KR20100096171A - 변형된 ｉｌ-4 뮤테인 수용체 길항제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리에틸렌 글리콜에 커플링되는 IL-4 뮤테인 수용체 길항제를 포함하는 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제에 관한 것이다. 또한, 치료 목적을 위한 이의 투여 방법, 용량 및 제형도 제공한다. 이러한 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제, 조성물 및 방법은 IL-4 및 IL-13 매개된 기도 과민증 및 호산구 증가증을 억제하여 호흡기 질환 예컨대 천식을 앓고있는 개체에게 치료 선택권을 제공한다. 보다 구체적으로 상기 길항제는 우수한 혈장 반감기를 통해서, 비변형된 IL-4RA와 대비하여 증가된 효능 지속 기간을 갖는다.

Description

변형된 ＩＬ-4 뮤테인 수용체 길항제{MODIFIED IL-4 MUTEIN RECEPTOR ANTAGONISTS}

본 발명은 비단백질 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜에 커플링된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제에 관한 것이다. 또한, 치료 목적을 위한 이의 관련 투여 방법, 용량 15 및 제형을 제공한다. 이들 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제, 및 관련 조성물 및 방법은 중증 천식, 만성 폐색성 폐질환 및 관련 폐 병태를 앓고 있는 개체에게 치료 선택권을 제공한다.

천식은 활성화된 T-림프구(T-세포), 및 호산구의 기관지 점막 침윤과 연관된, 가변적이고, 가역적인 기류 폐색 및 기도 과민증(AHR)을 특징으로 한다. 내재하는 기도 비만 세포와 함께, 이들 세포는 질환의 발병 과정에서 근본적인 역할을 하는 다양한 사이토카인과 매개인자를 분비한다. 특정한 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13)의 방출을 통해 CD4⁺ Th2 세포가 질환 추이를 조정하는 것으로 여겨진다(1,2). 구체적으로, Th2 사이토카인 IL-4 및 IL-13은 기도 염증 및 기도 과민증을 발생시키고 지속시키는데 중추적인 것으로 간주된다.

다수의 생체 내 연구가 또한 천식의 발병 과정에서 IL-4 및 IL-13의 중추적인 역할을 뒷받침한다. 이들 사이토카인이 결핍된 동물이나, IL-4 또는 IL-13 기능을 중성화시키는 시약을 사용한 경우에, 기도 염증 및 기도 과민증을 초래하는 1차 및 2차 면역 반응의 조절에서 이들 사이토카인의 중요한 역할이 관찰되었다(3,4). 점증적으로, 이러한 데이타들은 IL-4 및 IL-13이 알레르기성 기도 반응에서 중복되고 독립적인 역할을 수행할 수 있으며, 이들 2 사이토카인을 표적화하는 것은 2 사이토카인을 단독으로 표적화하는 것에 상당한 부가 혜택을 가질 수 있다는 것을 시사한다.

IL-4의 길항제는 문헌에 이미 보고된 바 있다. 길항제로서 기능하는 IL-4의 돌연변이체는 IL-4 길항제 뮤테인 IL-4/Y124D(Kruse, N., et al., Conversion of Human interleukin-4 into a high affinity antagonist by a single amino acid replacement, Embo J. 11:3237-44, 1992) 및 이중 뮤테인 IL-4[R121D/Y124D] (Tony, H., et al., Design of Human Interleukin-4 Antagonists in Inhibiting Interleukin-4-dependent and Interleukin-13-dependent responses in T-cells and B-cells with high efficiency, Eur . J. Biochem. 225:659-664 (1994))가 포함된다. 단일 뮤테인은 D-나선의 124 위치에서 티로신을 아스파르트산으로 치환된 것이다. 이중 뮤테인은 D-나선의 121 위치에서 아르기닌을 아스파르트산으로 치환하고, 위치 124의 티로신을 아스파르트산으로 치환한 것이다. 이러한 D 나선부의 변이는 제2 결합 영역에서 상호작용의 변화와 긍정적으로 상호 관련된다.

야생형 IL-4의 작동성 또는 길항성을 보이는 IL-4의 돌연변이체는 IL-4의 다면발현적 효과 중 하나와 연관된 병태를 치료하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, IL-4의 길항제는 IL-4 생성으로 악화되는 병태, 예컨대 천식, 알레르기 또는 다른 염증 반응 관련 병태를 치료하는데 유용할 수 있다. IL-4의 작동제는, IL-4의 존재가 질환, 예컨대 자가면역 질환 예컨대 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 인슐린 의존적 진성 당뇨병 등의 완화 또는 감쇠와 연관되는 병태를 치료하는데 유용할 수 있다. 이들 자가면역 질환은 1형 및 2형의 T 헬퍼 세포 개체군(Th1, Th2) 생성의 편중성을 특징으로 한다. 나이브(Naive) CD4+ T 세포는 자극 동안 존재하는 사이토카인에 따라서, Th1 또는 Th2 서브셋으로 분화된다. IL-4 작동제는 요구되는 T-헬퍼 세포, 즉 Th2 생성쪽으로 이상적으로 이동되어 치료 효과를 나타낸다.

PCT/US93/03613은 알파 나선 도메인에 Phe-Leu 또는 Tyr-Leu 서열을 가지며, Phe-Leu 또는 Tyr-Leu 서열의 바로 상류 또는 하류에 2 아미노산 내에 음으로 하전된 아미노산을 갖는 IL-4 변이체를 개시하고 있으며, 이 변이체는 음으로 하전된 아미노산 대신 치환된 중성 아미노산에 의해 IL-4 수용체에 대한 친화성이 증가되었다. 이 출원은 또한 음으로 하전된 잔기의 2-잔기 내에서 IL-4의 알파 나선 내 Trp-Leu 또는 Phe-Leu의 특이적 치환이 친화성을 향상시킨 것으로 개시되어 있다. 이 변이체는 IL-4 융합 단백질(디프테리아 독소와 융합)이다.

그 아미노산 서열의 2 위치에서 돌연변이된 인간 IL-4에서 유래하는 재조합 뮤테인 단백질(IL-4RA)이 U.S. 특허 제6,028,176호 및 제6,313,272호에 이미 보고되었다. IL-4RA는 IL-4 및 IL-13 수용체 복합체의 중요한 기능성 신호전달 성분인, 인간 IL-4 수용체 알파 사슬에 높은 친화성으로 결합한다. 이 뮤테인은 작동제 활성을 갖지 않으며, 시험관 내에서 강력한 경쟁적 IL-4 및 IL-13 수용체 길항제로서 작동한다(U.S. 특허 제6,028,176호 및 제6,313,272호). IL-4RA 사용의 중요한 단점은 생체 내에서 반감기가 비교적 짧다는 것이다(대략 3∼6시간). 영장류 천식 모델에서 IL-4RA의 약동학/약력학 모델링은 최적 치료 효능을 위해 유효한 평균 정상 상태 농도가 대략 60 ng/㎖인 것으로 나타났다.

짧은 반감기를 극복하기 위한 접근법 중 하나는 환자에게 IL-4RA 뮤테인을 자주 투여하는 것이지만, 빈번한 투여(일반적으로 주사 또는 기관내 삽관법에 의함)는 진료소에서 요법 및 치료적 투여에 대한 환자 수용도에 매우 심각한 장애를 초래하게 된다.

본 발명은 이전에 보고된 뮤테인보다 반감기가 높은 IL-4RA 뮤테인을 제공한다. 본 발명은 또한 IL-4 및 IL-13-매개 면역 반응을 억제하는 시약 및 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 측면 및 다른 측면은 이하에 열거한 1 이상의 구체예를 통해 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어진 군에서 선택된 비단백질 중합체에 커플링된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제를 포함하는 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제의 정제된 조제물을 제공한다. 이러한 구체예의 일 측면에서, 상기 정제된 조제물은 서열 번호 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 폴리펩티드를 포함한다. 이 구체예의 일 측면에서, 정제된 조제물은 서열 번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 폴리펩티드를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 선형 또는 분지형이고, 분자량은 약 3 kD∼50 kD 범위이다. 일 구체예에서, PEG 부분은 약 40 kD이다.

일 구체예에서, 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 폴리펩티드는 IL-4의 28, 36, 37, 38, 104, 105 또는 106 위치의 아미노산 잔기에서 비단백질 중합체와 커플링될 수 있다. 이러한 위치는 야생형 IL-4(즉, 인간 인터루킨-4) 아미노산 서열에 따라 번호화된 것이다. 이 구체예의 일 측면에서, 28, 36, 37, 38, 104, 105 또는 106 위치의 아미노산 잔기는 시스테인이다. 이 구체예의 다른 측면에서, 121, 124 및 125 위치의 아미노산 잔기는 아스파르트산이다. 이 구체예의 다른 측면에서, 13 위치의 아미노산 잔기는 아스파르트산이고, 121 및 124 위치의 아미노산은 아스파르트산이다.

일 구체예에서, 본 발명의 변형된 뮤테인 수용체 길항제는 약 0.1 nM∼약 10 μM, 약 0.5 nM∼약 1μM, 또는 약 1.0 nM∼약 100 nM의 K_D로 IL-4 수용체 알파 사슬에 결합한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제는 약 0.1 nM∼약 10 μM, 약 0.5 nM∼약 1μM, 또는 약 1.0 nM∼약 100 nM의 IC₅₀으로 TF-1 세포의 증식성 반응을 억제한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제는 약 0.1 nM∼약 10 μM, 약 0.5 nM∼약 1μM, 또는 약 1.0 nM∼약 100 nM에서 선택된 IC₅₀ 으로 IL-13에 대한 TF-1 세포의 증식성 반응을 억제한다.

추가 구체예에서, 본 발명의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제는 약 0.1 nM∼약 10 μM, 약 0.5 nM∼약 1.0 μM, 또는 약 1.0 nM∼약 100 nM에서 선택된 IC₅₀으로 IL-4에 대한 인간 B 세포의 증식성 반응을 억제한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제는 약 0.1 nM∼약 10 μM, 약 0.5 nM∼약 1 μM, 또는 약 1.0 nM∼약 100 nM로 이루어진 군에서 선택된 IC₅₀으로 IL-4에 대한 인간 T 세포의 증식성 반응을 억제한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제는 비변형된 IL-4 수용체 길항제보다 혈장 반감기가 적어도 약 2∼10배 높다.

본 발명은 또한, (a) 인간 IL-4 수용체에 결합하는 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8 또는 서열 번호 31에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 (b) 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 32 또는 서열 번호 33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 정제된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제를 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 길항제가 발현되는 조건 하에서 상기 기술된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 숙주 세포 배양물로부터 길항제를 정제하는 단계를 포함한다. 구체적인 측면에서, 본 발명의 방법으로 제조된 길항제는 IL-4 및 IL-13-매개된 활성을 억제할 수 있고, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어진 군에서 선택된 비단백질 중합체에 커플링된다.

