CN101918555A - 人源化抗整联蛋白α9抗体及其应用 - Google Patents

人源化抗整联蛋白α9抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人源化抗体。这些抗体中的一些可以抑制整联蛋白α9的生物学功能，从而显示对多种与整联蛋白α9有关的病症或疾病具有治疗作用，这些病症或疾病包括癌症，例如癌细胞的生长和转移，和炎症性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎性肠病(溃疡性大肠炎和克罗恩氏病)、自身免疫性疾病等。

Description

人源化抗整联蛋白α9抗体及其应用
                            1.发明领域
本发明涉及可免疫特异性地识别人整联蛋白α9的人源化抗体，并涉及它们在治疗和诊断各种与整联蛋白α9有关或涉及整联蛋白α9的疾病或病症中的应用，这些病症或疾病包括癌症、炎症性疾病、自身免疫性疾病等。
                            2.发明背景
细胞在一群称作整联蛋白(integrins)的细胞表面受体的介导下粘附于细胞外基质(下文简称作ECM)。整联蛋白通过形成α和β链的1∶1异源二聚体而发挥其功能。迄今为止，已经鉴定和确认了至少18种α链、8种β链和24种αβ异源二聚体。已知每种整联蛋白识别一种特异的配体。根据整联蛋白的配体特异性或功能将整联蛋白归为多个亚家族，并将它们分为存在于纤连蛋白、玻连蛋白等内的胶原蛋白受体、层粘连蛋白受体、识别Arg-Gly-Asp(RGD)序列的RGD受体，和仅存在于白细胞内的白细胞特异受体(Hynes，R.O.，2002，Integrins：Bidirectional，Allosteric Signaling Machines.Cell 110：673-87；Miyasaka，M.，2000，New edition of Adhesion Molecule Handbook，Shuiunsya)。α4和α9整联蛋白是一个不属于上述任何类型的亚家族的成员，该亚家族称作α4整联蛋白亚家族(Elise L.Palmer，Curzio Rfiegg，RonaldFerrando，Robert Pytela，Sheppard D.，1993，Sequence and Tissue Distribution ofthe Integrin α9 Subunit，a Novel Partner of β1 That Is Widely Distributed inEpithelia and Muscle.The Journal of Cell Biology，123：1289-97)。迄今为止ECM被认为仅发挥细胞间的粘合物质(cementing substance)的作用。现在已经清楚，整联蛋白介导的ECM-细胞相互作用显著地参与了细胞生长、粘附、移动等的调节，并与多种疾病的发生有关，包括癌症的进展、炎症加重等。
例如，骨桥蛋白(osteopontin)(下文简称作OPN)，一种ECM，是一种分泌型酸性磷酸化糖蛋白，分子量为大约41kDa，该分子的表达被广泛发现于乳汁、尿液、肾小管、破骨细胞、成骨细胞、巨噬细胞、活化的T细胞、肿瘤组织等。OPN具有：粘附序列GRGDS(SEQ ID NO：1)，位于其分子中心；人OPN中的SVVYGLR(SEQ ID NO：2)序列或小鼠OPN中的SLAYGLR(SEQ ID NO：3)序列；及与其非常邻近的一个凝血酶切割位点。OPN通过所述GRGDS(SEQ ID NO：1)序列与RGD整联蛋白结合，或者通过SVVYGLR(SEQ ID NO：2)序列或SLAYGLR(SEQ ID NO：3)序列与α4(α4β1)和α9(α9β1)整联蛋白结合。
WO 02/081522公开了通过使用OPN敲除小鼠或针对OPN的中和抗体抑制OPN的功能对风湿性关节炎或肝炎的治疗效果。而且，该公开文献表明，SVVYGLR(SEQ ID NO：2)序列通过识别α9和α4整联蛋白对于炎症性疾病的发病是至关重要的，并且OPN受体在免疫活性细胞等内表达并与炎症性疾病有关。
已经发现，α9和α4的结合谱的差异在于，α4β1既结合未被凝血酶切割的OPN(未切割的OPN)，也结合被凝血酶切割后OPN的N端片段(已切割的OPN)，而α9β1仅结合已切割的OPN(Y.Yokosaki，et al.，(1999)TheJournal of Biological Chemistry，274：36328-36334；P.M.Green，et al.，(2001)FEBS Letters，503：75-79；S.T.Barry，et al.，(2000)Experimental Cell Research，258：342-351)。
除了OPN之外，α4和α9整联蛋白有许多共同的配体。已知的配体有纤连蛋白的EDA域、前肽-血管性血友病因子(propeptide-von Willebrandfactor，pp-vWF)、组织转谷氨酰胺酶(tTG)、凝血因子XIII、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)等。此外，纤连蛋白的CS-1域、MadCAM-1(α4β7)等已知是被α4整联蛋白特异识别的配体。生腱蛋白-C、纤溶酶等已知是被α9整联蛋白特异识别的配体。
整联蛋白亚单位α9、α4和β1的氨基酸序列是公知的。例如，在GenBank中，人α9被登记为NM_002207，小鼠α9被登记为NM_133721，人α4被登记为NM_000885，小鼠α4被登记为NM_010576，人β1被登记为X07979，小鼠β1被登记为NM_010578。还已知这些整联蛋白的氨基酸序列在物种间高度相似。
                        3.发明概要
尽管目前已知有多种治疗癌症、炎症性疾病和自身免疫性疾病的药物，但是人们仍然希望开发对癌症、炎症性疾病和自身免疫性疾病具有更好的治疗效果的预防和/或抑制剂等。本发明是部分地基于本发明人的如下发现，即针对整联蛋白α9的特异性抑制抗体具有抑癌和抗炎作用。
先前，本发明人分离了可免疫特异性地识别人整联蛋白α9的小鼠单克隆抗体，它们是由杂交瘤克隆1K11、21C5、24I11、25B6和28S1(保藏号分别是FERM BP-10510、FERM BP-10511、FERM BP-10512、FERMBP-10513和FERM BP-10832)产生的，并分离了可免疫特异性地识别小鼠整联蛋白α9的小鼠单克隆抗体，它们是由杂交瘤克隆18R18D、12C4’58、11L2B和55A2C(保藏号分别是FERM ABP-10195、FERM ABP-10196、FERM ABP-10197和FERM ABP-10198)产生的。这里，杂交瘤克隆的名称可以和由该克隆产生的单克隆抗体的名称互换使用。所有这些小鼠抗人α9整联蛋白抗体均是IgG1同种型。这些单克隆抗体中的一些可抑制人和/或小鼠整联蛋白α9与整联蛋白α9的配体(例如骨桥蛋白)之间的结合。因此，这些抗整联蛋白α9抗体可抑制整联蛋白α9的功能，并对癌症，例如癌细胞的生长或转移，和炎症性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、自身免疫性疾病等，具有治疗作用。
而且，本发明的抗整联蛋白α9抗体可以用作体内诊断剂，用于检测受试者体内整联蛋白α9表达的存在和水平，藉此诊断涉及整联蛋白α9的疾病或病症。
然而，因为这些单克隆抗体是小鼠来源的，由于它们在人体内的免疫原性可能导致不良作用，这妨碍了它们直接应用于人体的诊断或治疗。为了降低免疫原性，本发明人制备了一种人源化抗体，它们具备作为所述人源化抗体来源的原始小鼠抗整联蛋白α9抗体所展示的生物学活性。
因此，本发明提供了一种可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，所述抗体包括部分地衍生自非人类来源且部分地衍生自人类来源的抗原结合区。在一个具体的实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包括：衍生自非人类来源(供体)，例如1K11、21C5、24I11、25B6和28S1单克隆抗体，的互补决定区(CDR)，和衍生自人类来源(受体)的框架区(FR)。在一个实施方案中，所述人源化抗体或其抗原结合片段可抑制人α9整联蛋白与人α9整联蛋白的配体之间的结合。
在一个具体的实施方案中，所述可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段包括：(i)重链(H链)，其包括至少一个衍生自人H链可变区(V区)的H链FR(FRH)，和至少一个H链互补决定区(CDRH)，所述CDRH衍生自可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的非人类抗体的CDRH中的至少一个；或(ii)轻链(L链)，其包括至少一个衍生自人L链V区的L链FR(FRL)，和至少一个L链互补决定区(CDRL)，该CDRL衍生自可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的非人类抗体的CDRL中的至少一个；或(iii)上面的(i)和(ii)。例如，所述非人类抗体，作为本发明人源化抗体中的至少一个CDRH和/或至少一个CDRL的来源，是由从下组选出的杂交瘤产生的单克隆抗体：保藏号FERM BP-10510、FERM BP-10511、FERMBP-10512、FERM BP-10513和FERM BP-10832。
在一个优选的具体实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含：(i)至少一个衍生自人FRH的FRH，以及至少一个CDRH，所述CDRH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：4、5和6中的氨基酸序列；或(ii)至少一个衍生自人FRL的FRL，以及至少一个CDRL，所述CDRL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：11、12和13中的氨基酸序列；或(iii)同时包含上面的(i)和(ii)。所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：4、5和6。或者，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：11，12和13。在一个优选实施方案中，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包含CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：4、5、6、11、12和13。又或者，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包含：从由GenBank登录号No.X65891(SEQ ID NO：18)编码的人H链可变区衍生的FRH，或从由GenBank登录号No.X72441(SEQID NO：23)编码的人κ-L链可变区衍生的FRL。在一个优选实施方案中，本发明人源化抗体的FRH包含至少一个选自氨基酸序列SEQ ID NO：19、20、21和22(FRH1、FRH2、FRH3和FRH4，分别由X65891的相应部分编码)中的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，本发明人源化抗体的FRL包含至少一个选自氨基酸序列SEQ ID NO：24、25、26和27(FRL1、FRL2、FRL3和FRL4，分别由X72441的相应部分编码)中的氨基酸序列。在一个最优选的实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包括：(i)H链可变区(VH区)，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：29；或(ii)L链可变区(VL区)，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：31；或(iii)上面的(i)和(ii)。
在另一个优选具体实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包括：(i)至少一个衍生自人FRH的FRH，以及至少一个CDRH，所述CDRH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：32、33和34中的氨基酸序列；或(ii)至少一个衍生自人FRL的FRL，以及至少一个CDRL，所述CDRL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：37、38和39中的氨基酸序列；或(iii)上面的(i)和(ii)。所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段可以包括CDRH1、CDRH2和CDRH3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：32、33和34。或者，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包括CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：37、38和39。在一个优选实施方案中，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包括CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：32、33、34、37、38和39。
在另一个优选具体实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包括：(i)至少一个衍生自人FRH的FRH，以及至少一个CDRH，所述CDRH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：42、43和44中的氨基酸序列；或(ii)至少一个衍生自人FRL的FRL，以及至少一个CDRL，所述CDRL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：47、48和49中的氨基酸序列；或(iii)上面的(i)和(ii)。所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段可以包括CDRH1、CDRH2和CDRH3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：42、43和44。或者，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包括CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：47、48和49。在一个优选实施方案中，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包括CDRH1、CDRH2，CDRH3，CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：42、43、44、47、48和49。
在另一个优选具体实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包括：(i)至少一个衍生自人FRH的FRH，以及至少一个CDRH，所述CDRH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：52、53和54中的氨基酸序列；或(ii)至少一个衍生自人FRL的FRL，以及至少一个CDRL，所述CDRL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：57、58和59中的氨基酸序列；或(iii)上面的(i)和(ii)。所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段可以包括CDRH1、CDRH2和CDRH3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：52、53和54。或者，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段可以包括CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：57、58和59。在一个优选实施方案中，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包括CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：52、53、54、57、58和59。
