CN101918434A - 呼肠弧病毒的病毒修饰作用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于属于呼肠弧病毒科的病毒(即，呼肠弧病毒)的反向遗传系统，其各种应用，遗传修饰的呼肠弧病毒，呼肠弧病毒选择/生产和繁殖系统、药物和疫苗。

Description

呼肠弧病毒的病毒修饰作用
发明领域
本发明提供了一种用于属于呼肠弧病毒科(Reoviridae)的病毒(即，呼肠弧病毒(Reoviruses))的反向遗传系统，其各种应用，遗传修饰的呼肠弧病毒，呼肠弧病毒选择/生产和繁殖系统、药物和疫苗。
背景
呼肠弧病毒科(呼吸道肠道孤儿病毒(Respiratory Enteritic Orphanviruses))构成了具有分段双链RNA基因组的无包膜病毒的家族。呼肠弧病毒科家族包括影响胃肠系统的病毒(如轮状病毒(Rotaviruses))，其引起呼吸道感染。术语“孤儿病毒”指特定的病毒与任何已知的疾病无关，并且，尽管呼肠弧病毒科已经与许多疾病相关，但仍然使用其最初的名称(Tyler，2001)。轮状病毒属可从人到人直接地传播，并且是全世界2岁以内的儿童中严重腹泻病的主要病原媒介，导致每年死亡约500,000人(Kapikian等人，2001)。
哺乳动物正呼肠弧病毒(Orthoreoviruses)的原型已从人呼吸道和肠道分离，但与严重的人类疾病无关。其中，人呼肠弧病毒3型Dearing(T3D)常常被用来研究并用作该家族的模型(Nibert等人，2001)。此外，在最近十年期间，哺乳动物正呼肠弧病毒，尤其是T3D，已经在临床前和临床癌症治疗实验中用作溶瘤剂(Norman等人，2000；Shmulevitz等人，2005)。本发明部分地基于下面的观察，即，呼肠弧病毒诱导肿瘤细胞但不诱导健康的未转化细胞中的细胞死亡和凋亡(Hashiro等人，1977；Duncan等人，1978)。迄今为止，已经在加拿大、美国和英国开始了几个临床试验，以研究此种方式对癌症治疗的可行性。
野生型呼肠弧病毒可使用几种不同的蛋白作为结合其靶细胞的受体。首先，已经证明连接粘附分子-A(Junction Adhesion Molecule-A)(Jam-A，也称为连接粘附分子1，或Jam-1)充当正呼肠弧病毒1型和3型的受体，并可介导病毒附着和感染(Chappell等人，2002d)。Jam-A是整合的紧密连接蛋白并且呼肠弧病毒T3D的Sigma-1蛋白的球状头部中的区域与Jam-A相互作用(Chappell等人，2002c)。另外，刺突蛋白(spike protein)Sigma-1的柄结构域(shaft domain)中的序列可与细胞表面唾液酸分子相互作用以引起生痰性感染(Chappell等人，1997)。Sigma-1蛋白由RNA节段S1(也称为σ1)编码。
尽管呼肠弧病毒受体普遍存在，但一些肿瘤细胞在其细胞表面上可具有有限数目的受体。例如，Smakman(2005)描述来自具有结肠直肠转移的患者的13个肿瘤片段没有一个易于发生呼肠弧病毒T3D感染(Smakman，2005)。肿瘤细胞上呼肠弧病毒受体的缺乏阻碍了呼肠弧病毒作为溶瘤剂的功效。
众所周知，呼肠弧病毒科的遗传修饰很困难，这归因于它们的双链RNA基因组的分段结构。为此，本发明涉及一种用于呼肠弧病毒科成员的反向遗传(reverse genetics)方法。Roner等人，2001&Roner等人，1990开发了一种复杂的呼肠弧病毒反向遗传系统，该系统涉及RNA节段之一的体外合成，该RNA的体外加帽，以及此RNA与其他9个节段的单链(正链)和/或双链RNA的共转染。为了启动复制，用缓慢形成空斑(slow-plaqueing)的呼肠弧病毒变体呼肠弧病毒T2或T1作为辅助病毒来感染被转染的细胞(Roner等人，2001)。尽管生成了携带有氯霉素乙酰转移酶基因的单重组呼肠弧病毒T3D，但该方法的效率低且很繁琐。
已经由Komoto和Sasaki(Komoto等人，2006)描述了备选方法，他们描述了用于轮状病毒的反向遗传系统的建立。尽管他们成功地拯救了重配的轮状病毒，但该方法的效率非常低，需要进行改进。Kobayashi和合作者最近描述了使用完全基于质粒的系统来生成重组呼肠弧病毒T3D。(Kobayashi，T.，A.A.R.Antar，K.W.Boehme，P.Danthi，E.A.Eby，K.M.Guglielmi，G.H.Holm，E.M.Johnson，M.S.Maginnis，S.Naik，W.B.Skelton，J.D.Wetzel，G.J.Wilson，J.D.Chappell，和T.S.Dermody.2007.APlasmid-Based Reverse Genetics for Animal Double-Stranded RNA Viruses(用于动物双链RNA病毒的基于质粒的反向遗传系统).Cell Host&Microbe(细胞宿主与微生物)1：147-157)。
这两种方法均依赖于具有真正节段末端的单链正链RNA的产生。这阻碍了重组体的形成，因为众所周知，通常非聚腺苷酸化的单链RNA在哺乳动物细胞中的寿命很短。(Zeevi等人，1982)
因此，本发明的目的之一是消除或减轻现有技术的上述问题。
发明的概述
本发明基于用于呼肠弧病毒科的有效反向遗传系统的发展，该系统可以在例如，呼肠弧病毒的遗传修饰的和/或宿主范围的变体的开发中具有特殊的应用。
在一个方面，本发明提供了一种修饰属于呼肠弧病毒科的病毒的基因组的方法，所述方法包括以下的步骤：
(a)将编码呼肠弧病毒基因组的修饰部分的核酸引入至细胞中；
(b)用呼肠弧病毒感染所述细胞；以及
(c)在诱导产生修饰病毒的条件下保持所述细胞；
其中所述修饰病毒，相对于步骤(b)中使用的呼肠弧病毒，包含修饰的基因组，所述修饰的基因组包含所述呼肠弧病毒基因组的修饰部分。
本发明基于下面出人意料的观察，即，当在细胞中表达时，呼肠弧病毒基因组的修饰部分可结合至新形成的呼肠弧病毒粒子中。不希望受理论的约束，相信该修饰的呼肠弧病毒基因组部分，一旦被引入至细胞中，就转录产生mRNA分子，该mRNA分子在真5′帽处起始，在3′端处未被截断，且其延伸以进一步包含多聚腺苷酸区(poly A tract)。
呼肠弧病毒科是具有分段双链RNA基因组的无包膜病毒家族，包括，例如，正呼肠弧病毒属(Orthoreovirus)、环状病毒属(Orbivirus)、轮状病毒属(Rotavirus)和科罗拉多比蜱传热症病毒属(Coltivirus)物种。为此，本发明提供了一种修饰属于呼肠弧病毒科家族的那些病毒的基因组的方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种遗传修饰正呼肠弧病毒属物种，如例如，呼肠弧病毒3型Dearing株(T3D)的基因组的方法。
典型地，用呼肠弧病毒感染细胞的步骤(上面的步骤(b))可能需要使用“野生型呼肠弧病毒”。野生型呼肠弧病毒可以是属于呼肠弧病毒科的任何病毒的天然或自然存在形式。优选地，野生型呼肠弧病毒是待经历本文所述的方法的呼肠弧病毒的野生型形式。作为实例，如果该方法涉及修饰正呼肠弧病毒属物种的基因组，则用来感染细胞的呼肠弧病毒属病毒可以是所述正呼肠弧病毒属物种的野生型形式。
