CN101918020A

CN101918020A - 修饰的il-4突变蛋白受体拮抗剂

Info

Publication number: CN101918020A
Application number: CN2008801246425A
Authority: CN
Inventors: D·布瓦韦尔; E·伯迈斯特-盖茨; K·德拉里尔; M·朗夫里; A·汤姆金森; T·M·翁
Original assignee: Aerovance Inc
Current assignee: Aerovance Inc
Priority date: 2007-11-14
Filing date: 2008-11-14
Publication date: 2010-12-15
Also published as: EA201070613A1; KR20100096171A; BRPI0820633A2; US20110183920A1; US20090010874A1; US7785580B2; JP2011503204A; WO2009065007A1; WO2009065007A8; EP2219660A4; AU2008322569A1; CA2705810A1; IL205749A0; EP2219660A1

Abstract

本发明涉及修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其包含与聚乙二醇偶联的IL-4突变蛋白受体拮抗剂。还提供了用于治疗目的的相关配制物、其给药剂量和给药方法。这些修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂、组合物和方法通过抑制IL-4和IL-13-介导的气道高反应性和嗜曙红细胞增多给那些患有呼吸病症如哮喘的个体提供治疗选择。更具体而言，这些拮抗剂由于血浆半衰期较长而相对于未修饰的IL-4RA具有增加的效应持续时间。

Description

修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂

发明背景

发明领域

本发明涉及与非蛋白聚合物如聚乙二醇偶联的IL-4突变蛋白受体拮抗剂。另外，提供了用于治疗目的的相关配制物、其给药剂量和给药方法。这些修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂以及有关的组合物和方法用于给患有严重哮喘、慢性阻塞性肺疾病和相关肺病症的个体提供治疗选择。

背景信息

哮喘的特征是可变的可逆性气流阻塞和气道高反应性(airway hyper-responsiveness(AHR))，与活化的T-淋巴细胞(T-细胞)和嗜酸性粒细胞浸润支气管粘膜相关。这些细胞和驻留的气道肥大细胞一起分泌多种细胞因子和调节子，它们在疾病发病机理中起到基础性的作用。据认为，CD4+Th2细胞通过释放特定的细胞因子(IL-4、IL-5、IL-9和IL-13)而引起疾病过程(1，2)。具体而言，Th2细胞因子IL-4和IL-13被认为对气道炎症和气道高反应性的发展和维持是至关重要的。

许多体内研究也支持IL-4和IL-13在哮喘发病机理中的关键作用。应用任一细胞因子缺陷的动物，或抑制IL-4或IL-13功能的试剂，观察到了这些细胞因子在调节初次免疫应答和二次免疫应答中的重要作用，所述免疫应答导致气道炎症和气道高-反应性(3，4)。经日积月累，这些数据表明，IL-4和IL-13在过敏性气道应答中起重叠和独立的作用，以及靶向这两种细胞因子相对于单独靶向任一细胞因子具有明显增加的益处。

文献中曾报道过IL-4的拮抗剂。起拮抗剂作用的IL-4突变体包括IL-4拮抗剂突变蛋白IL-4/Y124D(Kruse，N.，等，Conversion of human interleukin-4into a highaffinity antagonist by a single amino acid replacement，Embo J.11：3237-44，1992)和双突变蛋白IL-4[R121D/Y124D](Tony，H.，等，Design of Human Interleukin-4Antagonists in Inhibiting Interleukin-4-dependent and Interleukin-13-dependentresponses in T-cells and B-cells with high efficiency，Eur.J.Biochem.225：659-664(1994))。单个突变蛋白是由天冬氨酸在D-螺旋中位置124处替代酪氨酸。双突变蛋白是由天冬氨酸分别在D-螺旋中位置121和位置124处替代精氨酸和酪氨酸。D-螺旋这部分的变异与第二结合区相互作用的变化呈正相关。

显示野生型IL-4激动作用或拮抗作用的IL-4突变变体对于治疗与IL-4多效效应之一相关的病症是有用的。例如，IL-4的拮抗剂在治疗由于IL-4产生而加剧的病症中是有用的，所述病症诸如哮喘、过敏或其它炎症反应相关的病症。IL-4的拮抗剂对于治疗其中IL-4的存在与疾病的改善或缓解相关的病症是有用的，所述疾病例如自身免疫性疾病，如类风湿关节炎、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病等。这些自身免疫性疾病的特征是在T辅助细胞群，1型和2型(Th1，Th2)产生中的极化。幼稚CD4+T细胞根据刺激过程中所存在的细胞因子而分化成Th1或Th2亚群。IL-4激动剂理想地转换产生期望的T辅助细胞，即，转换为产生Th2，从而具有治疗效果。

PCT/US93/03613公开了这样的IL-4变体，所述IL-4变体在α-螺旋结构域中具有Phe-Leu或Tyr-Leu序列和紧接着在Phe-Leu或Tyr-Leu序列上游或下游的两个氨基酸中具有带负电荷的氨基酸，该变体由于中性氨基酸替代了带负电荷的氨基酸而具有对IL-4受体增加的亲合性。其还公开了IL-4的α-螺旋中Trp-Leu或Phe-Leu在带负电荷残基的2-残基中的特定替代导致亲合性提高。该变体是IL-4融合蛋白(具有白喉毒素)。

在其氨基酸序列的两个位置中突变的、来源于人IL-4的重组突变蛋白(IL-4RA)先前在美国专利第6,028,176号和第6,313,272中进行了报道。IL-4RA以高亲合性与人IL-4受体α链——IL-4和IL-13受体复合物的重要的功能信号传导组分——结合。该突变蛋白没有激动剂活性，并且起体外有效的竞争性IL-4和IL-13受体拮抗剂的作用(参见美国专利第6,028,176号和第6,313,272号)。应用IL-4RA的明显缺点是其体内半衰期相对短(大约3-6hrs)。IL-4RA在灵长类哮喘模型中的药物代谢动力学/药物动力学建模表明，最佳治疗效果的有效平均稳态浓度是大约60ng/ml。

一种克服半衰期短的方法是频繁给予患者IL-4RA突变蛋白，然而频繁给药(常常通过注射或气管插管)产生临床上非常明显的患者接受治疗和治疗性给药的障碍。

发明概述

本发明提供半衰期比先前报道的突变蛋白大的IL-4RA突变蛋白。本发明还提供抑制IL-4和IL-13介导的免疫反应的药剂和方法。本发明的这一方面和其它方面由下面列出的一种或更多种实施方式提供。

在一个实施方式中，本发明提供修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂的纯化制剂，其包含与选自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯的非蛋白聚合物偶联的IL-4突变蛋白受体拮抗剂。在该实施方式的一个方面，所述纯化制剂包含修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂多肽，该多肽包含SEQ ID NO：32中列出的氨基酸序列。在该实施方式的一个方面，所述纯化制剂包含修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂多肽，该多肽包含SEQ ID NO：33中列出的氨基酸序列。在该实施方式的另一个方面，所述聚乙二醇(PEG)是线性的或支化的并且具有范围从3kD至50kD的分子量。在一个实施方式中，所述PEG部分约40kD。

在一个实施方式中，修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂多肽可以在IL-4的位置28、36、37、38、104、105或106的氨基酸残基处与非蛋白聚合物偶联。这些位置根据野生型IL-4(即人白介素-4)氨基酸序列进行编号。在该实施方式的一个方面，在位置28、36、37、38、104、105或106处的氨基酸残基是半胱氨酸。在该实施方式的另一个方面，在位置121、124和125处的氨基酸残基是天冬氨酸。在该实施方式的另一个方面，在位置13处的氨基酸残基是天冬氨酸以及在位置121和124处的氨基酸残基是天冬氨酸。

在一个实施方式中，本发明的修饰的突变蛋白受体拮抗剂以约0.1nM至约10μM、约0.5nM至约1μM或约1.0nM至约100nM的K_D与IL-4受体α链结合。

在另一个实施方式中，修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂以约0.1nM至约10μM、15约0.5nM至约1.0μM或约1.0nM至约100nM的IC₅₀抑制TF-1细胞对IL-4的增殖应答。

在又一实施方式中，修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂以选自约0.1nM至约10μM、约0.5nM至约1μM或约1.0nM至约100nM的IC₅₀抑制TF-1细胞对IL-13的增殖应答。

在进一步的实施方式中，修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂以选自约0.1nM至约10μM、约0.5nM至约1.0μM或约1.0nM至约100nM的IC₅₀抑制人B细胞对IL-4的增殖应答。

在另一个实施方式中，修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂以选自约0.1nM至约10μM、约0.5nM至约1μM、约1.0nM至约100nM的IC₅₀抑制人T细胞对IL-4的增殖应答。

在又一实施方式中，本发明的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂具有为未修饰的IL-4受体拮抗剂血浆半衰期的至少约2-10倍的血浆半衰期。

本发明还提供药物组合物，其包含(a)与人IL-4受体结合的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂；以及(b)药学上可接受的载体。

本发明还提供纯化的多核苷酸，其包含(a)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：31中列出的核苷酸序列；或(b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33中列出的氨基酸序列。

本发明还提供表达载体，其包含本发明的多核苷酸；和包含本发明表达载体的宿主细胞。

此外，本发明提供制备修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂的方法，其包括如下步骤：(a)在表达拮抗剂的条件下培养上述宿主细胞；以及(b)从宿主细胞培养物中纯化所述拮抗剂。在具体的方面，由本发明方法产生的拮抗剂可以抑制IL-4和IL-13介导的活性并且与选自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯的非蛋白聚合物偶联。

本发明还提供治疗与IL-4和IL-13活性增强相关的人类病症的方法，其包括如下步骤：(a)提供患有IL-4和IL-13活性增强的病症的人；以及(b)给予所述人有效量的本发明修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂或本发明的药物组合物。在一方面，所述病症是哮喘、慢性阻塞性肺疾病(如肺气肿或慢性支气管炎)或相关的肺部病症。

本发明还提供制备活性形式的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂的方法、由所述方法制备的拮抗剂、包含所述拮抗剂的组合物和包含给予所述拮抗剂和包含所述拮抗剂的药物组合物的治疗人病症的方法。所述方法包括如下步骤：(a)在表达拮抗剂的条件下培养上述宿主细胞；(b)使所述拮抗剂在二硫苏糖醇存在的情况下重折叠；以及(c)从宿主细胞培养物中纯化所述拮抗剂。在一个实施方式中，所述方法进一步包括如下步骤：(d)将所述拮抗剂与非蛋白聚合物偶联；以及(e)纯化与非蛋白聚合物偶联的拮抗剂。

从下面对某些优选实施方式更加详细的描述和权利要求看，本发明的具体优选实施方式将变得明显。

附图简述

图1显示了PEG化反应化学的图示。

图2是显示IL-4双突变蛋白(IL-4DM)与在位置38C处具有30kD线性或40kD支化PEG的相同分子相比与IL-4Rα结合的BIAcore数据的图表。

图3是显示用IL-4刺激抑制TF-1生长的数据的图表，其揭示了PEG化的IL-4TM(T13D/R121D/Y124D)比PEG化的IL-4DM更有效并且等于IL-4DM(R121D/Y124D)的有效性。

发明详述

本发明涉及修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其包含与非蛋白聚合物、优选聚乙二醇分子偶联的IL-4突变蛋白受体。

除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数以及复数术语应当包括单数。

本文使用的节段标题仅仅是为了组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有参考文献通过引用明确并入本文。

术语“多核苷酸”或“核酸序列”或“核酸分子”指DNA或RNA序列。该术语包括由DNA和RNA的任意已知碱基类似物形成的分子，所述碱基类似物诸如但不限于4-乙酰基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮杂环丙基-胞嘧啶、假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基-甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异-戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(mannosylqueosine)、5′-甲氧基羰基-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-5N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧代乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧代乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧代乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧代乙酸、假尿嘧啶、辫苷、2-硫代胞嘧啶和2，6-氨基嘌呤。

术语“纯化的”或“分离的”多核苷酸指这样的本发明核酸分子，所述核酸分子：(1)当总核酸与来源细胞分离时与至少约50％的蛋白质、脂质、糖类或与其一起天然发现的其它物质分离，(2)不与自然界中“分离的核酸分子”连接的全部或部分多核苷酸连接，(3)与自然界中其不连接的多核苷酸可操作地连接，或(4)不作为较大的多核苷酸序列的一部分出现在自然界中。优选本发明的分离的核酸分子基本上不含任意其它污染核酸分子(或多个)或在其自然环境中发现的其它污染物，所述其它污染物将干扰分离的核酸分子在多肽生产中的应用或分离的核酸分子的治疗、诊断、预防或研究应用。