在另一个优选具体实施方案中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包括：(i)至少一个衍生自人FRH的FRH，以及至少一个CDRH，所述CDRH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：62、63和64中的氨基酸序列；或(ii)至少一个衍生自人FRL的FRL，以及至少一个CDRL，所述CDRL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：67、68和69中的氨基酸序列；或(iii)上面的(i)和(ii)。所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段可以包括CDRH1、CDRH2和CDRH3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：62、63和64的。或者，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包括CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：67、68和69。在一个优选实施方案中，所述的本发明人源化抗体或其抗原结合片段包括CDRH1、CDRH2、CDRH3，CDRL1、CDRL2和CDRL3，它们分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：62、63、64、67、68和69。
本发明进一步提供了一种分离的核酸分子，其包含编码可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的本发明人源化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。具体地，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含这样的核苷酸序列，该序列编码：包含从SEQ ID NO：4、5、6、32、33、34、42、43、44、52、53、54、62、63和64中选出的至少一种氨基酸序列的人源化H链，或包含从SEQ ID NO：11、12、13、37、38、39、47、48、49、57、58、59、67、68和69中选出的至少一种氨基酸序列的人源化L链，或者所述人源化H链和所述人源化L链二者。在一个优选的具体实施方案中，这样的分离的核酸分子包括编码VH区的核苷酸序列SEQ ID NO：28，或编码氨基酸序列SEQ ID NO：29的核苷酸序列。在另一个优选的具体实施方案中，这样的分离的核酸分子包括编码VL区的核苷酸序列SEQ ID NO：30，或编码氨基酸序列SEQ ID NO：31的核苷酸序列。在另外一个优选的具体实施方案中，这种分离的核酸分子同时包括核苷酸序列SEQ ID NO：28和30。在另外一个优选的具体实施方案中，本发明的分离核酸分子进一步包括编码供体来源的信号肽(例如氨基酸序列SEQ ID NO：10和17，分别地)或异种来源的信号肽的核苷酸序列。
本发明进一步提供了一种载体，例如表达载体，其包括编码本发明的可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段的H链和/或L链的核苷酸序列。在这样的载体中，本发明的核苷酸序列可与一种或多种调节元件可操作连接。本发明的核苷酸序列可以包括编码信号肽的核苷酸序列，其中所述信号肽是作为CDR来源的非人类供体抗体的天然信号肽，或者是异种来源的信号肽。
而且，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的核酸分子，包括含有本发明核酸分子的载体。在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的宿主细胞，其包括编码本发明人源化H链的第一核酸分子和编码本发明人源化L链的第二核酸分子，所述第一和第二核酸分子各自与调节元件可操作连接，使得有生物功能的本发明人源化抗体或其抗原结合片段得以被表达。
因此，本发明进一步提供了一种用于制备本发明人源化抗体的方法，其包括：在使得所述人源化抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞；并收集所产生的人源化抗体。
本发明进一步提供了一种组合物，其包含至少一种本发明的人源化抗体。此外，本发明提供了一种用于预防或治疗与α9整联蛋白有关的病症或疾病的药物组合物，其包含至少一种本发明的人源化抗体和可药用的载体。所述任何一种组合物均可进一步包含其它可以加和性或协同性地改善疾病或病症的活性化合物。这样的活性化合物包括，但不仅限于，抗炎化合物、化疗化合物，等等，以及抗体或其抗原结合片段，例如能够免疫特异性地结合人α4整联蛋白的抗体。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于预防或治疗与α9整联蛋白有关或涉及α9整联蛋白的疾病或病症的方法，所述方法包括向需要的受试者施用预防或治疗有效量的至少一种本发明人源化抗体。对于这类应用，本发明的人源化抗体可以和可增强该人源化抗体生物学效应的治疗性模块偶联。这样的治疗性模块的实例包括另一种抗体，例如抗α4抗体(例如形成双特异性抗体)，细胞生长抑制性或细胞杀伤性的细胞毒素，放射性元素，和/或其它治疗剂，包括抗炎剂、抗生素等。
在另外一个方面中，本发明提供了一种用于诊断受试者体内与α9整联蛋白有关或涉及α9整联蛋白的病症或疾病的方法，所述方法包括向待检查的受试者施用诊断有效量的本发明人源化抗体。对于这类诊断应用，本发明的人源化抗体可以用可检测的标志物，例如放射性元素，标记。
3.1 定义
如这里所使用的，术语“抗体”是指能够免疫特异性地结合期望抗原，例如α9整联蛋白，的抗体分子，并且涵盖完整抗体或其片段，包括抗原结合片段。
这里使用的术语“免疫特异性地识别”是指抗体或其抗原结合片段特异性地结合靶多肽或蛋白(尤其是人α9整联蛋白)的能力。这样的抗体不与其它多肽或蛋白非特异性结合。然而，免疫特异性结合靶多肽或蛋白(例如人α9整联蛋白)的抗体或其抗原结合片段可能和其它抗原交叉反应。例如，本发明可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段可能与例如鼠α9整联蛋白交叉反应。优选地，可免疫特异性地结合人α9整联蛋白的抗体或其抗原结合片段不与其它抗原交叉反应。
这里使用的术语“抗原结合片段”是指抗体的保留有免疫特异性结合靶多肽或蛋白(特别是人α9整联蛋白和/或小鼠α9整联蛋白)的能力的任意片段，包括单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、二硫键连接的Fvs，以及含有轻链(VL)可变区和/或重链(VH)可变区或者甚至互补决定区(CDR)的可以特异性结合靶多肽或蛋白的片段。因此，人源化抗体的这种抗原结合片段可以包含或者可以不包含部分或全长人类恒定区。各种用于获得上述抗体片段的方法在本领域是众所周知的。
这里使用的术语“衍生自人类来源”或“衍生自非人类来源”是指这样的抗体部分，其氨基酸序列衍生自人类抗体或非人类抗体的相应部分。
这里使用的术语“受体序列”是指来自人类抗体的VH或VL区的框架区的核苷酸或氨基酸序列，所述框架区充当来自供体抗体(通常是非人类抗体)的CDR的受体。
                        4.附图简述
图1显示了小鼠24I11 VH cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)和推导氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。氨基酸残基用单字母编码显示。信号肽序列(SEQID NO：10)用斜体标记。成熟VH的N端氨基酸残基(E)用双下划线标记。根据Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interests，Fifth edition，NIH Publication No.91-3242，U.S.Department of Health and Human Services，1991)定义的CDR序列用下划线标记。
图2显示了小鼠24I11 VL cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。氨基酸残基用单字母编码显示。信号肽序列(SEQ ID NO：17)用斜体标记。成熟VL的N端氨基酸残基(D)用双下划线标记。根据Kabat等(1991)定义的CDR序列用下划线标记。
图3显示了两侧有SpeI和HindIII位点(下划线)的设计的24I11 VH基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：72)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。氨基酸残基用单字母编码显示。信号肽序列(SEQ ID NO：10)用斜体标记。成熟VH的N端氨基酸残基(E)用双下划线标记。根据Kabat等(1991)定义的CDR序列用下划线标记。内含子序列用斜体标记。
图4显示了两侧有NheI和EcoRI位点(下划线)的设计的24I11 VL基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：73)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。氨基酸残基用单字母编码显示。信号肽序列(SEQ ID NO：17)用斜体标记。成熟VL的N端氨基酸残基(D)用双下划线标记。根据Kabat等(1991)定义的CDR序列用下划线标记。内含子序列用斜体标记。
图5显示了pCh24I11和pHu24I11(统称“表达载体”)的结构示意图。从顶部的SalI位点出发顺时针方向，质粒包含以人类巨细胞病毒(CMV)主立即早期启动子(major immediate early promoter)和增强子(CMV启动子)的重链转录单位，用于起始抗体重链基因的转录。CMV启动子后面是VH外显子，一段含有人类γ1重链恒定区的基因组序列，其包括CH1、铰链、CH2和CH3外显子以及间插的内含子，和一个位于CH3后面的、用于mRNA加工的γ-1基因多聚腺苷酸位点。在重链基因序列之后，轻链转录单位从CMV启动子开始，随后是VL外显子和一段含有人κ链恒定区外显子(CL)及其前面的部分内含子的基因组序列，和κ基因的多聚A信号。轻链基因的后面是SV40早期启动子(SV40启动子)、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt)和一个含有SV40多聚腺苷酸位点(SV40 poly(A)位点)的区段。最后，质粒含有质粒pUC19的一部分，包括细菌复制起点(pUC ori)和β内酰胺酶基因(β内酰胺酶)。
图6显示了24I11 VH(SEQ ID NO：9)、人源化24I11(Hu24I11)VH(SEQID NO：29)和人类受体序列FRH1(SEQ ID NO：19)、FRH2(SEQ ID NO：20)、FRH3(SEQ ID NO：21)和FRH4(SEQ ID NO：22)的氨基酸序列比对，这些序列衍生自由GenBank登录号No.X65891的核苷酸序列编码的氨基酸序列。氨基酸残基用单字母编码显示。序列上方的数字表示根据Kabat等(1991)的位置。由Kabat等(1991)定义的CDR序列用下划线标记。双下划线标记的残基被预测与CDR接触，并且在人源化形式中在这些位置上保留小鼠残基。图中省略了X65891中的CDR残基。
图7显示了24I11 VL(SEQ ID NO：16)、人源化24I11 VL(SEQ ID NO：16)和人类受体序列FRL1(SEQ ID NO：24)，FRL2(SEQ ID NO：25)，FRL3(SEQID NO：26)和FRL4(SEQ ID NO：27)的氨基酸序列比对，这些序列衍生自由GenBank登录号No.X72441的核苷酸序列编码的氨基酸序列。氨基酸残基用单字母编码显示。序列上方的数字表示根据Kabat等(1991)的位置。由Kabat等(1991)定义的CDR序列用下划线标记。双下划线标记的残基被预测与CDR接触，并且在人源化形式中在这些位置上保留小鼠残基。图中省略了X72441中的CDR残基。
图8显示了用于构建Hu24I11 VH基因的寡核苷酸。
图9显示了用于构建Hu24I11 VL基因的寡核苷酸。
图10显示了用于构建两侧有SpeI和HindIII位点的Hu24I11 VH基因(SEQ ID NO：74在5’端有5’-GGG尾巴，在3’端有CCC-3’尾巴)的寡核苷酸。箭头指示每条寡核苷酸的位置和方向(5’到3’)。信号肽(SEQ ID NO：10)和VH区(SEQ ID NO：29)的氨基酸残基用单字母编码显示。
图11显示了用于构建两侧有NheI和EcoRI位点(SEQ ID NO：75在5’端有5’-GGG尾巴，在3’端有CCC-3’尾巴)的Hu24I11 VL基因的寡核苷酸。箭头指示每条寡核苷酸的位置和方向(5’到3’)。信号肽(SEQ ID NO：17)和VL区(SEQ ID NO：31)的氨基酸残基用单字母编码显示。
图12显示了两侧有SpeI和HindIII位点(下划线)的Hu24I11 VH基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：74)，以及信号肽(SEQ ID NO：10；斜体显示)和VH区(SEQ ID NO：29)的推导氨基酸序列。氨基酸残基用单字母编码显示。成熟VH的N端氨基酸残基(Q)用双下划线标记。根据Kabat等(1991)定义的CDR序列用下划线标记。内含子序列用斜体标记。
图13显示了两侧有NheI和EcoRI位点(下划线)的Hu24I11 VL基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：75)，以及信号肽(SEQ ID NO：17；斜体显示)和VL区(SEQ ID NO：31)的推导氨基酸序列。氨基酸残基用单字母编码显示。成熟VL的N端氨基酸残基(D)用双下划线标记。根据Kabat等(1991)定义的CDR序列用下划线标记。内含子序列用斜体标记。
图14显示了嵌合24I11抗体和人源化24I11抗体与人α9整联蛋白亲和性之间的比较。通过细胞ELISA考察了1和0.5μg/ml的嵌合和人源化24I11与CHO/α9细胞的结合。实验重复进行三次。图中显示了平均吸光度值和SEM。
图15显示了小鼠、嵌合和人源化24I11抗体与人α9整联蛋白结合的FACS分析结果。测试每种抗体在1，0.33，0.11，0.037和0.012μg/ml下与CHO/huα9细胞的结合。该图中，以几何平均通道荧光值(MCF；Y轴)在被测的每种抗体浓度(X轴)作图。
图16显示了抗人α9整联蛋白抗体对人α9/CHO-K1细胞与hOPN(RAA)N-half、生腱蛋白-C、VCAM-1或人纤连蛋白之间细胞粘附抑制活性的结果。
图17显示了在抗人整联蛋白α4抗体的存在下，抗人α9整联蛋白抗体对人黑素瘤细胞的细胞粘附抑制作用的结果。
图18显示了抗整联蛋白α4抗体和抗α9整联蛋白抗体对肝炎的治疗效果。在图中，NHG指示正常仓鼠抗体，NRG指示正常大鼠抗体。
图19显示B16-BL6细胞的生长被抗α9整联蛋白抗体抑制。
图20显示了使用抗人α9整联蛋白抗体对人α9/CHO-K1细胞(图20a)、人α4/CHO-K1(图20b)和人嗜中性粒细胞(图20c)的FACS分析结果。
图21显示了在使用固定的VCAM-1作为ECM时，抗α9整联蛋白抗体对B16-BL6细胞生长的抑制。
图22显示了抗α9整联蛋白抗体在小鼠类风湿性关节炎模型中的治疗作用。
                            5.发明详细说明
5.1 针对人α9整联蛋白的抗体的制备
可以免疫特异性地识别人α9整联蛋白或其任何表位的抗体可以通过任何合适的本领域已知方法来产生。
在本发明中用作抗原的α9整联蛋白可以是(1)衍生自所有表达α9整联蛋白的人类细胞或所有存在这些细胞的组织的蛋白质；(2)α9整联蛋白编码基因DNA(优选地cDNA)被转染进入细菌、酵母、细胞系包括动物细胞系等并表达而得的重组蛋白质；或(3)合成蛋白质。
α9整联蛋白包括包含与人α9整联蛋白(SEQ ID NO：76，其中残基1-29是信号肽)的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多肽。
这里，术语“包含基本上相同氨基酸序列的多肽”是指这样的变体多肽，其包含这样的氨基酸序列，其中有多个氨基酸，优选地1-10个氨基酸，更优选地，1个至数个(例如1-5)氨基酸被替换、删除和/或修饰，只要这些变异体多肽仍具有与天然存在的人α9整联蛋白基本上等价的生物学性质；以及这样的变体多肽，其包含这样的氨基酸序列，其中有多个氨基酸，优选地1-10个氨基酸，更优选地，1个至数个(例如1-5个)氨基酸被添加到天然存在的人α9整联蛋白的氨基酸序列。而且，变体多肽可以是具有多个这样的氨基酸替换、删除、修饰和添加的多肽。
作为本发明抗原的人α9整联蛋白可以通过本领域众所周知的方法加以产生，除了基因重组技术之外，还可以使用例如化学合成方法、细胞培养方法等，或者它们的修改形式。