备选地，用呼肠弧病毒感染细胞的步骤可用呼肠弧病毒突变体或变体来进行。例如，在某些实施方案中，可能需要使用，例如，热敏感的和/或宿主范围的突变体。另外地，或备选地，上面步骤(b)中提到的呼肠弧病毒可以是这样的呼肠弧病毒，其与相同物种的参考或野生型毒株相比，包含修饰的基因组。在此情况下，本文所述的方法的步骤(b)中使用的呼肠弧病毒的基因组可根据本文所述的任意方法或本领域技术人员已经知晓的任意方法来修饰。如上所述地，步骤(b)中使用的变异的、突变的或修饰的呼肠弧病毒优选地是待经历本文所述的方法的呼肠弧病毒的变体、突变体或修饰形式。作为实例，如果该方法涉及修饰环状病毒属物种的基因组，则用来感染细胞的呼肠弧病毒可以是所述环状病毒属物种的变体、突变体和/或修饰形式。
应该理解，经历本文所述的方法的病毒相对于用来感染细胞的呼肠弧病毒是“修饰的”，并且步骤(b)中使用的呼肠弧病毒可以是同一病毒的野生型、变体、突变体或修饰形式。因此，短语“修饰的基因组”意欲指当与来源于步骤(b)中使用的病毒的基因组相比时，以某种方式被改变或不同的基因组。例如，基因组可被修饰以含有其他的核苷酸和/或取代的和/或反向核苷酸。另外地，或备选地，基因组可被修饰以使得，相对于用来感染细胞的病毒的基因组，某些核苷酸被删除。
此外，术语“细胞”包括能够被野生型呼肠弧病毒感染的任意类型的细胞。熟知的实例包括细胞系′911′、PER.C6、′293′、HeLa、A549和L929。
在一个实施方案中，本文所述的方法可用来修饰包含呼肠弧病毒基因组的一个或多个双链RNA基因组节段。另外地，或备选地，该方法可用来修饰一个或多个双链RNA基因组节段的一部分或多部分。
应该理解，通过本文所述的方法引入的基因组修饰作用可表现为这样的病毒的组分(例如，一种或多种结构和/或非结构蛋白)中的一种或多种修饰作用，所述病毒是由根据第一个方面的方法的步骤(b)中感染的细胞产生的。换句话说，由本文所述的方法产生的修饰的基因组可编码一种或多种修饰的病毒组分。因此，除了提供能够产生具有修饰的基因组的呼肠弧病毒的方法以外，本发明还提供修饰由该基因组编码的一种或多种病毒组分的方法。以此方式，由上面步骤(b)中感染的细胞产生的病毒可包含一种或多种修饰的组分(例如结构和/或非结构蛋白)和/或修饰的基因组。
在另一个实施方案中，该方法可用来修饰一种或多种结构组分如包含，例如，核心或衣壳结构的那些组分。另外地，或备选地，该方法可用来修饰一种或多种非结构组分如，例如，参与感染、复制、装配和/或释放的蛋白。特别地，该方法可用来修饰包括病毒衣壳的一种或多种蛋白。
另外地，或备选地，本文所述的方法可用来修饰呼肠弧病毒基因组使得其包含一种或多种异源核酸序列。在一个实施方案中，异源核酸序列可编码异源组分和/或蛋白。例如，基因组可被修饰，从而用相应的异源组分置换一种或多种天然或自然的呼肠弧病毒组分。在另一个实施方案中，呼肠弧病毒基因组可被修饰使得其除由呼肠弧病毒基因组编码的天然或自然组分以外，编码一种或多种异源组分和/或蛋白。
还另一个实施方案中，异源核酸序列可编码诱导细胞死亡或凋亡的一种或多种化合物或可抑制或阻碍一种或多种细胞过程的一种或多种化合物。
应该理解，术语“异源”是指来自除经历本文所述的方法的特定呼肠弧病毒以外的来源的核酸序列和/或其产物(例如，由其编码的蛋白)。
在正呼肠弧病毒属-呼肠弧病毒3型，Dearing株(T3D)的情况下，除了修饰包含所述基因组的一个或多个双链RNA节段(或其一部分或多部分)以外，本文所述的任一方法还可用来修饰T3D的一种或多种组分，例如，结构和/或非结构组分。特别地，这些方法可用来修饰包括T3D内衣壳和/或外衣壳的一种或多种蛋白。蛋白σ1、σ3、λ2和μ1c是外衣壳的组分，且蛋白λ1、λ3、σ2和μ2是内衣壳的部分。
本领域技术人员应该理解，为了修饰许多病毒组分，可将各自编码病毒的修饰组分的许多核酸引入至细胞中。
优选地，一种或多种)组分是结构和/或非结构组分。例如，结构组分可以是包括病毒衣壳的蛋白。
优选地，并且在一个实施方案中，待引入至细胞的核酸可由下列的方法提供，所述方法包括包括生成病毒基因组的一个选择部分或多个选择部分的互补DNA(cDNA)拷贝的步骤。有利地，病毒基因组的一个或多个选择部分可编码病毒的一种或多种组分。
在一个实施方案中，细胞(宿主细胞)可用来繁殖将经历本文所述的方法的病毒。适合用作宿主细胞的细胞可包括例如，911细胞、PER.C6细胞、293细胞、HeLa细胞、A549细胞和L929细胞。
典型地，在其中繁殖了病毒的细胞可经历RNA提取流程。在一个实施方案中，RNA提取流程可涉及使宿主细胞经受诱导溶胞的条件的步骤。此类条件可包括冻融含病毒细胞悬液的应用。以此方式，宿主细胞内的任何病毒粒子可被释放并通过，例如，离心，优选地通过超速离心而收获。
有利地，收获的病毒粒子可经受诱导溶胞的条件。这些条件可包括使用，例如，能够变性病毒粒子和灭活否则可变性和/或破坏核酸的酶的离液化合物。所述化合物可包括，例如，尿素和/或胍盐化合物如盐酸胍或硫氰酸胍。典型地，残余的病毒和/或细胞碎片可通过更多轮次的离心来去除，从而保留包含病毒RNA的上清液。
优选地，RNA提取可通过核酸沉淀技术来完成，该技术涉及使用化合物如苯酚-氯仿、硅石珠，粒子或硅藻和/或设计用于从溶液中提取RNA的微旋转(micro-spin)柱(QIAGEN)。关于这些技术的更多信息可从，例如，Boom等人，Rapid and simple method for purification of nucleic acids(纯化核酸的快速和简单的方法)，Journal of Clinical Microbiology(临床微生物学杂志)，卷(3)28，495-503页；Shafer等人，Interlaboratory comparison ofsequence-specific PCR and ligase detection reaction to detect a humanimmunodeficiency virus type 1 drug resistance mutation(用于检测1型人体免疫缺陷病毒药物抗性突变的序列特异PCR和连接酶检测反应的实验室间比较).The AIDS Clinical Trials Group Virology Committee Drug ResistanceWorking Group(AIDS临床试验组病毒学委员会药物抗性工作组)J.Clin.Microbiol.(临床微生物学杂志)1996 34：1849-1853和Molecular Cloning：ALaboratory Manual(Third Edition)(分子克隆：实验室指南(第三版))；Sambrook等人；CSHL Press(CSHL出版社)获得。
优选地，提取的RNA可经历扩增流程，在该扩增流程中，特异于一条或多条特定病毒RNA序列(以后称为靶病毒序列)的寡核苷酸引物用来扩增所选择的一条或多条序列。典型地，寡核苷酸引物被设计成与某些核苷酸序列特异性杂交。
在一个实施方案中，靶病毒序列编码某些病毒结构组分和/或非结构组分。例如，靶病毒序列可编码一种或多种衣壳蛋白。
有利地，该寡核苷酸引物与病毒RNA在允许生成靶病毒序列的cDNA拷贝的条件下接触。所述条件可涉及能够将RNA逆转录为cDNA的酶的使用。在一个实施方案中，一条或多条靶序列通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来扩增。关于RT-PCR的更多信息可见，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Third Edition)(分子克隆：实验室指南(第三版))；Sambrook等人；CSHL Press(CSHL出版社)。