如本文所用，“野生型IL-4”或“wtIL-4”和其等价物可互换使用，意即人白细胞介素-4——天然的或重组的，具有129个通常出现的天然人IL-4氨基酸序列，如在美国专利第5,017,691号中所公开的，通过引用并入本文。进一步，本文描述的修饰的人IL-4受体拮抗剂可以具有各种插入和/或删除和/或与非蛋白质聚合物偶联，并且按照wtIL-4进行编号，意即所选择的具体氨基酸是在wtIL-4中通常存在的相同氨基酸。因此，本领域技术人员将会理解，在位置，例如第13位(苏氨酸)、第121位(精氨酸)和/或第124位(酪氨酸)处通常出现的氨基酸，可以在突变蛋白中被转换。因而，半胱氨酸残基在氨基酸位置如第38位、第102位和/或第104位处的插入可以在突变蛋白上转换。然而，转换的丝氨酸(S)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)或插入的半胱氨酸(C)的位置可以通过检查和关联这些侧翼氨基酸与wtIL-4中那些在丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或半胱氨酸侧翼的氨基酸确定。

进一步，编码人IL-4或突变人IL-4蛋白的DNA序列可以包括或不包括编码信号序列的DNA序列。这种信号序列，如果存在，应该是被选择用于表达IL-4突变蛋白的细胞所识别的信号序列。其可以是原核的、真核的或是两者组合。其也可以是天然IL-4的信号序列。信号序列的包含取决于是否期望从制备IL-4突变蛋白的重组细胞中分泌出IL-4突变蛋白。如果所选择的细胞是原核的，一般优选DNA序列不编码信号序列但包括N-末端甲硫氨酸以指导表达。如果所选的细胞是真核的，一般优选编码信号序列，并且最优选被使用的是野生型IL-4信号序列，如在美国专利第6,028,176号中所公开，其通过引用而并入本文。

如本文所用，术语“突变的人IL-4蛋白”、“修饰的人IL-4受体拮抗剂”、“mhIL-4”、“IL-4突变蛋白”、“IL-4拮抗剂”和其等同物可互换使用，并在发明的范围之内。这些多肽和其功能片段是指其中已经对成熟人IL-4蛋白进行特定氨基酸置换的多肽。这些多肽包括本发明的mIL-4组合物，其被给予需要治疗哮喘的对象。具体而言，本发明的mhIL-4至少包括R121D/Y124D置换对(“IL-4RA”)(SEQID NO：31)。

如本文所用，“功能片段”是具有IL-4拮抗活性的多肽，包括更小的肽。mhIL-4和hIL-4修饰的这些和其他方面在美国专利编号第6,335,426；6,313,272；和6,028,176，号中描述，其全部内容通过引用而并入本文。

通过“根据野生型IL-4编号”我们的用意是，参考在野生型IL-4中氨基酸通常出现的位置来鉴定所选的氨基酸。

术语“载体(vector)”用来指用于将编码信息传递到宿主细胞的任意分子(例如，核酸、质粒或病毒)。

术语“表达载体”指适于宿主细胞转化并且含有指导和/或控制插入的异源核酸序列表达的核酸序列的载体。表达包括但不限于诸如转录、翻译和RNA剪接——如果内含子存在——的过程。

术语“宿主细胞”在本文中用来指已经用核酸序列转化或能够用核酸序列转化，然后表达选择的感兴趣的基因的细胞。该术语包括母细胞的子代——只要选择的基因存在，不论子代的形态学或遗传组成是否与原母代相同。

术语“转导”用来指通常利用噬菌体将基因从一个细菌转移至另一细菌。“转导”还指通过逆转录病毒获得和转移真核细胞序列。

术语“转染”用来指细胞对外来(foreign)或外源DNA的吸收，以及当外源DNA导入细胞膜内时细胞已经被“转染”。许多转染技术在本领域中是周知的并且公开在本文中。参见，例如Graham等1973，Virology 1052：456；Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratories，1989)；Davis等，Basic Methods in Molecular Biology(Elsevier，1986)；以及Chu等，1981，Gene13：197。这些技术可以用来将一个或更多个外源DNA部分导入适合的宿主细胞中。

如本文所用，术语“转化”指细胞遗传特性的改变，以及当细胞被修饰来含有新DNA时该细胞已经被转化。例如，在从细胞的天然状态遗传修饰细胞时该细胞被转化。在转染或转导后，转化DNA可以通过物理方法整合入细胞染色体而与细胞的DNA重组，可以作为附加体元件被瞬时保持而不被复制，或可以作为质粒独立复制。当DNA与细胞的分裂一起被复制时认为该细胞已经被稳定地转化。

如本领域中所知，术语“同一性”指通过比较序列所测定的、两个或更多个多肽分子序列或两个或更多个核酸分子序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还意指，根据具体情况，通过两个或更多个核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列的字串(string)之间的匹配所测定的、核酸分子或多肽之间序列关联的程度。“同一性”用具体数学模型或计算机程序(即，“算法”)提供的空位比对(如果有)度量较小的两个或更多个序列之间相同匹配的百分比。

术语“相似性”是与“同一性”相关的概念，但与“同一性”相比，“相似性”指关联性度量，其包括相同匹配和保守置换匹配。如果两个多肽序列具有例如10/20相同的氨基酸，并且其余全部是非保守置换，那么同一性和相似性百分比都是50％。如果在相同的实例中有五个以上存在保守置换的位置，那么同一性百分比还是50％，但相似性百分比是75％(15/20)。因此，在存在保守置换的情况下，两个多肽之间的相似性百分比将高于那两个多肽之间的同一性百分比。

相关核酸和多肽的同一性和相似性可以容易地通过已知方法进行计算。这些方法包括但不限于描述在COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，(Lesk，A.M.，ed.)，1988，Oxford University Press，New York；BIOCOMPUTING：INFORMATICS AND GENOME PROJECTS，(Smith，D.W.，ed.)，1993，AcademicPress，New York；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，Part 1，(Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.)，1994，Humana Press，New Jersey；von Heinje，G.，SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，1987，Academic Press；SEQUENCE ANALYSIS PRIMER，(Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.)，1991，M.Stockton Press，New York；Carillo等，1988，SIAM J.Applied Math.，48：1073；以及Durbin等，1998，BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS，Cambridge UniversityPress中的那些方法。

测定同一性的优选方法被设计来给出测试序列之间的最大匹配。测定同一性的方法描述在可公开获得的计算机程序中。测定两个序列之间同一性的优选的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包，所述GCG程序包包括GAP(Devereux等，1984，Nucl.Acid.Res.，12：387；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等，1990，J.Mol Biol，215：403-410)。BLASTX程序可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST Manual，Altschul等NCB/NLM/NIH Bethesda，MD 20894；Altschul等，1990，supra)公开获得。周知的Smith Waterman算法也可以用来测定同一性。

用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可以导致仅这两个序列的短区域匹配，并且该小比对区域可以具有非常高的序列同一性——即使在这两个全长序列之间没有明显的关系。因此，在某些实施方式中，选择的比对方法(GAP程序)将导致跨越靶多肽的至少50个连续氨基酸的比对。

例如，应用计算机算法GAP(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，比对待测定序列同一性百分比的两个多肽，以对它们各自的氨基酸进行最优匹配(通过算法所测定的“匹配跨度(matched span)”)。在某些实施方式中，空位开放罚分(其被计算为三倍的平均对角线；其中“平均对角线”是使用的比较矩阵的对角线的平均；“对角线”是具体的比较矩阵赋予每一完美氨基酸匹配的分数或数字)和空位延伸罚分(其通常是空位开放罚分的十分之一)以及比较矩阵如PAM250或BLOSUM 62结合算法一起应用。在某些实施方式中，标准比较矩阵(参见Dayhoff等，1978，Atlas of Protein Sequence and Structure，5：345-352for thePAM 250comparison matrix；Henikoff等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：10915-10919 for the BLOSUM 62comparison matrix)也被算法所使用。

在某些实施方式中，用于多肽序列比较的参数包括如下：

算法：Needleman等，1970，J.Mol Biol，48：443-453；

比较矩阵：Henikoff等，1992，supra中的BLOSUM 62；

空位罚分：12

空位长度罚分：4

相似性的阈值：0

GAP程序可以与上述参数一起使用。在某些实施方式中，上述参数是应用GAP算法的多肽比较的默认参数(以及对末端空位无罚分)。

如本文所用，20种常规氨基酸和它们的缩写遵循常规的应用。参见IMMUNOLOGY--A SYNTHESIS，2nd Edition，(E.S.Golub and D.R.Gren，Eds.)，Sinauer Associates：Sunderland，MA，1991，其通过引用而并入本文，用于任意目的。20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)；非天然氨基酸如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可以是本发明多肽的适合组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文使用的多肽符号中，按照标准应用和协定，左手方向为氨基末端方向以及右手方向为羧基末端方向。

天然存在的残基可以基于常见的侧链性质进行分类：

1)疏水性残基：正亮氨酸(Nor)、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

2)中度亲水性残基：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

3)酸性残基：Asp、Glu；

4)碱性残基：His、Lys、Arg；

5)影响侧链取向的残基：Gly、Pro；以及

6)芳香残基：Trp、Tyr、Phe。

保守氨基酸置换可以包括这些种类中的一个成员与相同种类中的另一成员的交换。保守氨基酸置换可以包括非天然存在的氨基酸残基，所述非天然存在的氨基酸残基通常是通过化学肽合成而不是通过生物系统中的合成而被参入。这些包括模拟肽(peptidomimetics)和氨基酸部分的其它翻转或颠倒形式。

非保守置换可以包括这些种类中的一个成员与另一种类中的成员的交换。这些置换的残基可以引入到与非人蛋白同源的人蛋白的区域或该分子的非同源区。

在进行这些改变的过程中，根据某些实施方式，可以考虑氨基酸的亲水指数。每一氨基酸在其疏水性和电荷特性的基础上已经被赋予亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。

亲水氨基酸指数在赋予蛋白活性生物功能中的重要性在本领域中是知晓的(参见，例如，Kyte等，1982，J.Mol.Biol.157：105-131)。据了解，某些氨基酸可以置换成具有类似亲水指数或分数的其它氨基酸并且仍保持类似的生物活性。在基于亲水指数进行改变的过程中，在某些实施方式中，包括亲水指数在±2以内的氨基酸的置换。在某些实施方式中，包括亲水指数在±1以内的氨基酸的置换以及在某些实施方式中，包括亲水指数在±0.5以内的氨基酸的置换。

在本领域中也知晓的是，相似氨基酸的置换可以在亲水性的基础上有效地进行，尤其是在由此产生的生物学上的功能蛋白或肽如本文所公开意图用于免疫学实施方式的情况下。在某些实施方式中，由其邻近氨基酸的亲水性所支配的蛋白质的最大局部平均亲水性，与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白质的生物性质相关。

下列亲水性值已被赋予这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于类似的亲水性值进行改变的过程中，在某些实施方式中，包括亲水性值在±2以内的氨基酸的置换，在某些实施方式中，亲水性值在±1以内的氨基酸的置换，以及在某些实施方式中，亲水性值在±0.5以内的氨基酸的置换。技术人员也可以在亲水性的基础上鉴定初级氨基酸序列的表位。这些区域也被称为“表位核心区(epitopic core regions)”。

示例性氨基酸置换在表1中列出。

表1：氨基酸置换

原残基	示例性置换	优选的置换
			Ala	Val、Leu、Ile	Val
Arg	Lys、Gln、Asn	Lys
			Asn	Gln	Gln
Asp	Glu	Glu
			Cys	Ser、Ala	Ser
Gln	Asn	Asn
			Glu	Asp	Asp
Gly	Pro、Ala	Ala
			His	Asn、Gln、Lys、Arg	Arg
Ile	Leu、Val、Met、Ala、Phe、正亮氨酸	Leu

Leu	正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe	Ile
			Lys	Arg、1，4二氨基-丁酸、Gin、Asn	Arg
Met	Leu、Phe、Ile	Leu
			Phe	Leu、Val、Ile、Ala、Tyr	Leu
Pro	Ala	Gly
			Ser	Thr、Ala、Cys	Thr
Thr	Ser	Ser
			Trp	Tyr、Phe	Tyr
Tyr	Trp、Phe、Thr、Ser	Phe
			Val	Ile、Met、Leu、Phe、Ala、正亮氨酸	Leu