본 발명은 또한 IL-4 및 IL-13의 활성 증가와 연관된 인간 질병을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) IL-4 및 IL-13의 활성이 증가된 병태를 갖는 인간을 제공하는 단계; 및 (b) 본 발명의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 또는 본 발명의 약학 조성물의 유효량을 상기 인간에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 측면에서, 상기 질병은 천식, 만성 폐색성 폐질환(예컨대 폐기종 또는 만성 기관지염), 또는 관련 폐 병태이다.

본 발명은 또한 활성형으로 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제를 제조하는 방법, 이 방법으로 제조된 길항제, 이러한 길항제를 포함하는 조성물, 이러한 길항제를 투여하는 것을 포함하는 인간 질병을 치료하는 방법, 및 이러한 길항제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이 방법은 (a) 길항제가 발현되는 조건 하에서 상기 기술된 숙주 세포를 배양하는 단계; (b) 디티오트레이톨 존재하에서 길항제를 리폴딩되도록 하는 단계; 및 (c) 숙주 세포 배양물로부터 길항제를 정제하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 (d) 비단백질 중합체에 길항제를 커플링시키는 단계; 및 (e) 비단백질 중합체에 커플링된 길항제를 정제하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 특정 바람직한 구체예는 이하의 일정 바람직한 구체예의 보다 상세한 설명과 청구항을 통해 분명해 질 것이다.

도 1은 PEG화 반응 화학을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 위치 38C에 30kD 선형 또는 40kD 분지형 PEG를 갖는 동일 분자와 IL-4 이중 뮤테인(IL-4DM)을 비교하는 IL-4R에 대한 BIAcord 결합 결과를 도시한 그래프이다.
도 3은 PEG화된 IL-4TM(T13D/R121D/Y124D)이 PEG화된 IL-4DM 보다 강력하고 IL-4DM(R121D/Y124D)와는 동등하게 강력하다는 것을 확인한 IL-4 자극으로 TF-1 성장을 억제한 결과를 도시한 그래프이다.

본 발명은 비단백질 중합체, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 분자에 커플링된 IL-4 뮤테인 수용체를 포함하는 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제에 관한 것이다.

본 명세서에서 달리 필요로하지 않으면, 단수 용어는 복수를 포함하며 복수 용어는 단수를 포함한다.

본 명세서에서 사용한 섹션 표제는 구성적인 목적만을 위한 것이고 본원에 기술한 대상을 제한하려는 것이 아니다. 본원에 인용한 모든 참조 문헌을 명백하게 참조하여 포함시킨다.

용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 서열" 또는 "핵산 분자"는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이 용어는 임의의 공지된 DNA 및 RNA의 염기 유사체, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니며, 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐-시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시히드록실메틸)우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시-메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소-펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸-구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노-메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실큐에오신, 5'-메톡시카르보닐-메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-5 N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신 및 2,6-디아미노퓨린으로 형성된 분자들을 포함한다.

용어 "정제된" 또는 "단리된" 폴리뉴클레오티드는 (1) 약 50% 이상의 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 전체 핵산을 공급 세포로부터 단리할 때 천연적으로 발견되는 다른 물질로부터 분리되거나, (2) 자연계에서 "단리된 핵산 분자"가 연결되는 폴리뉴클레오티드 전체 또는 그 일부에 연결되지 않거나, (3) 자연계에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되거나, 또는 (4) 거대한 폴리뉴클레오티드 서열의 일부로서 자연계에서 발견되지 않는 본 발명의 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 임의의 다른 오염된 핵산 분자(들), 또는 폴리펩티드 제조 또는 이의 치료, 진단, 예방 또는 연구 용도에서 그 사용을 방해하는 천연 환경에서 발견되는 다른 오염물이 실질적으로 없다.

본원에서 사용되는, "야생형 IL-4" 또는 "wtIL-4" 및 이의 균등물은 상호 교환적으로 사용되며, 본원에 참조하여 포함시킨, U.S. 특허 제5,017,691호에 개시된, 천연 인간 IL-4의 129개의 정상적으로 발생하는 아미노산 서열을 갖는, 천연 또는 재조합 인간 인터루킨-4를 의미한다. 또한, 본원에서 기술하는 변형된 인간 IL-4 수용체 길항제는 다양한 삽입 및/또는 결실 및/또는 비단백질 중합체와의 결합부를 가질 수 있으며, wtIL-4에 따라 번호화되는데, 이는 선택된 특정 아미노산이 wtIL-4에서 정상적으로 발생되는 동일 아미노산과 동일하다는 의미이다. 따라서, 당분야의 당업자는 예를 들어, 위치 13(트레오닌), 121(아르기닌), 및/또는 124(티로신)에서 정상적으로 발생하는 아미노산이 뮤테인에서는 바뀔 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 아미노산 위치, 예를 들어, 38, 102 및/또는 104에서 시스테인 잔기의 삽입이 뮤테인 상에서 이동될 수 있다. 그러나, 이동된 Ser(S), Arg(R), Tyr(Y) 또는 삽입된 Cys(C)의 위치는 wtIL-4에서 측접된 Ser, Arg, Tyr 또는 Cys과 측접한 아미노산의 상관 관계 및 검토를 통해 확인할 수 있다.

또한, 인간 IL-4 또는 돌연변이체 인간 IL-4 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 신호 서열을 코딩하는 DNA 서열을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 이러한 신호 서열은, 존재한다면, IL-4 뮤테인의 발현을 위해 선택된 세포가 인식할 수 있는 것이어야 한다. 이는 원핵생물, 진핵생물 또는 이 둘의 조합일 수 있다. 또한, 천연 IL-4의 신호 서열일 수도 있다. 신호 서열의 포함은 IL-4 뮤테인이 생성되는 재조합 세포로부터 IL-4 뮤테인이 분비되는 것이 요구되는 지에 따라 결정된다. 선택된 세포가 원핵생물이라면, DNA 서열이 신호 서열을 코딩하지 않지만, 발현을 지정하는 N-말단 메티오닌을 포함하는 것이 대체로 바람직하다. 선택된 세포가 진핵생물인 경우에는, 신호 서열을 코딩하는 것이 대체로 바람직하고, 가장 바람직하게는 본원에 참조하여 포함되는 U.S. 특허 제6,028,176호에 개시된 바와 같이, 야생형 IL-4 신호 서열을 사용하는 것이다.

본원에서 사용하는 용어 "돌연변이체 인간 IL-4 단백질", "변형된 인간 IL-4 수용체 길항제", "mhIL-4", "IL-4 뮤테인", "IL-4 길항제", 및 이의 균등물은 상호교환적으로 사용되며 본 발명의 범주에 속한다. 이들 폴리펩티드 및 이의 기능성 단편들은 성숙한 인간 IL-4 단백질에 대해 특이적인 아미노산 치환이 이루어진 폴리펩티드를 의미한다. 이들 폴리펩티드는 천식 치료를 필요로 하는 피험체에게 투여되는, 본 발명의 mIL-4 조성물을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 mhIL-4는 적어도 R121D/Y124D 치환쌍("IL-4RA")(서열 번호 31)을 포함한다.

본원에서 사용하는 "기능성 단편"은 보다 작은 펩티드를 비롯하여, IL-4 길항 활성을 갖는 폴리펩티드이다. mhIL-4의 이러한 측면 및 다른 측면과 hIL-4의 변형은 U.S. 특허 제6,335,426호; 제6,313,272호; 및 제6,028,176호에 기술되어 있으며, 이 문헌들의 전체 내용을 참조하여 본원에 포함시킨다.

본원에서 "야생형 IL-4에 따른 번호화"란, 아미노산이 야생형 IL-4에서 정상적으로 발생하는 위치와 관련하여 선택된 아미노산을 식별하는 것을 의미한다.

용어 "벡터"는 숙주 세포에 코딩 정보를 전달하는데 사용되는 임의의 분자(예를 들어, 핵산, 플라스미드 또는 바이러스)를 의미하는 것으로 사용된다.

용어 "발현 벡터"는 숙주 세포의 형질전환에 적합하고, 삽입된 이종성 핵산 서열의 발현을 지시 및/또는 제어하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 의미한다. 발현은 이에 제한되는 것은 아니지만, 예컨대 전사, 번역, 및 인트론이 존재하는 경우 RNA 스플라이싱 등의 프로세스를 포함한다.

본원에서 용어 "숙주 세포"는 형질전환되었거나, 또는 핵산 서열로 형질전환되어 이후에 목적하는 선택 유전자를 발현할 수 있는 세포를 의미한다. 이 용어는 선택 유전자가 존재하는 한, 자손 세포가 원래 모세포와 유전적 구성 또는 형태가 동일하건 동일하지 않건 무관하게 모세포의 자손 세포를 포함한다.

용어 "형질도입(transduction)"은 일반적으로 파지에 의해서, 한 박테리아로부터 다른 박테리아로 유전자가 전달되는 것을 의미하는데 사용된다. "형질도입"은 또한 레트로바이러스에 의한 진핵생물 세포 서열의 획득 및 전달을 의미한다.

용어 "형질감염(transfection)"은 세포에 의해 외래 또는 외생성 DNA가 흡수되는 것을 의미하는데 사용되며, 외생성 DNA가 세포막 안으로 도입될 때 세포가 "형질감염"된다. 수많은 형질감염 기법이 당분야에 공지되어 있으며, 본원에서 개시하였다. 예를 들어, 하기 문헌들을 참조한다: Graham et al , 1973, Virology 10 52:456; Sambrook et al , Molecular Cloning , A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Davis et al , Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, 1986); 및 Chu et al , 1981, Gene 13:197. 이러한 기법들을 사용하여 적절한 숙주 세포에 1 이상의 외생성 DNA 부분을 도입할 수 있다.

본원에서 용어 "형질전환(transformation)"은 세포의 유전적 특징이 변하는 것을 의미하는데 사용되며, 세포가 변형되어 새로운 DNA를 함유하게 된 경우 세포는 형질전환된 것이다. 예를 들어, 세포는 이의 천연 상태로부터 유전적으로 변형된 경우에 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입후, 형질전환 DNA는 세포의 염색체에 물리적으로 통합되어 세포의 DNA와 재조합되거나, 또는 복제되지 않고 에피솜 성분으로서 일시적으로 유지되거나, 또는 플라스미드로서 독립적으로 복제될 수 있다. 세포는 세포의 분열과 함께 DNA가 복제될 때 안정하게 형질전환된 것으로 간주된다.

당분야에서 공지된 용어 "동일성(identity)"은 서열 비교를 통해 결정시, 2 이상의 폴리펩티드 분자의 서열 간 또는 2 이상의 핵산 분자 간 관련도를 의미한다. 당분야에서, "동일성"은 또한 경우에 따라서, 2 이상의 뉴클레오티드 스트링 또는 2 이상의 아미노산 서열 간의 매치를 통해 측정시, 핵산 분자 또는 폴리펩티드 간 서열 관련도를 의미한다. "동일성"은 구체적인 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")으로 처리되는 갭 얼라인먼트(있는 경우라면)와 보다 작은 2 이상의 서열 간 동일한 매치 비율을 측정한다.

