN)结构域、菠菜铁氧还原蛋白还原酶、红氧还原蛋白还原酶、皮质铁氧还蛋白还原酶、硝酸还原酶、细胞色素b5还原酶、玉米硝酸还原酶、萜品氧还蛋白还原酶和酵母、大鼠、兔和人NADPH细胞色素P450还原酶。优选用于本发明的还原酶包括心肌黄酶和假单胞氧还蛋白还原酶。
还原酶可以为重组蛋白质或可以为经纯化或分离的天然存在的蛋白质。可以将还原酶突变以改进其性能，如使其进行电子转移的速度或其底物特异性最佳化。
还原酶通常以0.5至100mg/ml的量存在于试剂混合物中，例如1至50mg/ml、1至30mg/ml或2至20mg/ml。
在本发明的优选实施方式中，胆固醇检测的总体方案如下：
甘油三酯检测的总体方案如下：
其中
PdR-为假单胞氧还蛋白还原酶
Dia-为心肌黄酶
ChD-为胆固醇脱氢酶
GlyD-为甘油脱氢酶。
本领域的技术人员熟知脱氢酶可以被氧化酶取代，随后改变级联系统使得其能够测定过氧化物或酶介导的电化学。
上述试剂混合物任选地包含一种或多种其它组分，例如赋形剂和/或缓冲剂和/或稳定剂。如本领域所熟知，试剂混合物中优选包括赋形剂，以稳定混合物，且可选择地，当将试剂混合物在本发明的装置上干燥，以提供干燥混合物的多孔性。适合的赋形剂的实例包括如甘露醇、肌醇和乳糖的糖、甘氨酸和PEG。也可以包括缓冲剂以提供最佳酶活性所需的pH。例如，可以使用Tris缓冲剂(pH9)。可以加入稳定剂以增强如酶稳定性。适合的稳定剂的实例为氨基酸如甘氨酸和ectoine。
本发明的传感器通常包括用于测定与氧化酶或脱氢酶反应的胆固醇或甘油三酯的量的传感装置。在优选的实施方式中，传感器用于胆固醇或甘油三酯含量的电化学测定。在此实施方式中，传感器包括具有至少两个电极的电化学电池。电池可以为具有工作电极和反电极(也起假参比电极的作用)的双电极体系。或者，电池为具有工作电极、参比电极和反电极的三电极体系。在优选的实施方式中，电池的工作电极为微电极，例如具有不大于50μm宽度的微带电极。通常，电极不带有包含水溶性纤维素衍生物(如羧甲基纤维素、乙基纤维素或羟丙基纤维素)或非取代的水溶性糖类(如葡萄糖、果糖、海藻糖、蔗糖、乳糖或麦芽糖)的涂层。
传感器通常还包括测量单元，所述测量单元包括用于在电池两端提供电势的电源和用于测定产生的电化学响应(通常为通过电池的电流)的测量工具。
通常，可以将表面活性剂和酶试剂和任何其它所需的试剂作为单一的试剂混合物混合在一起，所述单独的试剂混合物被悬浮/溶解在适合的液体(如水或缓冲剂)中并被提供给传感器。试剂混合物随后通常在适当的位置干燥。此在传感器内/上干燥材料的步骤有助于将材料保持在所需的位置。干燥可以通过如空气干燥、真空干燥、冷冻干燥或烘箱干燥(加热)进行，优选通过冷冻干燥。通常将试剂混合物置于电极附近，使得当样品接触试剂混合物时，也发生与电极的接触。
传感器可以任选地包括膜，其中要测试的样品在与试剂混合物接触前通过所述膜。例如，膜可以用于滤出如红细胞、红血球和/或淋巴细胞等组分。适合的过滤膜(包括血液过滤膜)为本领域所熟知。血液过滤膜的实例为Pall filtration的Presence 200和PALL BTS SP300、Whatman VF2、WhatmanCyclopore、Spectral NX和Spectral X。玻璃纤维过滤器如Whatman VF2可以从全血中分离血浆，且适用于将全血样品提供给装置且要测定的样品为血浆的情况。
也可以使用备选的或额外的膜，包括在使用前经过亲水或疏水处理的那些膜。如果需要也可以改变膜的其它表面特性。例如，可以使用改变膜的水接触角的处理，以促进所需样品流动通过膜。膜可以包括一层、两层或更多层的材料，每层的材料可以相同或不同。例如，可以使用包括两层不同膜材料的常规双层膜。
适用于本发明的装置包括WO 2003/056319和WO 2006/000828中描述的那些。