本领域技术人员将可以利用熟知技术确定本文列出的多肽的合适变体。在某些实施方式中，本领域的技术人员可以鉴定合适的分子区域，其可以通过靶向于被认为是对活性不重要的区域而被改变，但不破坏活性。在其它实施方式中，技术人员可以鉴定相似的多肽中保守的分子残基和部分。在进一步的实施方式中，甚至对于生物学活性或对于结构可能是重要的区域也可以进行保守氨基酸置换而不破坏生物学活性或没有不利地影响多肽结构。

此外，本领域技术人员可以回顾结构-功能研究，鉴定类似多肽中对活性或结构重要的残基。鉴于这样的比较，技术人员可以预测蛋白中相对应于类似蛋白质中对于活性或结构重要的氨基酸残基之氨基酸残基的重要性。对于这种预测的重要氨基酸残基，本领域技术人员可以选择出化学上相似的氨基酸置换。

本领域技术人员也可以分析类似多肽中的三维结构和与该结构相关的氨基酸序列。根据这样的信息，本领域技术人员可以预测与其三维结构相关的多肽的氨基酸残基的排列。在某些实施方式中，本领域普通技术人员可以选择不要对经预测将处于蛋白表面上的氨基酸残基进行根本性的变化，是因为这样的残基可能参与和其它分子的重要相互作用。而且，本领域技术人员可以制备出在每个期望的氨基酸残基处含有单个氨基酸置换的测试变体。然后，应用本领域已知的活性测定筛选变体。这些变体能被用来收集关于合适变体的信息。例如，如果技术人员发现一个特定的氨基酸的改变导致受到破坏的、不期望降低的、或不适合的活性，那么具有这种改变的变体将被避免。换言之，基于从这类常规实验中收集的信息，本领域技术人员可以容易地确定这样的氨基酸，其中进一步的置换应被避免，或者是在单独情况下或与其它突变组合时被避免。

大量的科学出版物已经致力于二级结构的预测。参见Moult，1996，Curr.Op.inBiotech.7：422-427；Chou等，1974，Biochemistry 13：222-245；Chou等.1974，Biochemistry 113：211-222；Chou等，1978，Adv.Enzymol Relat.Areas Mol.Biol47：45-148；Chou等，1979，Ann.Rev.Biochem.47：251-276；和Chou等，1979，Biophys.J.26：367-384。而且，计算机软件目前可用来辅助预测二级结构。一种预测二级结构的方法是基于同源性模型。例如，序列同一性在约30％以上或者序列相似性在40％以上的两个多肽或蛋白质，常常具有类似的结构拓扑学。最近增大的蛋白质结构数据库(PDB)增强了二级结构的预测能力，包括处于多肽的或蛋白质的结构内的潜在折叠数目。参见Holm等，1999，Nucl.Acid.Res.27：244-247。据认为(Brenner等，1997，Curr.Op.Struct.Biol.7：369-376)，在一个给定的多肽或蛋白质中存在有限数目的折叠，并且一旦解析了5个结构的关键数，结构预测将会明显变得更加精确。

预测二级结构的其它方法包括“穿引(threading)”(Jones，1997，Curr.Opin.Struct.Biol.7：377-87；Sippl等，1996，Structure 4：15-19)、“序型分析”(Bowie等，1991，Science 253：164-170；Gribskov等，1990，Meth.Enzym.183：146-159；Gribskov等，1987，Proc.Nat.Acad.Sci.84：4355-4358)和“进化连锁(evolutionary linkage)”(参见Holm，1999，同上；以及Brenner，1997，同上)。

在某些实施方式中，蛋白变体包括糖基化变体，其中糖基化位点的数目和/或类型与亲代多肽的氨基酸序列相比已经发生改变。在某些实施方式中，蛋白质变体包括比天然蛋白更多或更少数目的N-联接糖基化位点。N-联接糖基化位点以序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr为特征，其中称为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸之外的任意氨基酸残基。用以产生这种序列的氨基酸残基置换给N-联接糖链的添加提供了潜在的新位点。可选地，消除这种序列的置换将会除去已经存在的N-联接糖链。也提供了N-联接糖链的重排，其中一个或更多个N-联接糖基化位点(通常是那些天然存在的)被消除，而一个或更多个新的N-联接位点产生。另外的优选变体包括半胱氨酸变体，其中，与亲代氨基酸序列相比，一个或更多个半胱氨酸残基被从亲代氨基酸序列删除或被置换为另一种氨基酸(例如丝氨酸)。当蛋白质必须重折叠成生物学上的活性构象时，如不溶性的包含体分离后，半胱氨酸变体可以是有用的。半胱氨酸变体一般具有比天然蛋白更少的半胱氨酸残基，并且通常具有偶数个半胱氨酸，以便使由未配对半胱氨酸所引起的相互作用最小化。

在另外的实施方式中，蛋白变体可以包括突变，如置换、添加、缺失或其任何组合；并且，其通常根据本文描述的方法以及本领域已知的方法(参见，例如Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，3rd Ed.，2001，Cold Spring Harbor，N.Y.and Berger and Kimmel，METHODS INENZYMOLOGY，Volume 152，Guide to Molecular Cloning Techniques，1987，Academic Press，Inc.，San Diego，CA.，通过引用而并入本文)，应用一种或多种诱变寡核苷酸，通过定点诱变产生。

根据某些实施方式，氨基酸置换是这样的置换，其：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和性，(4)改变结合亲和性，和/或(5)对这类多肽赋予或改变其它理化或功能性质。根据某些实施方式，一个或多个氨基酸置换(在某些情况下，保守氨基酸置换)可以在天然存在的序列中(某些实施方式中，在形成分子间接触的结构域(一个或多个)之外的多肽部分中)进行。在优选的实施方式中，保守氨基酸置换通常基本上不改变亲代序列的结构特征(例如，氨基酸置换不应当倾向于打破亲代序列中存在的螺旋，或者破坏表征亲代序列的其它类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级和四级结构的实例在PROTEINS，STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES，(Creighton，Ed.)，1984，W.H.Freeman and Company，New York；INTRODUCTIONTO PROTEIN STRUCTURE(C.Branden and J.Tooze，eds.)，1991，GarlandPublishing，New York，N.Y.；以及Thornton等，1991，Nature 354：105中进行了描述，其中每一个通过引用而并入本文。

肽类似物作为具有类似于模板肽性质的非肽药物常常用在制药工业中。这些种类的非肽化合物被称为“肽模拟物(peptide mimetics)”或“模拟肽(peptidomimetic)”。参见Fauchere，1986，Adv.drug Res.15：29；Veber & Freidinger，1985，TINS p.392；和Evans等.，1987，J.Med.Chem.30：1229，它们通过引用而并入本文，用于任意目的。这些化合物通常在计算机分子建模的辅助下被开发出来。与有治疗上有用的肽在结构上类似的肽模拟物，可以用来产生类似的治疗或预防效果。一般而言，模拟肽与范例多肽(即，具有生化性质或药理学活性的多肽)——如人抗体——结构类似，但却具有一个或更多个这样的肽键：其通过本领域中周知的方法，被任选地由选自：-CH₂-NH-、-CH₂-S-、-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-和-CH₂SO-的连接所替换。在某些实施方式中，可以使用相同类型的D-氨基酸系统性置换共有序列的一个或更多个氨基酸(如，D-赖氨酸替换L-赖氨酸)，以产生更稳定的肽。此外，包含有共有序列或者基本相同的共有序列变异的受限肽(constrained peptide)可通过本领域中已知的方法产生(Rizo & Gierasch，1992，Ann.Rev.Biochem.61：387，通过引用而并入本文，用于任意目的)；例如，通过添加能形成使肽环化的分子内二硫键桥的内部半胱氨酸残基进行制备。

在本发明的上下文中，短语“核酸序列”当指编码蛋白、多肽、肽的序列时，含义包括编码同源蛋白、多肽或肽序列以及所公开的序列的简并核酸序列。

(a)修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂的特性

如本文所用，“修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂”包括描述在美国专利第6,028,176号和第6,313,272号(通过引用全部在此并入)中的IL-4RA突变蛋白，该突变蛋白在成熟IL-4蛋白的一个或更多个位置处具有额外的氨基酸置换。示例性三重突变蛋白(triple muteins)包括但不限于D螺旋中在位置121处天冬氨酸置换精氨酸、在位置124处天冬氨酸置换酪氨酸和在位置125处天冬氨酸置换丝氨酸；以及D螺旋中在位置13处天冬氨酸置换苏氨酸、在位置121处天冬氨酸置换精氨酸和在位置124处天冬氨酸置换酪氨酸。在一个实施方式中，三重突变蛋白进一步包含N-端甲硫氨酸。在D-螺旋的这部分中的变异与在第二结合区域处的相互作用的改变正相关。修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂可以进一步包括一个或更多个置换，其中所述置换能够使至少一个非蛋白聚合物，如聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇(PEG)分子与突变蛋白进行位点-特异性偶联。PEG的位点特异性偶联，例如，使具有聚乙二醇化(PEG化)分子的益处的修饰突变蛋白产生，即血浆半衰期增加和免疫原性降低同时相对于非特异性聚乙二醇化策略，如N-端聚乙二醇化和赖氨酸侧链聚乙二醇化，保持更大的效力。

应当理解的是，连接的PEG部分的结构在最优化本发明突变蛋白的PEG化中是重要的。在一个实施方式中，PEG部分是线性的。线性PEG部分的大小受制造过程的限制，是因为PEG-二醇的量随着PEG分子量的增加而增加。就线性部分而言，PEG-突变蛋白分子大小的增加通常通过增加突变蛋白上PEG连接位点的数目来完成。这常常导致次优的药理特征。在另一实施方式中，PEG部分从单个连接位点支化。支化的PEG部分具有增加PEG分子大小而不增加位点连接的数目的优势。

因此，在一个方面，聚乙二醇(PEG)部分具有范围从约3kD至50kD的分子量。在一个实施方式中，PEG部分为大约40kD。PEG与药物的共价连接(也称为“PEG化”)可以通过已知的化学反应和/或合成技术来完成。例如，在本发明的一个方面，蛋白的PEG化可以通过在适合的反应条件下使NHS-活化的PEG与突变蛋白反应来完成。在本发明的另一个方面，蛋白的PEG化可以通过在适合的反应条件下使马来酰亚胺活化的PEG与蛋白中半胱氨酸(cytsteine)残基的巯基(sulhydrylgroup)反应来完成。

PEG-突变蛋白偶联物可以以三种不同的方式产生：可以将单一的大PEG部分连接在突变蛋白上的单一位点；可以将支化PEG部分(即，两个或更多个中间PEG链经由连接体连接在一起)连接在突变蛋白上的单一位点；或可以将几个小链连接在突变蛋白上的多个位点。理论上，单位点PEG化的突变蛋白具有更高的活性，是因为PEG连接不大可能发生在受体结合结构域处或其附近。

PEG化和其它种类的翻译后修饰(PTM)的改进已经是广泛的，并且现在存在大量本领域中已知的PTM技术和试剂，以及新的PTM技术和试剂正在有规律地被开发。用于PEG化的技术和试剂包括，例如：(i)专门的连接体和偶联化学；(ii)支化PEG，其有效地使另外的PEG基团与单一的偶联位点连接；(iii)位点特异性PEG化，包括位点特异性单PEG化；以及(iv)定点酶促PEG化(例如，应用转谷氨酰胺酶反应)。也存在另外的技术和试剂，其可从众多商业供应商获得(参见，例如Nektar/Shearwater(在万维网网址nektar.com)、Sunbio(在万维网网址sunbio.com和sunbio.com/peg-shop)、Celares GmbH(在万维网网址celares.com)、NOF Corporation(在万维网网址peg-drug.com)以及其它)。

还包括在本发明中的是能使所述分子表达后正确折叠的氨基酸置换的特异性位点的选择。相对于IL-4RA与IL-4和IL-13结合的亲和力降低，修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂与IL-4和IL-13结合的亲和力降低不大于10倍。相对于IL-4RA抑制IL-4和IL-13介导的活性的效价损失，修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂抑制IL-4和IL-13介导的活性的效价损失不超过10倍。此外，修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂具备比未修饰的IL-4RA至少长2至10倍的血浆半衰期。

本发明的IL-4突变蛋白的特征还可以是在一个或更多个位点处的氨基酸插入、缺失、置换和修饰，所述位点在天然IL-4多肽链的其它残基中或在天然IL-4多肽链的其它残基处。依照本发明，任意此类插入、缺失、置换和修饰应当导致IL-4突变蛋白保持其IL-4相关的活性。