용어 "유사성"은 관련 개념이지만, "동일성"과 대조적으로, "유사성"은 2개의 동일한 매치 및 보존성 치환 매치를 포함하는 관련도 측정치이다. 2 폴리펩티드 서열이 예를 들어, 10/20 동일 아미노산을 갖고, 나머지가 모두 비보존성 치환이라면, 동일성 및 유사성 비율은 둘 모두 50%일 수 있다. 동일 예에서, 보존성 치환이 존재하는 5 이상의 위치가 존재한다면, 동일성 비율은 50%이지만, 유사성 비율은 75%이다(15/20). 따라서, 보존성 치환이 존재하는 경우에, 2 폴리펩티드 간 유사성 비율은 2 폴리펩티드 간 동일성 비율보다 높아진다.

관련 핵산과 폴리펩티드의 동일성 및 유사성은 공지 방법을 통해 쉽게 계산할 수 있다. 이러한 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 하기 문헌들에 기술되어 있다: COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY(Lesk, A.M., ed.), 1988, Oxford University Press, New York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D.W., ed.), 1993, Academic Press, New York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.), 1994, Humana Press, New Jersey; von Heinje, G., SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, M. Stockton Press, New York; Carillo et al, 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073; and Durbin et al, 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press.

동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험하는 서열간 최대 매치가 주어지도록 설계된다. 동일성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 기술되어 있다. 2 서열간 동일성을 결정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 이에 제한되는 것은 아니고, GAP(Devereux et al, 1984, Nucl. Acid. Res., 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(Altschul et al, 1990, J. Mol Biol, 215:403-410)를 비롯하여, GCG 프로그램 패키지를 포함한다. BLASTX 프로그램은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 및 다른 소스(BLAST Manual, Altschul et al NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al, 1990, 상동)에서 공개적으로 이용가능하다. 잘 알려진 스미스 워터맨(Smith Waterman) 알고리즘을 사용하여 동일성을 결정할 수도 있다.

2 아미노산 서열을 정렬하기 위한 일정 정렬 계획으로 2 서열의 짧은 영역만이 매치될 수 있으며, 이러한 작은 정렬 영역은 2 전체 길이 서열간에 유의한 관련성이 없음에도 서열 동일성이 매우 높을 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 선택된 정렬 방법(GAP 프로그램)은 표적 폴리펩티드의 50 이상의 인접하는 아미노산을 스패닝하는 정렬 결과를 생성하게 된다.

예를 들어, 컴퓨터 알고리즘 GAP(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)을 사용하여, 서열 동일성 비율을 결정하려는 2 폴리펩티드를 그들의 개별 아미노산의 최적 매칭에 대해 정렬시킨다(알고리즘으로 결정시, "매칭된 스팬"). 일부 구체예에서, 갭 오프닝 패널티(gap opening penalty)(평균 항(diagonal) 3배로서 계산함; 여기서 "평균 항"은 비교 매트릭스가 사용하는 평균 항이고; "항"은 특정 비교 매트릭스에 의해 각각의 완벽한 아미노산 매치로 지정되는 점수 또는 번호임) 및 갭 확장 패널티(일반적으로 갭 오프닝 패널티의 1/10임)와 예컨대 PAM250 또는 BLOSUM 62 등의 비교 매트릭스를 알고리즘과 함께 사용한다. 일부 구체예에서, 표준 비교 매트릭스(Dayhoff et al, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al, 1992, Proc . Natl . Acad . Sci USA, 89:10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrix)도 알고리즘에 의해 사용된다.

일부 구체예에서, 폴리펩티드 서열 비교를 위한 변수에는 하기의 것들이 포함된다:

알고리즘: [Needleman et al, 1970, J. Mol Biol, 48:443-453];

비교 매트릭스: [Henikoff et al, 1992, 상동]의 BLOSUM 62;

갭 패널티: 12

갭 길이 패널티: 4

유사성 한계치: 0

GAP 프로그램은 상기 변수를 사용하여 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 언급한 변수는 GAP 알고리즘을 사용하는 폴리펩티드 비교(최종 갭에 대한 무 패널티와 함께)를 위한 디폴트 변수이다.

본원에서 사용하는 바와 같이, 20개의 통상의 아미노산 및 이들의 약어는 통상의 용법을 따른다. 예를 들어, 문헌 [IMMUNOLOGY--A SYNTHESIS, 2nd Edition, (E. S. Golub and D. R. Gren, Eds.), Sinauer Associates: Sunderland, MA, 1991]을 참조하며, 이 문헌을 임의의 목적을 위해 참조하여 본원에 포함시킨다. 통상적인 20개 아미노산의 입체이성질체(예를 들어, D-아미노산); 비천연 아미노산, 예컨대 α-, α-2치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 다른 비통상적인 아미노산도 본 발명의 폴리펩티드에 적합한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예로는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-히드록시프롤린)이 포함된다. 본원에서 사용되는 폴리펩티드 표시법은, 표준 용법 및 협약에 따라서, 왼쪽 방향이 아미노 말단 방향이고 오른쪽 방향이 카르복실 말단 방향이다.

천연 발생 잔기는 공통 측쇄 특성을 기초로 하기 부류로 분류될 수 있다:

1) 소수성: 노르류신(Nor), Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) 산성: Asp, Glu;

4) 염기성: His, Lys, Arg;

5) 사슬 배향성에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및

6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

보존성 아미노산 치환은 이들 부류 중 한 부류의 구성원과 동일 부류의 다른 구성원을 교환하는 것을 포함할 수 있다. 보존성 아미노산 치환은 대체로 생물계에서의 합성보다는 화학적 펩티드 합성으로 도입되는, 비천연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이들에는 펩티드모방체 및 아미노산의 다른 역전형 또는 전화형을 포함한다.

비보존성 치환은 이들 부류 중 한 부류의 구성원과 다른 부류의 구성원간 교환을 포함할 수 있다. 이러한 치환된 잔기는 비인간 단백질과 상동성을 갖는 인간 단백질 영역에, 또는 분자의 비상동성 영역에 도입될 수 있다.

일부 구체예에 따라, 이러한 변화를 생성시키는데, 아미노산의 소수성 지수(hydropathic index)가 고려된다. 각 아미노산은 소수성 및 전하 특징을 기준으로 소수성 지수가 지정되어 있다. 이는 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질에 대해 상호 활성적인 생물학적 기능을 부여하는데서 소수성 아미노산 지수의 중요성은 당분야에서 이해되고 있다(예를 들어, Kyte et al, 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). 일정 아미노산은 유사한 소수성 지수 또는 점수를 갖는 아미노산으로 치환되고 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있는 것으로 알려져 있다. 소수성 지수를 기초로 변화시키는 경우, 일정 구체예에서, 소수성 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, ±1 이내인 것을 포함하고, 일정 구체예에서는 ±0.5 이내인 것을 포함한다.

본원에 개시된 바와 같이, 또한 유사 아미노산의 치환은, 특히 그에 의해 생성되는 생물학적으로 기능성인 단백질 또는 펩티드를 면역학적 구체예에서 사용하고자 하는 경우, 친수성을 기초로 유효하게 이루어질 수 있다는 것은 당분야에서 주지된 바이다. 일정 구체예에서, 그 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되므로, 단백질의 최고 국지 평균 친수성은 이의 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성과 상호관련있다.

하기의 친수성 값이 이들 아미노산 잔기에 지정되어 있다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5) 및 트립토판(-3.4). 일정 구체예에서, 유사한 친수성 값을 기준으로 변화를 만드는 경우, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 포함되며, 일부 구체예에서는 ±1 이내인 아미노산의 치환이 포함되며, 일부 구체예에서는 ±0.5 이내인 아미노산의 치환이 포함된다. 또한, 친수성을 기초로 1차 아미노산 서열로부터 에피토프를 동정할 수도 있다. 이들 영역을 "에피토프 코어 영역"이라고도 한다. 예시적인 아미노산 치환을 하기 표 1에 열거하였다.

아미노산 치환
본래 잔기	예시적인 치환	바람직한 치환
Ala	Val, Leu, Ile	Val
Arg	Lys, Gln, Asn	Lys
Asn	Gln	Gln
Asp	Glu	Glu
Cys	Ser, Ala	Ser
Gln	Asn	Asn
Glu	Asp	Asp
Gly	Pro, Ala	Ala
His	Asn, Gln, Lys, Arg	Arg
Ile	Leu, Val, Met, Ala, Phe, 노르류신	Leu
Leu	노르류신, Ile, Val, Met, Ala, Phe	Ile
Lys	Arg, 1,4 디아미노-부티르산, Gin, Asn	Arg
Met	Leu, Phe, Ile	Leu
Phe	Leu, Val, Ile, Ala, Tyr	Leu
Pro	Ala	Gly
Ser	Thr, Ala, Cys	Thr
Thr	Ser	Ser
Trp	Tyr, Phe	Tyr
Tyr	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val	Ile, Met, Leu, Phe, Ala, 노르류신	Leu

숙련가는 공기된 기법을 사용하여 본원에 기술된 바와 같이 폴리펩티드의 적절한 변이체를 결정할 수 있다. 일정 구체예에서, 당분야의 숙련가는 활성에 중요한 것으로 여겨지지 않는 영역을 표적화하여 활성을 파괴하지 않고 변화시킬 수 있는 분자의 적절한 면을 동정할 수 있다. 다른 구체예에서, 숙련가는 유사한 폴리펩티드 간에 보존되는 분자의 잔기 및 부분을 동정할 수 있다. 추가 구체예에서, 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 영역에 대해 폴리펩티드 구조에 악영항을 주지 않으면서 또는 생물학적 활성을 파괴하지 않으면서 보존성 아미노산 치환을 수행할 수도 있다.

추가적으로, 당분야의 숙련가는 활성 또는 구조에 중요한 유사 폴리펩티드 내 잔기를 동정하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있다. 이러한 비교를 고려하여, 숙련가는 유사한 단백질의 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는, 단백질의 중요한 아미노산 잔기를 예측할 수 있다. 당분야의 당업자는 이렇게 예측된 중요 아미노산 잔기에 대해 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.

당분야의 숙련가는 또한 유사한 폴리펩티드의 구조에 관련하여, 3차 구조 및 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 이러한 정보를 고려하여, 당분야의 당업자는 그 3차원 구조에 대해, 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 정렬을 예측할 수 있다. 일정 구체예에서, 당분야의 당업자는 단백질의 표면 상에 존재할 것으로 예측되는 아미노산 잔기에 대해 라디칼 변화가 일어나지 않도록 선택할 수 있는데, 이러한 잔기는 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관여하기 때문이다. 또한, 당분야의 당업자는 각각의 원하는 아미노산 잔기에 단일 아미노산 치환을 함유하는 테스트 변이체를 생성시킬 수 있다. 이후 변이체는 당분야의 숙련가에게 공지된 활성 분석법을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 이러한 변이체는 적절한 변이체에 대한 정보를 모으는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기에 대한 변화가 활성을 파괴하거나, 원치않게 저하시키거나 또는 부적절한 활성을 초래하는 것으로 확인되면, 이러한 변화가 있는 변이체를 피할 수 있다. 달리 말해서, 이러한 통상적인 실험으로 수집된 정보를 기초로, 당분야의 당업자는 단독으로 또는 다른 돌연변이와 조합하여 추가의 치환을 피해야하는 경우에 아미노산을 용이하게 결정할 수 있다.