优选地，并且在一个实施方案中，靶病毒序列可被修饰，从而提供这样的序列，即当与相应的野生型病毒序列相比时，该序列以某种方式改变或不同。例如，靶病毒序列可被修饰，从而包含编码这样的氨基酸序列的核苷酸，即当与该病毒的野生型中的相应氨基酸序列相比时，所述氨基酸序列包括一个或多个添加的、缺失的、置换的或倒置(inverted)的氨基酸残基。
有利地，靶病毒序列可在扩增流程期间被修饰。优选地，除了与靶序列特异性杂交的那些核苷酸以外，用于上述RT-PCR扩增流程中的寡核苷酸引物可进一步包含编码待引入至所得cDNA中的修饰的核苷酸序列。另外地或备选地，该寡核苷酸可包含导致由该病毒靶序列编码的一个或多个氨基酸的缺失、置换或倒置的核苷酸序列。
因此，本文所述的方法可包括将编码呼肠弧病毒基因组的修饰部分和/或呼肠弧病毒的修饰组分的互补DNA(cDNA)引入至细胞中的步骤。
涉及将核酸引入至细胞中的步骤是本领域技术人员所熟知的，并且可涉及，例如，转染流程或载体(例如，真核基因表达载体)如转录盒(transcription cassette)、质粒或病毒载体的使用。理想地，所述载体不是痘苗病毒，T7RND聚合酶驱动的载体。有利地，本发明的方法不依赖于辅助病毒的使用。
典型地，转染流程使用使细胞膜可透过诸如核酸的化合物的条件。作为实例，有可能使用电穿孔、热激和/或如磷酸钙的化合物将核酸转染进细胞中。
另外地，或备选地，核酸可借助于基因枪被引入至细胞内。在这种情况下，待引入的核酸可以与可被直接递送至细胞的粒子缔合或否则缀合。
优选地，待引入至细胞中的核酸包含在RNA聚合酶II依赖性转录盒如，例如，病毒载体内。以此方式，核酸可被稳定地表达。在一个实施方案中，转录盒能够稳定地整合入细胞的基因组中，使得引入的核酸的产物被稳定地表达。优选地，RNA聚合酶II依赖性转录盒是慢病毒载体。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种修饰属于呼肠弧病毒科家族的病毒的基因组和/或组分的方法，其中核酸(例如cDNA)包含在RNA聚合酶II依赖性转录盒如，例如，载体内。
有利地，所述载体是病毒载体，优选是慢病毒载体。
属于呼肠弧病毒科的病毒可与某些细胞的表面上存在的特定类型的受体分子结合。例如，连接粘附分子-A(Jam-A：另外还称为连接粘附分子1，或Jam-1)已知充当正呼肠弧病毒属1型和3型的受体(介导附着和感染)。更具体地，T3D衣壳蛋白Sigma-1(S1)的一部分(球状头部区)与Jam-A相互作用，而S1的柄结构域内的某些其他序列可与细胞表面上存在的唾液酸分子相互作用。在结合特定的细胞分子(以后称为“细胞受体”)时，该病毒可被内化并因此“感染”细胞。
病毒结构组分和细胞受体之间的特异性相互作用促成属于呼肠弧病毒科的病毒所表现的特定细胞向性(即，结合和感染性特异性)。
因此，在进一步的方面，提供了一种修饰属于呼肠弧病毒科的病毒的细胞向性(cellular tropism)的方法，所述方法包括以下的步骤：
(a)将编码呼肠弧病毒的修饰组分的核酸引入至细胞中；
(b)用呼肠弧病毒感染所述细胞；以及
(c)在诱导产生具有修饰的细胞向性的修饰的呼肠弧病毒的条件下保持所述细胞；
其中所述具有修饰的向性的修饰的呼肠弧病毒，相对于步骤(b)中使用的呼肠弧病毒，包含所述呼肠弧病毒的修饰组分。
优选地，呼肠弧病毒的修饰组分可以是修饰的结构组分如病毒衣壳蛋白。有利地，该修饰作用使该病毒组分能够结合步骤(b)中使用的呼肠弧病毒不能结合的细胞受体。
在另一实施方案中，修饰属于呼肠弧病毒科的病毒的细胞向性的方法，可包括修饰病毒的基因组使得其编码能够结合特定细胞的蛋白的步骤。以此方式有可能使呼肠弧病毒粒子靶向细胞如树突细胞、巨噬细胞和/或其他类型的免疫细胞或白血细胞和/或来源于人体或动物体的组织和器官的细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了一种修饰T3D的细胞向性的方法，所述方法包括以下的步骤：
(a)提供编码修饰的S1衣壳蛋白的核酸；
(b)将该核酸引入至细胞中；
(c)用T3D病毒感染所述细胞；以及
(d)在适合产生具有修饰的细胞向性的新T3D病毒的条件下保持所述细胞；
其中所述具有修饰的向性的新T3D，相对于步骤(c)中使用的T3D病毒，包含所述修饰的S1衣壳蛋白。
典型地，步骤(c)中使用的T3D病毒是经历上述方法的T3D的野生型、突变体、变体或修饰形式。
优选地，修饰的S1蛋白包含修饰的一级结构，该结构使S1蛋白能够结合步骤(c)中使用的T3D呼肠弧病毒的S1蛋白不能结合的细胞受体。在一个实施方案中，S1蛋白的修饰作用，相对于步骤(c)中使用的呼肠弧病毒的S1蛋白，可包括向初级S1氨基酸序列，或从初级S1氨基酸序列上添加、缺失、置换或倒置一个或多个氨基酸。有利地，该修饰作用可包括对S1蛋白的羧基末端的修饰作用。更优选地，该修饰作用包括向S1初级序列上添加氨基酸，并且在一个实施方案中，该修饰作用包括向S1衣壳蛋白的羧基末端上添加一个或多个组氨酸残基。
在另一个实施方案中，经历上述修饰细胞向性的方法的呼肠弧病毒可用于某些疾病和/或病症的研究和/或治疗中。在这些疾病和/或病症中，有可能研究和/或治疗的是细胞增殖和/或分化障碍如癌症。由于已知呼肠弧病毒诱导癌细胞中的凋亡，因此被修饰以显示对特定细胞类型的向性的呼肠弧病毒可用来治疗癌症。
有利地，和在另一个实施方案中，呼肠弧病毒可进一步被修饰以包含一条或多条核酸序列，这些序列编码可诱导细胞死亡或凋亡的一种或多种化合物或可抑制或阻碍一个或多个细胞过程的一种或多种化合物。例如，所述一种或多种化合物可影响参与蛋白生成和/或细胞(分裂)周期的那些过程。例如，呼肠弧病毒基因组可进一步被修饰以包含编码这样的化合物的核酸序列，所述化合物如，例如，反义寡核苷酸序列，干扰或抑制正常细胞过程的siRNA和/或iRNA序列。在另一个实施方案中，修饰的基因组可包含编码这样的化合物的核酸序列，所述化合物对细胞具有细胞毒性、细胞凋亡和/或抑制作用。以此方式，根据本发明的修饰的呼肠弧病毒粒子可用来治疗某些疾病或病症。
在另一个实施方案中，呼肠弧病毒基因组可被修饰，从而包含编码一种或多种化合物的核酸序列，所述化合物允许细胞内的检测。例如，修饰的基因组可包含编码荧光性化合物如GFP等的核酸。
在另一个实施方案中，本发明提供一种修饰呼肠弧病毒3型，Dearing株(T3D)的Sigma-1(S1)衣壳蛋白的方法，所述方法包括以下的步骤：
(a)将包含编码修饰的T3D S1蛋白的cDNA的慢病毒载体引入至细胞中；
(b)用T3D呼肠弧病毒感染所述细胞；以及
(c)在诱导产生具有修饰的S1蛋白的修饰T3D病毒的条件下保持所述细胞；
其中所述具有修饰的S1衣壳蛋白的修饰的T3D病毒，相对于步骤(b)中使用的T3D呼肠弧病毒，还包含编码所述修饰的S1衣壳蛋白的修饰的基因组。
典型地，步骤(b)中使用的T3D呼肠弧病毒是经历上述方法的T3D的野生型、突变体、变体或修饰形式。
在第四个方面，提供通过本文所述的方法产生的属于呼肠弧病毒科家族的修饰病毒。
在第五个方面，提供修饰的呼肠弧病毒3型，Dearing株(T3D)，所述病毒包含修饰的S1衣壳蛋白，所述修饰的S1衣壳蛋白在其羧基末端处包含至少一个组氨酸残基。
在第六个方面，提供一种制备包含修饰的S1衣壳蛋白的呼肠弧病毒3型，Dearing株(T3D)的方法，所述方法包括以下的步骤：
(a)将编码修饰的T3D S1衣壳蛋白的cDNA引入至细胞中；
(b)用T3D呼肠弧病毒感染所述细胞；以及
(c)在诱导产生修饰的T3D病毒的条件下保持所述细胞；
其中所述修饰的T3D病毒，相对于野生型病毒，包含所述修饰的S1衣壳蛋白。
典型地，步骤(b)中使用的T3D呼肠弧病毒是经历上述方法的T3D的野生型、突变体、变体或修饰形式。