本发明的另外方面是提供如实施例2中所述表达和重折叠蛋白质的方法。IL-4突变蛋白必须适当纯化，以便进行有效的PEG化。用于纯化的示例性方法描述在下面的实施例2中。当在巯基保护剂存在的情况下重折叠突变蛋白时，共价二硫键在IL-4突变蛋白的游离半胱氨酸和保护剂之间形成。相反，巯基保护剂二硫苏糖醇(DTT)——其氧化形成稳定的二硫键——的应用将不与IL-4突变蛋白的游离半胱氨酸形成共价键，从而使其巯基游离，以与PEG马来酰亚胺试剂反应。在巯基保护剂存在的情况下重折叠后纯化的IL-4突变蛋白如果用DTT进行处理则可以与PEG试剂反应，但却产生单PEG化产物和多PEG化产物的混合物，这表明现有的IL-4半胱氨酸也被PEG化。现有半胱氨酸的PEG化将导致失活的错折叠产物。

修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂与IL-4受体的[[K_d]]K _D可以应用本领域中已知的任意方法进行测定，包括诸如实施例4中概述的实时双分子相互作用分析(Bimolecular Interaction Analysis(BIA))的技术。BIA是用于实时研究生物特异性相互作用而不用标记任何相互作用物的技术(例如，BIAcore^TM)。光学现象表面等离子共振(SPR)的改变可以被用作生物学分子之间实时反应的指示。

修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂抑制免疫细胞增殖应答的能力可以应用实施例5中概述的增殖测定进行评价，并且这种能力被表示为50％抑制浓度(IC₅₀)。

在BIAcore^TM测定中，本发明的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂以范围从约1.0nM至约100nM的优选[[K_d]]K _D与人IL-4受体特异性结合。本发明的更优选的实施方式以大约0.5nM至约1.0μM的[[K_d]]K _D与人IL-4受体结合。本发明的又一更优选的实施方式以大约0.1nM至约1.0μM的[[K_d]]K _D与人IL-4受体结合。另外，本发明的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，如所预想的那样，将以范围从约1.0nM至约100nM的优选IC₅₀与人IL-4受体结合并且抑制其促进免疫细胞增殖的能力。更优选的人拮抗剂以范围从约0.5nM至约1μM的IC₅₀结合IL-4受体并且抑制其免疫细胞增殖能力，以及本发明的最优选的拮抗剂以大约0.1nM至约10μM的IC₅₀结合并抑制IL-4受体。

本发明的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂的目前的实施方式还显示比未修饰的IL4RA血浆半衰期长优选至少2至10倍的血浆半衰期，以及本发明的最优选的实施方式显示比未修饰的IL4RA血浆半衰期长10至100倍的血浆半衰期(参见实施例7)。

许多具有上述特性的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂已经用上述测定通过筛选候选物而进行了鉴定。本发明的实施方式具有表2中显示的多肽序列(SEQ IDNOS：10-16和32-33)。

表2：多肽序列

SEQ ID NO	名称	序列
			9	IL-4RA(IL-4DM)	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMDEKDSKCSS

10	IL4-RE-T28C	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELCVTDIFASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMDEKDSKCSS
			11	IL4-RE-S36C	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAACKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMDEKDSKCSS
12	IL4-RE-K37C	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASCNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMDEKDSKCSS
			13	IL4-RE-N38C	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKCTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMDEKDSKCSS
14	IL4-RE-A104C	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKECNQSTLENFLERLKTIMDEKDSKCSS
			15	IL4-RE-N105C	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEACQSTLENFLERLKTIMDEKDSKCSS
16	IL4-RE-Q106C	MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANCSTLENFLERLKTIMDEKDSKCSS
			32	IL4-RE-T13D	MHKCDITLQEIIKDLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMDEKDSKCSS

33

IL4-RE-T13D-N38C

MHKCDITLQEIIKDLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKCTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMDEKDSKCSS

(b)编码修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂的多核苷酸

本发明还提供编码修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂的多核苷酸。这些多核苷酸可以，例如，用来产生大量的拮抗剂用于治疗应用。本发明进一步提供编码相同的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂的简并DNA序列。构建和表达简并DNA序列——其能够作为给定的多核苷酸序列表达相同的氨基酸序列——的方法在本领域中是已知的。

本发明的多核苷酸可以以各种方式容易地获得，包括而不限于化学合成、cDNA或基因组文库筛选、表达文库筛选和/或cDNA的PCR扩增。

本发明描述的重组DNA方法一般是下列中列出的那些：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)和/或Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，eds.，Green Publishers Inc.and Wiley and Sons 1994)。本发明提供本文所述的核酸分子和获得这些分子的方法。

一种获得合适核酸序列的方法是聚合酶链反应(PCR)。在该方法中，应用酶逆转录酶由聚(A)+RNA或总RNA制备cDNA。两个引物-——通常与修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂cDNA的两个单独的区域互补——然后与聚合酶如Taq聚合酶一起被添加到cDNA，并且聚合酶扩增这两个引物之间的cDNA区域。

制备本发明核酸分子的另一种手段是化学合成，所述化学合成应用的是本领域技术人员周知的方法，如Engels等，1989，Angew.Chem.Intl.Ed.28：716-34描述的那些方法。这些方法包括用于核酸合成的磷酸三酯、亚磷酰胺和H-磷酸酯方法等等。用于这些化学合成的优选方法是应用标准亚磷酰胺化学术的聚合物支持合成。通常，DNA的长度将是几百个核苷酸。大于约100个核苷酸的核酸可以应用这些方法合成为几个片段。然后将所述片段连接在一起。本领域技术人员已知的其它方法也可以应用。

可以用来编码修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂的本发明的多核苷酸示于表3中(SEQ ID NO：2-8和31)。

表3：多核苷酸序列

SEQ IDNO

名称

序列

1	IL-4RA	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCCAAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTAAAGACGATCATGGACGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCTAATAA
			2	IL4-RE-T28C	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGTGCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCCAAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTAAAGACGATCATGGACGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCTAATAA

3	IL4-RE-S36C	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTGCAAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTAAAGACGATCATGGACGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCTAATAA
			4	IL4-RE-K37C	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCCTGCAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTAAAGACGATCATGGACGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCTAATAA

5	IL4-RE-N38C	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCCAAGTGCACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTAAAGACGATCATGGACGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCTAATAA
			6	IL4-RE-A104C	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCCAAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAATGCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTAAAGACGATCATGGACGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCTAATAA

7	IL4-RE-N105C	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCCAAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCTGCCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTAAAGACGATCATGGACGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCTAATAA
			8	IL4-RE-Q106C	ATGCACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCCAAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTACAGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACTGCAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTAA
31	IL4-RE-T13D-N38C(IL-4TM-N38C)	ATGCACAAATGCGATATCACCCTGCAGGAAATCATCAAAGACCTGAATTCTCTGACCGAACAGAAAACCCTGTGCACCGAACTGACCGTTACCGACATCTT

CGCTGCTTCGAAATGCACCACCGAAAAAGAAACCTTCTGCCGTGCTGCTACCGTTCTGCGTCAGTTCTACTCTCACCACGAAAAAGACACCCGTTGCCTGGGTGCTACCGCTCAGCAGTTCCACCGTCACAAACAGCTGATCCGTTTCCTGAAACGTCTGGACCGTAACCTGTGGGGTCTGGCTGGTCTGAACAGCTGCCCGGTTAAAGAAGCTAACCAGTCTACCCTGGAAAACTTCCTGGAACGTCTGAAAACCATCATGGACGAAAAAGACTCTAAATGCTCTTCT

本发明还提供包含本发明多核苷酸的表达载体和包含本发明表达载体的宿主细胞。

本发明的多核苷酸可以应用标准连接技术插入到适当的表达载体中。载体通常被选择以在使用的具体宿主细胞中起作用(即，载体与宿主细胞机构相容，以便基因的扩增和/或基因的表达可以发生)。本发明的多核苷酸可以在原核宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫(杆状病毒系统)宿主细胞和/或真核宿主细胞中表达。宿主细胞的选择将取决于各种因素，诸如期望的病毒水平。对于表达载体的评述，参见Meth.Enz.，vol.185(D.V.Goeddel，ed.，Academic Press 1990)。

通常，用在宿主细胞中的表达载体含有用于质粒维持的序列和用于外源核苷酸序列克隆和表达的序列。这些序列——共同称为“侧翼序列”——在某些实施方式中通常包括下列核苷酸序列中的一种或更多种：启动子、一个或更多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体剪接位点和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达核苷酸的核酸的多聚接头区(polylinker region)和可选择的标记元件。这些序列中的每一个在下面进行论述。

侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或株系)、异源的(即，来自不同于宿主细胞物种或株系的物种)、杂合的(即，来自一种以上来源的侧翼序列的组合)或合成的，或者侧翼序列可以是通常起调节IL-4突变蛋白受体拮抗剂表达作用的天然序列。同样地，侧翼序列的来源可以是任意原核或真核生物体、任意脊椎生物体或无脊椎生物体，或任意植物，条件是侧翼序列在宿主细胞机构中是有功能的并且可以通过宿主细胞机构活化。

可用于本发明载体的侧翼序列可以通过本领域中周知的几种方法中的任意一种获得。通常，用在本文中的侧翼序列——除IL-4突变蛋白受体拮抗剂基因侧翼序列外——先前已经通过作图(mapping)和/或限制核酸内切酶消化进行了鉴定并且可以因此应用适当的限制核酸内切酶与合适的组织来源分离。在一些情况下，侧翼序列的全核苷酸序列可以是已知的。此处，侧翼序列可以应用本文中描述的用于核酸合成或克隆的方法来合成。

在全部或仅部分侧翼序列已知的情况下，侧翼序列可以应用PCR和/或通过用来自相同或另一物种的合适的寡核苷酸和/或侧翼序列片段筛选基因组文库来获得。在侧翼序列未知的情况下，含有侧翼序列的DNA片段可以与较大的DNA分离，所述较大的DNA可以含有，例如编码序列或甚至另一基因或多个基因。分离可以通过下列方法完成：限制核酸内切酶消化，产生适当的DNA片段，接着应用琼脂糖凝胶纯化、

柱色谱(Chatsworth，CA)或技术人员已知的其它方法进行分离。用以达到该目的的适合的酶的选择对本领域普通技术人员而言将是很明显的。

复制起点通常是那些商业购得的原核表达载体的一部分，并且该起点在宿主细胞中有助于载体的扩增。如果选择的载体不含有复制起始位点，则可以基于已知的序列化学合成复制起始位点并且连接到载体中。例如，来自质粒pBR322(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)的复制起点适用于大部分革兰氏阴性细菌以及各种起点(例如，SV40、多瘤、腺病毒、疱疹性口腔炎病毒(VSV)或乳头瘤病毒如HPV或BPV)可用于克隆哺乳动物细胞中的载体。一般而言，复制起点组分对于哺乳动物表达载体是不需要的(例如，通常仅应用SV40起点，是因为其含有早期启动子)。

转录终止序列通常位于多肽编码区的3′端并且起终止转录的作用。通常，原核细胞中的转录终止序列是富含G-C的片段接着聚-T序列。尽管转录终止序列从文库容易地被克隆或甚至作为载体的一部分商业购得，其也可以应用核酸合成的方法如本文描述的那些容易地进行合成。

可选择的标记基因元件编码生长在选择培养基中的宿主细胞生存和生长必需的蛋白。通常的选择标记基因编码这样的蛋白，所述蛋白(a)赋予原核宿主细胞对抗生素或其它毒素，例如氨苄青霉素、四环素或卡那霉素的抗性；(b)补充细胞的营养缺陷型缺陷；或(c)供给不可从复合培养基获得的关键营养物。优选的可选择标记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。在原核和真核宿主细胞中，新霉素抗性基因也可以用于选择。

其它选择基因可以用来扩增将被表达的基因。扩增是这样的过程，其中对生长关键的蛋白的产生需求较大的基因在连续代的重组细胞染色体中被串联重复。适于哺乳动物细胞的可选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。将哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，在所述选择压力下只有转化体由于载体中存在的选择基因而独特地适合生存。选择压力通过在这样的条件下培养转化的细胞来施加，在所述条件中培养基中选择剂(selection agent)的浓度被不断改变，从而导致选择基因和编码修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂的DNA的扩增。结果，增加量的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂从扩增的DNA合成。

核糖体结合位点常常对于mRNA的翻译起始是必需的并且其特征在于Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。该元件通常位于修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂的启动子的3′端和编码序列的5′端。Shine-Dalgarno序列有很多种，但通常是多聚嘌呤(即，具有高A-G含量)。许多Shine-Dalgarno序列已经被鉴定，其中每一种均可以应用本文中所述的方法容易地合成并且用于原核载体中。