用于产生变体多肽的方法实例包括合成寡核苷酸定点突变(缺口双链体法(gapped duplex method))、涉及通过用亚硝酸盐或亚硫酸盐处理随机引入点突变的点突变方法、涉及用Bal31酶或其它酶制备删除突变体的方法、盒式诱变、接头扫描法、错误掺入法(miss incorporation method)、错配引物法、DNA区段合成法等。
在本发明中用作抗原的人α9整联蛋白还包括所述α9整联蛋白的“部分”。如这里所使用的，“部分”是指包含与α9整联蛋白配体(例如OPN、VCAM-1、生腱蛋白-C等)结合所需区域的部分；具体地说，包含成熟人α9整联蛋白(SEQ ID NO：76的第30-第1035个氨基酸残基)第14-第980个氨基酸残基的部分，和包含第11-第981个氨基酸残基的部分。所述α9整联蛋白的“部分”可以根据下文所述的本领域已知方法通过基因重组或化学合成或其修改形式来产生，或者可以通过用蛋白水解酶等适当地消化通过细胞培养方法分离的人α9整联蛋白来产生。
作为抗原，也可以使用在细胞膜或其膜级分上过表达α9整联蛋白的细胞本身。过表达人α9整联蛋白的细胞可以通过本领域众所周知的重组DNA技术加以制备。
使用如上所述制备的合适抗原，可以通过本领域众所周知的各种方法制备特异针对人α9整联蛋白或其任意表位的抗体。可以通过本领域众所周知的各种程序产生针对人α9整联蛋白的多克隆抗体。例如，可以将目的抗原施用于多种宿主动物，包括但不限于，家兔、小鼠、大鼠等，诱导含有抗原特异多克隆抗体的抗血清的产生。可以使用各种佐剂以提高免疫响应，这取决于宿主物种，包括但不限于，弗氏佐剂(完全或不完全)、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇类(pluronicpolyols)、聚阴离子、肽、油乳液、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚，和潜在可用于人类的佐剂，例如BCG(卡介苗)和短棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)。这些佐剂也是本领域众所周知的。
单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术加以制备，包括使用杂交瘤、重组、噬菌体展示技术或其组合。例如，单克隆抗体可以用杂交瘤技术产生，所述杂交瘤技术包括本领域已知的和例如下列文献中教导的：Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2nd ed.1988)；Hammerling等，Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas，pp.563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(本文通过提述并入两篇文献的全部内容)。这里使用的术语“单克隆抗体”不仅限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指衍生自单个克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，的抗体，并不指产生它们的方法。
用杂交瘤技术产生和筛选特异抗体的方法是常规的并且是本领域众所周知的。在一个非限制性实例中，可以用感兴趣的抗原或表达这种抗原的细胞对小鼠进行免疫。一旦检测到免疫响应，例如在小鼠血清中检测到特异针对该抗原的抗体，即收集小鼠的脾脏并分离脾细胞。然后通过众所周知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞(例如P3U1，P3X63-Ag8，P3X63-Ag8-U1，P3NS1-Ag4，SP2/0-Ag14，P3X63-Ag8-653等)融合。通过有限稀释对杂交瘤进行筛选和克隆。然后通过本领域已知的方法对杂交瘤克隆进行测定，检测分泌能够结合该抗原的抗体的细胞。可以通过用阳性杂交瘤克隆对小鼠进行腹腔接种以产生腹水，其一般含有高水平的抗体。
识别特异表位的抗体片段可以通过已知技术加以产生。例如，Fab和F(ab’)2片段可以通过用酶，例如木瓜蛋白酶(用于产生Fab片段)或胃蛋白酶(用于产生F(ab’)2片段)，对免疫球蛋白分子进行蛋白酶切割加以产生。F(ab’)2片段含有完整的轻链和重链的可变区、CH1区和铰链区。
本发明的抗体或其抗原结合片段还可以通过任何本领域已知的用于合成抗体的方法来产生，特别是通过化学合成，或者优选地，通过重组表达技术产生。
编码抗体的核苷酸序列可以从本领域技术人员能够获得的任何信息来获得(即，从Genbank、文献或者通过常规克隆和序列分析)。如果含有编码特定抗体或其表位结合片段的核酸的克隆无法获得，但是该抗体分子或其表位结合片段的序列已知，则可以化学合成编码该免疫球蛋白的核酸，或者通过使用可与序列的5’端杂交的合成引物进行PCR扩增，从合适的来源[例如抗体cDNA文库，或者从任何表达该抗体的组织或细胞(例如被选择用于表达抗体的杂交瘤细胞)产生的cDNA文库或从其分离的核酸，优选为poly A+RNA]获得编码该免疫球蛋白的核酸，或者通过用特定针对特殊基因序列的寡核苷酸探针进行克隆，从编码该抗体的cDNA文库中鉴定出例如cDNA克隆。PCR产生的扩增核酸随后可通过任何本领域众所周知的方法克隆到可复制的克隆载体内。
5.2 重组抗体的制备
一旦确定了抗体的核苷酸序列，就可以用本领域众所周知的核苷酸序列操作方法对抗体的核苷酸序列进行操作，例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(见例如前文Sambrook等中描述的技术；和Ausubel等编，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY，本文通过提述并入其全部内容)，通过向抗体的表位结合域区域或任何可能提高或降低抗体生物学活性的抗体部分内引入例如氨基酸替换、删除、和/或插入，而产生具有不同氨基酸序列的抗体。
抗体的重组表达需要构建含有编码该抗体的核苷酸序列的表达载体。一旦获得了编码抗体分子或抗体的重链或轻链或其一部分的核苷酸序列，就可以通过使用如前面部分讨论的本领域众所周知的技术通过重组DNA技术产生用于产生抗体分子的载体。本领域技术人员众所周知的方法可以用于构建含有抗体编码序列和合适转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。可以将编码重链可变区、轻链可变区、重链和轻链可变区、重链和/或轻链可变区表位结合片段、或抗体的一个或多个互补决定区(CDR)的核苷酸序列克隆到这样的载体内，用于表达。可以使这样的序列和编码原始抗体的天然信号肽或异源信号肽的多核苷酸融合。然后可以将这样制备的表达载体引入到合适的宿主细胞内，用于表达该抗体。因此，本发明包括含有编码可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人源化抗体或其抗体结合片段的多核苷酸的宿主细胞。
可以用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞，第一个载体编码衍生自重链的多肽，第二个载体编码衍生自轻链的多肽。两个载体可以含有相同的选择标记，以便同等(equal)表达重链和轻链多肽，或含有不同的选择标签，以确保维持这两种质粒。或者，可以使用编码并且能够表达重链和轻链多肽二者的单个载体。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
在另一个实施方案中，抗体还可以用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体域被展示在携带有它们的编码多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。在一个特定的实施方案中，这样的噬菌体可用于展示从全套或组合抗体文库(例如人或鼠)表达的抗原结合域，例如Fab和Fv或二硫键稳定化Fv。对于展示与感兴趣的抗原结合的抗原结合域的噬菌体，可以用抗原来选择或鉴定它们，例如使用标记抗原或结合或捕获于固体表面或珠子上的抗原。在这些方法中使用的噬菌体典型地为丝状噬菌体，包括fd和M13。抗原结合域被表达作为与噬菌体基因III或基因VIII蛋白融合的重组融合蛋白。可用于制造本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示方法的实例包括在如下文献中公开的方法：Brinkman etal.，J.Immunol.Methods，182：41-50，1995；Ames et al.，J.Immunol.Methods，184：177-186，1995；Kettleborough et al.，Eur.J.Immunol.，24：952-958，1994；Persic et al.，Gene，187：9-18，1997；Burton et al.，Advances in Immunology，57：191-280，1994；PCT申请No.PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利Nos.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108，本文通过提述并入上述所有文献的全部内容。
如在上述参考文献中介绍的，在噬菌体选择之后，可以从噬菌体分离出抗体编码区，并用它们产生完整抗体，包括人抗体，或者产生任何其它期望的片段，并在任何期望的宿主内表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、细菌，例如将在下文详细介绍的。例如，也可以采用重组产生Fab，Fab’和F(ab’)2片段的技术，其中可以使用本领域已知的方法，例如在下列文献中公开的方法：PCT公布WO 92/22324；Mullinax et al.，BioTechniques，12(6)：864-869，1992；和Sawai et al.，AJRI，34：26-34，1995；和Better et al.，Science，240：1041-1043，1988(本文通过提述并入上述所有文献的全部内容)。可以用于产生单链Fvs和抗体的技术的实例包括在下列文献中介绍的技术：美国专利Nos.4,946,778和5,258,498；Huston et al.，Methods in Enzymology，203：46-88，1991；Shu et al.，PNAS，90：7995-7999，1993；和Skerra et al.，Science，240：1038-1040，1988。
一旦通过上述任何方法产生了本发明的抗体分子，就可以用任何本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的方法加以纯化，例如通过色谱(例如离子交换色谱、亲和色谱，特别是经蛋白A或蛋白G纯化后借助针对特定抗原的亲和性，和大小排阻柱色谱)、离心、差异溶解性、或任何其它用于纯化蛋白的常规技术。进一步，本发明的抗体或其片段可以和本文所述的或者本领域已知的异源多肽序列相融合以帮助纯化。
对于一些应用，包括抗体在人体内的体内使用和体外检测试验，可以优选地使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体和人源化抗体在下文5.3部分中有详细讨论。
在体外免疫测定、纯化方法(例如亲和色谱)以及体内治疗或诊断应用中，可以使用与其它化合物或异源多肽融合或偶联的抗体。见例如PCT公布WO 93/21232；EP 439,095；Naramura et al.，Immunol.Lett.，39：91-99，1994；美国专利5,474,981；Gillies et al.，PNAS，89：1428-1432，1992；和Fell et al.，J.Immunol.，146：2446-2452，1991，本文通过提述并入它们的全部内容。例如，抗体可以用已知方法或商业可得的试剂盒以多种方式加以标记(例如生物素标记、FITC标记、APC标记)。作为另一个实例，可以将抗体和可在体内提高抗体生物学效应的治疗性模块偶联。这些治疗性模块的实例包括另一种抗体，细胞生长抑制性或细胞杀伤性的细胞毒素，放射性元素，和/或其它治疗剂，包括抗炎剂、抗生素等。在本发明中，人源化抗人α9整联蛋白抗体可以和另一种抗体(例如抗α抗体)偶联(以便例如形成双特异性抗体)。作为另一个实例，本发明的人源化抗体可以用可检测的标志物(例如放射性元素)加以标记，用于体内诊断用途。
5.3 嵌合和人源化抗体
嵌合抗体是这样的分子，其中抗体的不同部分来源于不同的动物物种，例如抗体具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和衍生自人免疫球蛋白的恒定区。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。见例如Morrison，Science，229：1202，1985；Oi et al.，BioTechniques，4：214 1986；Gillies et al.，J.Immunol.Methods，125：191-202，1989；美国专利Nos.5,807,715；4,816,567；和4,816,397，本文通过提述并入其全部内容。
人源化抗体是这样的分子，其结合期望的抗原，并包含如下所述的可变区：该可变区含有一个或多个衍生自非人物种的互补决定区(CDR)和一个或多个衍生自人免疫球蛋白分子的框架区。典型的非人类抗体人源化方法已经在多种参考文献中有描述，例如Queen et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033和美国专利Nos.5,585,089和5,693,762；Riechmann etal.，Nature，332：323，1988；和Tsurushita et al.，Methods 36：69-83，2005，本文通过提述并入上述所有文献的全部内容。例如，Tsurushita等(2005，前文；下文称作“Tsurushita”)的参考文献提供了一种根据Queen等(1989，前文)最初开发的抗体-人源化方法改进的用于小鼠单克隆抗体人源化的实际且有指导性的方案。Tsurushita中公开的通用方案简述如下。
5.3.1.用于制备人源化抗体的通用方案
小鼠V基因克隆和测序
有多种方法可用于克隆编码目标小鼠单克隆抗体VH和VL区的cDNA。例如，使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences，CA)或GeneRacer试剂盒(Invitrogen，CA)的5’RACE(cDNA末端快速扩增)方法已经被普遍使用。根据靶单克隆抗体H链和L链的同种型可以制备用于5’RACE的基因特异引物，从而能够结合每条H链和L链可变区的直接下游。因此，5’RACE引物可以被设计成对小鼠的每个亚型(例如γ1，γ2a，γ2b或γ3)特异。或者，可以根据亚型间的共有或高度同源区设计用于所有亚型的通用引物。在Tsurushita中，公开了如下的5’RACE引物作为举例：
(i)5’-GCCAGTGGATAGACTGATGG-(SEQ ID NO：129)(用于克隆小鼠γ1，γ2a，γ2b和γ3H链)
(ii)5’-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-(SEQ ID NO：130)(用于克隆小鼠κ轻链)
PCR扩增的V基因片段可以被直接克隆到质粒载体内，例如使用ZeroBlunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)，并确定它们的DNA序列。对所得的序列应当加以确认，例如通过将其编码的氨基酸序列与目标单克隆抗体的氨基酸序列进行比较，该靶单克隆抗体的序列通过N端氨基酸测序来确定，例如通过使用Model 241蛋白测序仪(Hewlett-Packard，CA)。典型地，确定目标抗体N端的至少15-20个氨基酸残基，例如通过例如Edman降解，即足以确认所克隆的DNA序列的真实性。Tsurushita提醒，当N端氨基酸是谷氨酰胺-小鼠N端氨基酸最常见的两种氨基酸之一-时，它可能已被转换成焦谷氨酸(pyroglutamine)并可阻断N端测序。在这种情况下，必须将N端去阻断以获得序列。
V区的三维建模
首先，基于VH和VL区的序列，依照例如R.Levy et al.，1989，Biochemistry 28：7168-7175和B.Zilber et al.，1990，Biochemistry29：10032-10041介绍的方法，鉴定对于保持CDR构象结构具有潜在重要性的目标抗体框架残基。典型地，将每一个VH和VL区分成14个结构上有意义的区段，它们是包含免疫球蛋白超家族域结构的β折叠片和类环结构。在PDB数据库中，将每个来自目标抗体的区段的氨基酸序列与结构已知的抗体的相应区段进行比对(见H.M.Berman et al.，2000，Nucleic Acids Res.28：235-342)。通过多重序列比对，选择与每个目标区段具有最高序列同源性的相应区段，并构建V区的三维模型。为了使结构最优化，将模型进行多个循环的共轭梯度能量最小化(例如使用ENCAD，或如Press et al.，1990，“Numerical Recipes，Cambridge University Press，Cambridge所述；AMBER，如Weiner et al.，1981，J.Comp.Chem.2：287-303所述；3D-JIG-SAW，可在由Cancer Research UK运营的BioMolecularModelling或“BMM”网站访问；或SWISS-MODEL，可在由Swiss Institute of Bioinformatics，Geneva运营的ExPASy Proteomics Server网站访问)。