在第七个方面，本发明提供了繁殖呼肠弧病毒的方法。这些方法可能需要根据本文所述的任意一种方法修饰呼肠弧病毒的一种或多种组分，以及随后使修饰的呼肠弧病毒与细胞(例如，修饰的细胞)相接触，所述细胞表达能够与所述修饰的呼肠弧病毒的修饰的组分结合或相互作用的结构部分(如蛋白质化合物，例如，抗体等)。有利地，呼肠弧病毒可被修饰，从而包含修饰的衣壳组分，所述修饰的衣壳组分能够与由细胞表达或细胞上存在的化合物或结构部分相互作用或结合。以此方式，经与细胞的结构部分和呼肠弧病毒的修饰组分的相互作用(或之间的结合)，该细胞可被修饰的呼肠弧病毒感染。本领域技术人员应该理解，通过在允许产生/生成新病毒的条件下保持所述修饰的细胞，有可能繁殖该呼肠弧病毒。
同样地，本发明提供一种繁殖修饰的呼肠弧病毒的方法，所述方法包括以下的步骤：
(a)使根据本文所述的任意一种方法修饰的呼肠弧病毒与包含能够与所述修饰的呼肠弧病毒结合或相互作用的结构部分的细胞在允许所述修饰的呼肠弧病毒感染所述细胞的条件下进行接触；和
(b)在诱导产生修饰的呼肠弧病毒的条件下保持所述细胞。
由于上文，并且在一个实施方案中，提供一种繁殖修饰的呼肠弧病毒的方法，所述方法包括以下的步骤：
(a)根据本文所述的任意一种方法修饰S1衣壳蛋白，使得其在其羧基末端处包含至少一个组氨酸残基；
(b)将修饰的呼肠弧病毒与被修饰以表达能够结合所述至少一个组氨酸残基的结构部分的细胞接触；以及(c)在诱导产生修饰的病毒的条件下保持所述细胞。
优选地，所述修饰的呼肠弧病毒是修饰的呼肠弧病毒T3D，并且“细胞”来源于成胶质细胞瘤细胞系。在一个实施方案中，所述细胞是U118MG细胞。
有利地，能够结合所述至少一个组氨酸残基的结构部分是肽，如，例如，抗体。术语“结合结构部分”也可用来包括任何此类肽或抗体的组氨酸结合片段/部分。例如，并且在抗体的情况下，该片段可包括重链和/或轻链和/或F(ab)和/或F(ab)2片段中的一种或多种。例如，所述结合结构部分可以是单链抗体。
本领域技术人员应该理解，尽管缺少天然呼肠弧病毒受体(例如，JAM-A受体)，携带HIS-修饰的S1衣壳蛋白的修饰的呼肠弧病毒可感染细胞并在细胞(如U118MG细胞)中繁殖，所述细胞已经被修饰以表达与所述修饰的S1衣壳蛋白的至少一个组氨酸残基相互作用的单链抗体。
在一个具体的实施方案中，根据第七个方面的方法除了修饰衣壳蛋白以外，可允许繁殖呼肠弧病毒，该方法进一步包括对一种或多种其他的衣壳蛋白的修饰作用。例如，待繁殖的呼肠弧病毒可包括在S1衣壳蛋白的羧基末端上添加至少一个组氨酸残基的修饰作用以及对同一或另一衣壳蛋白的一种或多种另外的修饰作用。这些另外的修饰作用可包括，例如，一个或多个氨基酸的缺失、插入和置换，所述氨基酸包括负责与天然呼肠弧病毒受体相互作用的衣壳(例如S1)蛋白。应该理解“天然”的呼肠弧病毒受体可被认为是一般由呼肠弧病毒结合以便感染细胞的受体。此类受体可存在于正常、健康细胞上。在呼肠弧病毒T3D的情况下，天然受体可被认为是JAM-A。通过修饰负责与天然呼肠弧病毒受体相互作用的氨基酸序列，可能阻止或抑制修饰的呼肠弧病毒和天然呼肠弧病毒受体之间的结合、相互作用和/或缔合。
因此，并且在另一个实施方案中，根据第七个方面的方法可涉及繁殖修饰的呼肠弧病毒的方法，所述修饰的呼肠弧病毒包括在其羧基末端上添加至少一个组氨酸残基的修饰作用以及对改变与天然呼肠弧病毒受体相互作用的氨基酸的衣壳蛋白进行的另外的修饰作用。
有利地，所述另外的修饰作用可包括对呼肠弧病毒T3D的S1蛋白的氨基酸Asn369到Glu384的修饰作用。本领域技术人员应该理解，这些特定的残基已经被提示与JAM-A相互作用(Campbell等人，(2005)JunctionalAdhesion Molecule A Serves as a Receptor for Prototype and Field-IsolateStrains of Mammalian Reovirus(连接粘附分子A充当哺乳动物呼肠弧病毒的原型和野外分离株的受体).(JOURNAL OF VIROLOGY(病毒学杂志)，79：7967-7978)。
上述方法可用来繁殖病毒，所述病毒除了携带对S1蛋白的羧基末端的组氨酸修饰以外，还包括将阻止病毒与天然受体相互作用、结合或否则缔合的修饰引入至衣壳蛋白中的修饰作用。这样的病毒可用于治疗疾病，如癌症，因为它们可特异地靶向肿瘤细胞而非健康细胞。
在第八个方面，提供了一种分离修饰的呼肠弧病毒粒子的方法，所述方法包括使具有至少一种修饰的衣壳组分的修饰的呼肠弧病毒与能够与所述至少一种修饰的衣壳组分结合或相互作用的结构部分在这样的条件下相接触的步骤，所述条件允许所述至少一种修饰的衣壳组分和能够与所述至少一种修饰的衣壳组分结合或相互作用的结构部分之间的结合。例如，该方法可包括使在S1蛋白的羧基末端处具有一个组氨酸残基的修饰的呼肠弧病毒与组氨酸结合结构部分在这样的条件下相接触的步骤，所述条件允许所述至少一个组氨酸残基和该组氨酸结合结构部分之间的结合。
本领域技术人员应该理解，组氨酸结合结构部分可以是上述的任意一种结构部分。另外地，或备选地，组氨酸结合结构部分可包括金属离子，如镍离子。优选地，金属离子可结合或否则固定在一些形式的支持物上，如，例如，琼脂糖凝胶(sepharose)、玻璃、塑料、硝化纤维、琼脂糖等。
组氨酸结合结构部分可以柱的形式提供。作为实例，该柱可包括与镍离子偶联或缀合的琼脂糖凝胶。
该方法可包括洗涤步骤，在该步骤期间去除不与该组氨酸结合结构部分结合的任何修饰的呼肠弧病毒。
以此方式，修饰的呼肠弧病毒可从水溶液、细胞溶胞产物等中分离和/或浓缩。
在第九个方面，本发明提供了由本文所述的任意一种方法产生的修饰的呼肠弧病毒在制备针对由呼肠弧病毒科的成员引起或促成的疾病的疫苗中的应用。
在第十个方面，提供了由本文所述的任意一种方法产生的修饰的呼肠弧病毒在制造用于治疗细胞增殖和分化病症如，例如，癌症的药物中的应用。
详述
现在参考下面的附图描述本发明，附图中显示：
图1：不同细胞系中的呼肠弧病毒产率。
图2：S1 cDNA序列和由其编码的Sigma1蛋白的氨基酸序列。
图3：S1HIS cDNA序列和由其编码的sigma1-HIS蛋白的氨基酸序列。
图4：编码HAJam-A，scFvHIS和S1HIS的慢病毒构建体的图示。
图5：证明U118MG细胞中缺少Jam-A mRNA的逆转录酶PCR分析。下方的部分图示了引物相对于Jam-A mRNA的位置。
图6：如用WST细胞生存力测定法确定，呼肠弧病毒T3D感染的911和U118MG细胞的存活。
图7：如通过采用HA抗血清的Western分析检测，HAJam在U118MG细胞中的异源表达。
图8：呼肠弧病毒T3D感染后两天时在U118MG-HAJam细胞和U118MG细胞中的致细胞病变(cyopathic)效应。
图9：如图所示，呼肠弧病毒T3D感染细胞的[35S]甲硫氨酸-标记检测呼肠弧病毒蛋白的λ，σ和μ类。
图10：用LV-S1HIS-IRES-Neo转导的911细胞中的Sigma1-HIS蛋白。如通过采用抗HIS抗血清的western分析检测。
图11：对来自在911-S1HIS细胞上传代2次(P2)或3次(P3)的呼肠弧病毒T3D的蛋白提取物或作为对照对911细胞进行的Western分析。采用5-HIS(pentaHIS)血清进行该western分析以检测含HIS-标记物的Sigma1蛋白的存在。
图12：对用LV-scFvHIS-IRES-Neo细胞感染的U118MG细胞的蛋白提取物的Western分析。使用抗HA血清进行该western分析以检测转导的细胞中HA-标记的scFvHIS的存在。