前导序列或信号序列可以用来将修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂引导到宿主细胞之外。通常，编码信号序列的核苷酸序列位于修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂核酸分子的编码区中或者直接位于修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂编码区的5′端处。许多信号序列已经被鉴定，并且在选择的宿主细胞中有功能的任意信号序列可以联合修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂核酸分子应用。因此，信号序列可以同源(天然存在的)或异源于修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂核酸分子。另外，信号序列可以应用本文描述的方法化学合成。在大部分情况下，修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂由于信号肽的存在从宿主细胞的分泌，将导致信号肽从分泌的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂中除去。信号序列可以是载体的组分，或者其可以是插入载体中的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂核酸分子的一部分。

在许多情况下，核酸分子的转录因一个或更多个内含子在载体中存在而增加；这在多肽产生于真核宿主细胞，特别是哺乳动物宿主细胞中的情况下是尤其正确的。应用的内含子可以天然存在于修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂基因内，尤其在使用的基因是全长基因组序列或其片段的情况下。如果内含子没有天然存在于基因内，则该内含子可以由另一来源获得。内含子相对于侧翼序列和修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂基因的位置一般是重要的，这是因为内含子必须被有效地转录。因此，当本发明的核酸分子正在被转录时，内含子的优选位置是转录起始位点的3′端和聚-A转录终止序列的5′端。优选地，一个或更多个内含子位于cDNA的一侧或另一侧(即，5′或3′)，以便其不打断编码序列。来自任意来源包括病毒、原核和真核(植物或动物)生物体的任意内含子可以用来实践本发明，条件是其与其插入的宿主细胞相容。还包括在本文中的是合成内含子。任选地，可以在载体中应用一种以上内含子。

本发明的表达和克隆载体通常含有启动子，所述启动子被宿主生物体识别并且可操作地连接到本发明的核酸分子。启动子是位于结构基因(一般在约100至1000bp内)起始密码子的上游(即，5′)控制结构基因转录的未转录的序列。启动子按常规分为下列两类中的一类：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子响应培养条件的一些改变，如营养物的存在或不存在或温度的改变而在它们的控制下启动增加水平的DNA转录。另一方面，组成型启动子启动连续的基因产物产生；也即，很少控制基因表达或不控制基因表达。许多启动子——其被各种潜在的宿主细胞识别——是周知的。适合的启动子可以通过限制酶消化从来源DNA中除去启动子并且将期望的启动子插入到载体中而可操作地连接到本发明的核酸分子。天然IL-4突变蛋白受体拮抗剂启动子序列可以用来指导本发明核酸分子的扩增和/或表达。异源启动子是优选的，然而，条件是其与天然启动子相比允许被表达蛋白的更好转录和更高收率以及其与选择使用的宿主细胞系统相容。

适于与原核宿主使用的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统；碱性磷酸酶；色氨酸(trp)启动子系统；和杂合启动子如tac启动子。其它已知的细菌启动子也是适用的。它们的序列已经被公布，从而使本领域的技术人员能够应用提供任意有用限制位点所必需的连接体或衔接头将这些序列连接到期望的DNA序列。

适于与酵母宿主使用的启动子在本领域中也是周知的。酵母增强子有利地与酵母启动子一起使用。适于与哺乳动物宿主细胞使用的启动子是周知的并且包括但不限于那些从病毒基因组获得的启动子，所述病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳突瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、肝炎-B病毒以及最优选猿猴病毒40(SV40)。其它适合的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。

可以有益于控制基因表达的另外的启动子包括但不限于：SV40早期启动子区(Bernoist and Chambon，1981，Nature 290：304-10)；CMV启动子；在劳斯肉瘤病毒的3′长末端重复序列中含有的启动子(Yamamoto，等，1980，Cell 22：787-97)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-45)；金属硫蛋白(metallothionine)基因的调节序列(Brinster等，1982，Nature 296：39-42)；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75：3727-31)；或tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：21-25)。还感兴趣的是下列动物转录控制区，所述控制区显示组织特异性并且已经被应用在转基因动物中：弹性蛋白酶I基因控制区，其在胰腺腺泡细胞中是有活性的(Swift等，1984，Cell 38：639-46；Ornitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol50：399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；胰岛素基因控制区，其在胰腺β细胞中是有活性的(Hanahan，1985，Nature 315：115-22)；免疫球蛋白基因控制区，其在淋巴样细胞中是有活性的(Grosschedl等，1984，Cell 38：647-58；Adames等，1985，Nature 318：533-38；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol，7：1436-44)；小鼠乳癌病毒控制区，其在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴样细胞和肥大细胞中是有活性的(Leder等，1986，Cell 45：485-95)；白蛋白基因控制区，其在肝脏中是有活性的(Pinkert等，1987，Genes and Devel 1：268-76)；甲胎蛋白基因控制区，其在肝脏中是有活性的(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol，5：1639-48；Hammer等，1987，Science235：53-58)；α1-抗胰蛋白酶基因控制区，其在在肝脏中是有活性的(Kelsey等，1987，Genes and Devel.1：161-71)；β-球蛋白基因控制区，其在骨髓细胞中是有活性的(Mogram等，1985，Nature 315：338-40；Kollias等，1986，Cell 46：89-94)；髓鞘碱性蛋白基因控制区，其在脑中的少突神经胶质细胞中是有活性的(Readhead等，1987，Cell 48：703-12)；肌球蛋白轻链-2基因控制区，其在骨骼肌中是有活性的(Sani，1985，Nature 314：283-86)；以及促性腺激素释放激素基因控制区，其在下丘脑中是有活性的(Mason等，1986，Science 234：1372-78)。

可以将增强子序列插入到载体中以增加高等真核生物对本发明核酸分子的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，长度通常为约10-300bp，其对启动子起作用以增加转录。增强子相对地不依赖于方向和位置。在转录单元的5′和3′端已经发现了增强子。几种可从哺乳动物基因获得的增强子序列是已知的(例如，球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，通常应用来自病毒的增强子。SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子的增强子、多瘤增强子和腺病毒增强子是用于活化真核增强子的示例性增强元件。尽管增强子可以在本发明核酸分子的5′或3′位置处剪接到载体中，但其通常位于启动子的5′位点处。

本发明的表达载体可以由起始载体(starting vector)如商业获得的载体构建。这些载体可以或可以不含有所有期望的侧翼序列。在载体中不存在一种或更多种本文描述的侧翼序列的情况下，它们可以单独获得并且连接到载体中。用于获得每一种侧翼序列的方法是本领域技术人员周知的。

用于实践本发明的优选载体是那些与细菌宿主细胞、昆虫宿主细胞和哺乳动物宿主细胞相容的载体。这些载体包括pCRII、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，SanDiego，CA)、pBSII(Stratagene，La Jolla，CA)、pET15(Novagen，Madison，WI)、pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)、pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，CA)、pETL(BlueBacII，Invitrogen)、pDSR-α(PCT Pub.No.WO 90/14363)和pFastBacDual(Gibco-BRL，Grand Island，NY)等等。

另外适合的载体包括但不限于黏粒、质粒或修饰的病毒，但本领域的技术人员将知晓载体系统必须与选择的宿主细胞相容。这些载体包括但不限于质粒如

质粒衍生物(高拷贝数的基于ColE的噬菌粒，Stratagene Cloning Systems，La Jolla CA)、设计用于克隆Taq-扩增的PCR产物的PCR克隆质粒(例如，TOPO^TMTA

Kit，

质粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)和哺乳动物、酵母或病毒载体如杆状病毒表达系统(pBacPAK质粒衍生物，Clontech，Palo Alto，CA)。

在载体已经被构建并且本发明的核酸分子已经被插入到载体的适当位点中之后，完成的载体可以插入到适于扩增和/或多肽表达的宿主细胞中。本发明的表达载体向选择的宿主细胞中的转化可以通过周知的方法完成，所述方法包括诸如转染、感染、氯化钙、电穿孔、微注射、脂转染、DEAE-葡聚糖方法或其它已知技术的方法。选择的方法将部分与待使用的宿主细胞种类相关。这些方法和其它适合的方法是本领域技术人员周知的，并且在上面，例如在Sambrook等中进行了阐述。

宿主细胞可以是原核宿主细胞(如大肠杆菌(E.coli))或真核宿主细胞(如酵母、昆虫或脊椎动物细胞)。当在适当的条件下培养宿主细胞时，宿主细胞合成修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，所述拮抗剂可以随后从培养基中收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生其的宿主细胞收集(如果其没有被分泌)。适合的宿主细胞的选择将取决于各种因素，诸如期望的表达水平、期望的或对活性而言必需的多肽修饰(如糖基化或磷酸)和易于折叠成生物活性分子。

许多适合的宿主细胞在本领域中是已知的并且许多可以从American TypeCulture Collection(ATCC)，Manassas，VA获得。实例包括但不限于哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、CHO DHFR(-)细胞(Urlaub等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：4216-20)、人胚肾(HEK)293或293T细胞或3T3细胞。适合的哺乳动物宿主细胞的选择以及转化、培养、扩增、筛选、产物产生和纯化的方法在本领域中是已知的。其它适合的哺乳动物细胞系是猴COS-1和COS-7细胞系以及CV-1细胞系。进一步的示例性哺乳动物宿主细胞包括灵长类细胞系和啮齿类动物细胞系，包括转化的细胞系在内。正常的二倍体细胞、由初生组织的体外培养物衍生的细胞株以及初始外植体(primary explants)也是适合的。候选细胞可以在基因型上缺乏选择基因或可以含有显性作用选择基因(dominantly acting selection gene)。其它适合的哺乳动物细胞系包括但不限于小鼠成神经细胞瘤N2A细胞、海拉细胞、小鼠L-929细胞、由Swiss、Balb-c或NIH小鼠衍生的3T3系、BHK或HaK仓鼠细胞系。这些细胞系中的每一种都是蛋白表达领域中的技术人员已知得并且是蛋白表达领域中的技术人员可获得的。

同样用作适于本发明的宿主细胞的是细菌细胞。例如，各种大肠杆菌菌株(例如，HB101、DH5D、DH10和MCI061)周知为生物技术领域中的宿主细胞。各种枯草芽孢杆菌菌株(B.subtilis)、假单胞菌属某些种(Pseudomonas spp.)、其它芽孢杆菌属某些种(Bacillus spp.)、链霉菌属某些种(Streptomyces spp.)等等也可以应用在该方法中。

本领域技术人员已知的许多酵母细胞菌株也可用作宿主细胞来表达本发明的多肽。优选的酵母细胞包括，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerivisae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

另外，在期望的情况下，昆虫细胞系统也可以用在本发明的方法中。这些系统描述在例如Kitts等，1993，Biotechniques，14：810-17；Lucklow，1993，Curr.Opin.Biotechnol.4：564-72；和Lucklow等，1993，J.Virol.，67：4566-79中。优选的昆虫细胞是Sf-9和Hi5(Invitrogen)。

存在于宿主细胞中的本发明的多核苷酸可以与其它细胞组分如膜组分、蛋白质和脂质分离。可以应用标准核酸纯化技术从细胞中分离多核苷酸，或者可以应用扩增技术如聚合酶链反应(PCR)或通过应用自动合成器合成多核苷酸。分离多核苷酸的方法在本领域中是常规的和已知的。获得多核苷酸的任意此类技术可以用来获得编码本发明拮抗剂的分离多核苷酸。例如，限制酶和探针可以用来分离编码所述拮抗剂的多核苷酸。优选地，分离多核苷酸在不含其它分子或至少70、80或90％不含其它分子的制剂中。

本领域的技术人员将会意识到，本文描述的核酸和多肽分子可以通过重组和其它手段产生。例如，本发明的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂cDNA分子可以应用mRNA作为模板用标准分子生物学技术来制备。其后，可以应用本领域已知的和实施例1中描述的分子生物学技术复制cDNA分子。实施例2描述了5种特异性重组表达和纯化技术，所述技术被用来制备本发明的修饰的突变蛋白拮抗剂。

(c)人拮抗剂治疗效用的评价

为评价具体拮抗剂在过敏性哮喘治疗中的潜在功效，可以在实施例5和6中所详述的细胞增殖试验中对该拮抗剂进行体外测试。另外，修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂的血浆半衰期可以用实施例6所述的大鼠药物动力学研究在体内进行测量。

(d)药物组合物

上面描述的任意修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂可以以包含药学上可接受的运载体的药物组合物进行提供。药学上可接受的运载体优选是非热源性的。组合物可以单独或联合至少一种其它药剂如稳定化化合物给药，其可以在任意无菌的、生物相容的药物运载体中给药，所述药物运载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。多种含水运载体可以被使用，例如0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的并且一般不含颗粒物质。这些溶液可以通过常规的周知灭菌技术(例如，过滤)进行灭菌。