人框架的选择
与V区结构建模并行地，将分别依据小鼠VH和VL区cDNA克隆推导出的氨基酸序列与数据库中，例如Kabat数据库(见Johnson et al.，2000，Nucleic Acids Res.28：214-218.)、GenBank等，的人V区序列进行比较。与小鼠序列具有至少大约65％、至少大约70％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、或者至少大约95％整体同一性的人框架序列可以使用，例如，Smith-Waterman算法(Gusfield，1997，“Algorithms on Strings，Trees，andSequences”，Cambridge University Press，Cambridge)或BLAST(Karlin et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268)等来检索。这些人序列可以以基于cDNA的序列或者是蛋白质衍生序列为基础；然而，常常优选地使用胚系(germline)，因为胚系可有助于消除与基于cDNA的或蛋白质衍生的序列中的体细胞高度突变(somatic hypermutations)相关的潜在免疫原性。或者，如Queen等(1989，前文)中介绍的，使用共有框架序列也能够鉴定和除去从基于cDNA的或蛋白质衍生的序列获得的框架内的这些超突变残基。在使用胚系VH区段作为受体框架的情况下，应当使用14号染色体，而非15和16号染色体上编码的VH片段，因为只有14号染色体上的VH片段可产生有功能的VH区。
人源化V区的设计
根据Queen等(1989，前文)，必须鉴定CDR的大约4-6
Figure BPA00001182605700201
内的框架氨基酸，因为这些残基被认为是支持正确CDR结构的潜在的关键框架残基。这个过程可以用根据原子坐标计算原子间距离的计算机程序来实现，或者通过计算机模型进行人工检查来实现，所述计算机程序例如RASMOL，其可以在由National Science Foundation(NSF)支持的Molecular VisualizationFreeware网站访问。如果关键框架位置处的氨基酸在小鼠供体与人受体序列之间不同，则通常用小鼠供体的氨基酸代替人类残基。然而，如果这些残基对支持CDR结构的贡献极小，则通常使用相应的人类残基。另外，如果所选的人类受体含有“非典型”氨基酸，此类氨基酸在少于大约10-20％的V区序列中出现，则它们可能是在亲和力成熟期间发生了体细胞高度突变的结果，应当用供体残基代替它们，以避免人体内的潜在免疫原性。
此外，为了设计人源化的V区，还需要仔细考虑其它的因素，例如潜在N连接糖基化信号的残基(详见Tsurushita)。
取决于治疗用途所需要获得的或需要消除的效应物功能，人源化抗体可以含有衍生自人抗体的人κ或λ轻链和/或γ1、γ2、γ3、γ4、μ、α1、α2、δ，或ε重链的人类恒定区或其一部分，或其变异体。例如，含有突变的恒定区Fc部分可以和本发明嵌合或人源化抗体的可变区融合，从而减少抗体与Fc受体的结合，和/或减少其修复(fix)补体的能力(见例如Winter et al.，GB2,209,757 B；Morrison et al.，WO 89/07142，Morgan et al.，WO 94/29351)。这些抗体分子操作可以借助在5.2部分介绍的重组DNA技术来实施。
优选地，所得的嵌合或人源化抗体具有与非人类供体抗体相同的特异性，并具有与非人类供体抗体相似的或者至少为其大约1/3、至少大约1/2、或至少大约2/3的亲和力。在另一方面中，所得的嵌合或人源化抗体的亲和力常数为至少大约1x107M-1，优选地至少大约1x108M-1，并且最优选地至少大约1x109M-1。
除了上述的通用方案之外，抗体可以用本领域已知的多种技术进行人源化，包括例如CDR移植(EP 239,400；PCT公布WO 91/09967；美国专利Nos.5,225,539；5,530,101和5,585,089)，饰面或表面重修(EP 592,106；EP519,596；Padlan，Molecular Immunology，28(4/5)：489-498，1991；Studnicka etal.，Protein Engineering，7(6)：805-814，1994；Roguska et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA，91：969-973，1994)，和链改组(chain shuffling)(美国专利No.5,565,332)，本文通过提述并入这些文献的全部内容。
5.3.2 用于制备人源化抗体作为药物的其它考虑
为了提供用作药物的人源化抗体，需要为其准备一个高效、持续的产生系统。例如，通过插入H和L链序列来制备用于人源化抗体的合适表达载体，并且可以获得用该表达载体转染的高产率细胞系作为主细胞库(master cell bank MCB)的种子细胞，其充当工作细胞库(working cell bank，WCB)的稳定和半永久性来源。然后，可通过培养来自WCB的工作细胞并收集培养基来制备人源化抗体。
多种具有合适调节基因的表达载体均可用于制备这种生产细胞系。作为宿主细胞，可以使用常用于表达哺乳动物蛋白质的细胞来表达人源化抗体。这些宿主细胞的实例包括，但不限于，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、SP2/0-Ag14.19细胞、NSO细胞等。可以通过选择表达载体与宿主细胞的最佳组合使人源化抗体的生产率最大化。而且，应当探索培养基的组成，以便从各种无血清培养基和补充物中选择合适的介质，使宿主细胞的人源化抗体表达得以最优化。
根据效率和最终的产率，可以用本领域众所周知的各种方法从培养上清纯化由宿主细胞产生的人源化抗体，包括亲和色谱、离子交换色谱、疏水互作色谱等。
5.4 药物组合物和治疗用途
本发明提供了一种药物组合物，其包含如上所述的可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人源化抗体或其抗体结合片段。包含本发明人源化抗体作为活性成分的药物组合物可用作预防和/或治疗与α9整联蛋白有关的疾病或病症的药剂，所述疾病或病症包括但不限于，癌症，例如癌细胞的生长和转移，和炎症性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、癌症转移、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、自身免疫性疾病等。
包含本发明人源化抗体的药物组合物还可用于治疗器官移植后的慢性排斥，和自身免疫性疾病，例如全身性自身免疫性疾病、红斑狼疮、葡萄膜炎、白赛氏病(Behcet’s disease)、多肌炎、增生性肾小球肾炎、结节病等。
包含本发明人源化抗体的用于预防或治疗上述疾病或病症的预防和/或治疗剂，具有低毒性，通过与合适的溶剂混合直接作为液体制备物，或者作为呈合适剂型的药物组合物，能够经口或肠胃外施用给人类。
用于上述施用的药物组合物含有前述抗体或其盐，以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。这种组合物以适于口服或胃肠外施用的剂型提供。
剂量可以根据待施用的受试者的年龄、体格、目标疾病、状况、施用途径等而改变。当抗体用于预防和/或治疗例如成年患者的类风湿性关节炎时，有利的是通过静脉内施用本发明抗体，通常为单个剂量大约0.01-大约20mg/kg体重，优选地大约0.1-大约10mg/kg体重，更优选地大约0.1-大约5mg/kg体重，每天大约1-5次，优选地大约每天1-3次。在其它胃肠外施用和口服施用中，抗体可以按照相应于上面给定剂量的剂量施用。当状况特别严重时，剂量可以根据状况而增加。
各种输送系统是已知的，并可用于施用本发明的药物组合物，例如包裹在脂质体、微颗粒、微胶囊内，能够表达突变病毒的重组细胞，受体介导的内吞(见例如Wu and Wu，1987，J.Biol.Chem.262：44294432)。导入的方法包括，但不仅限于，皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。化合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮细胞或黏膜衬里(例如口腔黏膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并可以和其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。也可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器并与气溶胶化剂配方。
在一个具体实施方案中，可能希望将本发明的药物组合物局部施用于需要治疗的区域；这可以通过包括但不限于下述的方法实现：手术期间的局部灌注、局部施加(topical application)，例如与手术后的创口包扎一起进行，通过注射、通过导管、通过栓剂、通过鼻喷雾、或通过植入体，所述植入体是有孔、无孔或胶状材料，包括膜，例如sialastic膜，或纤维。在一个实施方案中，施用可以是通过在被感染组织部位(或之前部位)直接注射。
在另一个实施方案中，药物组合物可以用在囊泡，特别是脂质体中投递(见Langer，1990，Science 249：1527-1533；Treat et al.，in Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，上文，pp.317-327；通见上文)。
在另外一个实施方案中，药物组合物可以用控释系统投递。在一个实施方案中，可以使用泵(见Langer，前文；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald et al.，1980，Surgery 88：507；和Saudek et al.，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(见Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug ProductDesign and Performance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；seealso Levy et al.，1985，Science 228：190；During et al.，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard et al.，1989，J.Neurosurg.71：105)。在另外一个实施方案中，可以将控释系统置于组合物的目标的附近，这样就仅需要全身剂量的一部分(见例如Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，前文，vol.2，pp.115-138(1984))。其它的控释系统在Langer(Science 249：1527-1533(1990))的综述中有讨论。
用于口服给药的组合物实例包括固体或液体剂型，具体地，药片(包括糖衣和薄膜包衣的药片)、药丸、颗粒、粉末制备物、胶囊(包括软胶囊)、糖浆、乳剂、悬浮液等。这种组合物通过公知的方法制造，并包含在药物制备领域中通常使用的载体、稀释剂或赋形剂中。用于药片的载体或赋形剂实例有乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。
可注射的制备物可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、点滴注射等的剂型。这些可注射制备物可以通过公知的方法制备。可注射制备物可以通过例如将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水介质或油介质内加以制备。用于注射的水介质有例如生理盐水、含有葡萄糖和其它助剂的等渗溶液等，其可以与合适的增溶剂联合使用，例如醇(例如乙醇)、多元醇(polyalcohol)(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨醇80(polysorbate 80)，HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。作为油介质，可以采用例如芝麻油、大豆油等，它们可以与增溶剂联合使用，例如苯甲酸苄酯、苯甲醇等。这样制备的注射剂优选地填充在合适的安瓿小瓶内。用于直肠给药的栓剂可以通过将前述抗体或其盐与常规的栓剂基质混合加以制备。
有利地，上述用于经口或胃肠外使用的药物组合物被制备成与活性成分的某个剂量相符合的单位剂量剂型(dosage forms in a unit dose)。这类单位剂量剂型包括例如片剂、药丸、胶囊、注射剂(安瓿小瓶)、栓剂等。所含的前述抗体的量一般为每个单位剂量剂型大约5-500mg；特别地，在注射剂型中，优选地含有大约5-100mg前述抗体，对于其它剂型，为大约10-250mg。
上述的每种组合物可以进一步包含其它的活性化合物，除非配方会导致与上述抗体发生任何不良相互作用。
本发明还涉及细胞和/或组织重塑的抑制剂和/或促进剂，其包括α9整联蛋白结合性功能分子(例如OPN、VCAM-1、生腱蛋白-C、纤连蛋白、pp-vWF、tTG等)作为活性成分；并涉及用于抑制和/或促进细胞和/或组织重塑的方法，其包括使表达α9整联蛋白的细胞和/或组织(例如肿瘤细胞、嗜中性粒细胞、平滑肌等)与α9整联蛋白结合性功能分子接触。在这种治疗剂中活性成分的剂量、给药方法、药物制备等可以参考前述包含本发明的人源化抗体的药物的说明合适地加以确定。
如上所述，本发明进一步提供了用于预防或治疗涉及α9整联蛋白或与α9整联蛋白有关的疾病或病症的方法，所述方法包括向需要的受试者施用有效量的至少一种本发明人源化抗体。
5.5 诊断用途
包含本发明人源化抗体的药物组合物可以用作如下疾病的诊断剂：癌症，例如癌细胞的生长和转移，和炎症性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、癌症转移、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿等，或作为下述疾病的诊断剂：器官移植后慢性排斥，自身免疫性疾病，例如全身性自身免疫性疾病、红斑狼疮、葡萄膜炎、白赛氏病、多肌炎、增生性肾小球肾炎、结节病等。本发明的人源化抗体能够特异识别α9整联蛋白，因此能够用于定量试液中的α9整联蛋白，特别是用于通过夹心式免疫测定、竞争性测定、免疫测量、浊度滴定法等、免疫染色等等的定量。在本发明的测试方法中应用这些免疫学方法时，不需要陈述任何特定的条件、程序等。通过在常规条件和程序的基础上加以本领域的普通技术上的考虑就足以构建测定系统。关于这些一般技术手段的细节，可以参考综述、教科书等。
如上所述，使用本发明的抗体可以高敏感度地定量α9整联蛋白。本发明的人源化抗体特别有用于通过应用体内定量α9整联蛋白的方法诊断各种与α9整联蛋白有关的疾病。例如，当检测到α9整联蛋白的表达水平增加或降低时，即可诊断某人很可能正患有与α9整联蛋白有关的疾病，例如癌症或炎症性疾病，或者某人很可能将来会患上这些疾病。因此，本发明还提供了用于诊断受试者涉及α9整联蛋白或与α9整联蛋白有关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的至少一种本发明人源化抗体或两种均施用。用于这种体内诊断的所需剂量可能少于治疗用途所需的剂量，并可以由本领域的技术人员根据常规程序加以确定。
本发明的人源化抗体还可用于特异性检测试液(例如体液、组织等)中存在的α9整联蛋白。所述人源化抗体还可用于制备纯化α9整联蛋白用的抗体柱、用于在纯化时检测每一组分中含有的α9整联蛋白、或用于分析整联蛋白α在测试细胞内的行为。
                            6.实施例
下面的实施例举例说明了可免疫特异性识别人和/或小鼠α9整联蛋白的单克隆抗体的制备，单克隆抗体可变区的测序，抗体的表位作图和其它表征，这些抗体的嵌合和人源化，以及所得的嵌合和人源化抗体的表征。这些实施例不应理解为限制性。
6.1 针对人α9整联蛋白的小鼠抗体的制备