在上述实施方式中，本发明的传感器用于检测甘油三酯或胆固醇。然而，本领域的技术人员将明白可以使用单独的传感器来测定样品中甘油三酯和胆固醇的含量。在一个实施方式中，这通过在传感器中放入两个电化学电池来实现，其中一个电化学电池适用于测定样品中的胆固醇含量，且一个电化学电池适用于测定样品中的甘油三酯含量。在WO 2003/056319和WO2006/000828所述的传感器中，这可以通过以下来实现，即向容器形式的一个电化学电池中提供用于胆固醇测试的适合的试剂，且向容器形式的第二个电化学电池中提供用于甘油三酯测试的适合的试剂。可以随后对传感器进行冷冻干燥过程，使得试剂混合物在其适合的电化学电池的适当位置中被干燥。在此实施方式中，将两种试剂混合物在局部的位置中固定，使得两个试验可以平行进行而彼此不相互干扰。
在本发明的方法中，使将要测试的样品接触本文所述的表面活性剂，并进一步接触一种或多种其它试剂，以测定胆固醇或甘油三酯含量。通常，使样品接触本文所述的试剂混合物，并通过电化学方法测定胆固醇或甘油三酯含量。
在进行测定前，必需给与充足的时间用于试剂混合物与样品的混合和反应的发生(“润湿”期)。当血浆样品与包含冻干试剂的传感器一起使用时，在样品与表面活性剂和酶试剂接触和测试开始之间经过约20至30秒的时间间隔。此“润湿”期可以缩短至20秒或甚至15秒，但也可以为至多45秒或2分钟。此短暂的“润湿”期足以使得本发明的表面活性剂分解样品中存在的全部类型的脂蛋白产物，并使得释放出的胆固醇或甘油三酯能够与酶试剂反应。当使用全血时，可能需要额外的时间来去除血细胞。例如，可以向传感器提供全血样品，且提供4或5分钟的周期用于去除血细胞和吸收试剂混合物/与试剂混合物反应。
在电化学测定中，在样品加入前，试剂混合物通常存在于电化学电池中。向电池中加入样品启动上述“润湿”期，且在“润湿”期结束后开始施加电势。在可选择的实施方式中，在电极外将样品与试剂混合，并加入到电池中，同时立即施加电势。
在样品加入后，在10秒至5分钟的周期内测定电化学响应。通常，在样品加入后至少0.5分钟测定电化学响应，例如至少1分钟。在优选的实施方式中，在样品加入后至少1.5分钟测定电化学响应，优选至少2分钟。
通常，当Ru(II)为在工作电极处要被检测的产物时，施加到电池的电势为0.1V至0.3V。优选施加的电势为0.15V。(本文提及的全部电压针对Ag/AgCl参比电极和0.1M氯化物提出)。在优选的实施方式中，首先将电势调整为0.15V的正电势持续约1至4秒，并随后在需要测定还原电流时调整为负电势。当使用不同的氧化还原剂时，根据氧化/还原峰出现时的电势可以改变施加的电势。施加电势的时间长度也可以改变。
因此，本发明的电化学测试能够使胆固醇和/或甘油三酯的测定在极短的时间周期内进行，通常在样品加入到装置起约5分钟或约4分钟内进行。
本发明还提供了式(1)的表面活性剂(优选为式(I)的表面活性剂)在用于分解样品中全部脂蛋白成分以测定样品中胆固醇和/或甘油三酯总量中的用途。
在本发明的另一个具体实施方式中，本发明提供了用于测定样品中甘油三酯和/或胆固醇量的传感器，所述传感器包括
(a)式(Ix)或(II)的表面活性剂
糖类-O(CH2)NA (II)
其中R1为式-CONH(CH2)M-CH3的基团，其中M为6至20，R2为氢或甲基，A为C3-C8环烷基，且N为1至10；和
(b)用于测定甘油三酯的酶试剂和/或用于测定胆固醇的酶试剂。
在此实施方式中，表面活性剂优选为式(Ixx)：
其中R11为式-CONH(CH2)M-CH3的基团，且R12为氢或甲基；或R11为氢或甲基，且R12为-(CH2)N-A。优选M为6至10，N为2至6，且A为环己基。具体优选的表面活性剂为甲基-6-O-(N-庚基氨基甲酰基)-D-吡喃葡萄糖苷或3-环己基-1-丙基-D-葡糖苷。
在此实施方式中，传感器还可以包括具有至少两个电极的电化学电池、辅酶和能够被氧化或被还原以形成产物的氧化还原剂；或包括具有至少两个电极的电化学电池、辅酶、能够被氧化或被还原以形成产物的氧化还原剂和可选择地额外的还原酶。
通常，表面活性剂和酶试剂作为单一的试剂混合物存在，或表面活性剂、酶试剂、辅酶、氧化还原剂和/或还原酶作为单一的试剂混合物存在。例如，用于测定胆固醇的酶试剂可以包括(i)胆固醇酯酶或脂肪酶和(ii)胆固醇脱氢酶。例如，用于测定甘油三酯的酶试剂可以包括(i)胆固醇酯酶或脂肪酶和(ii)甘油脱氢酶。例如，用于测定甘油三酯的酶试剂可以包括脂肪酶或甘油脱氢酶。