组合物可以含有所需的药学上可接受的辅助物质。可接受的辅助物质优选在所采用的剂量和浓度下对受者是无毒的。药物组合物可以含有这样的辅助物质，所述辅助物质用于改变、维持或保持例如pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速度、吸收或组合物的渗透。适合的配料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗微生物剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲液(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)、膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))、络合剂(如咖啡碱、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填料、单糖、二糖和其它糖类(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、形成盐的平衡离子(如钠)、防腐剂(如杀藻胺、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、羟苯甲酸甲酯(methylparaben)、羟苯甲酸丙酯(propylparaben)、双氯苯双胍己烷(chlorhexidine)、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或湿润剂(如pluronics；PEG；山梨聚糖酯；聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；triton；tromethamine；卵磷脂；胆固醇或tyloxapal)、稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)、张力增强剂(如碱金属卤化物-优选氯化钠或氯化钾-或甘露醇山梨醇)、输送运载体(vehicle)、稀释剂、赋形剂和/或药物助剂。参见Remington′sPharmaceutical Sciences(18th Ed.，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publishing Company1990)。

本发明的拮抗剂在这种药物配制物中的浓度可以变化很大，即，从按重量计小于约0.5％，常常在约1％或至少约1％，至多达15或20％，并且主要根据选择的具体给药方式基于液体体积、粘度等进行选择。如果期望，一种以上拮抗剂——例如对IL-4受体结合具有不同的[[K_d]]K _D——可以包含在药物组合物中。

组合物可以单独或联合其它药剂、药物或激素向患者给药。除活性成分外，这些药物组合物可以含有药学上可接受的运载体，所述运载体包含促进将活性化合物处理成药学上可以应用的制剂的赋形剂和辅助剂。

可接受的配料优选在所采用的剂量和浓度下对受者无毒。

药物组合物可以含有这样的配料，所述配料用于改变、维持或保持，例如pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速度、吸收或组合物的渗透。适合的配料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗微生物剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲液(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)、膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))、络合剂(如咖啡碱、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填料、单糖、二糖和其它糖类(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、形成盐的平衡离子(如钠)、防腐剂(如杀藻胺、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、羟苯甲酸甲酯(methylparaben)、羟苯甲酸丙酯(propylparaben)、双氯苯双胍己烷(chlorhexidine)、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或湿润剂(如pluronics；PEG；山梨聚糖酯；聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；triton；氨基丁三醇(tromethamine)；卵磷脂；胆固醇或tyloxapal)、稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)、张力增强剂(如碱金属卤化物-优选氯化钠或氯化钾-或甘露醇山梨醇)、输送运载体(vehicle)、稀释剂、赋形剂和/或药物助剂。参见Remington′s PharmaceuticalSciences(18th Ed.，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publishing Company 1990)。

最佳的药物组合物可以由技术人员根据例如意图的给药途径、输送形式和期望的剂量来确定。参见，例如，上面的Remington′s Pharmaceutical Sciences。这些组合物可以影响本发明核酸分子或骨密度调节剂的物理状态、稳定性、体内释放速度和体内清除速度。

药物组合物中主要的运载体(vehicle/carrier)本质上可以是含水的或不含水的。例如，用于注射的适合的运载体(vehicle/carrier)可以是水、生理盐水溶液或人造脑脊髓液，其中可能添加有肠胃外给药的组合物中常用的其它材料。中性缓冲盐水或混合有血清白蛋白的盐水是另外的示例性运载体。其它示例性药物组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的醋酸盐缓冲液，其可以进一步包含山梨醇或适合的替代品。在本发明的一个实施方式中，本发明的药物组合物可以通过将选择的具有期望纯度的组分与任选的配制剂(formulation agent)(如上Remington′s Pharmaceutical Sciences)混合来制备用于储存，为冻干饼状物或含水溶液的形式。进一步，可以应用适当的赋形剂如蔗糖将组合物配置为冻干物(lyophilizate)。

药物组合物可以被选择用于肠胃外输送。可选地，组合物可以被选择用于吸入或用于经过消化道输送如口服。这些药学上可接受的组合物的制备在本领域的技能内。

配制组分以给药位点可接受的浓度存在。例如，缓冲液被用来将组合物维持在生理pH或略低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。

当考虑肠胃外给药时，本发明中应用的治疗组合物可以是药学上可接受的运载体中的无致热原的、肠胃外可接受的、含水溶液的形式，所述溶液包含本发明的期望分子。特别适合的用于肠胃外注射的运载体是无菌蒸馏水，其中所述分子被配置成无菌的、等张溶液，适当保存。又一种制剂可以牵涉期望的分子与药剂的配制，如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(如聚乳酸或聚羟乙酸)、珠或脂质体，其提供产物的控制或持续释放，该产物然后可以经由贮存库注射输送。也可以应用透明质酸，其可以具有促进循环持续时间的效果。用于导入期望分子的其它适合的手段包括可植入的药物输送装置。

在一个实施方式中，药物组合物可以配制成用于吸入。例如，本发明的核酸分子或骨密度调节剂可以配制成干燥粉末以用于吸入。吸入溶液也可以与推进剂(propellant)一起配制以用于气溶胶输送。在又一实施方式中，溶液可以被雾化。肺部给药进一步描述在PCT公开号WO 94/20069中，其描述了化学修饰的蛋白质的肺部输送。

在其它实施方式中，某些配制物可以口服给药。在本发明的一个实施方式中，以这种方式给药的本发明的核酸分子或骨密度调节剂可以与或不与固体剂型如片剂和胶囊的化合中通常应用的那些运载体一起配制。例如，胶囊可以被设计来在生物利用度最大且预系统降解最小时的点在胃肠道中释放配制物中的活性部分。可以包括另外的药剂以促进本发明分子或调节剂的吸收。也可以应用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、药片崩解剂和黏合剂。

另一种药物组合物可以牵涉有效量的本发明核酸分子或骨密度调节剂与适于制造片剂的无毒赋形剂混合。通过将片剂溶解在无菌水或另一种适合的运载体中，可以以单位剂量形式制备溶液。适合的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

另外的药物组合物对本领域的技术人员而言将是明显的，包括将本发明的核酸分子或骨密度调节剂包含在持续或控制释放配制物中的配制物。配制各种其它持续或控制输送方法如脂质体运载体、生物可侵蚀微粒或多孔珠和贮存库注射液的技术也是本领域技术人员已知的。参见，例如，PCT/US93/00829，其描述了用于药物组合物输送的多孔聚合微粒的5种控制释放。

持续释放制剂的另外的实例包括成品形式的半透性聚合物基质，例如膜或微胶囊。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚交酯(美国专利第3,773,919号和欧洲专利第058481号)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等，1983，Biopolymers 22：547-56)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277和Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)、乙烯醋酸乙烯(Langer等，同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利第133988号)。持续释放组合物也可以包括脂质体，其可以通过本领域中已知的几种方法中的任一种进行制备。参见，例如，Eppstein等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-92；以及欧洲专利第036676号、第088046号和第143949号。

用于体内给药的药物组合物通常必须是无菌的。这可以通过无菌过滤膜过滤来完成。在组合物被冻干的情况下，应用该方法灭菌可以在冻干和重构(reconstitution)之前或之后进行。肠胃外给药的组合物可以以冻干形式或溶液储存。此外，肠胃外组合物一般被置于具有无菌入口的容器中，例如，静脉内溶液包或小瓶，其具有皮下注射器针头可刺穿的塞子。

本发明的药物组合物可以通过许多本文所述的任何数量的途径给药，包括但不限于口服方式、静脉内方式、肌肉内方式、动脉内方式、脊髓内方式、鞘内方式、心室内方式、经皮方式、皮下方式、腹膜内方式、鼻内方式、肠胃外方式、局部方式、舌下方式或直肠方式。

在药物组合物已经被制备后，可以将它们放置在适当的容器中并且贴上治疗所示病症的标签。这种标签将包括给药的量、频率和方法。

(d)治疗方法

本发明提供通过结合IL-4受体α链和抑制IL-4和IL-13-介导的活性来改善疾病症状的方法。这些疾病包括，而不限于，气道过敏和气道炎症，其包括肥大细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞、与哮喘和其它免疫学或过敏性疾病相关的募集和激活。

在本发明的一个实施方式中，治疗有效剂量的本发明修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂和/或本发明药物组合物被给药于患有特征是IL-4和IL-13活性升高的疾病如上述那些疾病的患者。

(e)治疗有效剂量的确定

治疗有效剂量的确定完全在本领域技术人员的能力内。治疗有效剂量指与在治疗有效剂量不存在的情况下明显的功效相比用于有效治疗哮喘的拮抗剂的量。

治疗有效剂量可以在动物模型，常常是大鼠、小鼠、兔、狗、猪或非人灵长类中进行初步估算。动物模型也可以用来确定适当的浓度范围和给药途径。这些信息然后可以用来确定在人中有用的剂量和给药途径。

治疗功效和毒性，例如，人拮抗剂的ED₅₀(50％的群体治疗有效的剂量)和LD₅₀(50％的群体的致命剂量)，可以在实验动物的细胞培养物中通过标准药物方法确定。毒性效果与治疗效果的剂量比为治疗指数，以及其可以表示为比率，LD₅₀/ED₅₀。

显示大的治疗指数的药物组合物是优选的。从动物研究获得的数据被用于配制人应用的剂量范围。这些组合物中含有的剂量优选在包括具有小毒性或无毒性的ED₅₀的循环浓度范围内。剂量根据采用的剂型、患者的敏感性和给药途径在该范围内变化。

精确剂量将由从业者根据与需要治疗的患者有关的因素确定。调整剂量和给药以提供足够水平的拮抗剂或维持期望的效果。可以考虑的因素包括疾病状态的严重度、对象的总体健康、对象的年龄、体重和性别、饮食、给药的时间和频率、药物结合(一种或多种)、反应敏感性和对治疗的耐受/反应。长效药物组合物可以每3至4天给药一次、每周给药一次或每两周给药一次，取决于具体配制物的半衰期和清除速度。

可以应用充分确立的技术，将编码本发明修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂的多核苷酸离体或体内构建并且导入细胞中，所述充分确立的技术包括但不限于转铁蛋白-聚阳离子-介导的DNA转移、用裸核酸或包封的核酸进行的转染、脂质体-介导的细胞融合、DNA-涂覆的乳胶珠(latex bead)的细胞间转运、原生质体融合、病毒感染、电穿孔、“基因枪”和DEAE-或磷酸钙-介导的转染。

拮抗剂的有效体内剂量在每千克患者体重约5μg至约50μg、约50μg至约5mg、约100μg至约500μg和每千克患者体重约200至约250μg的范围内。对于编码拮抗剂的多核苷酸的给药，有效体内剂量在约100ng至约200ng DNA、500ng至约50mg DNA、约1μg至约2mg DNA、约5μg至约500μgDNA和约20μg至约100μgDNA的范围内。

本发明的含有修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂的药物组合物的给药方式可以是将拮抗剂输送至宿主的任意适合的途径。本发明的药物组合物特别适用于肠胃外给药，即，皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药、气管内或鼻内给药以及其它肺部给药方式。

在本公开中引用的所有专利和专利申请通过引用明确并入本文。上述公开一般性地描述了本发明。通过参考下面特定的实施例可以获得更加完全的理解，所述实施例被提供仅仅用于说明目的并且不意图限制本发明的范围。

实施例1

IL-4-RA和IL-4-RE半胱氨酸突变蛋白的重组产品

pET Directional

表达系统(Invitrogen)被选择用于IL-4的重组表达。该系统应用高效的一步“

Cloning”策略来定向克隆平端PCR产物和T7lac启动子，以用于大肠杆菌中感兴趣基因的高水平表达和IPTG-可诱导表达。另外的特征包括用以减少基础转录的lacI基因、用于质粒的复制以及维持的pBR322起点和用于选择的氨苄青霉素抗性基因。

将IL-4克隆到pET101/D-TOPO载体中以产生重组IL-4蛋白。寡核苷酸引物显示在表4中。正向PCR引物设计有用以促进定向克隆的5′CACC突出端，其后是用于亚克隆的独特的Ndel限制酶位点和初始ATG起始密码子。反向PCR引物包括用以确保不掺入c-端标记的两个终止密码子和用于亚克隆的独特的BamHI限制酶位点。应用先前克隆的人IL-4作为模板，产生平端IL-4PCR产物。将该产物凝胶纯化并且与盐溶液和

载体在室温下温育5分钟，以便定向克隆到pET101/D-TOPO载体中。将重组载体转化入化学感受态One Shot TOP 10大肠杆菌中。将重组质粒DNA用于DNA测序，以确认正确的序列。