针对人α9整联蛋白的小鼠单克隆抗体根据消减免疫法(Williams C.V.，etal.，1992，Biotechniques 12：842-847)加以制备。简而言之，三只Balb/c小鼠以4x106细胞/小鼠腹腔注射CHO-K1细胞。随后2天内，对小鼠环磷酰胺腹腔给药，剂量为4mg/小鼠。环磷酰胺注射后2周时，对小鼠进行腹腔注射表达人α9整联蛋白的CHO-K1细胞(人α9/CHO-K1细胞)，剂量为2x106细胞/小鼠。在2周后再用相同的细胞以3x106细胞/小鼠再进行一次腹腔注射。通过本领域众所周知的方法制备杂交瘤(见例如Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling，et al.，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas，pp.563-681(Elsevier，N.Y.，1981)。建立了产生与人α9/CHO-K1细胞免疫特异性反应，但不与表达人整联蛋白α4的CHO K1细胞反应的单克隆抗体的杂交瘤克隆，并分离了5个产生可免疫特异性识别人α9整联蛋白的单克隆抗体的杂交瘤克隆(即1K11，21C5，24I11，25B6和28S1)。
6.2 抗人α9整联蛋白单克隆抗体的表位分析
制备了多个12残基多肽，它们从人α9整联蛋白的N端及随后每隔3个残基开始(即氨基酸残基1-12，4-15，7-18，以此类推)，并以5nmol/点将它们藉由C6间隔臂和2βAla残基偶联到纤维素膜上。用封闭缓冲液(牛奶/0.05％Tween20溶于PBS)封闭膜，并使之与10ml如下所述的溶液在室温下反应3小时，该溶液含有1.0μg/ml用过氧化物酶标记的每种抗人α9整联蛋白单克隆抗体(即分别是1K11，21C5，24I11和25B6)。用T-TBS清洗后，使膜与增强化学发光(ECL)检测试剂在室温下反应1分钟。测量由于酶反应而发射的冷光，并根据发光强度确定抗体的表位。作为对照，使用Y9A2(见Wang et al.，1996，Am J Respir Cell Mol Biol 15，664-672)，一种商业可得的针对人α9整联蛋白的单克隆抗体。
下面的表1显示了表位作图的结果，表明本发明人分离的单克隆抗体具有与Y9A2迥异的表位。
表1
 人整联蛋白α9序列   1K11   21C5   24I11   25B6   Y9A2
 FQGPADSFFGYA(SEQ ID NO：77)   -   -   -   ++   -
 KSPGAVFKCRVHTNPDRR(SEQ ID NO：78)   ++   +++   ++++   -   +
 WMGVSLARQPKADGRVLA(SEQ ID NO：79)   +   +++   +   -   +
 CAHRWKNIYYEADHI(SEQ ID NO：80)   +   +   +++   +   +
 GFCYIIPSNLQAKGRTLI(SEQ ID NO：81)   +++   +++++   +++++   +++++   +++++
 VMGAPGSFYWAGTIKVLN(SEQ ID NO：82)   +   +   +   +++   +
 VIMNRRYTYLGYAVT(SEQ ID NO：83)   +++++   ++   +++++   +++++   +++
 VYIFRADRRSGTLIKIFQ(SEQ ID NO：84)   ++++   +++++   +++   -   +
 QYSMKLSGQKINPVLRMFGQSISG(SEQ ID NO：85)   +   ++++   -   -   +
 VVLLRARPVITVDVSIFL(SEQ ID NO：86)   ++   ++   -   -   +++++
 RHYVAHVKRRVQDVISPI(SEQ ID NO：87)   +++   +++   +++++   +   ++
 ELPPLTPVLRWKKGQKIAQKNQTVFERNCR(SEQ ID NO：88)   +   +++++   +   -   ++
 YLALGAVKNISL(SEQ ID NO：89)   +   +   -   ++   +++++
 CSVGFPFMRSKSKYEFSV(SEQ ID NO：90)   +   ++   ++   -   +++
 SSSVIQFMSRAKVKVDPALRV(SEQ ID NO：91)   +   ++   +++   -   +
6.3 抗人α9整联蛋白抗体的CDR分析
单克隆抗体(即1K11，21 C5，24I11，25B6和28S1)的CDR氨基酸序列通过将从相应杂交瘤提取的mRNA逆转录制备cDNA来加以确定。使用这些cDNA作为模板，使用ScFv克隆引物(Light Primer Mix和Heavy PrimerMix；Amersham Biosciences Corp.，IL生产)通过PCR对H链和L链的可变区进行延伸和扩增。将PCR产物克隆到pCRII TOPO载体内，测序并确定氨基酸序列。每种抗体该过程重复3次。结果如表2所示。
Figure BPA00001182605700281
6.4 细胞粘附抑制活性
(1)因为已知细胞粘附涉及α9整联蛋白与其配体，即各种ECM，包括OPN、纤连蛋白、生腱蛋白-C、VCAM-1等，的结合，所以对分离的抗人α9整联蛋白抗体的细胞粘附抑制活性进行了检查。
简而言之，通过从大肠杆菌宿主细胞分离N端以下至OPN凝血酶切割位点为止的部分，制备了与谷胱甘肽S转移酶(GST)形成融合蛋白的hOPN(RAA)N-half，其中GRD序列已被RAA序列替换；并用Precision蛋白酶(Amersham Biosciences)切去GST部分。VCAM-1从R&D Systems，Inc.(Minneapolis，MN)购买。生腱蛋白-C和人纤连蛋白通过分别合成含有AEIDGIEL(SEQ ID NO：92)的多肽；生腱蛋白-C的α9整联蛋白结合区和CPEDGIHELFP(SEQ ID NO：93)；人纤连蛋白的α9整联蛋白结合区)，随后将它们附接于牛血清白蛋白(BSA)上来加以制备。对于人α9整联蛋白，使用大量表达人α9整联蛋白的CHO-KO细胞(人α9/CHO-K1)。
将50微升生腱蛋白-C、纤连蛋白、VCAM-1或hOPN(RAA)N-half以1.25-5.0μg/ml添加到96孔板中，并在37℃温育1小时以包被平板。用封闭液(0.5％BSA/PBS)封闭平板后，用PBS清洗一次，然后向平板添加人α9/CHO-K1细胞(1.0x105细胞/ml)并以200μl/孔添加溶解于0.25％BSA-最小基本培养基(MEM)中的分离单克隆抗体(10g/ml)，并在5％CO2下37℃温育1小时。用PBS洗去未粘附细胞，固定粘附的细胞并用0.5％结晶紫(WAKO，Osaka，Japan)/20％甲醇进行染色。将经染色的细胞在室温下保持30分钟，并向其添加20％乙酸以使之分散(dissolution)。通过测量590nm波长下的OD对粘附活性进行定量。
如图16所示，涉及生腱蛋白-C的细胞粘附被21C5，24I11，25B6和28S1抑制，但不被1K11抑制。涉及纤连蛋白的细胞粘附被21C5，25B6和28S1抑制，并被24I11抑制(程度低一些)，但不被1K11抑制。涉及VICAM-1的细胞粘附被21C5，24I11，25B6和28S1抑制，但不被1K11抑制。相似地，涉及hOPN(RAA)N-half的细胞粘附被21C5，24I11，25B6和28S1抑制，但不被1K11抑制。
(2)因为整联蛋白α4与α9整联蛋白具有许多共同的ECM配体，故而预期抗整联蛋白α4和抗α9整联蛋白抗体的共存可提高细胞粘附抑制活性。因此，对两种类型抗体的组合效果进行体外检验，基于表达整联蛋白α4和α9整联蛋白的人黑素瘤细胞(G361)的细胞粘附考察抗体组合对转移癌的可能抑制效果，以VCAM-1(1.25μg/ml)为ECM，使用大鼠单克隆抗体P1H4(Cat.No.MAB 16983Z，Chemicon InternationalInc.，CA)作为抗人整联蛋白α4抗体。
如图17所示，涉及VCAM-1的粘附不被单独任何一种抗人α9整联蛋白抗体抑制，但在抗人整联蛋白α4抗体的共同存在下，可以被阳性对照(Y9A2)、21C5和24I11抑制。由于表达多种α9整联蛋白分子的细胞通常也表达整联蛋白α4分子，所以这个结果提示，通过组合使用抗人α9整联蛋白抗体和抗人整联蛋白α4抗体，可有效实现对细胞粘附的抑制，藉此增强对各种病症和疾病，包括涉及这些整联蛋白分子的转移癌，的抑制。
6.5 抗人α9整联蛋白抗体在FACS分析中的应用
使用内源表达α9整联蛋白的人α9/CHO-K1细胞、CHO-K1细胞和人嗜中性粒细胞检查抗人α9整联蛋白抗体是否可用于FACS。在人嗜中性粒细胞中，FACS分析在细胞计数为1.0x105的条件进行，且抗体在冰上反应。用50％山羊血清封闭与Fc受体的非特异性反应。使用FITC标记的抗小鼠IgG抗体作为第二抗体。结果(见图20a，20b和20c)，所有抗人α9整联蛋白抗体均可检测到人α9/CHO-K1和人嗜中性粒细胞上的α9整联蛋白。所有抗体均不与人α4/CHO-K1细胞反应(见图20a，20b和20c)。这些结果显示，所有的抗人α9整联蛋白抗体均可用FACS检测在细胞上表达的人α9整联蛋白。
6.6 抗α9整联蛋白抗体的治疗效果
在小鼠系统中考察抗α9整联蛋白的治疗效果。
制备了抗小鼠α9整联蛋白抗体(11L2B，12C4’58，18R18D和55A2C)，方法与制备小鼠抗人α9整联蛋白抗体的方法(见前文6.1部分)基本上相同，只是仓鼠用表达小鼠α9整联蛋白的CHO-K1细胞(小鼠α9/CHO-K1细胞)进行免疫，并且选择所得的与小鼠α9/NIH3T3细胞反应但不与小鼠α4/NIH3T3细胞反应的单克隆抗体。
6.6.1 对肝炎的治疗效果
WO 02/081522公开，抑制OPN功能可以治疗肝炎。因此，在小鼠肝炎模型中使用仓鼠抗小鼠α9整联蛋白抗体11L2B和大鼠抗小鼠整联蛋白α4抗体R1-2(Pharmingen)对抗α9整联蛋白抗体的治疗效果进行了研究。静脉内注射200μg伴刀豆球蛋白A(Con A)(Vector)12小时后，用GPT/ALT-PIII和GOT/AST-PIII(Fuji Film)对小鼠血液的AST和ALT水平进行测量。Con A注射前3个小时，施用200μg抗体。如图18所示，发现AST和ALT水平被抗α9整联蛋白抗体降低，可以见到治疗效果。此外，同时使用抗整联蛋白α4抗体可以提高治疗效果。这些结果表明，抗α9整联蛋白抗体可以治疗肝炎。
6.6.2 抗α9整联蛋白抗体对小鼠癌细胞系生长的影响
鼠黑素瘤细胞系B16-BL6大量表达α9整联蛋白。因此，对于已建立的抗小鼠α9整联蛋白抗体，考察了它们抑制癌细胞生长的活性。
在细胞培养用96孔板(Becton Dickinson)上准备B16-BL6细胞，10％FCS/DMEM中5x104细胞/mL。添加10μg/ml抗小鼠α9整联蛋白抗体和抗小鼠整联蛋白α4抗体之后，向每个孔添加100μL细胞-抗体悬浮液。在5％CO2下37℃温育24小时，并添加每孔10μL Cell Counting Kit 8(DojinKagaku Kenkyu-sho)，随后在5％CO2下37℃温育1小时。测量O.D.450吸光值，并对细胞计数进行定量分析。如图19所示，12C4′58给出最高的抑制活性，对B16-BL6细胞生长的抑制为大约35％。55A2C和R1-2均可抑制生长达大约20％。
接下来，为了在接近体内条件下分析对细胞生长的抑制效果，将VCAM-1固定在固相上，并类似地进行测定。VCAM-1是α9整联蛋白的配体；使用了一种重组可溶形式的VCAM-1蛋白：rhVCAM-1-Fc嵌合体(Roche)。使用10μg/mL的固定在固相上的rhVCAM-1-Fc嵌合体，用0.5％BSA/PBS封闭非特异性反应。在抗体单独使用时，嵌合体的添加浓度为10μg/ml，在共同使用抗体时，添加浓度为各5μg/ml。之后，遵循与图19相同的程序。结果，单独施用12C4′58和单独使用α4抑制抗体克隆R1-2根本未获得效果或者仅获得微弱的效果，而在同时施用12C4′58和R1-2时，细胞生长抑制效果显示了大约20％的显著增加，如图21所示。
6.6.3 抗α9整联蛋白抗体在小鼠类风湿性关节炎模型中的治疗效果
用仓鼠抗小鼠α9整联蛋白抗体(55A2C)或正常仓鼠IgG(NHG)以400μg/小鼠腹腔内注射7周龄雌性小鼠(Balb/c)(每组3只)。24小时后，以2mg/小鼠静脉内注射II型胶原特异性单克隆抗体关节炎诱导鸡尾酒(ChondrexInc.)。72小时后，腹腔内注射400μg/小鼠的55A2C或NHG以及50μg/小鼠的LPS。从LPS注射前3天到LPS注射后6天对小鼠进行观察，根据Wood等人(1969，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.35：456)的方法对关节炎水平进行打分。结果如图22所示。注射对照NHG的小鼠具有高分值，并发生了类风湿性关节炎，而在注射了抗小鼠α9整联蛋白抗体的小鼠体内，类风湿性关节炎的发生被完全阻断。因此，表明抗α9整联蛋白抗体对类风湿性关节炎具有预防和治疗效果。
6.7 非人抗体的人源化
6.7.1 小鼠24I11 V基因的克隆和测序
小鼠24I11杂交瘤细胞在含有10％胎牛血清(FBS；HyClone，Logan，UT)的TIL培养基I(Immuno-Biological Laboratories，Gunma，Japan)中在7.5％CO2培养箱内37℃生长。使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)按照供应商的方案从大约3x106个杂交瘤细胞提取总RNA。使用GeneRacer试剂盒(Invitrogen)按照供应商的规程合成以寡dT为引物的cDNA。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增24I11重链和轻链的可变区cDNA，其中使用PhusionDNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)、分别对小鼠γ1-和κ链恒定区退火的引物、以及GeneRacer试剂盒提供的GeneRacer 5′引物(5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-)(SEQ ID NO：94)。对于重链可变区(VH)的PCR扩增，引物序列为5′-GCCAGTGGATAGACAGATGG-(SEQ IDNO：95)。对于轻链可变区(VL)的PCR扩增，引物序列为5′-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-(SEQ ID NO：96)。将扩增的VH和VLcDNA亚克隆到pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen)内，用于确定序列。在Tocore(Menlo Park，CA)进行可变区DNA测序。对多条重链和轻链克隆测序，鉴定了与典型小鼠重链和轻链可变区同源的独特序列。图1和2分别显示了共有cDNA序列以及推导的氨基酸序列。
6.7.2 嵌合24I11IgG1/κ抗体的构建
通过PCR生成了呈包括剪接供体信号和合适的侧翼限制酶位点的外显子形式的编码24I11 VH的基因，所述PCR用24I11 VH cDNA作为模板，5’-GGGACTAGTACCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTC-(SEQ IDNO：97)(SpeI位点用下划线标记)作为5’引物，5’-GGGAAGCTTAGAGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC-(SEQ ID NO：98)(HindIII位点用下划线标记)作为3’引物(图3)。相似地，通过PCR生成了呈包括剪接供体信号和合适侧翼限制酶位点的外显子形式的编码24I11 VL的基因，PCR以24I11 VL cDNA为模板，5’-GGGGCTAGCACCACCATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTG-(SEQ IDNO：99)(NheI位点用下划线标记)为5’引物，5’-GGGGAATTCTGAGAAGACTACTTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC-(SEQ ID NO：100)(EcoRI位点用下划线标记)为3’引物(图4)。24I11 VH和VL外显子的剪接供体信号分别衍生自小鼠胚系JH4和Jκ2序列。PCR扩增片段用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行凝胶纯化，用SpeI和HindIII(用于VH)或NheI和EcoRI(用于VL)消化，并克隆到带有人γ-1和κ恒定区的哺乳动物表达载体内，用于产生嵌合24I11 IgG1/κ抗体。图5显示了所得的表达载体pCh24I11的结构示意图。
6.7.3 人源化24I11基因的产生
24I11可变区的人源化按照Queen等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033，1989)概述的方法进行。首先，在计算机程序的帮助下构建24I11可变区的分子模型。接着，基于面向人可变区序列的同源性搜索，选择了由GenBank登录号No.X65891核苷酸序列编码的人氨基酸序列作为受体来提供人源化24I11 VH的框架，其中X65891与24I11 VH具有高度同源性[FRH中的氨基酸同一性为74.2％(63/87)]。相似地，选择由GenBank登录号No.X72441[FRH中的氨基酸同一性为77.5％(62/80)]的核苷酸序列编码的人氨基酸序列作为受体，用于人源化24I11 VL。