在此具体实施方式中还提供了用于测定样品中胆固醇和/或甘油三酯量的方法，所述方法包括：
-使样品接触本实施方式的表面活性剂；和
-测定存在的胆固醇和/或甘油三酯的量。
在此方法中，胆固醇和/或甘油三酯量的测定通常为电化学测定。例如，方法可以包括在电化学电池中使样品接触表面活性剂、酶试剂、辅酶和氧化还原剂，或使样品接触表面活性剂、酶试剂、辅酶、氧化还原剂和还原酶，在电化学电池两端施加电势，并测定电池的电化学响应。优选地，在样品与表面活性剂接触至少1.5分钟后测定电池的电化学响应。优选地，与样品接触的表面活性剂的量足以在样品和表面活性剂的混合物中提供至少20mM的表面活性剂浓度。
实施例1：Anameg-7和Cyglu-3
本实验的目的是研究由新型表面活性剂制备的胆固醇传感器对血浆HDL或LDL测定的影响。
方法
30mM Ru(Acac)溶液
通过混合Tris缓冲剂、KOH、β-乳糖和Ru(Acac)制备Ru(Acac)溶液，以提供包含100mM Tris缓冲剂(pH9.0)、30mM KOH、10重量/体积％β-乳糖和30mM Ru(Acac)的溶液。使用Covaris超声混合器混合此溶液。Ru(Acac)＝Ru(acac)2(Py-3-CO2H)(Py-3-CO2)
Anameg-7和Cyglu-3溶液
通过向Ru(Acac)溶液中加入相关表面活性剂以提供以下终浓度来制备双倍浓度的Anameg-7或Cyglu-3溶液：
Anameg-7(Anatrace，A340)
200mM(0.0088g，131μl Ru(Acac)溶液)
100mM(37.5μl的200mM储备液+37.5μl Ru(Acac)溶液)
50mM(25μl的200mM储备液+75μl Ru(Acac)溶液)
Cyglu-3(Anatrace，C323G)
200mM(0.0077g，125μl Ru(Acac)溶液)
100mM(37.5μl的200mM储备液+37.5μl Ru(Acac)溶液)
50mM(25μl的200mM储备液+75μl Ru(Acac)溶液)
酶混合物
通过向Ru(Acac)溶液中加入酶和辅因子以产生以下终浓度来制备双倍浓度的酶混合物：
17.7mM硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Oriental Yeast Co)
8.4mg/ml假单胞氧还蛋白还原酶(Biocatalysts)
6.7mg/ml脂肪酶(Genzyme)
44.4mg/ml胆固醇脱氢酶，不含明胶(Amano，CHDH-6)
使用Covaris超声混合器混合此溶液。
分散和冷冻干燥
对于各种酶溶液，将等体积(约50ul)的双浓度酶溶液和Anameg-7或Cyglu-3溶液以1∶1混合以得到最终的酶/表面活性剂混合物。如WO2006/000828所述，使用电子移液管将0.4μl/每孔的各种溶液分散在传感器上。随后将分散的传感器板冷冻干燥。
血浆样品
血浆样品解冻30分钟，然后在2900RCF下离心5分钟。脱脂的血清(Scipac，S139)也作为样品使用。使用Space临床分析仪(SchiappanelliBiosystems Inc)对样品的总胆固醇、甘油三酯(TG)、HDL胆固醇和LDL胆固醇浓度进行分析。
测试方法1
每个电化学电池使用15μl血浆样品。加入15μl血浆同时起始计时电流法测试。在0.15V，13个时间点(0、32、64、96、128、160、192、224、256、288、320、352和384秒)时测定氧化电流，在-0.45V，最终时间点(416秒)时测定还原电流。在每个特定时间点对电流进行4秒测定。每个样品测试两次。
测试方法2
每个电化学电池使用15μl血浆样品。加入15μl血浆同时起始计时电流法测试。在0.15V，13个时间点(0、34、68、102、136、170、204、238、272、306、340、374和408秒)时测定氧化电流，在-0.45V，最终时间点(442秒)时测定还原电流。在每个特定时间点对电流进行4秒测定。每个样品测试两次。
分析