表4：用于产生IL-4RE半胱氨酸突变蛋白的寡核苷酸引物

SEQ ID NO IL4 RE 的寡聚序列

体

17 T28C Fwd(正向)GAAGACTCTGTGCACCGAGTTGTGCGTAACA

GACATCTTTGC

18 T28C Rev(反向)GCAAAGATGTCTGTTACGCACAACTCGGTGC

ACAGAGTCTTC

19 S36C Fwd GTAACAGACATCTTTGCTGCCTGCAAGAACA

CAACTGAG

20 S36C Rev CTCAGTTGTGTTCTTGCAGGCAGCAAAGATGT

CTGTTAC

21 K37C Fwd CCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCCTGCAAC

ACAACTGAGAAGG

22 K37C Rev CCTTCTCAGTTGTGTTGCAGGAGGCAGCAAA

GATGTCTGTTACGG

23 N38C Fwd GACATCTTTGCTGCCTCCAAGTGCACAACTGA

GAAGGAAACC

24 N38C Rev GGTTTCCTTCTCAGTTGTGCACTTGGAGGCAG

CAAAGATGTC

25 A104C Fwd GAATTCCTGTCCTGTGAAGGAATGCAACCAG

AGTACGTTGG

26 A104C Rev CCAACGTACTCTGGTTGCATTCCTTCACAGGA

CAGGAATTC

27 N105C Fwd CCTGTGAAGGAAGCCTGCCAGAGTACGTTGG

AAAACTTC

28 N105C Rev GAAGTTTTCCAACGTACTCTGGCAGGCTTCCT

TCACAGG

29 Q106C Fwd CCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACTGCAGTAC

GTTGGAAAACTTC

30 Q106C Rev GAAGTTTTCCAACGTACTGCAGTTGGCTTCCT

TCACAGGACAGG

IL-4/pET101/D-TOPO充当模板，用Strategene的

定点诱变试剂盒产生IL-4RE半胱氨酸突变蛋白。每一半胱氨酸突变蛋白应用两个寡核苷酸引物进行制备，每一个均与载体的相反链互补并且含有密码子TGC或GCA，以掺入期望的半胱氨酸突变。表4列出了用于制备IL-4RE突变蛋白的引物。含有交错切口的突变质粒应用制造商方案中限定的循环参数和条件进行制备。将产物用Dpnl核酸内切酶在37℃下处理1小时，以消化甲基化的、非突变的亲代DNA模板。将DpnI-处理的DNA转化到其中突变质粒中的切口被修复的XL-1Blue超感受态细胞中。根据标准测序技术分析诱变的5个质粒DNA，以确认正确的序列。

实施例2

重组体表达和纯化

将用含有蛋白的质粒转化的BL21Star(DE3)One Shot细胞(Invitrogen)表征为最佳表达并且生长在37℃下直至OD₆₀₀达到大约0.4以及通过1mMIPTG(Invitrogen)在37℃下诱导3小时。将一升细胞在13,000rpm下离心10分钟，称重并且储存在-80℃下。将冷冻的细胞沉淀(pellet)重悬浮在细胞破裂缓冲液(0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.3、0.1％Triton X100、1mM EDTA)中，每克细胞8ml所述缓冲液，并且超声处理4次，处理1分钟休息1分钟。通过以35,000g离心10分钟来除去细胞裂解液。然后这样将细胞沉淀洗涤2-3次：重悬浮在30ml细胞破裂缓冲液，超声处理1分钟，接着进行离心。将最终的细胞沉淀，包含体，储存在-20℃下。将包含体重悬浮在溶解缓冲液(0.2M Tris pH 9、7M盐酸胍)中，每克细胞5ml所述缓冲液。添加Sulphotolysis试剂(每克细胞0.16克亚硫酸钠、0.08克连四硫酸钾)并且将包含体在室温下搅拌2小时。然后通过以35,000g离心20分钟，除去未溶解的组分，留下溶解的包含体。然后将包含体过Superdex200大小排阻柱(Akta)，以分离蛋白。用2个柱体积(CV)的6M盐酸胍/PBS pH 7以1ml/min的流速来平衡柱子并且蛋白在1.5CV中洗脱。收集峰值级份(每份1.5ml)并且通过12％或4-20％Bis-Tris-SDS凝胶电泳进行筛选。汇集含有蛋白质的级份并且添加最终浓度为7.5mM的DTT，以便还原蛋白分子。在室温下温育2小时后，将混合物用水稀释5次并且透析到4.5L 3mM NaH₂PO₄、7mM Na₂HPO₄、2mM KCl、120mM NaCl中。透析持续3-4天，并且更换新鲜缓冲液至少3次。然后将透析的物质滤过0.2μm过滤器并且用醋酸将pH调节至5。用10CV的缓冲液1(25mM醋酸铵pH5)平衡柱子，接着是20分钟梯度至100％缓冲液B(25mM醋酸铵pH5/1M NaCl)的后注射。收集峰级份(每份0.5ml)并且通过12％或4-20％Bis-Tris-SDS凝胶电泳进行筛选。收集含有产物的级份并且用缓冲液A(0.1％TFA/水)稀释2x。然后应用5ml线圈和1ml/min的流速在C4反相-HPLC(Beckman系统Gold)上将蛋白进行层析，程序如下：注射期间为10％缓冲液A，10分钟梯度至40％缓冲液B(0.1％TFA/ACN)、30分钟梯度至50％缓冲液B以及5分钟梯度至100％缓冲液B。收集峰值级份(每份0.5ml)并且通过12％或4-20％Bis-Tris-SDS凝胶电泳进行筛选。将含蛋白的级份干燥并且重悬浮在0.1M MES pH 6.1中，用于分析和试验。

实施例3

位点特异性半胱氨酸PEG化和纯化

方案被确立以经由蛋白的巯基和线性22kD甲氧基-聚乙二醇-马来酰亚胺衍生物(Nektar Therapeutics)的马来酰亚胺基之间稳定的硫醚键来PEG化含有半胱氨酸的IL4RA突变蛋白。向60μM溶解在反应缓冲液，0.1M MES，pH 6中的蛋白添加2-倍摩尔过量的mPEG-MAL 22kD试剂。在室温下0.5小时后，用相对于mPEG-MAL 22kD 2-倍摩尔过量的半胱氨酸将反应终止(图1)。通过阳离子交换色谱和大小排阻色谱将PEG化的蛋白与未反应的mPEG-MAL 22kD(用半胱氨酸猝灭)和未反应的IL4RA半胱氨酸突变蛋白分离纯化。将粗反应混合物施加到用0.4mL0.1M MES，pH 6平衡的Vivapure Mini S阳离子交换柱(Vivascience)。用0.4mL 0.1MMES，pH 6将柱子洗涤两次，每次洗涤后以2,000×g进行离心。用0.4mL 0.6MNaCl/0.1M MES，pH6通过离心从柱子洗脱样品。应用Beckman HPLC系统Gold将0.4mL洗脱液加载到TSK-GEL G2000SWXL HPLC筛分柱(Tosoh Biosep)上。应用磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco的PBS)流动相在1ml/min的流速下解析样品30min。收集峰值级份(0.5ml)并且通过4-12％Bis-Tris-SDS凝胶电泳对PEG化的蛋白进行评价。汇集含有产物的级份并且应用Ultrafree Biomax-5装置(Millipore)按照制造商的方案浓缩到大约60μM(或～1mg/ml)，以用于分析和体外试验。PEG化的蛋白的最终浓度通过氨基酸分析确定。最终收率描述在表5中。

表5：PEG化的IL4RA半胱氨酸突变蛋白的纯化收率

突变蛋白 PEG化的 PEG化的％回收

(mg，最初的)(mg，最终的)

IL4RA ND ND ND

T28C 0.267 0.064 24.0

S36C 0.392 0.057 14.5

K37C 0.264 0.011 4.2

N38C 0.387 0.083 21.4

A104C 0.213 0.010 4.7

N105C 0.289 0.044 15.2

Q106C 0.125 0.023 18.4

平均 0.176 0.042 14.6

实施例4

BiaCore IL-4受体结合试验

通过胺偶联将IL-4受体固定化在BIAcore CM5研究级感应芯片上。用EDC/NHS脉冲活化感应器表面。将IL-4受体溶于10mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)中并且注射到流动孔(flowcell)2中，接着用1.0M乙醇胺-HCL脉冲使表面失活。受体的固定化水平是～300RU。流动孔1也在无配体的情况下被活化，以起空白的作用。Biacore Wizard被用来完成动力学分析。将候选IL4RE拮抗剂稀释在HBS-EP(运行缓冲液)中并且以30ul/分钟流速注射3分钟以及解离时间为15分钟。芯片的再生通过在接下来以浓度系列注射之前将10mM甘氨酸pH2.5(流速100ul/min)注射至基线两次30秒来完成。基于直接结合动力学计算每一候选物的解离常数(K_D)值(表5)。结果显示，构建物IL4-RE-A104C、IL4-RE-N105C和IL4-RE-Q106C的解离常数均低于0.6nM。

实施例5

TF-1细胞增殖测试

TF-1细胞对IL-4(0.5ng/ml，0.033nM)或IL-13(5ng/ml，0.416nM)的增殖应答被用来评价IL-4RE分子的功能性拮抗活性。在该测试中，将TF-1细胞在有或没有IL-4或IL-13和IL-4RE分子的情况下在RPMI+10％血清中于96孔板(1×10⁴/孔，100μl体积)中培养2-4天。GM-CSF处理被用作阳性对照。在最终读数前二十四小时，向每一孔添加10μl AlamarBlue(10％体积)。应用WALLAC Victor 2在530/590nm处测定荧光。抑制浓度50％(IC₅₀)基于候选IL-4RE分子的剂量滴定进行计算。IL-4和IL-13抑制的TF-1生物测定结果的总结显示在表6中。结果表明，构建物IL4-RE-K37C、IL4-RE-N38C和IL4-RE-A104C显示出与在IL-4或IL-13存在的情况下IL-4-RA的IC₅₀值相当的IC₅₀值。

表6：在TF-1细胞增殖试验中PEG化的突变蛋白与IL4RA的PEG-IL4REBIAcore结合试验和生物活性评价

突变蛋白 BIAcore亲和性， TF-1/IL-4IC₅₀， TF-1/IL-13IC₅₀，

nM nM nM

BAY 16-9996IL-4RA 0.11 0.56+0.86(n＝17) 1.17+1.77(n＝6)

IL4-RE-T28C 0.89 2.35+0.75(n＝2) 2.87+0(n＝1)

IL4-RE-S36C 1.15 1.20+0.02(n＝2) 1.21+0(n＝1)

IL4-RE-K37C 0.74 0.82+0.01(n＝2) 1.22+0.58(n＝2)

IL4-RE-N38C 0.77 0.70+0.18(n＝2) 1.24+0.58(n＝2)

IL4-RE-A104C 0.56 0.55+0.10(n＝2) 1.34+1.21(n＝2)

IL4-RE-N105C 0.59 2.26+0.20(n＝2) 2.11+0(n＝1)

IL4-RE-Q106C 0.52 2.44+0.68(n＝2) 1.95+0(n＝1)

实施例6

初级细胞增殖试验

人初级细胞(T-细胞和B-细胞)对IL-4的增殖应答也可以在IL-4RE分子预处理之后进行评价。从外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)，其中一些用PHA处理4天，以诱导T细胞的胚细胞形成。将PBMC也用抗-CD40进行处理以激活B细胞活性，并且立即应用。将细胞接种在96孔板中(每孔10⁵细胞)。将PHA T-细胞的胚细胞和B细胞制剂在不同浓度的IL-4RE分子存在的情况下用IL-4(10ng/ml，0.667nM)刺激3天。在温育的最后20小时内参入含氚胸苷用作增殖的指示剂。这些试验的结果显示在表7中。结果表明，对于两种初级细胞试验，所有PEG化的构建物均显示出IC₅₀大于IL-4RA的IC₅₀小于5倍的IL-4RA的IC₅₀。

表7：在B-细胞和T-细胞的胚细胞增殖试验中PEG-IL4RE生物活性评价

突变蛋白 B-细胞IC₅₀，nM T-细胞的胚细胞IC₅₀，

nM

BAY 16-9996IL-4RA 0.86+0.42(n＝10) 3.22+3.26(n＝16)

IL4-RE-K37C 3.73+2.15(n＝2) 13.86+12.77(n＝2)

IL4-RE-N38C 3.33+2.68(n＝2) 9.94+8.99(n＝2)

IL4-RE-A104C 3.29+1.46(n＝2) 4.67+4.65(n＝2)