다수의 과학 문헌이 2차 구조의 예측에 기여하였다. 하기 문헌들을 참조한다: Moult, 1996, Curr . Op . in Biotech. 7:422-427; Chou et al, 1974, Biochemistry 13:222-245; Chou et al, 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al, 1978, Adv . Enzymol Relat . Areas Mol . Biol 47:45-148; Chou et al, 1979, Ann. Rev . Biochem. 47:251-276; 및 Chou et al, 1979, Biophys . J. 26:367-384. 또한, 최근에는 2차 구조 예측을 보조하는데 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 2차 구조를 예측하는 한 방법은 상동성 모델링을 기초로 한다. 예를 들어, 서열 동일성이 30%를 넘거나, 또는 유사성이 40%를 넘는 2 폴리펩티드 또는 단백질은 종종 유사한 구조적 위상을 갖는다. 단백질 구조 데이타베이스(PDB)의 최근 성장으로 폴리펩티드 또는 단백질 구조 내에 가능한 폴드 수를 포함하여 2차 구조의 예측도가 향상되었다. 예를 들어, 문헌 [Holm et al, 1999, Nucl . Acid . Res. 27:244-247]을 참고한다. 주어진 폴리펩티드 또는 단백질에 제한된 수의 폴드가 존재하고 5 구조의 임계 수가 해결되면, 구조 예측이 상당히 보다 정확해 진다고 제안되었다(Brenner et al, 1997, Curr . Op . Struct . Biol . 7:369-376).

2차 구조를 예측하는 추가 방법은 "쓰레딩(threading)"(Jones, 1997, Curr . Opin. Struct . Biol. 7:377-87; Sippl et al, 1996, Structure 4:15-19), "프로파일 분석법"(Bowie et al, 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al, 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al, 1987, Proc . Nat . Acad . Sci . 84:4355-4358), 및 "진화적 연계법"(Holm, 1999, 상동; 및 Brenner, 1997, 상동)을 포함한다.

일부 구체예에서, 단백질 변이체는 글리코실화 변이체를 포함하며, 여기서 글리코실화 부위의 수 및/또는 유형은 모 폴리펩티드의 아미노산과 비교하여 변경되었다. 일부 구체예에서, 단백질 변이체는 천연 단백질보다 많거나 또는 적은 수의 N-연결된 글리코실화 부위를 포함한다. N-연결된 글리코실화 부위는 하기 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr으로 특징되며, 여기서 X로 표시된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 이러한 서열을 생성하기 위한 아미노산 잔기의 치환은 N-연결된 탄수화물 사슬의 부가를 위해 가능한 새로운 부위를 제공한다. 대안적으로, 이 서열을 제거하는 치환은 존재하는 N-연결된 탄수화물 사슬을 제거하게 된다. 또한, N-연결된 탄수화물 사슬의 재배열을 제공하며, 여기서 1 이상의 N-연결된 글리코실화 부위(대체로 천연 발생된 것)는 제거되고 1 이상의 새로운 N-연결 부위가 생성된다. 추가로 바람직한 변이체는 시스테인 변이체를 포함하고, 여기서 1 이상의 시스테인 잔기는 모 아미노산 서열과 비교하여 다른 아미노산(예를 들어, 세린)으로 치환되거나 또는 결실된다. 시스테인 변이체는 예컨대 불용성 봉입체의 단리 이후에 단백질이 생물학적 활성 형태로 리폴딩되어야 하는 경우에 유용할 수 있다. 시스테인 변이체는 대체로 천연 단백질보다 적은 시스테인 잔기를 가지며, 대체로 짝이없는 시스테인에 의해 일어나는 상호작용을 최소화하기 위해 짝수개이다.

추가적인 구체예에서, 단백질 변이체는 돌연변이 예컨대 치환, 부가, 결실 또는 이의 임의 조합을 포함할 수 있고, 대체로 본원에 기술된 방법을 비롯하여 당분야에 공지된 방법에 따라 1 이상의 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드(들)을 사용하는 부위 지정 돌연변이 유발법으로 생성된다(예를 들어, Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd Ed., 2001, Cold Spring Harbor, N.Y. and Berger and Kimmel, METHODS IN ENZYMOLOGY, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, CA., 이들 문헌을 참조하여 본원에 포함시킴).

일정 구체예에 따라, 아미노산 치환은 이러한 폴리펩티드에 대해, (1) 단백질가수분해에 대한 민감도를 낮추고/낮추거나, (2) 산화에 대한 민감도를 낮추고/낮추거나, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화성을 변경시키고/시키거나, (4) 결합 친화성을 변경시키고/시키거나, (5) 다른 생리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 또는 변형시킨다. 일정 구체예에 따라, 단일 또는 다수 아미노산 치환(일부 구체예에서, 보존성 아미노산 치환)을 천연 발생 서열에 수행할 수 있다(일정 구체예에서, 분자간 접촉부를 형성하는 도메인(들) 외쪽 폴리펩티드 부분에). 바람직한 구체예에서, 대체로 보존성 아미노산 치환은 실질적으로 모 서열의 구조적 특징을 변화시키지 않는다(예를 들어, 치환 아미노산이 모 서열에서 일어나는 나선을 파괴하거나, 또는 모 서열을 특징짓는 다른 유형의 2차 구조를 파괴하는 경향이 없어야 함). 당분야에서 인식되는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌 [PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, (Creighton, Ed.), 1984, W. H. Freeman and Company, New York; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (C. Branden and J. Tooze, eds.), 1991, Garland Publishing, New York, N.Y.; 및 Thornton et al., 1991, Nature 354:105] 등을 참고하며, 이들 각각을 참조하여 본원에 포함시킨다.

펩티드 유사체는 통상 주형 펩티드와 유사한 특성을 갖는 비펩티드 약물로서 약학 산업 분야에서 사용된다. 이러한 유형의 비펩티드 화합물을 "펩티드 모방체(peptide mimetics, 또는 peptidomimetics)라고 한다. 문헌 [Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber & Freidinger, 1985, TINS p.392; 및 Evans et al, 1987, J. Med . Chem. 30:1229] 등을 참조하며, 이들을 임의의 목적을 위해 참조하여 본원에 포함시킨다. 이러한 화합물은 대체로 컴퓨터화 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체를 사용하여 유사한 치료 또는 예방 효과를 생성시킬 수 있다. 일반적으로 펩티드 모방체는전형 폴리펩티드(즉, 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드), 예컨대 인간 항체와 구조적으로 유사하지만, 당분야에 공지된 방법을 통해서, -CH₂-NH-, -CH₂-S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH-(cis 및 trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂-, 및 -CH₂SO-에서 선택된 결합부로 경우에 따라 치환된 1 이상의 펩티드 결합부를 갖는다. 일부 구체예에서 동일 유형의 D-아미노산으로 공통 서열의 1 이상의 아미노산 서열을 조직적으로 치환(예를 들어, L-리신 대신 D-리신으로)하는 것을 사용하여 보다 안정한 펩티드를 생성시킬 수 있다. 또한, 공통 서열 또는 실질적으로 동일한 공통 서열 변이를 포함하는 제한형(constrained) 펩티드를 당분야의 공지 방법(Rizo & Gierasch, 1992, Ann . Rev . Biochem. 61:387, 임의의 목적을 위해 참조하여 본원에 포함시킴), 예를 들어, 펩티드를 고리화시키는 분자내 이황화 결합을 형성시킬 수 있는 내부 시스테인 잔기를 부가하여 생성시킬 수 있다.

본 발명에서, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 서열을 언급할 때 사용되는 어구 "핵산 서열"은 개시된 서열을 비롯하여 상동성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 서열을 코딩하는 축퇴형 핵산 서열을 포함하는 것을 의미한다.

(a) 변형된 IL -4 뮤테인 수용체 길항제의 특징

본원에서 사용되는, "변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제"는 성숙한 IL-4 단백질의 1 이상의 위치에 부가적인 아미노산 치환을 갖는 US 특허 제6,028,176호 및 제6,313,272호(전체로 참조하여 본원에 포함시킴)에 기술된 IL-4RA 뮤테인을 포함한다. 예시적인 삼중 뮤테인은 이에 제한되는 것은 아니고, D-나선 내에 위치 121에서 아르기닌을 아스파르트산으로 치환, 위치 124에서 티로신을 아스파르트산으로 치환, 및 위치 125에서 세린을 아스파르트산으로 치환한 것을 포함하고, 또한, D-나선 내에 위치 13에서 트레오닌을 아스파르트산으로 치환, 위치 121에서 아르기닌을 아스파르트산으로 치환, 및 위치 124에서 티로신을 아스파르트산으로 치환을 포함한다. 일 구체예에서, 삼중 뮤테인은 N-말단 메티오닌을 추가로 포함한다. D 나선의 이러한 부분 내 변이는 제2 결합 영역에서 상호작용의 변화와 긍정적으로 상호 관련된다. 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제는 1 이상의 치환을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 치환은 1 이상의 비단백질 중합체, 예컨대 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 뮤테인에 부위 특이적으로 커플링시킬 수 있다. PEG의 부위 특이적 커플링은, 예를 들어, 폴리에틸렌-글리코실화(PEG화) 분자의 장점을 보유하는 변형된 뮤테인을 생성시킬 수 있는데, 다시 말해서, 혈청 반감기를 증가시키고 면역원성을 감소시키는 한편 예컨대 N 말단 및 리신 측쇄 PEG화 등의 비특이적 PEG화보다 큰 효능을 유지한다.

부착된 PEG 부분의 구조는 본 발명의 뮤테인의 PEG화를 최적화하는데 중요하다는 것을 이해해야 한다. 일 구체예에서, PEG 부분은 선형이다. 선형 PEG 부분은, PEG-디올 양이 PEG 분자량 증가에 따라 증가하기 때문에 제조 과정을 통해 그 크기가 제한된다. 선형 부분에서, PEG-뮤테인 분자 크기 증가는 대체로 뮤테인 상의 PEG 부착 부위 수 증가를 수반한다. 이는 종종 차선의 약리학적 프로파일을 야기한다. 다른 구체예에서, PEG 부분은 단일 부착 부위로부터 분지화된다. 분지형 PEG 부분은 부착 부위 개수 증가없이 PEG 분자 크기가 증가된다는 장점을 갖는다.