将所收集的电流测量结果与由Space分析仪测定的血浆样品的HDL和LDL胆固醇浓度绘图。使用每个时间点的斜率计算由LDL和HDL测量结果之间获得的％差异。对于每个时间点下HDL和LDL的标准曲线的斜率和截距显示在表1A中，且表明这些表面活性剂对HDL和LDL起作用，特别是在超过32秒时起作用。
可以根据公式(i)确定对于HDL的HDL和LDL之间的差异：
其中Gx为测定的对X响应的斜率(如测定的电流对X的已知浓度)。测定的响应可以为与脂蛋白浓度相关(或对应)的任何测定值，例如与脂蛋白浓度成正比的值。
对于用Anameg-7制备的传感器，HDL的响应斜率很低，并随着表面活性剂浓度的增加而降低。LDL的响应斜率随着表面活性剂浓度的增加而增加，且相对较高。这可以表明HDL与表面活性剂反应很快，随后为对LDL的强响应。由Cyglu-3制备的传感器观察到相似的效果。
同样将传感器响应与Space分析仪测定的总胆固醇浓度的绘图。对于每个时间点下总胆固醇的标准曲线的斜率和截距显示在表1B中。在长时间下，100mM Anameg-7或Cyglu-3对总胆固醇的响应的斜率很高，且截距很低，表明传感器响应总胆固醇而非HDL或LDL胆固醇。
总胆固醇响应的标准曲线显示在图1中。图1(a)至(c)涉及使用Anameg-7作为表面活性剂((a)25mM Anameg-7；(b)50mM Anameg-7；(c)100mM Anameg-7)在288秒时得到的电流测定结果，且图1(d)至(f)涉及使用Cyglu-3作为表面活性剂((d)25mM Cyglu-3；(e)50mMCyglu-3；(f)100mM Cyglu-3)在320秒时得到的电流测定结果。
图1显示包含100mM Anameg-7或Cyglu-3的传感器对总胆固醇的响应具有良好的线性和很高的斜率。
实施例2至14
使用相同的基础酶混合物进行若干个实验，在通用配方和/或测试步骤上略有改变。以下列出了在每个实施例中与通用细节改变相关的所述修改。
酶混合物
通用的酶混合物包含以下组分：
0.1M Tris缓冲剂(pH 9.0)
40mM KOH
40mM Ru(Acac)
10％乳糖
100mM Anameg 7
500mM NaCl
8.9mM硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(TNAD)
4.2mg/ml假单胞氧还蛋白还原酶(PdR)
3.3mg/ml脂肪酶
22mg/ml胆固醇脱氢酶，不含明胶(ChDH)。
分散和冷冻干燥
如WO 2006/000828所述，使用电子移液管将0.4μl/每孔的各种溶液分散在传感器上。随后将分散的传感器板冷冻干燥。
血浆样品
使用血浆或脱脂的血清(Scipac，S139)测试传感器。使用Space临床分析仪(Schiappanelli Biosystems Inc)对样品的总胆固醇和甘油三酯浓度进行分析。
测试方法
向每个电化学电池中加入12μl血浆样品。加入样品同时起始计时电流法测试，并按照实施例1中的方法1获得一系列电流测定结果。。
将传感器响应与Space分析仪测定的总胆固醇浓度绘图。随后在所选的时间点下计算对总胆固醇的标准曲线的斜率和截距。
实施例2：不同的烷基链长度
配方和测试步骤如上所述，具有的修改如下：
使用30mM KOH而非40mM KOH
使用30mM Ru(Acac)而非40mM Ru(Acac)
混合物中不存在NaCl。
用在0、25、50和100mM浓度下使用的以下表面活性剂替代Anameg-7表面活性剂：
-正己基-β-D-吡喃葡萄糖苷(HexGP，得自Anatrace)
-正庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷(HepGP，得自Anatrace)
-正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OGP，得自Anatrace)
-正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NGP，得自Anatrace)
结果显示在表2中。
实施例3：不同的离子强度
配方和测试步骤如上所述，具有的修改如下：