图13：如用WST细胞存活测定法检测，用野生型呼肠弧病毒T3D和sigma1-HIS负荷的呼肠弧病毒感染后的细胞存活。
图14：用于富集获得了S1-HIS基因组节段的呼肠弧病毒T3D的选择系统的示意性简图。
图15：分别在911-S1His细胞和U118MG-scFvHIS细胞上连续传代(P)和选择(S)期间的呼肠弧病毒T3D的Western分析，其使用5HIS(pentaHIS)血清，以检测HIS标记的sigma1蛋白。M＝分子量标记，wt从911细胞中分离的野生型呼肠弧病毒T3D的样品。
图16：逆转录酶PCR，用于检测野生型呼肠弧病毒T3D和已经在U118MG-scFvHIS细胞上选择的S1-HIS呼肠弧病毒上的修饰的S1基因组节段。
图17：由来自在U118MG-scFvHIS细胞上针对存在HIS-标记物而选择的呼肠弧病毒的S1-HIS节段编码的Sigma1_HIS蛋白的氨基酸序列。来自4个分离株RT5、RT6、RT8和RT10的序列与在911细胞中表达的Sigma1-HIS(最上面的行)比较。
本公开书描述了本发明用于改造Sigma-1蛋白或呼肠弧病毒T3D中的氨基酸的异源序列段的应用。这些氨基酸容许携带修饰的Sigma-1蛋白的病毒结合并利用肿瘤细胞外部上的新蛋白受体。如从下面的观察显而易见的是相互作用是功能性的，所述观察是携带含有该氨基酸序列段的Sigma-1蛋白的呼肠弧病毒T3D能够感染表达能够结合所述氨基酸序列段的关联蛋白受体的肿瘤细胞，而亲代野生型呼肠弧病毒T3D则不能。携带含有该氨基酸序列段的Sigma-1蛋白的呼肠弧病毒T3D可在表达能够结合所述氨基酸序列段的关联蛋白受体的肿瘤细胞系上繁殖，而亲代野生型呼肠弧病毒T3D则不能。
本发明的方法依赖于使用常规的真核基因表达载体表达修饰的呼肠弧病毒T3D基因组节段。在本公开书中，申请人修饰了Sigma1基因组节段以编码携带由一束6个组氨酸组成的羧基末端延长的Sigma1蛋白。以如下的方式构建表达盒，即，mRNA在正链Sigma-1RNA的真CAP位点处起始。与野生型S1基因组节段相反，修饰的形式在正义RNA的正常3′端处是不截断的，而是延长并包含多聚腺苷酸束。任何常规的RNA聚合酶II依赖性转录盒可达到此目的。在目前的形式中，使用标准慢病毒载体。借助于标准慢病毒载体法(Carlotti等人，2004)，表达盒被转移至所谓的911细胞中。在生成的细胞中，野生型呼肠弧病毒T3D繁殖了3代。生成的病毒储液用来感染在其表面上表达结合HIS-标记物的单链(scFv)抗体的U118MG细胞。U118MG细胞缺少正常的呼肠弧病毒T3D受体Jam-A。野生型呼肠弧病毒既不能感染U118MG细胞也不能感染其表达scFvHIS受体的衍生物。然而，含有HIS-标记的S1蛋白的修饰的呼肠弧病毒T3D可使用scFvHIS受体作为替代受体并可在这些细胞中繁殖。我们通过western印迹和通过S1节段的核苷酸序列分析确认了子代病毒中HIS-标记物的存在。综合我们的数据证明(i)具有多腺苷酸化mRNA的呼肠弧病毒科的反向遗传学可行性，(ii)呼肠弧病毒科的遗传再靶向是可行的，以及(iii)S1蛋白的C末端是用于插入修饰宿主范围的修饰突变的有效位置。这将直接用于生成更有效的溶瘤性呼肠弧病毒，并将促进用于致病性呼肠弧病毒科的新疫苗的开发。
引物
表1：本研究中使用的引物
  引物   序列
  hjam new FrevRThjamhjamnest RReoS1N1ReoS1H3HisReoS1M2SigmaEnd RevS1endRevS1testForHisRevM13ForM13Rev   ATGGGGACAAAGGCGCAAGTCCACCAGGAATGACGAGGTCATACAAGTGTATGTCCCAGTGTCTTATTGCGGcCGCGATGAAATGCCCCAGTGCCGCCAAGCTTGCTATTGGTCGGATGGATCCTCGGCAGGGTGGTCTGATCCTCAGTGATGGTGATGGTGATGCGTGAAACTACGCGGGTAGATGAAATGCCCCAGTGCCGCGGGGTGGTCTGATCCTCAGATGAAATGCCCCAGTGCGAGCATGTGGATAGGAATTGGTGATGGTGATGGTGATGGTAAAACGACGGCCAGCAGGAAACAGCTATGAC
下划线的是限制性位点(NotI和HindIII)和HIS-标记物的序列
实施例1：构建用于异源表达呼肠弧病毒受体和呼肠弧病毒Sigma 1的载体
在第一个试验中，呼肠弧病毒T3D在小鼠L细胞上繁殖。感染后5天，通过冻融培养基和在其中重新悬浮的细胞而从感染细胞中释放子代病毒。使用此溶胞产物的一个等分试样来感染911细胞(Fallaux等人，1996)、911细胞的SV40大T表达克隆、PER.C6细胞(Fallaux等人，1998)和最初被称为293/tsA1609neo的293T细胞(DuBridge等人，1987)。在初次感染(在37℃，5％CO2下2小时)后，用含有10％胎牛血清(FCS)的标准达尔伯克氏改良伊格尔培养基(normal Dulbecco′s modified Eagles medium)(DMEM)更换培养基，并继续温育。在感染后48小时，在所有呼肠弧病毒T3D感染的细胞系中致细胞病变效应均很明显。在多个时间点处，收获培养基，并将细胞以109/mL的密度重新悬浮在含有2％FCS的磷酸盐缓冲液(PBS)中。通过冻融三个循环使病毒从细胞中释放。溶胞产物通过在台式离心机中以1200xg离心10分钟而变得澄清。如先前对腺病毒载体所述地，通过对911细胞进行标准的空斑测定法来测定病毒的浓度(Fallaux等人，1996)。图1中表示的数据显示所有被测的细胞系均产生了合理量的呼肠弧病毒T3D。在感染后48小时在911细胞中获得最高产率。为方便起见，911细胞系用作病毒生产和通过空斑测定法量化的标准细胞系。
为了获得Sigma 1基因组节段的互补DNA(cDNA)克隆，在DMEM/2％FCS中用呼肠弧病毒T3D以5空斑形成单位(pfu)/细胞感染911细胞。在初次感染(37℃，5％CO2下2小时)后，用含10％FCS的标准DMEM更换培养基。感染后24小时，使用Stratagene绝对RNA RT-PCR小量制备试剂盒(Stratagene Absolutely RNA RT-PCR Miniprep Kit)根据生产厂商的流程，从感染的细胞中提取RNA。采用引物对ReoS1/H3和ReoS1/N1(表1)并采用获自Invitrogen的Superscript II逆转录酶，S1基因组节段被拷贝为互补DNA(cDNA)并使用获自Promega的Taq聚合酶通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。在琼脂糖凝胶电泳后，S1-DNA片段用JETsorb凝胶提取试剂盒(Genomed)纯化，并用限制性核酸内切酶HindIII和NotI消化。将生成的片段克隆在HindIII和NotI消化的质粒pcDNA3.1+中。使用由此获得的连接混合物来转化大肠杆菌(Escherichia coli)株TOP10F′，并且分离并扩增(expanded)含有具有期望结构的质粒的克隆，命名为pCDNART3S1。来自克隆pCDNART3S1的质粒DNA用于在莱顿基因组技术中心(Leiden Genome Technology Center)使用引物对ReoS1/H3和ReoS1/N1进行序列分析。代表S1节段的cDNA的序列显示在图2中。下划线的是理论翻译起始序列。给出了Sigma-1蛋白的推测的氨基酸序列。