따라서, 일 측면에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분은 분자량이 약 3 kD∼50 kD 범위이다. 일 구체예에서, PEG 부분은 약 40 kD이다. 약물에 PEG의 공유적 부착("PEG화"로 알려짐)은 공지의 화학 반응 및/또는 합성 기법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 PEG화는 적절한 반응 조건 하에서 NHS-활성화된 PEG를 뮤테인과 반응시켜 수행될 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, 단백질의 PEG화는 적절한 반응 조건 하에서 시스테인 잔기의 설히드릴 기와 말레이미드 활성화된 PEG를 반응시켜 수행될 수 있다.

PEG-뮤테인 접합체는 하기의 3가지 다른 방식으로 생성될 수 있다: 단일한 거대 PEG 부분을 뮤테인 상의 단일 부위에 부착시키거나; 분지형 PEG 부분(즉, 링커를 통해 함께 연결된 2 이상의 중간 PEG 사슬)을 뮤테인 상의 단일 부위에 부착시키거나: 또는 몇몇 소형 사슬을 뮤테인 상의 다수 부위에 부착시킬 수 있다. 이론적으로, 단일부위 PEG화 뮤테인은, PEG 부착이 수용체-결합 도메인 또는 그 근처에서 발생될 가능성이 덜하므로 보다 높은 활성을 갖는다.

PEG화 및 다른 유형의 번역후 변형(PTM)의 개선점은 광범위하였으며 현재는 당분야에 공지된 다수의 PTM 기법 및 시약이 존재하고, 새로운 것들이 정기적으로 개발되고 있다. PEG화를 위한 기법 및 시약은 예를 들어, (i) 특수화된 링커 및 커플링 화학물; (ii) 단일 접합 부위에 추가 PEG 기를 효과적으로 부착시킬 수 있는 분지형 PEG; (iii) 부위 특이적 단일PEG화를 비롯한, 부위 특이적 PEG화; 및 (iv) 부위 지정된 효소적 PEG화(예를 들어, 트랜스글루타미나제 반응 사용)를 포함한다. 또한, 다수의 상업적 공급자(예를 들어, Nektar/Shearwater(www.nektar.com), Sunbio(www.sunbio.com 및 www.sunbio.com/peg-shop), Celares GmbH(www.celares.com), NOF Corporation(www.peg-drug.com) 및 기타)에서 구매가능한 추가 기법 및 시약들이 존재한다.

본 발명은 또한, 발현 후 분자의 적절한 폴딩을 가능하게 하는 아미노산 치환의 특정 부위를 선택하는 것을 포함한다. 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제는 IL-4RA에 비하여 10배를 넘지 않는 친화성 손실로 IL-4 및 IL-13에 결합한다. 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제는 IL-4RA에 비하여 10배를 넘지않는 역가 손실로 IL-4 및 IL-13 매개 활성을 억제한다. 또한, 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제는 비변형된 IL-4RA 보다 적어도 2 내지 10배 높은 혈장 반감기를 보유한다.

본 발명의 IL-4 뮤테인은 천연 IL-4 폴리펩티드 사슬의 1 이상의 부위 또는 다른 잔기에서 아미노산 삽입, 결실, 치환 및 변형을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 따라서, 임의의 이러한 삽입, 결실, 치환 및 변형은 IL-4 관련 활성을 보유하는 IL-4 뮤테인을 생성시킨다.

본 발명의 추가 측면은 실시예 2에 기술한 바와 같이, 단백질이 발현되어 리폴딩되는 방법을 제공한다. IL-4 뮤테인은 유효한 PEG화가 가능하도록 적절하게 정제되어야 한다. 예시적인 정제 방법은 하기 실시예 2에 기술하였다. 설프히드릴 보호제 존재하에 뮤테인이 리폴딩되는 경우, IL-4 뮤테인의 자유 시스테인과 보호제 간에 공유 이황화 결합이 형성된다. 대조적으로, 안정한 이황화 결합을 형성하도록 산화되는, 설프히드릴 보호제, 디티오트레이톨(DTT)을 사용하는 것은 IL-4 뮤테인의 자유 시스테인과 공유 결합을 형성하지 않으며, 따라서, 이의 설프히드릴 기는 자유로운 상태로 남아서 PEG 말레이미드 시약과 반응하게 된다. 설프히드릴 보호제 존재하에서 리폴딩한 후 정제된 IL-4 뮤테인은 DTT를 처리하면 PEG 시약과 반응할 수 있지만, 단일PEG화 및 다중PEG화 생성물의 혼합물이 생성되는데, 이는 존재하는 IL-4 시스테인도 PEG화된다는 것을 의미한다. 존재하는 시스테인의 PEG화는 불활성인 미스폴딩 생성물을 야기시킨다.

IL-4 수용체에 대한 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제의 K_D는 실시예 4에 기재된 실시간 이중분자 상호작용 분석법(real-time Bimolecular Interaction Analysis)(BIA) 등의 기법을 포함하여, 당분야에 공지된 임의 방법을 사용해서 분석할 수 있다. BIA는 임의의 상호작용제(예를 들어, BIAcore™)를 표지하지 않고, 실시간으로 생물특이적 상호작용을 연구하기 위한 방법이다. 광학 현상 표면 플라스몬 공명(SPR) 변화를 사용하여 생물학적 분자간 실시간 반응을 표시할 수 있다.

면역 세포의 증식성 반응을 억제하기 위한 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제의 능력은 실시예 5에 나타낸 증식성 분석법을 사용하여 평가할 수 있으며, 이러한 능력은 억제 농도 50%(IC₅₀)로 표현된다.

BIAcore ™ 분석에서, 본 발명의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제는 약 1.0 nM∼약 100 nM 범위의 바람직한 K_D로 인간 IL-4 수용체에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 보다 바람직한 구체예는 대략 0.5 nM∼약 1.0 μM의 K_D로 인간 IL-4 수용체에 결합한다. 본 발명의 보다 바람직한 구체예는 대략 0.1 nM∼약 10 μM의 K_D로 인간 IL-4 수용체에 결합한다. 추가적으로, 예상하는 바와 같이, 본 발명의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제는 인간 IL-4 수용체에 결합하여 1.0 nM∼약 100 nM 범위의 바람직한 IC₅₀으로 면역 세포 증식을 촉진하는 이 수용체의 능력을 중성화시킨다. 보다 바람직한 인간 길항제는 IL-4 수용체에 결합하여 대략 0.5 nM∼1 μM 범위의 IC₅₀으로 면역 세포 증식 능력을 중성화시키며, 가장 바람직하게 본 발명의 길항제는 IL-4 수용체에 결합하여 대략 0.1 nM∼약 10 μM의 IC₅₀으로 억제한다.

본 발명의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제의 이러한 구체예에서는 또한 비변형된 IL4RA 보다 바람직하게는 적어도 2 내지 10배 높은 혈장 반감기를 나타내며 본 발명의 가장 바람직한 구체예는 비변형된 IL-4RA 보다 10 내지 100배 높은 혈장 반감기를 나타낸다(실시예 7 참조).

상기 기술한 특징을 갖는 다수의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제를 상기 분석법을 사용한 후보물 스크리닝을 통해 동정하였다. 본 발명의 구체예는 하기 표 2에 나타낸 폴리펩티드 서열을 갖는다(서열 번호 10-16 및 32-33).

(b) 변형된 IL -4 뮤테인 수용체 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드

본 발명은 또한, 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 치료 용도를 위한 다량의 길항제를 생성하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한, 동일한 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제를 코딩하는 축퇴성 DNA 서열을 제공한다. 주어진 폴리뉴클레오티드 서열과 동일한 아미노산 서열을 발현할 수 있는 축퇴성 DNA 서열을 제작하고 발현시키는 방법은 당분야에 공지이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 제한없이, 화학 합성법, cDNA 또는 게놈 라이브러리 스크리닝, 발현 라이브러리 스크리닝 및/또는 cDNA의 PCR 증폭법을 비롯한 다양한 방식으로 용이하게 얻을 수 있다.

본원에 기술한 재조합 DNA 방법은 대체로 문헌 [Sambrook et al , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)] 및/또는 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al , eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994]에 기술되어 있다. 본 발명은 본원에 기술한 핵산 분자 및 이러한 분자를 획득하는 방법을 제공한다.

적절한 핵산 서열을 획득하는 방법 중 하나는 중합효소 연쇄 반응(PCR)이다. 이 방법에서, cDNA는 역전사 효소를 사용하여 폴리(A)+RNA 또는 전체 RNA로부터 제조한다. 대체로, 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 cDNA의 2 개별 영역에 상보적인 2 프라이머를 중합효소, 예컨대 Taq 중합효소와 함께 cDNA에 부가하면, 이 중합효소가 2 프라이머 사이의 cDNA 영역을 증폭시킨다.

본 발명의 핵산 분자를 제조하는 다른 방법은 문헌 [Engels et al, 1989, Angew. Chem . Intl . Ed. 28:716-34]에 기술된 방법 등과 같이 당분야에 공지된 방법을 사용하는 화학 합성법이다. 이러한 방법은 그 중에서도, 핵산 합성을 위해 포스포트리에스테르, 포스포르아미다이트 및 H-포스포네이트 방법을 포함한다. 이러한 화학 합성을 위해 바람직한 방법은 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하는 중합체-지지된 합성법이다. 대체로, DNA는 길이가 수백 뉴클레오티드가 된다. 약 100 뉴클레오티드보다 큰 핵산은 이러한 방법을 사용하여 몇몇 단편으로서 합성될 수 있다. 이후 단편들을 함께 결찰시킬 수 있다. 당업자에게 공지된 다른 방법도 사용할 수 있다. 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제를 코딩하는데 사용할 수 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 하기 표 3에 나타내었다(서열 번호 2-8 및 31).

[표 3a]

[표 3b]

본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 표준 결찰법을 사용하여 적절한 발현 벡터에 삽입시킬 수 있다. 벡터는 대체로, 적용되는 특정 숙주 세포에서 기능적인 것을 선택한다(즉, 벡터는 유전자의 증폭 및/또는 유전자 발현이 일어날 수 있도록 숙주 세포 기구와 상용성임). 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 원핵생물, 효소, 곤충(배큘로바이러스 시스템) 및/또는 진핵생물 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 숙주 세포의 선택은 다양한 인자들, 예컨대 목적하는 발현 수준에 따라 결정하게 된다. 발현 벡터에 대한 고찰은 예를 들어, 문헌 [Meth . Enz ., vol. 185 (D.V. Goeddel, ed., Academic Press 1990]을 참고한다.

대체로, 숙주 세포에서 사용되는 발현 벡터는 플라스미드 유지, 및 외생성 뉴클레오티드 서열의 클로닝과 발현을 위한 서열을 포함하게 된다. 일부 구체예에서, 집합적으로 "측접 서열"이라고 불리는 이러한 서열은 대체로 1 이상의 하기 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 프로모터, 1 이상의 인핸서 서열, 복제 원점, 전사 종결 서열, 도너와 억셉터 스플라이싱 부위를 함유하는 완전한 인트론 서열, 폴리펩티드 분비용 리더 서열을 코딩하는 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현시키려는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 삽입을 위한 폴리링커 영역 및 선별 마커 성분. 이들 각 서열은 하기에서 설명한다.