在计算机模型提示与互补决定区(CDR)有显著接触的框架位置上，用来自24I11可变区的氨基酸代替人框架氨基酸。这在位置27、28、29、30、48、66、67和71上进行(根据Kabat编码系统；见Kabat et al.，Sequences ofProteins of Immunological Interests，Fifth edition，NIH Publication No.91-3242，U.S.Department of Health and Human Services，1991)，从而产生人源化24I11(Hu24I11)VH(图6)。对于轻链，在残基70和71进行替换，以产生人源化24I11(Hu24I11)VL(图7)。图6和图7分别显示了VH和VL的24I11、设计的Hu24I11和人受体氨基酸序列的比对结果。
将编码每一个Hu24I11 VH和VL的基因设计为这样的外显子，其包含信号肽、剪接供体信号、和用于后续克隆到哺乳动物表达载体内的合适的限制酶位点。Hu24I11 VH和VL外显子的剪接供体信号分别来自人胚系JH4和Jκ1序列。Hu24I11 VH和VL外显子内的信号肽序列分别衍生自相应的小鼠Hu24I11 VH和VL序列。使用ThermalAce DNA聚合酶(Invitrogen)，通过多个重叠合成寡核苷酸引物的延伸和PCR扩增，构建了Hu24I11 VH和VL基因，如He等(J.Immunol.160：1029-1035，1998)所概述的那样。图8和9分别列举了用于构建Hu24I11 VH和VL基因的寡核苷酸。图10和11分别显示了所述寡核苷酸在Hu24I11 VH和VL基因内的位置。用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)对PCR扩增片段进行凝胶提纯，并克隆到pCR4Blunt-TOPO载体内，用于确定序列。用SpeI和HindIII(用于VH)或NheI和EcoRI(用于VL)消化后，将Hu24I11 VH和VL基因亚克隆到哺乳动物表达载体内的相应位点，用于产生人IgG1/κ形式。图5显示了所得的表达载体pHu24I11的示意结构。图12和13分别显示了所得的Hu24I11 VH和VL基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。
6.7.4 嵌合和人源化24I11 IgG1/κ的瞬时表达
根据Durocher等(Nucl.Acids Res.30：e9，2002)的方法利用聚乙烯亚胺分别将pCh24I11和pHu24I11质粒DNA转染到HEK293细胞内，对嵌合和人源化的24I11 IgG1/κ抗体进行瞬时表达。将经瞬时转染的HEK293细胞在含有10％FBS的DMEM内在7.5％CO2培养箱内37℃保持4天。通过夹心式ELISA测量培养上清中每种Ch24I11和Hu24I11 IgG1/κ抗体的表达水平。取块ELISA板，加入100μl/孔在PBS中以1/2,000稀释过的山羊抗人IgG Fcγ链特异多克隆抗体(SouthernBiotech，Birmingham，AL)在4℃过夜进行包被，用清洗缓冲液(含有0.05％Tween 20的PBS)清洗，并用300μl/孔封闭缓冲液(含有2％脱脂牛奶和0.05％Tween 20的PBS)在室温下封闭1小时。用清洗缓冲液清洗后，向ELISA板添加100μl/孔的适当溶解于ELISA缓冲液(含有1％脱脂牛奶和0.025％Tween 20的PBS)中的样品。使用从人骨髓瘤血清纯化的人IgG1/κ抗体(SouthernBiotech)作为标准。在室温下温育ELISA板2小时并用清洗缓冲液清洗之后，用100μl/孔的1/2,000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人κ链多克隆抗体(SouthernBiotech)检测结合的抗体。在室温下温育1小时并用清洗缓冲液清洗之后，通过添加100μl/孔ABTS底物(bioWORLD，Dublin，OH)进行显色。通过添加100μl/孔的2％草酸终止显色。读取405nm吸光度。
6.7.5 人源化24I11的表征
通过细胞ELISA考察嵌合和人源化24I11抗体与人α9整联蛋白的结合。将在表面上表达重组人α9整联蛋白的CHO-K1稳定转染体(CHO/huα9；由Gene Techno Science提供)以2x105个细胞/孔接种在96孔组织培养板的50μl含有10％FBS的F12/DMEM(HyClone)内，并使其在7.5％CO2培养箱内37℃过夜生长。为了检测与人α9整联蛋白的结合，向每个孔添加50μl溶于含有10％FBS的F12/DMEM中的嵌合24I11、人源化24I11或无关人IgG1/κ骨髓瘤抗体(SouthernBiotech)。在4℃温育1小时并用冰冷PBS清洗细胞两次后，向每个孔添加100μl/孔1/1,000稀释的HRP偶联山羊抗人IgG多克隆抗体(SouthernBiotech)。在4℃温育1小时后，用冰冷PBS清洗细胞三次。为了显色，添加100μl ABTS底物。通过添加100μl 2％草酸终止显色。读取405nm吸光度。结果显示，在0.5和1μg/ml下，嵌合24I11抗体与人α9整联蛋白的结合与人源化24I11抗体几乎相同(图14)。
还利用CHO/huα9细胞进行FACS结合测定检查了小鼠、嵌合和人源化24I11单克隆抗体的抗原结合。纯化的小鼠24I11单克隆抗体由Gene TechnoSciences提供。每次试验大约8x105个CHO/hu α9细胞，用FACS结合缓冲液(含有0.5％BSA和0.05％NaN3的PBS)清洗，并悬浮在200μl含有各种量的测试抗体的FACS结合缓冲液中。冰上30分钟后，用FACS结合缓冲液清洗细胞两次。然后将被小鼠24I11染色的细胞悬浮在200μl以1/200稀释在FACS结合缓冲液内的FITC标记山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(SouthernBiotech)内。将被嵌合或人源化24I11染色的细胞悬浮在200μl以1/200稀释在FACS结合缓冲液内的FITC标记羊抗人IgG多克隆抗体(SouthernBiotech)内。冰上30分钟后，将细胞用FACS结合缓冲液清洗，并悬浮在200μl FACS结合缓冲液中，用FACSCan流式细胞仪(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)进行分析。在本分析中，嵌合和人源化24I11抗体与CHO/hu α9细胞的结合彼此非常相似(图15)。
使用瞬时表达抗体的细胞ELISA和FACS的实验结果表明，小鼠24I11抗体的人源化是成功的。
这里公开的其它小鼠抗人α9抗体(即1K11，21C5，25B6和28S1)的人源化也同样可以通过采用本文说明的程序来进行。这些小鼠单克隆抗体各自的VH和VL区DNA序列和氨基酸序列汇总如下。
  小鼠单克隆抗体   VH区DNA序列(SEQ ID NO：)1   成熟VH推导氨基酸序列(SEQ ID NO：)2   VL区DNA序列(SEQ ID NO：)1   成熟VL推导氨基酸序列(SEQID NO：)
  1K11   35   36   40   41
  21C5   45   46   50   51
  25B6   55   56   60   61
  28S1   65   66   70   71
1每一个抗体的V基因通过使用Amersham简并引物的方法克隆。
2每个克隆的推导氨基酸序列从VH区的第2个残基开始(根据Kabat编码体系)
                            7.保藏
根据微生物保藏布达佩斯条约，可产生抗人α9整联蛋白单克隆抗体的在这里称作1K11，21C5，24I11，25B6和28S 1的杂交瘤于2006年2月15日储存于日本产业技术综合研究所国际专利生物保管(International PatentOrganism Depositary)，地址为AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chomeTsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566 Japan，授予的登录号分别为Nos.FERMBP-10510，FERM BP-10511，FERM BP-10512，FERM BP-10513和FERMBP-10832，本文引用所有这些的全部内容作为参考。
                            8.工业实用性
本发明的人源化单克隆抗体可抑制α9整联蛋白的功能，从而对癌症，例如癌细胞的生长或转移，和炎症性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、肝炎、支气管哮喘、纤维化、糖尿病、癌症转移、动脉硬化、多发性硬化、肉芽肿、炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、自身免疫性疾病等，显示治疗作用。本发明的包含抗α9整联蛋白抗体和抗整联蛋白α4抗体二者的的药物组合物显示出对癌症和炎症性疾病具有更高的治疗作用。
                                        9.序列表
整个说明书中引用的序列总结如下。
  SEQID NO.   类型   描述   序列
  1   AA   OPN粘附序列   GRGDS
  2   AA   HuOPN的α4β1/α9β1结合位点   SVVYGLR
  3   AA   MuOPN的α4β1/α9β1结合位点   SLAYGLR
  4   AA   24I11(FERM BP-10512)的CDRH1   DTYVH
  5   AA   24I11(FERM BP-10512)的CDRH2   NIDPANGNTKYDPKFQG
  6   AA   24I11(FERM BP-10512)的CDRH3   WLRHFYYAMDY
  7   DNA   24I11(FERM BP-10512)的VH，包括编码信号肽(1-57)的序列   ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATGTGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAATATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGATGGTTACGACATTTTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
  8   AA   24I11(FERM BP-10512)的VH，包括信号肽(1-19)   MKCSWVIFFLMAVVTGVNSEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYVHWVKQRPEQGLEWIGNIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCARWLRHFYYAMDYWGQGTSVTVSS
  9   AA   24I11(FERM BP-10512)的成熟VH   EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYVHWVKQRPEQGLEWIGNIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCARWLRHFYYAMDYWGQGTSVTVSS
  10   AA   24I11 H链的信号肽   MKCSWVIFFLMAVVTGVNS
  11   AA   24I11(FERM BP-10512)的CDRL1   RASENIYYSLA
  12   AA   24I11(FERM BP-10512)的CDRL2   NANSLED
  13   AA   24I11(FERM BP-10512)的   KQAYDVPYT
  CDRL3
  14   DNA   24I11(FERM BP-10512)的VL，包括编码信号肽(1-60)的序列   ATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGACGCAGGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTGGCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTGGCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATAATGCAAACAGCTTGGAAGATGGTGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACACAGTATTCTATGAAGATCAACAGCATGCAGCCTGAAGATACCGCAACTTATTTCTGTAAACAGGCTTATGACGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
  15   AA   24I11(FERM BP-10512)的VL，包括信号肽(1-20)   MSVPTQLLGLLLLWLTDAGCDIQMTQSPASLAASVGETVTITCRASENIYYSLAWYQQKQGKSPQLLIYNANSLEDGVPSRFSGSGSGTQYSMKINSMQPEDTATYFCKQAYDVPYTFGGGTKLEIK
  16   AA   24I11(FERM BP-10512)的成熟VL   DIQMTQSPASLAASVGETVTITCRASENIYYSLAWYQQKQGKSPQLLIYNANSLEDGVPSRFSGSGSGTQYSMKINSMQPEDTATYFCKQAYDVPYTFGGGTKLEIK
  17   AA   24I11 L链的信号肽   MSVPTQLLGLLLLWLTDAGC
  18   DNA   X65891   ATGGACTGGACCTGGAGGGTCCTCTTTTTGGTGGCAGCAGCCACAGGTGCCCACTCCCAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAGCTATGCTATGCATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACGCTGGCAATGGTAACACAAAATATTCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAATACCCCGTATTAGCAGTGGCTGGTTGGGGGACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
  19   AA   X65891的FRH1   QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
  20   AA   X65891的FRH2   WVRQAPGQRLEWMG
  21   AA   X65891的FRH3   RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
  22   AA   X65891的FRH4   WGQGTLVTVSS
  23   DNA   X72441   CGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
  24   AA   X72441的FRL1   DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
  25   AA   X72441的FRL2   WYQQKPGKAPKLLIY
  26   AA   X72441的FRL3   GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
  27   AA   X72441的FRL4   FGQGTKVEIK
  28   DNA   Hu24I11的VH   CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATGTGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAGAGGCTGGAGTGGATTGGAAATATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCGCGAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGATGGTTACGACATTTTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