为了将呼肠弧病毒重新靶向至备选的受体，新的肽配体可包含在病毒衣壳中。一种选择是将编码此配体的密码子引入至编码衣壳组分的基因节段之一中。在衣壳组分和位置的选择中，需要以下列的方式选择用于插入关于该配体的密码子的位点，即，在病毒粒子中配体易接近被靶向的受体，并且不妨碍被修饰的衣壳组分的基本结构或功能。因此，我们选择将配体插入至Sigma-1蛋白中。呼肠弧病毒T3D的Sigma-1蛋白的一部分的晶体结构是已知的(Chappell等人，2002b)，并且以1KKE，DOI10.2210/pdb1kke/pdb保藏在布鲁克港蛋白质数据库(Brookhaven Proteindata bank)中。
将人工配体插入在Sigma-1蛋白的羧基末端处，因为该区位于头部结构域(head domain)中，该头部结构域靠近被假设与充当呼肠弧病毒T3D的天然受体的Jam-A蛋白相互作用的区域。(Chappell等人，2002b)。另外，Sigma 1的羧基末端以下列的方式定位，即，末端氨基酸指向外侧。因此，推测在羧基末端处融合另外的氨基酸应该不影响头部结构域的空间结构。此外，我们假设附加的氨基酸会在头部结构域的表面处被暴露，使得它们是可评估的并使它们能够与被靶向的受体相互作用。
为了向Sigma-1蛋白编码区的羧基末端添加编码6个组氨酸残基(′HIS-标记物′)的核苷酸序列，使用聚合酶链式反应克隆策略。制备两个不同的构建体，两个都含有与Sigma 1的那些相融合的HIS-标记物的密码子。第一个构建体含有HIS-标记物但缺少HIS标记的Sigma 1下游的所有呼肠弧病毒序列。因此该质粒缺少HIS-标记的Sigma 1蛋白编码区下游的非编码序列。第二个构建体含有编码HIS-标记的Sigma-1的节段的全部cDNA。该构建体含有整个3′非翻译区。
第一个质粒通过使用引物对HisReoS1 M2和ReoS1H3(其序列见表1)的聚合酶链式反应制备。为了生成含有平端的产物，使用Pfu聚合酶(Promega)。PCR产物用HindIII消化，然后进行凝胶电泳，凝胶提取和片段纯化。该产物被克隆进用HindIII和EcoRV消化的pCDNA3.1+的质粒DNA中。具有预期的限制图谱的质粒被命名为pRT3S1HISstop，并用于进一步研究。插入至pCDNA3.1+中的片段的序列通过DNA序列分析确定。结果验证片段的身份和预期序列。
使用pRT3S1HISstop作为模板以及SigmaEndRev和ReoS1H3的引物组合通过聚合酶链式反应生成质粒pRT3S1HISComplete。PCR产物用HindIII消化，然后进行凝胶电泳、凝胶提取和片段纯化。该产物被克隆进用HindIII和EcoRV消化的pCDNA3.1+的质粒DNA中。具有预期的限制图谱的质粒被命名为pRT3S1HISComplete，其用于进一步的研究。插入至pCDNA3.1+中的片段的序列通过DNA序列分析确定。结果验证片段的身份和预期序列。修饰的呼肠弧病毒S1基因组节段的cDNA序列显示在图3中，在该序列下面显示了Sigma-1-HIS蛋白的氨基酸序列。
为了生成稳定表达异源互补DNA(cDNA)克隆的细胞系，可相对容易地使用慢病毒载体。对于随后的试验，通过标准的克隆技术生成四种不同的慢病毒载体。在本研究中使用的所有慢病毒构建体均基于在pLV-CMV-IRES-NEO载体(Vellinga等人，2006)中制备的载体。图4给出了制备的构建体的图示。
为了生成质粒pLV-CMV-S1HIS-IRES-NEO和pLV-CMV-S1HISstop-IRES-NEO，构建体pRT3S1HISComplete和pRT3S1HISstop用Eco105I和XbaI消化，并克隆在质粒pLV-CMV-IRES-NEO的Eco105I和Xbal位点之间。
为了生成质粒pLV-CMV-HAJam-IRES-NEO，质粒pCDNA-HAJam(Naik等人，2001)(由Dr.U.P Naik友情提供)使用限制性核酸内切酶Eco105I和XbaI消化，并插入在质粒pLV-CMV-IRES-NEO的Eco105I和Xbal位点之间。
为了生成编码单链HIS-标记物受体的构建体，pHISsFv.rec(Douglas等人，1999)(由Dr.D.T.Curiel友情提供)用Eco105I和XhoI消化并插入在质粒pLV-CMV-IRES-NEO的Eco105I和XhoI位点之间。图4给出了制备的构建体的概貌。
慢病毒载体储液的生产完全如前所述地(Carlotti等人，2004；Vellinga等人，2006)在293T细胞上使用磷酸钙共沉淀法来进行。所有慢病毒载体均在转染后48小时收获。
为了产生稳定表达转基因的细胞系，在8μg/ml聚凝胺(polybrene)(Sigma Aldrich(西格玛奥德里奇)，Zwijndrecht，荷兰)的存在下将不同慢病毒载体储液的适当稀释物加入至细胞系(浓度为1-10ng p24/2500细胞)中，并温育过夜。第二天，向细胞提供新鲜培养基。48小时后，通过胰蛋白酶消化分离细胞，并将其重新涂布在含有700μg/ml G418(Invitrogen，布莱达(Breda)，荷兰)的培养基中以选择G418抗性细胞群。开始选择后3-5天时，用含有200μg G418/ml的培养基更换培养基。
实施例2：U118MG细胞由于缺少呼肠弧病毒受体Jam-A而抵抗呼肠弧病毒感染。
几个小组已经证明U118MG完全地抵抗呼肠弧病毒感染。(Wilcox等人，2001；Yang等人，2003)。为了针对我们的U118MG验证此观察结果，，我们通过逆转录酶聚合酶链式反应(rtPCR)分析了Jam-A mRNA的存在。作为阳性对照，我们在此分析中包括了911细胞。
用于逆转录酶反应的引物列举在表1中。U118MG细胞和911细胞接种在5cm皿中。在培养物汇合后，使用获自Stratagene的绝对RNA小量制备试剂盒(Absolutely RNA Miniprep Kit)从细胞中分离RNA。使用RevRThJam引物(根据说明书，每次反应2pmol)，在采用Superscript II(Invitrogen)第一链合成中使用600ng RNA/细胞系。使用2μl cDNA来进行使用RevRThJam和hJam new F的引物组合的扩增反应以扩增hJam-A的全编码区(928bp)。另外，使用引物对组合hJamnest R和hjam new F来扩增较短的产物(359bp)。使用Taq聚合酶(Promega)以由下列循环组成的方案来扩增：3分钟95℃，(30s 95℃-40s 58℃-1分钟72℃)x30-10分钟72℃-10分钟4℃-结束。结果描绘在图5中。尽管Jam-A RNA很容易在911细胞中检测到，但在U118MG来源的样品中没有明显的信号，这表明MG118细胞缺少可检测水平的Jam-A mRNA。
为了验证U118MG细胞对呼肠弧病毒T3D感染有抗性，使U118MG细胞的培养物暴露于各种感染复数的呼肠弧病毒T3D病毒。作为此试验中的对照，911细胞的培养物在相同的感染复数下暴露。尽管致细胞病变效应在911细胞的培养物中很容易观察到，但在MG118培养物中病毒感染时改变不明显，甚至在较长的温育时间时也不明显。这些培养物中细胞的生存力用WST细胞生存力测定法进行测定(图6)。这些数据再次确证尽管呼肠弧病毒T3D很容易杀死911细胞，但U118MG细胞完全抵抗呼肠弧病毒T3D感染。