측접 서열은 동종성(즉, 숙주 세포와 동일한 종 및/또는 계통에서 유래)이거나, 이종성(숙주 세포 종 또는 계통과 다른 종 유래)이거나, 하이브리드(즉, 1 이상의 공급원에서 유래하는 측접 서열의 조합)이거나, 또는 합성된 것일 수 있거나, 또는 측접 서열은 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 발현을 조절하는 정상적인 기능을 하는 천연 서열일 수 있다. 이와 같이, 측접 서열의 공급원은 임의의 원핵생물이거나 또는 진핵생물 유기체, 임의의 척추동물 또는 무척추동물 유기체이거나, 임의의 식물일 수 있으며, 단, 측접 서열은 숙주 세포 기구에서 기능성이고, 이를 통해 활성화될 수 있는 것이다.

본 발명의 벡터에서 유용한 측접 서열은 당분야에 공지된 여러 방법들 중 임의의 방법으로 획득할 수 있다. 대체로, IL-4 뮤테인 수용체 길항제 유전자 측접 서열 이외에, 본원에서 유용한 측접 서열은 맵핑 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 효소 분해를 통해 앞서 동정한 후, 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 적합한 조직 공급원에서 단리할 수 있다. 일부 경우에서, 측접 서열의 전체 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다. 여기서, 측접 서열은 핵산 합성 또는 클로닝을 위해 본원에서 기술한 방법을 사용하여 합성할 수 있다.

측접 서열의 전체 또는 일부만이 알려진 경우, 적절한 올리고뉴클레오티드 및/또는 동일종 또는 다른 종 유래의 측접 서열 단편을 사용하는 게놈 라이브러리 스크리닝 및/또는 PCR를 통해 얻을 수 있다. 측접 서열이 알려지지 않은 경우, 측접 서열을 함유하는 DNA 단편을, 예를 들어, 코딩 서열 또는 다른 유전자 또는 유전자들을 함유하는 보다 큰 DNA 조각으로부터 단리할 수 있다. 단리는 제한 엔도뉴클레아제 효소분해로 수행하여 적절한 DNA 단편을 생성시킨 후, 아가로스 겔 정제, Qiagen^® 컬럼 크로마토그래피(Chatsworth, CA), 또는 당분야에 공지된 다른 방법을 사용해서 단리할 수 있다. 이러한 목적을 실행하기 위해 적절한 효소의 선택은 당분야에 숙련가에게는 자명하다.

복제 원점은 대체로, 상업적으로 판매되는 원핵생물 발현 벡터의 일부이고, 이 원점은 숙주 세포에서 벡터가 증폭될 수 있게 한다. 선택 벡터가 복제 원점 부위를 함유하지 않는 경우에는, 공지 서열을 기준으로 화학 합성한 후, 벡터에 결찰시킬 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 pBR322(New England Biolabs, Beverly, MA)의 복제 원점은 대부분의 그람 음성 박테리아에 적합하며, 다양한 원점(예를 들어, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 또는 파필로마 바이러스, 예컨대 HPV 또는 BPV)이 포유동물 세포의 벡터를 클로닝하는데 유용하다. 대체로, 복제 원점 성분은 표유동물 발현 벡터에 필수적이지 않다(예를 들어, SV40 원점은 초기 프로모터를 함유하기 때문에 이 원점만이 종종 사용됨).

전사 종결 서열은 대체로 폴리펩티드 코딩 영역의 3' 말단에 위치하여 전사 종결을 위한 기능을 한다. 일반적으로, 원핵생물 세포의 전사 종결 서열은 G-C 풍부 단편 이후에 폴리-T 서열이 후속된다. 이 서열은 라이버르리로부터 용이하게 클로닝하거나 또는 벡터 일부로서 상업적으로 구매할 수 있지만, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 합성 방법을 사용하여 쉽게 합성할 수도 있다.

선별 마커 유전자 성분은 선별 배양 배지에서 성장하는 숙주 세포의 성장 및 생존에 필수적인 단백질을 코딩한다. 대표적인 선별 마커 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 원핵생물 숙주 세포에 대해 암피실린, 테트라사이클린 또는 카나마이신 내성을 부여하거나; (b) 세포의 영양 요구성 결핍을 보완하거나; 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할수 없는 핵심 영양분을 공급하는 단백질을 코딩한다. 바람직한 선별 마커는 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자 및 테트라사이클린 내성 유전자이다. 네오마이신 내성 유전자도 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포에서 선별용으로 사용될 수 있다.

다른 선별 유전자를 사용하여 발현되는 유전자를 증폭시킬 수 있다. 증폭은 성장에 중요한 단백질 생산을 위해 상당히 요구되는 유전자가 재조합 세포의 연속 세대의 염색체 내에서 앞뒤 일렬로 반복되는 프로세스이다. 포유동물 세포를 위해 적절한 선별 마커의 예는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 티미딘 키나제를 포함한다. 포유동물 세포 형질전환체는 이 형질전환체가 벡터에 존재하는 선별 유전자에 의해 생존하도록 고유하게 적응되는 선별 압력 하에 놓이게 된다. 선별 압력은 배지 내 선별 제제의 농도가 연속적으로 변화하여, 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제를 코딩하는 DNA 및 선별 유전자 둘 모두가 증폭되는 조건 하에서 형질전환 세포를 배양하여 부과된다. 결과적으로, 증폭된 DNA로부터 많은 양의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제가 합성된다.

리보솜 결합 부위는 일반적으로 mRNA의 번역 개시를 위해 필수적이며 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열(원핵생물) 또는 코작(Kozak) 서열(진핵생물)로 특징된다. 이 성분은 대체로 프로모터에 대해 3'에 그리고 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제의 코딩 서열에 대해 5'에 위치한다. 샤인-달가르노 서열은 다양하지만 대체로 폴리퓨린(즉, 높은 A-G 함량)이다. 많은 샤인-달가르노 서열이 동정되었는데, 이들 각각은 본원에 기술한 방법을 사용하여 용이하게 합성할 수 있고 원핵생물 벡터에서 사용될 수 있다.

리더, 또는 신호 서열을 사용하여 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제가 숙주 세포 밖으로 향하게 할 수 있다. 대체로, 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 핵산 분자의 코딩 영역에 위치하거나, 또는 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 코딩 영역의 5' 말단에 직접적으로 위치한다. 많은 신호 서열이 동정되었으며, 선택된 숙주 세포에서 기능성인 임의의 신호 서열들을 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 핵산 분자와 함께 사용할 수 있다. 따라서, 신호 서열은 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 핵산 분자와 동종성(천연 발생)이거나 또는 이종성일 수 있다. 추가적으로, 신호 서열은 본원에 기술한 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 대부분의 경우에서, 신호 펩티드의 존재를 통해 숙주 세포로부터 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제가 분비되면 분비되는 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제에서 신호 펩티드가 제거된다. 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터에 삽입되는 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 핵산 분자의 일부일 수 있다.

많은 경우에, 핵산 분자의 전사는 벡터에 1 이상의 인트론 존재에 의해 증가되며, 이는 특히 진핵생물 숙주 세포, 특히 포유동물 숙주 세포에서 폴리펩티드를 생성시키는 경우에는 정확히 그러하다. 사용되는 인트론은, 특히 사용되는 유전자가 전체 길이 게놈 서열 또는 이의 단편인 경우에 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 유전자 내에서 천연적으로 발생될 수 있다. 인트론이 상기 유전자 내에서 천연적으로 발생하는 것이 아닌 경우, 인트론은 다른 공급원으로부터 획득될 수 있다. 측접 서열 및 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제에 대한 인트론의 위치가 대체로 중요한데, 인트론이 유요하게 전사되어야 하기 때문이다. 따라서, 본 발명의 핵산 분자가 전사될때, 인트론에 대해 바람직한 위치는 전사 출발 부위에 대해 3', 및 폴리-A 전사 종결 서열에 대해 5'에 존재한다. 바람직하게, 인트론 또는 인트론들은 코딩 서열을 파괴하지 않도록 cDNA의 한면 또는 다른 면(즉, 5' 또는 3') 상에 위치하게 된다. 바이러스, 원핵생물 및 진핵생물(식물 또는 동물) 유기체를 포함하여, 임의의 공급원에서 유래하는 임의의 인트론을 본 발명을 실시하는데 사용할 수 있는데, 단, 인트론이 삽입되는 숙주 세포와 상용성인 것이다. 또한 본원에서는 합성 인트론을 포함한다. 경우에 따라, 1보다 많은 인트론을 벡터에 사용할 수 있다.

본 발명의 발현 및 클로닝 벡터는 대체로 숙주 유기체가 인식하고, 본 발명의 핵산 분자에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유하게 된다. 프로모터는 구조적 유전자의 전사를 제어하는 구조적 유전자의 출발 코돈에 대해 상류(즉, 5')에 위치하는 비전사 서열이다(대체로 약 100 내지 1000 bp). 프로모터는 통상 2 부류: 유도성 프로모터 및 항상성 프로모터 중 하나로 분류된다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 일부 변화, 예컨대 영양소의 존재 또는 부재, 또는 온도 변화 등에 반응하여 그들 제어 하에 DNA로부터 높은 수준의 전사를 개시시킨다. 반면, 항상성 프로모터는 연속적인 유전자 생성물 생산을 개시하는데, 즉, 유전자 발현에 대한 제어가 거의 없거나 전혀 없다. 다양한 가능한 숙주 세포가 인식하는 다양한 프로모터가 공지되어 있다. 적절한 프로모터를, 제한 효소 분해를 통해 공급 DNA로부터 프로모터를 제거하고 벡터에 원하는 프로모터 서열을 삽입하여 본 발명의 핵산 분자에 작동적으로 연결할 수 있다. 천연 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 프로모터 서열을 사용하여 본 발명의 핵산 분자의 증폭 및/또는 발현을 지정할 수 있다. 그러나, 천연 프로모터와 비교하여 보다 높은 수준의 전사가 가능하고 발현 단백질의 수율을 높히는게 가능한 경우에, 그리고 사용 목적을 위해 선택된 숙주 세포 시스템과 상용적인 경우라면, 이종성 프로모터가 바람직하다.

원핵생물 숙주와 사용하기 적합한 프로모터는 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템; 알칼리 포스파타제; 트립토판(trp) 프로모터 시스템; 및 하이브리드 프로모터 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 다른 공지의 박테리아 프로모터도 적합하다. 이들의 서열은 공개되어 있으므로, 당분야의 당업자는 필요에 따라서, 임의의 유용한 제한효소 부위를 공급하는 링커 또는 어댑터를 사용하여, 목적하는 DNA 서열에 이들 프로모터 서열을 결찰시킬 수 있다.