  29   AA   Hu24I11的VH   QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYVHWVRQAPGQRLEWIGNIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWLRHFYYAMDYWGQGTLVTVSS
  30   DNA   Hu24I11的VL   GACATCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAACATTTACTACAGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAATGCAAACAGCTTGGAAGATGGTGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACACAGTATACTCTCACCATCAGCAGCCTG
  CAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTAAACAGGCTTATGACGTTCCGTACACGTTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
  31   AA   Hu24I11的VL   DIQMTQSPS SLSASVGDRVTITCRASENIYYSLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLEDGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCKQAYDVPYTFGQGTKVEIK
  32   AA   1K11(FERM BP-10510)的CDRH1   DYNMD
  33   AA   1K11(FERM BP-10510)的CDRH2   DINPNNGGTIYNQKFQG
  34   AA   1K11(FERM BP-10510)的CDRH3   SGVISTDY
  35   DNA   1K11(FERM BP-10510)的VH   GTGCAGCTGCAGGAGTCAGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATACCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACATGGACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAACGGTGGTACAATCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGGTTATTAGTACGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
  36   AA   1K11(FERM BP-10510)的成熟VH，从根据Kabat编号的第2个残基开始   ？VQLQESGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTIYNQKFQGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARSGVISTDYWGQGTTVTVSS
  37   AA   1K11(FERM BP-10510)的CDRL1   RASQEISGYLI
  38   AA   1K11(FERM BP-10510)的CDRL2   AASTLDS
  39   AA   1K11(FERM BP-10510)的CDRL3   LQYANYPPT
  40   DNA   1K11(FERM BP-10510)的VL   GACATCCAGATGACACAGTCTCCACCCTCCCTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGGCAAGTCAGGAAATTAGTGGTTACTTAATCTGGCTTCAACAGAAACCAGATGGAACTATTCAACGCCTGATCTACGCCGCATCCACTTTAGATTCTGGTGTCCCAAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGCAGACTATTACT
  GTCTACAATATGCTAATTATCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG
  41   AA   1K11(FERM BP-10510)的成熟VL   DIQMTQSPPSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLIWLQQKPDGTIQRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYANYPPTFGGGTKLEIKR
  42   AA   21C5(FERM BP-10511)的CDRH1   DYYMY
  43   AA   21C5(FERM BP-10511)的CDRH2   TISDGGNYTYYPDSVKG
  44   AA   21C5(FERM BP-10511)的CDRH3   DRDGSSLFAY
  45   DNA   21C5(FERM BP-10511)的VH   GTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAATTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAATAACCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATCGGGACGGTAGTAGCCTGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
  46   AA   21C5(FERM BP-10511)的成熟VH，从根据Kabat编号的第2个残基开始   ？VQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDGGNYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCARDRDGSSLFAYWGQGTTVTVSS
  47   AA   21C5(FERM BP-10511)的CDRL1   KASQDVNIAVA
  48   AA   21C5(FERM BP-10511)的CDRL2   WASTRHT
  49   AA   21C5(FERM BP-10511)的CDRL3   QQHYNTPW
  50   DNA   21C5(FERM BP-10511)的VL   CATCCAGATGACACAGTCTCCAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAATATTGCTGTAGCCTGGTATCAACAAAGACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATCATAACACTCCGTGGACG
  TTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG
  51   AA   21C5(FERM BP-10511)的成熟VL   HPDDTVSKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNIAVAWYQQRPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYNTPWTFGGGTKLEIKR
  52   AA   25B6(FERM BP-10513)的CDRH1   SYGVH
  53   AA   25B6(FERM BP-10513)的CDRH2   VIWSGGSTNYNSALMS
  54   AA   25B6(FERM BP-10513)的CDRH3   DYGNYPWFAY
  55   DNA   25B6(FERM BP-10513)的VH   GTCAAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACTTGCACTGTCTCTGGGTTTTCATTAACCAGTTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGTCTGGTGGAAGCACAAATTATAATTCGGCTCTCATGTCCAGACTGAGCATCAGTAAAGACAATTTTAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATATACTACTGTGCCAGAGACTATGGTAACTACCCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
  56   AA   25B6(FERM BP-10513)的成熟VH，从根据Kabat编号的第2个残基开始   ？VKLQQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWSGGSTNYNSALMSRLSISKDNFKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCARDYGNYPWFAYWGQGTTVTVS
  57   AA   25B6(FERM BP-10513)的CDRL1   KASQDVNTAVA
  58   AA   25B6(FERM BP-10513)的CDRL2   SASYRYT
  59   AA   25B6(FERM BP-10513)的CDRL3   QQHYSTPCA
  60   DNA   25B6(FERM BP-10513)的VL   CATCCAGATGACACAGTCTCCAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCCCCTAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTACTCCGTGCGCG
  TTCGGAGGGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGG
  61   AA   25B6(FERM BP-10513)的成熟VL   HPDDTVSKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPCAFGGGTKLEIKR
  62   AA   28S1(FERM BP-10832)的CDRH1   GYGVN
  63   AA   28S1(FERM BP-10832)的CDRH2   MIWGDGITEYNSALKS
  64   AA   28S1(FERM BP-10832)的CDRH3   RDASSGYGFA
  65   DNA   28S1(FERM BP-10832)的VH   AGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCGTCTCAGGGTTCTCATTAACCGGCTATGGTGTAAACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGGTGATGGAATCACAGAGTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCAGGTACTACTGTGCCAGAGATGCCAGCTCGGGCTACGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
  66   AA   28S1(FERM BP-10832)的成熟VH，从根据Kabat编号的第2个残基开始   ？VKLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGITEYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDASSGYGFAYWGQGTTVTVSS
  67   AA   28S1(FERM BP-10832)的CDRL1   TASSSVSSSYLH
  68   AA   28S1(FERM BP-10832)的CDRL2   STSNLAS
  69   AA   28S1(FERM BP-10832)的CDRL3   HQYHRSPYT
  70   DNA   28S1(FERM BP-10832)的VL   TACATTGTGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCGT
  ACACGTTCGGAGGGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGG
  71   AA   28S1(FERM BP-10832)的成熟VL   YIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPYTFGGGTKLEIKR
  72   DNA   24I11(FERM BP-10512)的VH，包括编码信号肽(1-57)的序列，两侧为SpeI和HindIII位点   ACTAGTACCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATGTGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAATATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGATGGTTACGACATTTTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAATGGCCTCTAAGCTT
  73   DNA   24I11(FERM BP-10512)的VL，包括编码信号肽(1-60)的序列，两侧为NheI和EcoRI位点   GCTAGCACCACCATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGACGCAGGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTGGCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTGGCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATAATGCAAACAGCTTGGAAGATGGTGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACACAGTATTCTATGAAGATCAACAGCATGCAGCCTGAAGATACCGCAACTTATTTCTGTAAACAGGCTTATGACGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTAAGTAGTCTTCTCAGAATTC
  74   DNA   图10(有5’-GGG和CCC-)和图12 Hu24I11 VH基因，两侧为SpeI和HindIII位点   ACTAGTACCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCACAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATGTGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAGAGGCTGGAGTGGATTGGAAATATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGACCCGAAGTTCC
Figure BPA00001182605700451
  NMWQKEEMGISCELLESDFLKCSVGFPFMRSKSKYEFSVIFDTSHLSGEEEVLSFIVTAQSGNTERSESLHDNTLVLMVPLMHEVDTSITGIMSPTSFVYGESVDAANFIQLDDLECHFQPINITLQVYNTGPSTLPGSSVSISFPNRLSSGGAEMFHVQEMVVGQEKGNCSFQKNPTPCIIPQEQENIFHTIFAFFTKSGRKVLDCEKPGISCLTAHCNFSALAKEESRTIDIYMLLNTEILKKDSSSVIQFMSRAKVKVDPALRVVEIAHGNPEEVTVVFEALHNLEPRGYVVGWIIAISLLVGILIFLLLAVLLWKMGFFRRRYKEIIEAEKNRKENEDSWDWVQKNQ
  77   AA   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   FQGPADSFFGYA