如下所述，在通用酶混合物中加入盐或从通用酶混合物中除去盐：
-混合物中存在0mM盐
-混合物中存在250mM KCl或NaCl
-混合物中存在500mM KCl
结果显示在表3中。
实施例4：用BSA替代乳糖
配方和测试步骤如上所述，除了用1％、2％和3％浓度的BSA替代乳糖。
结果显示在表4中。
实施例5：胆固醇脱氢酶浓度的变化
配方和测试步骤如上所述，除了在22、44和66mg/ml下测试胆固醇脱氢酶浓度。
根据实施例1的方法2完成测试。
结果显示在表5中。
实施例6：用二乙醇胺缓冲剂替换Tris缓冲剂
配方和测试步骤如上所述，除了将缓冲剂由Tris替换为0.1M二乙醇胺(pH8.6)。
也进行以下其它的修改：
1重量/体积％肌醇(myo-inositol)和1重量/体积％ectoine的组合替换10％乳糖
400mM KCl替换500mM NaCl
80mM钌六胺络合物(Ru(NH3)6Cl3)替换40mM Ru(Acac)。
此外，用以下表面活性剂替换通用酶混合物中的100mM Anameg 7：
-200mM Anameg-7
-100或200mM Cyglu-3
-100或200mM辛基吡喃葡萄糖苷(OGP)
-100或200mM正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NGP)
-5重量/体积％CHAPS：5重量/体积％DeoxyBigCHAPS(对比例)
在此实施例中，对测试方法进行如下略微修改。于+0.15V在196秒的时间内以15个连续的时间间隔对氧化电流进行1秒测定，随后在-0.45V对还原电流进行1秒测定。在约0、14、28、42、56、70、84、98、112、126、140、154、168、182、196秒测定氧化电流，于-0.45V在210秒测定还原电流。
结果显示在表6中。
实施例7：在宽范围内改变表面活性剂浓度
配方和测试步骤如上所述，但所用表面活性剂和其浓度变化如下(替换通用混合物中的100mM Anameg 7)：
-无表面活性剂
-10、25、50、200或300mM Anameg-7
-10、25、50、200或300mM Cyglu-3
-10、25、50、100、200或300mM正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NGP)
测试方法与实施例1的方法2相同。
结果显示在表7A和7B中。
实施例8：不含胆酸盐的胆固醇脱氢酶
配方和测试步骤如上所述，除了用不含胆酸盐的脱氢酶替换标准的胆固醇脱氢酶。
测试方法与实施例7所述相同。
结果显示在表8中。
实施例9：双重表面活性剂体系
配方和测试步骤如上所述，除了用以下表面活性剂的组合替换通用酶混合物中的100mM Anameg：
-50mM Anameg-7和50mM正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NGP)
-50mM Cyglu-3和50mM正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NGP)
测试方法与实施例7所述相同。
结果显示在表9中。
实施例10：使用不同的新型介质
配方和测试步骤如上所述，除了用不同的钌介质替换存在于通用酶混合物中的40mM Ru(Acac)。
使用存在于通用酶混合物中的100mM Anameg-7表面活性剂组分进行实验。随后使用以下可选择的表面活性剂进行其它实验：
-无表面活性剂
-100mM Cyglu-3
-100mM正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NGP)
测试方法与实施例7所述相同。
结果显示在表10中。
实施例11：不同的糖表面活性剂
配方和测试步骤如上所述，除了对通用酶混合物中的100mM Anameg-7进行以下替换：
-无表面活性剂
-50mM正辛基-β-D-吡喃半乳糖苷
-50mM正庚基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷
-50mM N-辛酰基-β-D-葡萄糖胺(NOGA)
-50mM Anameg-7
-50mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OGP)
-50mM正庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷(HeptGP)
-100mM NOGA
-50、100或200mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OGP)
-50或100mM正辛基-β-D-吡喃甘露糖苷(OMP)
-200mM正辛基-β-D-吡喃甘露糖苷(OMP)
-50、100或200mM正辛酰基D-吡喃葡萄糖苷(OYGP)
测试方法与实施例7所述相同。
结果显示在表11中。
实施例12：Anameg表面活性剂系列
配方和测试步骤如上所述，除了使用如下的一系列Anameg表面活性剂：
-无表面活性剂
-50mM、100mM或200mM Anameg-5
-50mM、100mM或200mM Anameg-6
-50mM、100mM或200mM Anameg-7
-50mM、100mM或200mM Anameg-8
-50mM、100mM或200mM Anameg-9
测试方法与实施例7所述相同。
结果显示在表12中。
实施例13：Cyglu表面活性剂系列
配方和测试步骤如上所述，除了使用如下的一系列Cyglu表面活性剂替换Anameg-7：
-无表面活性剂
-0、50、100或200mM β-cyglu-1
-50、100或200mM β-cyglu-2
-50、100或200mM β-cyglu-3
-50、100或200mM α-cyglu-3
测试方法与实施例7所述相同。
结果显示在表13中。
实施例14：用相当的酶替换
配方和测试步骤如上所述，除了使用如下的不同NADH氧化酶或不同的酯裂解酶：
-用4.2mg/mL心肌黄酶替换4.2mg/mL假单胞氧还蛋白还原酶
-用3.3mg/mL Toyobo ChE替换3.3mg/mL脂肪酶(Genzyme)
此外，用2重量/体积％BSA替换10％乳糖
测试方法与实施例7所述相同。
结果显示在表14中。
实施例15：冻干的甘油三酯传感器
在此实施例中，用于甘油三酯传感器的最终酶混合物包括：
0.1M HEPBS(pH 9.0)
30mM KOH
30mM Ru(Acac)
10重量/体积％乳糖
17.6mM硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(TNAD)
6.7mg/ml心肌黄酶
5mg/ml Toyobo ChE
45mg/ml甘油脱氢酶
此配方在没有表面活性剂时和包含以下浓度的如下表面活性剂时均使用：
-1重量/体积％和5重量/体积％Anameg-7
-1重量/体积％和5重量/体积％cyglu-3
-1重量/体积％和5重量/体积％正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NGP)
分散和冷冻干燥
如WO 2006/000828所述，使用电子移液管将0.3μl/每孔的各种溶液分散在传感器上。随后将分散的传感器板冷冻干燥。
血浆样品
使用血浆或脱脂的血清(Scipac，S139)测试传感器。使用Space临床分析仪(Schiappanelli Biosystems Inc.)对样品的总胆固醇和甘油三酯浓度进行分析。
测试方法
向每个电化学电池中加入12μl血浆样品，其余测试方法如实施例7所述。
将传感器响应与Space分析仪测定的总甘油三酯浓度的绘图。随后计算甘油三酯的标准曲线在所选的时间点下的斜率和截距。
结果显示在表15中。
表2
表3
表4
表5
表6
表7A
表7B
表8
表9
表10
表11
表12
表13
表14
表15
Claims (20)
1.一种用于测定样品中甘油三酯和/或胆固醇量的传感器，所述传感器包括：
(a)式(1)的表面活性剂
其中