实施例7

大鼠药物动力学研究

使用称重为250至300克的成年雄性Sprague-Dawley大鼠。将颈静脉导管插入大鼠中用于血液样品收集。另外，将股静脉导管插入静脉内(IV)剂量组的大鼠中用于药物给药。

以1和0.5mg/kg的剂量分别给予大鼠IL-4RA或修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂。使用IV和SC(皮下)给药途径。通过向留置的股静脉导管直接注射来给予IV剂量。通过向胸背部区域注射来给予SC剂量。每个剂量组使用3只大鼠。

在单一弹丸注射(bolus injection)(IV或SC)后，在给药前(predose)和预先确定的时间收集血液样品，一直到给药后168小时。样品的离心在收集的1小时内开始。收获血浆并且置于干冰上，然后储存在大约-70℃下。

IL-4RA和修饰的突变蛋白的血浆浓度用酶联免疫测定进行定量。抗IL-4抗体被用作包被试剂和检测试剂。这种测定的定量下限是0.2ng/ml。应用WinNonlin(Pharsight，Mountain view，CA)通过非区室分析(non-compartmentalanalysis)来得到药物动力学参数。特别感兴趣的是吸收和消除动力学、分布体积以及吸收的量的估算。

实施例8

大肠杆菌编码的IL-4突变蛋白

高纯度和高收率的包含体表达直接影响生产能力和成本。已经显示，IL-4三重突变蛋白分子可以在实验室里通过将应用人DNA密码子的IL-4三重突变蛋白构建物包含到适于在大肠杆菌中表达的适当的质粒载体中而得到制备。尽管从应用人密码子的IL-4三重突变蛋白构建物可以获得少量的包含体，但是大肠杆菌发酵过程不强烈。观察到，应用人密码子的IL-4三重突变蛋白构建物的表达对大肠杆菌细胞可能是有毒的，引起裂解，导致包含体的低收率。不局限于某些理论，这种观察结果可能是由于大肠杆菌中有限量的人密码子。为了改进该方法，通过QuickChange(Strategene)应用大肠杆菌-密码子IL-4RA质粒来制备大肠杆菌-编码的IL4-RE-T13D。简而言之，通过QuickChange和适合的引物改造IL-4RA质粒，以将在位置丙氨酸104(密码子GCT)或天冬酰胺38(密码子AAC)处的密码子改为半胱氨酸(密码子TGC)。制备了两种编码IL-4TM(IL4-RE-T13D)分子的大肠杆菌-密码子IL4-RE-T13D质粒(表8)。

表8：大肠杆菌-密码子IL-4TM质粒

SEQIDNO	名称	序列
			34	大肠杆菌-密码子104C	atgcacaaatgcgatatcaccctgcaggaaatcatcaaaaccctgaattctctgaccgaacagaaaaccctgtgcaccgaactgaccgttaccgacatcttcgctgcttcgaaaaacaccaccgaaaaagaaaccttctgccgtgctgctaccgttctgcgtcagttctactctcaccacgaaaaagacacccgttgcctgggtgctaccgctcagcagttccaccgtcacaaacagctgatccgtttcctgaaacgtctggaccgtaacctgtggggtctggctggtctgaacagctgcccggttaaagaatgcaaccagtctaccctggaaaacttcctggaacgtctgaaaaccatcatggacgaaaaagactctaaatgctcttcttaataa
	序列
			35	大肠杆菌-密码子38C序列	atgcacaaatgcgatatcaccctgcaggaaatcatcaaaaccctgaattctctgaccgaacagaaaaccctgtgcaccgaactgaccgttaccgacatcttcgctgcttcgaaatgcaccaccgaaaaagaaaccttctgccgtgctgctaccgttctgcgtcagttctactctcaccacgaaaaagacacccgttgcctgggtgctaccgctcagcagttccaccgtcacaaacagctgatccgtttcctgaaacgtctggaccgtaacctgtggggtctggctggtctgaacagctgcccggttaaagaagctaaccagtctaccctggaaaacttcctggaacgtctgaaaaccatcatggacgaaaaagactctaaatgctcttcttaataa
36	大肠杆菌-密码子T13DN38C序列	atgcacaaatgcgatatcaccctgcaggaaatcatcaaagacctgaattctctgaccgaacagaaaaccctgtgcaccgaactgaccgttaccgacatcttcgctgcttcgaaatgcaccaccgaaaaagaaaccttctgccgtgctgctaccgttctgcgtcagttctactctcaccacgaaaaagacacccgttgcctgggtgctaccgctcagcagttccaccgtcacaaacagctgatccgtttcctgaaacgtctggaccgtaacctgtggggtctggctggtctgaacagctgcccggttaaagaagctaaccagtctaccctggaaaacttcctggaacgtctgaaaaccatcatggacgaaaaagactctaaatgctcttct

37

具有大肠杆菌-密码子T13DN38C序列的大肠杆菌质粒

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实施例9

PEG化的IL-4/IL-13抑制剂

当用马来酰亚胺-PEG(20kDa，线性的，来自Nektar、Dow或NOF；30kDa，线性的，来自Nektar、Dow或NOF；40kDa，线性的，来自Nektar、Dow或NOF；40kDa，支化的，来自Necktar或NOF)PEG化IL-4TM-N38C或IL-4TM-A104C时，活性明显降低——当应用BIAcore方法、基于TF-1细胞的试验或来自外周血的初级B或T淋巴细胞测定时(图2)。

此外，观察到，放置另外的半胱氨酸的位置是重要的。如表9中所示，在TF-1活性试验中PEG化的104C表现出的活性是PEG化的38C的约2倍多。

表9：IL-4DM与PEG化的IL-4TM的活性比较

为了弥补这种活性损失，应用QuikChange、适当的引物和大肠杆菌-密码子N38C质粒，将另外的T13D突变包含在IL-4TM-N38C上。先前已经显示，该T13D突变增加与IL-4Rα的结合亲和性(参见美国专利第6,028,176号，其通过引用而并入本文)。图3中所示，具有40kDa支化PEG的PEG化的T13D-N38C具有与未PEG化的IL-4DM(R121D/Y124D)相等的BIAcore，但这些数据不可以准确地预测基于细胞的测试，因为PEG化影响所有PEG化的IL-4TM分子的占据率(on-rate)。正是离去率(off-rate)一般是生物试验中效价决定的。应用基于TF-1细胞的试验，具有40kDa支化PEG的PEG化T13D-N38C具有与IL-4DM相等的活性。

在初级T细胞试验中观察到了类似的结果。在该试验中收集了10个供体的全血并且分离PBMC。将PBMC与PHA-P一起温育4天，然后将这些“胚细胞”用于试验。将胚细胞与IL-4和IL-4TM测试化合物的12种稀释液之一一起温育3天。在最后18小时内，向培养物添加3H-腺苷。收获细胞并且在b-计数器上对掺入3H-腺苷的DNA进行定量。表10示明了，通过PEG化的效价损失以及与104C相比在38C处PEG化所得到的效价的改善。

表10

候选物	IC50(nM)	＞95％抑制(nM)	IC50增加倍数(相对于IL-4DM)
				104C 40B	8.0±2.07	～171.4	7.4
104C 30L	4.93±0.79	～135.7	4.6

38C 40B	2.43±0.5	～55.7	2.3
				T13D 40B	3.28±1.428	～38.6	3.1
T13D	0.714±0.214	～10.7	0.67
				IL4-DM	1.071±0.714	～22.1	1

还在初级B细胞中进行了研究。类似地，收集5个供体的全血并且分离PBMC。将PBMC与小鼠抗人CD40、IL-4和IL-4TM测试化合物的12种稀释液之一一起温育3天。在最后18小时内，向培养物添加3H-腺苷。收获细胞并且在b-计数器上对掺入3H-腺苷的DNA进行定量(表11)。

表11

候选物	IC50(nM)	＞95％抑制(nM)	IC50成倍增加(相对于IL-4DM)
				104C 40B	19.42±6.28	～335.6	11.3
104C 30L	13.0±5.21	～142.8	7.6
				38C 40B	6.85±2.21	～96.4	4.0
T13D 40B	2.43±1.07	～22.1	1.4
				T13D	0.5±0.143	～7.14	0.3
IL-4DM	1.71±0.64	～25.7	1

再次观察到与104C位置相比在38C位置处PEG化的改善，以及与IL-4DM(R121D/Y124D)相比T13D和T13D 40B构建物效价分别增加或类似。

实施例10

提高IL-4/IL-13抑制剂的重折叠收率

IL-4TM(T13D/R121D/Y124D)在位置38C或104C处含有蛋白序列中的第7个半胱氨酸残基。该奇数半胱氨酸降低来自包含体的IL-4TM的重折叠效率。向IL-4TM重折叠缓冲液添加谷胱甘肽，以最优化IL-4TM重折叠的收率，而仍保留38C或104C通过马来酰亚胺联接的PEG分子被PEG化的能力。除向重折叠混合物添加谷胱甘肽外，存在重折叠的时间依赖性，以最优化IL-4TM进行PEG化的收率。通过BIAcore试验监测最大蛋白重折叠收率。一旦达到最大重折叠收率，用酸将重折叠溶液的pH降低到其中半胱氨酸氧化化学不再有效的pH。维持低pH直至IL-4TM在更中性的pH——其中半胱氨酸-马来酰亚胺键形成——与马来酰亚胺-PEG反应。

参考文献

1.Ying，S.，M.Humbert，J.Barkans，C.J.Corrigan，R.Pfister，G.Menz，M.Larche，D.S.Robinson，S.R.Durham and A.B.Kay.1997.Expression of IL-4andIL-5mRNA and protein product by CD4+and CD8+T cells，eosinophils，and mastcells in bronchial biopsies obtained from atopic and nonatopic(intrinsic)asthmatics.J.Immunol.158：3539-3544.

2.Huang，S.K.，H.Q.Xiao，J.Kleine-Tebbe，G.Paciotti，D.G.Marsh，L.M.Lichtenstein and M.C.Liu.1995.IL-13expression at the sites of allergen challengein patients with asthma.J.Immunol.155：2688-2694.

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尽管通过参考上述实施例已经对本发明进行了描述，但是应当理解的是，修改和变化包括在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅通过所附权利要求进行限定。

Claims

1.修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其在IL-4的位置28、36、37、38、104、105、106的氨基酸残基处与非蛋白聚合物偶联，其中在位置13、121和124的氨基酸是天冬氨酸，其中所述氨基酸根据野生型人IL-4进行编号，以及其中所述非蛋白聚合物是聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。

2.权利要求1所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其中所述非蛋白聚合物被偶联在IL-4的位置37、38或104的氨基酸残基处。

3.权利要求1所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其包含SEQ ID NO：33中列出的氨基酸序列。

4.权利要求1所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其中所述非蛋白聚合物是聚乙二醇。

5.权利要求4所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其中所述聚乙二醇为线性的。

6.权利要求4所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其中所述聚乙二醇为支化的。

7.权利要求6所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其中所述聚乙二醇为约3kD至50kD。

8.权利要求7所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其中所述聚乙二醇为40kD。

9.药物组合物，其包含：

a)权利要求1所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂；以及

b)药学上可接受的载体。

10.药物组合物，其包含：

a)权利要求8所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂；以及

b)药学上可接受的载体。

11.权利要求1所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其中所述修饰的突变蛋白受体拮抗剂以约0.1nM至约10μM、约0.5nM至约1μM或约1.0nM至约100nM的K_D与IL-4受体α链结合。

12.权利要求1所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其中所述修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂以约0.1nM至约10μM、约0.5nM至约1μM或约1.0nM至约100nM的IC₅₀抑制TF-1细胞对IL-4的增殖应答。

13.权利要求1所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其中所述修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂以约0.1nM至约10μM、约0.5nM至约1μM或约1.0nM至约100nM的IC₅₀抑制TF-1细胞对IL-13的增殖应答。

14.权利要求1所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其中所述修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂以约0.1nM至约10μM、约0.5nM至约1μM或约1.0nM至约100nM的IC₅₀抑制人B细胞对IL-4的增殖应答。

15.权利要求1所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其中所述修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂以约0.1nM至约10μM、约0.5nM至约1μM或约1.0nM至约100nM的IC₅₀抑制人T细胞对IL-4的增殖应答。

16.权利要求1所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其中所述修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂具有比未修饰的IL-4受体拮抗剂血浆半衰期长至少约2-10倍的血浆半衰期。

17.权利要求18所述的修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂，其中所述修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂具有比未修饰的IL-4受体拮抗剂血浆半衰期长至少约10-100倍的血浆半衰期。

18.编码多肽的纯化多核苷酸，所述多肽包含SEQ ID NO：33中列出的氨基酸序列。