  78   AA   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   KSPGAVFKCRVHTNPDRR
  79   AA   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   WMGVSLARQPKADGRVLA
  80   aa   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   CAHRWKNIYYEADHI
  81   aa   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   GFCYIIPSNLQAKGRTLI
  82   aa   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   VMGAPGSFYWAGTIKVLN
  83   aa   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   VIMNRRYTYLGYAVT
  84   aa   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   VYIFRADRRSGTLIKIFQ
  85   aa   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   QYSMKLSGQKINPVLRMFGQSISG
  86   aa   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   VVLLRARPVITVDVSIFL
  87   aa   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   RHYVAHVKRRVQDVISPI
  88   aa   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   ELPPLTPVLRWKKGQKIAQKNQTVFERNCR
  89   aa   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   YLALGAVKNISL
  90   aa   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   CSVGFPFMRSKSKYEFSV
  91   aa   huα9整联蛋白部分氨基酸序列   SSSVIQFMSRAKVKVDPALRV
  92   aa   生腱蛋白-C huα9结合位点   AEIDGIEL
  93   aa   人纤连蛋白huα9结合位点   CPEDGIHELFP
  94   DNA   GeneRacer 5′引物   CGACTGGAGCACGAGGACACTGA
  95   DNA   VH引物   GCCAGTGGATAGACAGATGG
  96   DNA   VL引物   GATGGATACAGTTGGTGCAGC
  97   DNA VH 5’引物，带有SpeI位点   GGGACTAGTACCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTC
  98   DNA VH引物，带有HindIII位点   GGGAAGCTTAGAGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC3
  99   VL 5’引物，带有NheI位点   GGGGCTAGCACCACCATGAGTGTGCC
  CACTCAACTCCTG
  100 VL 5’引物，带有EcpRI位点   GGGGAATTCTGAGAAGACTACTTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC
  101   DNA   JNJ120   GGGACTAGTACCACCATGAAATGCAGC
  102   DNA   JNJ137   GGGACTAGTACCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTT
  103   DNA   JNJ138   AGACTGCACCAGCTGAACCTGTGAATTGACCCCTGTAACCACTGCCATCAGGAAGAA
  104   DNA   JNJ139   CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAG
  105   DNA   JNJ140   GTCTTTAATGTTGAAGCCAGAAGCCTTGCAGGAAACCTTGACTGAGGCCCCTGGCTT
  106   DNA   JNJ141   TCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATGTGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAGAGG
  107   DNA   JNJ142   ACCATTCGCAGGATCAATATTTCCAATCCACTCCAGCCTCTGTCCAGGGGCCTGGCG
  108   DNA   JNJ143   AATATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACT
  109   DNA   JNJ144   CATGTAGGCTGTGCTCGCGGATGTGTCTGCTGTTATAGTGGCCTTGCCCTGGAACTT
  110   DNA   JNJ145   TCCGCGAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACTGCCGTC
  111   DNA   JNJ146   ATAGTAAAAATGTCGTAACCATCTAGCACAGTAATAGACGGCAGTGTCCTCAGA
  112   DNA   JNJ147   TGGTTACGACATTTTTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACC
  113   DNA   JNJ148   GGGAAGCTTTTGTGAGGACTCACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCTTGACC
  114   DNA   JNJ149   GGGAAGCTTTTGTGAGGACTC
  115   DNA JNJ150   GGGGCTAGCACCACCATGAGT
  116   DNA JNJ126   GGGGCTAGCACCACCATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGG
  117   DNA JNJ127   AGACTGAGTCATCTGGATGTCACATCGTGCGTCTGTAAGCCACAGCAGCAGCAACCCCAG
  118   DNA JNJ128   GACATCCAGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGA
  119   DNA JNJ129   GTAAATGTTCTCACTTGCTCGACATGTGATGGTGACTCTGTCTCCCACAGATGCAGA
  120   DNA JNJ130   CGAGCAAGTGAGAACATTTACTACAGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAA
  121   DNA JNJ131   CAAGCTGTTTGCATTATAGATCAGGAGCTTAGGGGCTTTCCCTGGCTTCTGCTGATA
  122   DNA JNJ132   ATCTATAATGCAAACAGCTTGGAAGATGGTGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGA
  123   DNA JNJ133   CAGGCTGCTGATGGTGAGAGTATACTGTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAACCTCGA
  124   DNA JNJ134   ACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTAAACAG
  125   DNA JNJ135   GGTCCCTTGTCCGAACGTGTACGGAACGTCATAAGCCTGTTTACAGTAATAAGTTGC
  126   DNA JNJ136   TACACGTTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTGAGTAG
  127   DNA JNJ101   GGGGAATTCTTTAAATTCTACTCACGTTTGATTTCCA
  128   DNA JNJ117   GGGGAATTCTTTAAATTCTA
  129   DNA 用于小鼠γ1，γ2a，γ2b和γ3H链的引物  GCCAGTGGATAGACTGATGG
  130   DNA 用于小鼠κL链引物的引物   GATGGATACAGTTGGTGCAGC
Figure IPA00001182605100021
Figure IPA00001182605100031
Figure IPA00001182605100041
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Claims (23)

1.一种可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，其包括：
(i)H链，其包含至少一个衍生自人抗体VH区的FRH，以及至少一个CDRH，所述CDRH衍生自可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的非人类抗体的至少一个CDRH；或
(ii)L链，其包含至少一个衍生自人抗体VL区的FRL，以及至少一个CDRL，所述CDRL衍生自可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的非人类抗体的至少一个CDRL；或
(iii)上述的(i)和(ii)。
2.权利要求1的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述非人类抗体是由选自下组的杂交瘤产生的小鼠单克隆抗体：保藏号FERM BP-10510、FERM BP-10511、FERM BP-10512、FERM BP-10513和FERM BP-10832。
3.权利要求1的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体的至少一个CDRH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：4、5和6中的氨基酸序列，并且所述人源化抗体的至少一个CDRL包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：11、12和13中的氨基酸序列。
4.权利要求2或3的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述人抗体VH区包含从由GenBank登录号为X65891(SEQ ID NO：18)的核苷酸序列编码的氨基酸序列衍生的氨基酸序列，并且所述人抗体VL区包含从由GenBank登录号X72441(SEQ ID NO：23)的核苷酸序列编码的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
5.权利要求4的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述H链包含氨基酸序列SEQ ID NO：29，并且所述L链包含氨基酸序列SEQ ID NO：31。
6.一种分离的核酸分子，其包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：29的核苷酸序列。
7.权利要求6的核酸分子，其中所述核苷酸序列具有核苷酸序列SEQID NO：28。
8.权利要求6的核酸分子，进一步包含编码信号肽的核苷酸序列。
9.权利要求8的核酸分子，其中所述信号肽包含氨基酸序列SEQ IDNO：10。
10.一种分离的核酸分子，其包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：31的核苷酸序列。
11.权利要求10的核酸分子，其中所述核苷酸序列具有核苷酸序列SEQID NO：30。
12.权利要求10的核酸分子，进一步包含编码信号肽的核苷酸序列。
13.权利要求12的核酸分子，其中所述信号肽包含氨基酸序列SEQ IDNO：17。
14.一种载体，其包含权利要求6或10或其二者的核酸分子，其中所述核酸分子与一个或多个调节元件可操作地连接。
15.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求14的载体。
16.一种制备人源化抗体或其抗原结合片段的方法，包括在所述人源化抗体或其抗原结合片段得以表达的条件下培养权利要求15的宿主细胞，并收集所表达的人源化抗体。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1、2或5中任一项的人源化抗体或其抗原结合片段以及可药用的载体。
18.一种预防或治疗与α9整联蛋白有关的病症或疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求5的人源化抗体或其抗原结合片段。
19.一种体内诊断与α9整联蛋白有关的病症或疾病的方法，所述方法包括向待检受试者施用有效量的权利要求1或2的人源化抗体或其抗原结合片段。
20.一种可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)H链，其包含至少一个衍生自人抗体VH区的FRH以及，至少一个CDRH，所述CDRH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：32、33和34中的氨基酸序列；或
(ii)L链，其包含至少一个衍生自人抗体VL区的FRL，以及至少一个CDRL，所述CDRL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：37、38和39中的氨基酸序列；或
(iii)上述的(i)和(ii)。
21.一种可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)H链，其包含至少一个衍生自人抗体VH区的FRH，以及至少一个CDRH，所述CDRH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：42、43和44中的氨基酸序列；或
(ii)L链，其包含至少一个衍生自人抗体VL区的FRL，以及至少一个CDRL，所述CDRL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：47、48和49中的氨基酸序列；或
(iii)上述的(i)和(ii)。
22.一种可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)H链，其包含至少一个衍生自人抗体VH区的FRH，以及至少一个CDRH，所述CDRH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：52、53和54中的氨基酸序列；或
(ii)L链，其包含至少一个衍生自人抗体VL区的FRL，以及至少一个CDRL，所述CDRL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：57、58和59中的氨基酸序列；或
(iii)上述的(i)和(ii)。
23.一种可免疫特异性地识别人α9整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)H链，其包含至少一个衍生自人抗体VH区的FRH，以及至少一个CDRH，所述CDRH包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：62、63和64中的氨基酸序列；或
(ii)L链，其包含至少一个衍生自人抗体VL区的FRL，以及至少一个CDRL，所述CDRL包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：67、68和69中的氨基酸序列；或
(iii)上述的(i)和(ii)。
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