为了证明这种结果是由于缺少Jam-A受体，使U118MG细胞暴露于慢病毒载体pLV-CMV-HAJam-IRES-NEO，以迫使充当呼肠弧病毒的初级受体的HA-标记的Jam-A蛋白的合成。使用HA特异性抗血清进行的G418-抗性LV-CMV-HAJam-IRES-NEO-转导的细胞群的蛋白溶胞产物的western分析证明了这些细胞中HA-标记的Jam-A的强力表达(图7)。这进一步通过免疫荧光显微法确证，免疫荧光显微法揭示在转导和选择的细胞群中的绝大多数细胞中均可检测到HA-Jam-A信号。这些细胞暴露于呼肠弧病毒T3D导致在表达HA-Jam的U118MG细胞中致细胞病变效应的征象的快速形成，但在亲代U118MG细胞中不形成(图8)。这进一步通过病毒蛋白的代谢标记来确证。感染或模拟感染细胞用Redivue[35S]甲硫氨酸原混合物(Pro-mix)(200μCi/ml；Amersham，罗森达尔(Roosendaal)，荷兰)在感染后的多个时间点时标记4小时。细胞用PBS洗涤一次，并在含有蛋白酶抑制剂混合物(完整小片(Complete mini tablets)，罗氏诊断(RocheDiagnostics)，阿尔梅勒(Almere)，荷兰)的Giordano溶胞缓冲液(50mMTris-HCl pH 7.4，250mM NaCl，0.1％Triton，5mM EDTA)中溶解。所有标记测定在24孔板中完成，每孔使用5μl原混合物，并且溶胞缓冲液的体积为每孔100μl。加入样品缓冲液后，将其50μl加入至10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。将凝胶干燥并暴露于射线照相胶片，并且遵照标准程序处理(图9)。结果证明在911细胞和表达HA-Jam-A的U118MG细胞中存在病毒蛋白，但在未修饰的U118MG细胞中不存在。从这些数据我们得出结论，U118MG细胞抵抗呼肠弧病毒T3D感染，并且这仅仅是由于缺少可充当呼肠弧病毒T3D感染的初级受体的Jam-A蛋白而引起的。
实施例3：产生Sigma 1的911细胞系的生成。
作为下一步骤，我们生成了产生呼肠弧病毒T3D蛋白的细胞系。为此目的，以1-10ng p24/2500个细胞的浓度将911细胞暴露于LV-CMV-S 1HIS-IRES-NEO载体病毒。在选择G418抗性细胞群，在此命名为911-S1HIS细胞后，从这些细胞生成蛋白溶胞产物，并使用以1∶1500稀释的α-5-His血清(Qiagen Benelux bv，荷兰)通过western分析而进行分析，以检测含HIS-标记物的Sigma 1蛋白。结果绘制在图10中。这些数据证明在G418选择中存活的LV-CMV-S1HIS-IRES-NEO转导的细胞中存在49kDa条带，而在亲代911细胞中不存在该条带。从这些数据我们得出结论911细胞系含有显著量的HIS标记的S1蛋白。这意味着S1过表达对细胞没有毒性。
实施例4：在病毒衣壳中功能性地引入修饰的Sigma 1蛋白
随后，我们用呼肠弧病毒T3D以约10的感染复数感染911-S1HIS细胞。出现致细胞病变效应后1天，收获病毒，通过冻融释放细胞结合的病毒，并使用1/100的产物感染911-S1HIS细胞的次级培养物(second culture)。病毒在911-S1HIS上连续传代3次。分离的病毒的等分试样使用α-5-His血清通过western分析来分析。结果绘制在图11中。抗HIS血清检测到以预期的尺寸迁移的蛋白，这提示呼肠弧病毒能够将HIS标记的Sigma 1蛋白引入在其衣壳中。
为了检测在此位置中插入的氨基酸是否可与HIS-标记物功能性地相互作用，U118MG细胞被修饰以表达可与其细胞表面上的HIS-标记物相互作用的单链抗体。为此，使U118MG细胞暴露于慢病毒载体LV-CMV-scFvHIS-IRES-NEO。如从使用HA抗血清作为探针对细胞的蛋白溶胞产物进行的western分析中显而易见地，G418抗性细胞群表达单链HIS受体(图12)。在亲代U118MG细胞中，缺少该信号。免疫荧光显微法还揭示在培养的所有细胞中有均一的染色，证明在所有细胞中有相似量的蛋白。从这些数据我们得出结论，现在U118MG细胞在其表面上表达单链HIS受体。
为了检测单链HIS受体是否可被用作携带HIS标记的Sigma-1蛋白的呼肠弧病毒T3D的替代受体，使细胞系暴露于增加量的病毒储液，并且作为对照，暴露于等量的亲代野生型呼肠弧病毒T3D。表达HA标记的JAM-A的U118MG细胞对911来源的T3D呼肠弧病毒和911-S 1HIS来源的呼肠弧病毒均敏感，而U118MG-scFvHIS细胞仅对911-S1HIS来源的呼肠弧病毒敏感，但对911来源的T3D呼肠弧病毒不敏感。在使用在911-S 1HIS细胞系上繁殖的T3D病毒感染后三天显微镜检查U118MG-scFv-HIS细胞时，致细胞病变效应变得很明显。这些数据使用WST细胞存活力测定法进行量化(图13)。综合这些数据，证明scFv-HIS可用作U118MG细胞中的人工受体。这使U118MG细胞的感染能够继续进行而不依赖于正常的呼肠弧病毒T3D受体Jam-A。另外，验证了HIS标记的Sigma-1蛋白在病毒衣壳中的存在，并且证明HIS-标记物暴露在病毒衣壳处，从而容许U118MG-scFv-HIS细胞的感染。
实施例5：在呼肠弧病毒中引入修饰的S1基因组节段
为了检测呼肠弧病毒T3D是否获得了在911-S1HIS细胞上繁殖期间引入的HIS标记的S1基因组节段，使用从911-S1HIS细胞收获的病毒来感染U118MG-scFvHIS细胞。在出现明显的致细胞病变效应的征象时，通过轻轻地将细胞从皿上冲洗下来而使细胞与表面分离，并且通过研磨(triturating)细胞而将其悬浮在条件培养基中。通过冻融从细胞中释放病毒。随后，该批次呼肠弧病毒在台式离心机中以2000rpm离心10分钟而澄清。该批病毒再次用来感染U118MG-scFvHIS细胞，并且感染后4天收获细胞。该程序重复6次。该选择方案概括在图14中。在连续繁殖时，在用从911-S1HIS细胞收获的呼肠弧病毒T3D初次感染的U118MG-scFvHIS中致细胞病变效应的征象变得比用从911细胞中分离的呼肠弧病毒T3D感染的细胞中更明显。这提示病毒可以在U118MG-scFvHIS细胞上繁殖。对用在911-S1HIS细胞上繁殖的呼肠弧病毒及其连续传代的子代感染的U118MG-scFvHIS细胞的蛋白溶胞产物的western分析，证明了溶胞产物中HIS标记的S1蛋白的存在(图15)。
为了证明HIS标记的S1基因组节段的存在，对从作为第7代的连续传代的呼肠弧病毒T3D中分离的RNA进行逆转录酶聚合酶链式反应(rtPCR)分析。在用连续传代的病毒感染的U118MG-scFvHIS细胞中出现致细胞病变效应的征象时，使用获自Stratagene的绝对RNA小量制备试剂盒(Absolutely RNA Miniprep Kit)从细胞中分离RNA。使用HisRev引物(根据说明书，每次反应2pmol)，在采用Superscript II(Invitrogen)是第一链合成中使用600ng RNA/细胞系。使用2μl cDNA来进行使用HisRev和ReoS1N1的引物组合的扩增反应以扩增S1基因组节段的全编码区。使用Taq聚合酶(Promega)来扩增，采用由下列循环组成的方案：3分钟95℃，(30s 95℃-40s 58℃-80s 72℃)x30-10分钟72℃-10分钟4℃-结束。结果描绘在图16中。HIS标记的S1产物在U118MG-scFvHIS中很容易检测到，而在用未修饰的911细胞来源的呼肠弧病毒T3D感染的U118MG-scFvHIS细胞中无明显信号。根据生产厂商的说明书，将PCR产物克隆在质粒pCRII-TOPO(Invitrogen)中。具有插入片段的克隆被单独地扩增，并且从这些克隆中分离的质粒DNA分别使用M13反向和M123正向引物用于DNA序列分析。克隆的PCR产物的序列分析确认在Sigma1编码区C末端的预期位置处存在HIS-标记物的密码子。由四种不同的S1HIS cDNA克隆编码的sigma-1蛋白的氨基酸序列显示在图17中。亲代序列(来自图3)表示在最上面一行，并且命名为Sigma1-His(克隆的)。克隆RT5和RT6的氨基酸序列与亲代克隆相同，但RT8和RT10分别具有1个和2个氨基酸差别。尽管如此，如所预期地，在所有情况下HIS-标记物都连接到sigma 1的羧基末端。