효모 숙주와 사용하기 적합한 프로모터도 당분야에 공지되어 있다. 효모 인핸서는 효모 프로모터와 유용하게 사용된다. 포유동물 숙주 세포와 사용하기 적합한 프로모터는 공지되어 있으며, 제한없이, 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예컨대 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 및 가장 바람직하게는 SV 40(Simian Virus 40)의 게놈에서 얻은 것들을 포함한다. 다른 적절한 포유동물 프로모터는 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어, 열 충격 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다.

유전자 발현을 제어하는데 중요할 수 있는 추가적인 프로모터는, 이에 제한되는 것은 아니고, SV40 초기 프로모터 영역(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-10); CMV 프로모터; 루이스 육종 바이러스의 3' 장 말단 반복부에 함유된 프로모터(Yamamoto, et al , 1980, Cell 22:787-97); 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al, 1981, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 78:1444-45); 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열(Brinster et al, 1982, Nature 296:39-42); 원핵생물 발현 벡터 예컨대 베타-락타마제 프로모터(Villa-Kamaroff et al, 1978, Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A., 75:3727-31); 또는 tac 프로모터(DeBoer et al, 1983, Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A., 80:21-25)를 포함한다. 또한, 조직 특이성을 나타내고 형질전환 동물에서 사용되는 하기의 동물 전사 제어 영역도 중요하다: 췌장 선포 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역(Swift et al, 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al , 1986, Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역(Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); 림프구양 세포에서 활성이 있는 면역글로불린 유전자 제어 영역(Grosschedl et al , 1984, Cell 38:647-58; Adames et al, 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al, 1987, Mol . Cell. Biol, 7:1436-44); 고환, 유방, 림프구양 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유선 종양 바이러스 제어 영역(Leder et al , 1986, Cell 45:485-95); 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역(Pinkert et al , 1987, Genes and Devel 1:268-76); 간에서 활성인 알파-feto-단백질 유전자 제어 영역(Krumlauf et al , 1985, Mol . Cell . Biol, 5:1639-48; Hammer et al, 1987, Science 235:53-58); 간에서 활성인 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역(Kelsey et al, 1987, Genes and Devel. 1:161-71); 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역(Mogram et al , 1985, Nature 315:338-40; Kollias et al , 1986, Cell 46:89-94); 뇌의 희소돌기아교 세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역(Readhead et al , 1987, Cell 48:703-12); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역(Sani, 1985, Nature 314:283-86); 및 시상하부에서 활성인 성선자극성 방출 호르몬 유전자 제어 영역(Mason et al , 1986, Science 234:1372-78).

인핸서 서열을 벡터에 삽입하여 고등 진핵생물에 의해 본 발명의 핵산 분자의 전사를 증가시킬 수 있다. 인핸서는 DNA의 시스-작용 성분이고, 일반적으로 길이가 약 10∼300 bp로서, 전사를 증가시키도록 프로모터에 작용한다. 인핸서는 비교적 배향성 및 위치 독립적이다. 이들은 전사 유닛에 대해 5' 및 3'에서 발견되었다. 포유동물 유전자에서 이용가능한 몇몇 인핸서 서열이 공지되어 있다(예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-feto-단백질 및 인슐린). 그러나, 대체로, 바이러스 유래의 인핸서를 사용하게 된다. SV 40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 예시적인 인핸싱 성분이다. 인핸서는 본 발명의 핵산 분자에 대해 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱되지만, 대체로, 프로모터로부터 5' 부위에 존재한다.

본 발명의 발현 벡터는 예컨대 시판 벡터 등의 출발 벡터로부터 제작될 수 있다. 이러한 벡터는 원하는 측접 서열 모두를 함유하거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 본원에 기술한 1 이상의 측접 서열이 이미 벡터에 존재하지 않는 경우, 이들을 개별적으로 얻어서 벡터에 결찰시킬 수 있다. 각각의 측접 서열을 얻는데 사용되는 방법은 당분야의 당업자에게 공지이다.

본 발명을 실시하는데 바람직한 벡터는 박테리아, 곤충 및 포유동물 숙주 세포와 상용성인 것이다. 이러한 벡터는, 특히 pCRII, pCR3, 및 pcDNA3.1(Invitrogen, San Diego, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla, CA), pET15(Novagen, Madison, WI), pGEX(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2(Clontech, Palo Alto, CA), pETL(BlueBacII, Invitrogen), pDSR-alpha(PCT Pub. No. WO 90/14363) 및 pFastBacDual(Gibco-BRL, Grand Island, NY)을 포함한다.

추가의 적절한 벡터는, 이에 제한없이, 코스미드, 플라스미드, 또는 변형된 바이러스를 포함하지만, 당분야의 당업자는 벡터 시스템이 선택되는 숙주 세포와 상용성이어야 한다는 것을 인지할 것이다. 이러한 벡터는 이에 제한되는 것은 아니고, 플라스미드, 예컨대 Bluescript® 플라스미드 유도체(높은 카피수의 ColE1 기반 파지미드, Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA), Taq 증폭된 PCR 생성물을 클로닝하기 위해 디자인된 PCR 클로닝 플라스미드(예를 들어, TOPO™ TA Cloning® Kit, PCR2.1 플라스미드 유도체, Invitrogen, Carlsbad, CA), 및 포유동물, 효모 또는 바이러스 벡터 예컨대 배큘로바이러스 발현 시스템(pBacPAK 플라스미드 유도체, Clontech, Palo Alto, CA)를 포함한다.

벡터를 제작하고 본 발명의 핵산 분자를 벡터의 적절한 부위에 삽입시킨 후, 완전한 벡터를 증폭 및/또는 폴리펩티드 발현을 위해 적절한 숙주 세포에 삽입시킬 수 있다. 본 발명의 발현 벡터로 선택된 숙주 세포를 형질전환시키는 것은 예컨대 형질감염, 감염, 염화칼슘, 전기영동, 미세주입법, 리포펙틴, DEAE-덱스트란 방법 또는 다른 공지 방법 등을 포함하는 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 선택된 방법은 부분적으로 사용되는 숙주 유형에 따라 기능하게 된다. 이들 방법 및 다른 적절한 방법은 당분야의 숙련가에게 공지이고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al ., 상동]에 기술되어 있다.

숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포(예컨대 이.콜라이(E. coli)) 또는 진핵생물 숙주 세포(예컨대 효모, 곤충 또는 척추동물 세포)일 수 있다. 적절한 조건 하에서 배양시, 숙주 세포는 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제를 합성하며, 이를 이후에 배양 배지에서 회수(숙주 세포가 이 길항제를 배지로 분비하는 경우)하거나, 또는 이 길항제를 생성하는 숙주 세포로부터 직접 회수한다(분비하지 않는 경우). 적절한 숙주 세포의 선택은 다양한 인자, 예컨대 원하는 발현 수준, 활성에 요구되거나 또는 필요한 폴리펩티드 변형(예컨대 글리코실화 또는 인산화) 및 생물학적 활성 분자로의 폴딩 용이함 등에 따라 좌우된다.

다수의 적절한 숙주 세포가 당분야에 공지되어 있으면 많은 것들은 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA)에서 입수가능하다. 이에 제한되지 않지만, 예로는 포유동물 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포(CHO), CHO DHFR(-) 세포(Urlaub et al, 1980, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 97:4216-20), 인간 배아 신장(HEK) 293 또는 293T 세포, 또는 3T3 세포가 포함된다. 적절한 포유동물 숙주 세포의 선택 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝, 생성물 제조, 및 정제 방법은 당분야에서 공지이다. 다른 적절한 포유동물 세포주는 원숭이 COS-1 및 COS-7 세포주, CV-1 세포주이다. 추가로 예시적인 포유동물 숙주 세포는 형질전환된 세포주를 비롯하여, 영장류 세포주 및 설치류 세포주를 포함한다. 정상적인 배수 세포, 1차 외식편을 비롯하여 1차 조직의 시험관 내 배양물 유래의 세포주도 적절하다. 후보 세포는 선별 유전자가 유전형적으로 결핍되어 있거나, 또는 우성적으로 작용하는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 다른 적절한 포유동물 세포주는 이에 제한되는 것은 아니고, 마우스 신경아세포종 N2A 세포, HeLa, 마우스 L-929 세포,스위스, Balb-c 또는 NIH 마우스 유래의 3T3 세포주, BHK 또는 HaK 햄스터 세포주를 포함한다. 이러한 각각의 세포주들은 단백질 발현 분야의 숙련가에게 공지이고 이들이 용이하게 입수할 수 있는 것들이다.

유사하게, 본 발명에 적합한 유용한 숙주 세포는 박테리아 세포이다. 예를 들어, 이.콜라이의 다양한 균주(예를 들어, HB101, DH5D, DH10 및 MCI061)가 생명공학 분야에서 숙주 세포로 공지되어 있다. 비.서브틸리스(B. subtilis), 슈도모나스 종(pseudomonas spp.), 다른 바실러스 종(Bacillus spp.), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp.) 등도 본 방법에서 사용할 수 있다.

당분야의 숙련가에게 공지된 많은 효모 세포주들도 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포로 이용가능하다. 바람직하나 효모 세포는 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerivisae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다.

추가적으로, 원하는 경우, 곤충 세포 시스템을 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 이러한 시스템은 예컨대 문헌 [Kitts et al, 1993, Biotechniques, 14:810-17; Lucklow, 1993, Curr . Opin . Biotechnol. 4:564-72; 및 Lucklow et al, 1993, J. Virol., 67:4566-79]에 기술되어 있다. 바람직한 곤충 세포는 Sf-9 및 Hi5(Invitrogen)이다.

숙주 세포에 존재하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 다른 세포 성분, 예컨대 막 성분, 단백질 및 지질 등 없이 단리할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표준 핵산 정제법을 사용하여 세포로부터 단리하거나, 또는 증폭 방법, 예컨대 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하거나, 또는 자동 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 단리하는 방법은 통상적이며 당분야에서 공지이다. 폴리뉴클레오티드를 얻는 임의의 이러한 방법은 본 발명의 길항제를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 얻는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제한 효소 및 프로브를 사용하여 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단리할 수 있다. 바람직하게, 단리된 폴리뉴클레오티드는 다른 분자가 없거나 또는 70, 80 또는 90% 이상으로 없는 조제물로 존재한다,

본원에서 기술한 핵산 및 폴리펩티드 분자는 재조합 및 다른 방법을 통해 생성시킬 수 있다는 것은 당분야의 당업자에게는 자명하다. 예를 들어, 본 발명의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 cDNA 분자는 주형으로서 mRNA를 사용하는, 표준 분자 생물학 방법으로 제조할 수 있다. 이후에, cDNA 분자는 당분야에 공지되고 실시예 1에 기술된 분자 생물학적 방법을 사용하여 복제시킬 수 있다. 실시예 2는 본 발명의 변형된 뮤테인 길항제를 생성하는데 사용되는 5 특이적 재조합 발현 및 정제 방법을 설명한다.