每个Ra、Rb、Rc、Rd和Re独立地为-OH、C1-C4烷氧基或式-OCONH(CH2)m′-CH3、-OCO(CH2)m′-CH3、O(CH2)m-CH3、-S(CH2)m″-CH3、-O(CH2)n-A、-S(CH2)n-A、-OCO(CH2)m-CH3或-NHCO(CH2)m-CH3的基团，其中m为4至20，m′为4至20，m″为4至6或8至20，n为0至10，且A为C3-C8环烷基或苯基，
条件是Ra、Rb、Rc、Rd和Re基团中的至少一个不为-OH或C1-C4烷氧基；和
(b)用于测定甘油三酯的酶试剂和/或用于测定胆固醇的酶试剂。
2.如权利要求1所述的传感器，其中所述表面活性剂为式(I)
其中：
i)R1为式-CONH(CH2)m′-CH3或-CO(CH2)m′-CH3的基团，其中m′为4至20；且X为-OH或C1-C4烷氧基；或
ii)R1为氢或C1-C4烷基；且X为式-O(CH2)m-CH3、-S(CH2)m″-CH3、-O(CH2)n-A、-S(CH2)n-A、-OCO(CH2)m-CH3或-NHCO(CH2)m-CH3的基团，其中m为4至20，m″为4至6或8至20，n为0至10，且A为C3-C8环烷基或苯基。
3.如权利要求2所述的传感器，其中m′为3至10。
4.如权利要求2所述的传感器，其中m为5至9。
5.如权利要求2所述的传感器，其中m″为4至6。
6.如权利要求2所述的传感器，其中n为0至5。
7.如权利要求2或6所述的传感器，其中A为C3-C8环烷基。
8.如权利要求2、6或7所述的传感器，其中A为环己基。
9.如权利要求2或3所述的传感器，其中R1为式-CONH(CH2)m′-CH3或-CO(CH2)m′-CH3的基团，且X为-OH或C1-C4烷氧基。
10.如权利要求2、4或5所述的传感器，其中R1为氢或C1-C4烷基；且X为式-O(CH2)m-CH3、-S(CH2)m″-CH3、-OCO(CH2)m-CH3或-NHCO(CH2)m-CH3的基团。
11.如权利要求2、6、7或8所述的传感器，其中R1为氢或C1-C4烷基，且X为式-O(CH2)n-A或-S(CH2)n-A的基团。
12.如权利要求1所述的传感器，其中所述表面活性剂为甲基-6-O-(N-庚基氨基甲酰基)-D-吡喃葡萄糖苷或3-环己基-1-丙基-D-葡糖苷。
13.如权利要求2至12中任一项所述的传感器，其中所述表面活性剂由式(Ia)、(Ib)或(Ic)表示：
其中R1和X如前述任一项权利要求所定义。
14.如在前任一项权利要求所述的传感器，其中所述传感器进一步包括具有至少两个电极的电化学电池、辅酶、能够被氧化或被还原以形成产物的氧化还原剂和任选的还原酶。
15.如在前任一项权利要求所述的传感器，其中所述表面活性剂、酶试剂以及，如果使用的话，所述辅酶、氧化还原剂和/或还原酶作为单一的试剂混合物存在。
16.如在前任一项权利要求所述的传感器，其中用于测定胆固醇的所述酶试剂包括：(i)胆固醇酯酶或脂肪酶；和(ii)胆固醇脱氢酶；和/或其中用于测定甘油三酯的酶试剂包括：(i)胆固醇酯酶或脂肪酶；和(ii)甘油脱氢酶。
17.一种用于测定样品中胆固醇和/或甘油三酯量的方法，所述方法包括：
-使样品接触如权利要求1至13中任一项所述的表面活性剂；和
-测定存在的胆固醇和/或甘油三酯的量。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述胆固醇和/或甘油三酯量的测定为电化学测定，且其中所述方法任选地包括在电化学电池中使样品接触表面活性剂、酶试剂、辅酶、氧化还原剂和任选的还原酶，在电化学电池两端施加电势，以及测定电池的电化学响应。
19.如权利要求18所述的方法，其中在样品与表面活性剂接触至少1.5分钟后测定电池的电化学响应。
20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中与样品接触的表面活性剂的量足以在样品和表面活性剂的混合物中提供至少20mM的表面活性剂浓度。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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