从这些数据，我们得出结论在911S1HIS细胞上繁殖时，呼肠弧病毒T3D获得了HIS标记物的密码子。这最有可能是亲代野生型亲代S1基因组节段和异源S1RNA之间的重配过程(reassorting process)的结果。然而，基于到目前为止获得的数据，其他机制如重组，或复制期间的模板转换(template switching)不能被排除在外。
连续繁殖的病毒不能感染未修饰的U118MG细胞，从而证明转导严格地依赖于细胞上的scFv-HIS蛋白，该蛋白的作用是替代受体。
综合我们的数据显示通过在含有嵌入呼肠弧病毒S1基因组节段的多腺苷酸化mRNA的细胞上繁殖呼肠弧病毒可相对容易地生成再靶向的呼肠弧病毒。在细胞中表达的mRNA是单链的，并含有S1基因组节段的整个正链RNA。然而，尽管在5′端，异源S1mRNA在真正的S1基因组节段的位置处或附近起始，但是3′端显著地延长并含有IRES序列、NEO基因、乙型肝炎病毒(HBV)来源的转录后调控元件(PRE)和人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)长末端重复序列的一部分。很显然，S1基因组节段的正链上存在3′延长不干扰再靶向突变作用的获得。
参考文献目录
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Claims (22)

1.一种修饰属于呼肠弧病毒科(Reoviridae)的病毒的基因组的方法，所述方法包括以下的步骤：
(d)将编码呼肠弧病毒基因组的修饰部分的核酸引入至细胞中；
(e)用呼肠弧病毒感染所述细胞；以及
(f)在诱导产生修饰病毒的条件下保持所述细胞；
其中所述修饰病毒，相对于步骤(b)中使用的呼肠弧病毒，包含修饰的基因组，所述修饰的基因组包括所述呼肠弧病毒基因组的修饰部分。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述属于呼肠弧病毒科的病毒是正呼肠弧病毒属(Orthoreovirus)、环状病毒属(Orbivirus)、轮状病毒属(Rotavirus)或科罗拉多比蜱传热症病毒属(Coltivirus)物种。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中包含所述呼肠弧病毒基因组的一个或多个双链RNA基因组节段被修饰。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述一个或多个双链RNA基因组节段的一部分或多部分被修饰。
5.如前述任一项权利要求所述的方法，其中由所述基因组编码的一种或多种病毒组分被修饰。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述一种或多种病毒组分是结构组分和/或非结构组分。
7.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述呼肠弧病毒基因组被修饰从而包含一条或多条异源核酸序列。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述异源核酸序列编码诱导细胞死亡或凋亡的一种或多种化合物或可抑制或阻碍一个或多个细胞过程的一种或多种化合物。
9.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述待引入至细胞中的核酸包含在RNA聚合酶II依赖性转录盒内。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述RNA聚合酶II依赖性转录盒是慢病毒载体。
11.一种修饰属于呼肠弧病毒科的病毒的细胞向性的方法，所述方法包括以下的步骤：
(d)将编码呼肠弧病毒的修饰组分的核酸引入至细胞中；
(e)用呼肠弧病毒感染所述细胞；以及
(f)在诱导产生具有修饰的细胞向性的修饰的呼肠弧病毒的条件下保持所述细胞；
其中所述具有修饰的向性的修饰的呼肠弧病毒，相对于步骤(b)中使用的呼肠弧病毒，包含所述呼肠弧病毒的修饰组分。
12.一种修饰呼肠弧病毒3型，Dearing株(T3D)的Sigma-1(S1)衣壳蛋白的方法，所述方法包括以下的步骤：
(a)将包含编码修饰的T3D S1蛋白的cDNA的慢病毒载体引入至细胞中；
(d)用T3D病毒感染所述细胞；以及
(e)在诱导产生具有修饰的S1蛋白的修饰T3D病毒的条件下保持所述细胞；
其中所述具有修饰的S1衣壳蛋白的修饰的T3D病毒，相对于步骤(b)中使用的T3D病毒，还包含编码所述修饰的S1衣壳蛋白的修饰的基因组。
13.一种由权利要求1-12所述的方法产生的属于呼肠弧病毒科家族的修饰病毒。
14.修饰的呼肠弧病毒3型，Dearing株(T3D)，所述病毒包含修饰的S1衣壳蛋白，所述修饰的S1衣壳蛋白在其羧基末端处包含至少一个组氨酸残基。
15.一种繁殖修饰的呼肠弧病毒的方法，所述方法包括以下的步骤：
(a)将根据权利要求13或14所述的呼肠弧病毒或根据权利要求1-12所述的任意一种方法修饰的呼肠弧病毒与包含能够与所述修饰的呼肠弧病毒结合或相互作用的结构部分的细胞在允许所述修饰的呼肠弧病毒感染所述细胞的条件下进行接触；和
(b)在诱导产生修饰的呼肠弧病毒的条件下保持所述细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述修饰的呼肠弧病毒是T3D呼肠弧病毒，所述T3D呼肠弧病毒包含如下修饰的S1衣壳蛋白，即所述修饰的S1衣壳蛋白在其羧基末端处包含至少一个组氨酸残基，并且此外其中所述细胞的结构部分能够结合所述修饰的S1衣壳蛋白的至少一个组氨酸残基。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述修饰的呼肠弧病毒进一步包括对衣壳蛋白的一种或多种附加的修饰作用。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述附加的修饰包括对呼肠弧病毒T3D的S1蛋白的氨基酸Asn369至Glu384的修饰作用。
19.通过权利要求15-18所述的方法繁殖的病毒在治疗疾病如癌症中的应用。
20.一种分离修饰的呼肠弧病毒粒子的方法，所述方法包括将在所述S1蛋白的羧基末端处具有至少一个组氨酸残基的修饰的呼肠弧病毒与组氨酸结合结构部分在允许所述至少一个组氨酸残基和所述组氨酸结合结构部分之间的结合的条件下进行接触的步骤。
21.由本文所述的任意一种方法产生的修饰的呼肠弧病毒在制备用于预防由呼肠弧病毒科的成员引起或促进的疾病的疫苗中的应用。
22.由本文所述的任意一种方法产生的修饰的呼肠弧病毒在制造用于治疗细胞增殖和分化病症的药物中的应用。
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