(c) 인간 길항제의 치료적 활용도 평가

알레르기성 천식 치료에서 특정 길항제의 가능하나 효능을 평가하기 위해, 길항제를 실시예 5 및 6에 구체적으로 설명한 세포 증식 분석법으로 시험관 내에서 시험할 수 있다. 또한, 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제의 혈장 반감기는 실시예 6에 따라 래트의 약동력학적 실험으로 생체 내에서 측정할 수 있다.

(d) 약학 조성물

상기 기술한 임의의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제를 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물로 제공할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 바람직하게 발열원 무함유이다. 조성물은 예컨대 이에 제한되는 것은 아니고, 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물을 포함하는 임의의 멸균된, 생체적합성 약학 담체 중에서 투여될 수 있는, 안정화 화합물 등의 1 이상의 다른 제제와 조합하여, 또는 단독으로 투여될 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등을 사용할 수 있다. 이러한 용액은 멸균된 것이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들 용액은 통상의, 공지된 멸균 방법(예를 들어, 여과)으로 멸균될 수 있다.

조성물은 필요에 따라 약학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 허용되는 보조 물질은 바람직하게 적용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성인 것이다. 약학 조성물은 pH, 삼투몰농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 면균성, 안정성, 용해율 또는 방출률, 흡수성, 조성물의 침투성 등을 변형시키거나, 유지시키거나 또는 보존하기 위한 보조 물질을 함유할 수 있다. 적절한 제제 물질은 이에 제한되는 것은 아니고, 아미노산(예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신), 항균제, 항산화제(예컨대 아스코르브산, 아황산나트륨, 또는 아황산수소 나트륨), 완충액(예컨대 보레이트, 중탄산염, Tris-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기산), 증량제(예컨대 만니톨 또는 글리신), 킬레이팅화제(예컨대, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)), 착화제(예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린, 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린), 충진제, 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물(예컨대 포도당, 만노스 또는 덱스트린), 단백질(예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린), 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 친수성 중합체(예컨대 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩티드, 염형성 반대이온(예컨대, 나트륨), 보존제(예컨대, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 솔브산 또는 과산화수소), 용매(예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알콜(예컨대, 만니톨 또는 솔비톨), 현탁제, 계면활성제 또는 습윤제(예컨대 pluronics; PEG; 솔비탄 에스테르; 폴리솔베이트 예컨대, 폴리솔베이트 20 또는 폴리솔베이트 80; triton; 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 타일록살팔), 안정화 향상제(예컨대, 수크로스 또는 솔비톨), 장성 향상제(예컨대 알칼리 금속 할라이드-바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨- 또는 만니톨 솔비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약학 보조제를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990]을 참조한다.

이러한 약학 제제 중 본 발명의 길항제의 농도는 광범위하게 다양할 수 있는데, 즉, 약 0.5% 보다 적고, 일반적으로 약 1% 또는 그 이상 내지 15 또는 20 중량%일 수 있으며, 선택되는 특정 투여 방식에 따라, 유체 부피, 점도 등에 주로 기초하여 선택된다. 원한다면, 예를 들어, IL-4 수용체 결합에 대해 다른 K_D를 갖는 1보다 많은 유형의 길항제를 약학 조성물에 포함시킬 수 있다.

조성물은 환자에게 단독으로, 또는 다른 제제, 약물 또는 호르몬과 함께 투여될 수 있다. 활성 성분이외에도, 이들 약학 조성물은, 약학적으로 사용할 수 있는 조제물로 활성 성분의 프로세싱을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적절한 약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다.

허용되는 제제 물질은 바람직하게 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성인 것이다.

약학 조성물은 예를 들어, pH, 삼투몰농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡수성 또는 조성물의 투과성 등을 변화, 유지 또는 보존하기 위한 제제 물질을 포함할 수 있다. 적절한 제제 물질은 아미노산(예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신), 항균제, 항산화제(예컨대 아스코르브산, 아황산나트륨, 또는 아황산수소 나트륨), 완충액(예컨대 보레이트, 중탄산염, Tris-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기산), 증량제(예컨대 만니톨 또는 글리신), 킬레이팅화제(예컨대, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)), 착화제(예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린, 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린), 충진제, 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물(예컨대 포도당, 만노스 또는 덱스트린), 단백질(예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린), 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 친수성 중합체(예컨대 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩티드, 염형성 반대이온(예컨대, 나트륨), 보존제(예컨대, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 솔브산 또는 과산화수소), 용매(예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알콜(예컨대, 만니톨 또는 솔비톨), 현탁제, 계면활성제 또는 습윤제(예컨대 pluronics; PEG; 솔비탄 에스테르; 폴리솔베이트 예컨대, 폴리솔베이트 20 또는 폴리솔베이트 80; triton; 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 타일록살팔), 안정화 향상제(예컨대, 수크로스 또는 솔비톨), 장성 향상제(예컨대 알칼리 금속 할라이드-바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨- 또는 만니톨 솔비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약학 보조제를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990]을 참조한다.

최적 약학 조성물은 예를 들어, 의도하는 투여 경로, 전달 형태 및 원하는 용량에 따라서, 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 상동]을 참조한다. 이러한 조성물은 본 발명의 핵산 분자 또는 골밀도 조절인자의 생체 내 제거율, 생체 내 방출 속도, 안정성 및 물리적 상태에 영향을 줄 수 있다.

약학 조성물 중 주요 비히클 또는 담체는 천연적으로 수성이거나 또는 비수성일 수 있다. 예를 들어, 주사에 적절한 비히클 또는 담체는 가능하게는 비경구 투여용 조성물에 통상적인 다른 물질과 함께 공급되는, 물, 생리적 염수액 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 혈청 알부민과 혼합된 염수 또는 중성 완충 염수가 또한 예시적인 비히클이다. 다른 예시적인 약학 조성물은 약 pH 7.0∼8.5의 Tris 완충액, 또는 약 pH 4.0∼5.5의 아세테이트 완충액을 포함하며, 이는 추가로 솔비톨 또는 적절한 대체물을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 동결건조 케익 또는 수용액의 형태로 최적 제형 제제(Remington's Pharmaceutical Sciences, 상동)와 함께 목적하는 순도를 갖는 선택 조성물을 혼합하여 보관용으로 제조될 수 있다. 또한, 조성물은 적절한 부형제 예컨대 수크로스를 사용하여 동결건조물로서 제제화될 수 있다.

약학 조성물은 비경구 전달용으로 선택될 수 있다. 다르게, 조성물은 소화관을 통해 전달, 예컨대 경구 전달을 위해 또는 흡입을 위해 선택될 수 있다. 이러한 약학적으로 허용되는 조성물의 제조는 당분야의 기술에 속하는 것이다.

제제 성분은 투여 부위에 허용되는 농도로 존재한다. 예를 들어, 완충제를 사용하여 조성물을 생리적 pH 또는 약간 낮은 pH, 대체로 약 pH 5∼약 8 범위 내로 유지시킨다.

비경구 투여를 고려할 때, 본 발명에서 사용되는 치료 조성물은 약학적으로 허용되는 비히클에 본 발명의 목적 분자를 포함하는, 발열원을 함유하지 않고, 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. 비경구 주사에 특히 적합한 비히클은 분자가 멸균된, 등장액으로서 제제화되고, 적절하게 보존되는 멸균 증류수이다. 또다른 조제물은 예컨대 주사가능한 미세구, 생체 침식성 입자, 중합성 화합물(예컨대, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드, 또는 이후에 데포 주사를 통해 전달될 수 있는 생성물의 제어 또는 지연 방출을 제공하는, 리포솜 등의 제제와 목적 분자의 제형을 포함할 수 있다. 순환계에서 지속 기간을 촉진하는 효과를 가질 수 있는 히알루론산도 사용할 수 있다. 목적 분자의 도입을 위해 적절한 다른 수단은 이식가능한 약물 전달 장치를 포함한다.

일 구체예에서, 약학 조성물은 흡입용으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 분자 또는 골밀도 조절인자는 흡입을 위해 건조 분말로서 제제화될 수 있다. 흡입 용액도 에어로졸 전달을 위한 추진제와 함께 제제화될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 용액은 또한 분무될 수 있다. 폐 투여가 또한 PCT 공개 출원 제WO 94/20069호에 기술되어 있는데, 여기서는 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달이 설명되어 있다.

다른 구체예에서, 일정 제제는 경구 투여될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 이러한 방식으로 투여되는 본 발명의 핵산 분자 또는 골밀도 조절인자는 정제 및 캡슐 등의 고체 제형의 배합에서 통상적으로 사용되는 담체와 함께 또는 없이 제제화될 수 있다. 예를 들어, 캡슐은 생체이용률이 최대이고 사전 전신 분해가 최소인 시점에 위장관에서 제제의 활성 부분이 방출되도록 설계될 수 있다. 본 발명의 분자 또는 조절인자의 흡수를 용이하게 하도록 추가 제제가 포함될 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물성유, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제 및 결합제도 사용할 수 있다.

다른 약학 조성물은 정제 제조에 적합한 비독성 부형제와 함께 혼합물 중에 본 발명의 핵산 분자 또는 골밀도 조절인자의 유효량을 표함할 수 있다. 멸균 수, 또는 다른 적절한 비히클에 정제를 용해하여, 용액을 단위 제형으로 준비할 수 있다. 적절한 부형제는 이에 제한되지 않지만, 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 윤활제 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 탈크를 포함한다.

추가적인 약학 조성물은 지연 전달 또는 제어 전달 제제에 본 발명의 핵산 분자 또는 골밀도 조절인자를 포함하는 제제를 포함하여, 당분야의 당업자에게 명백하다. 예컨대 리포솜 담체, 생체 침식성 미립자 또는 다공성 비드 및 데포 주사 등, 다양한 다른 지연 전달 또는 제어 전달 수단을 제제화하기 위한 방법도 역시 당분야의 숙련가에게 공지이다. 예를 들어, PCT/US93/00829를 참조하며, 여기서는 약학 조성물의 전달을 위해 다공성 중합체 미립자의 제어된 5 방출에 대해 설명하고 있다.

지연 방출 조제물의 추가예는 성형품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스, 예컨대 필름 또는 미세캡슐 등을 포함한다. 지연 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드(U.S. 특허 제3,773,919호 및 유럽 특허 제058481호), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al, 1983, Biopolymers 22:547-56), 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트)(Langer et al, 1981, J. Biomed. Mater . Res. 15:167-277 and Langer, 1982, Chem . Tech . 12:98-105), 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer et al., 상동) 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산(유럽 특허 제133988호) 등을 포함한다. 지연 방출 조성물은 15일 수 있고 또한 리포솜을 포함하며, 당분야에 공지된 몇몇 방법 중 임의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Eppstein et al., 1985, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:3688-92; 및 유럽 특허 제036676호, 제088046호 및 제143949호]를 참조한다.

대체로 생체 내 투여를 위해 사용하려는 약학 조성물은 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과를 통해 수행할 수 있다. 조성물을 동결건조하는 경우, 이 방법을 사용한 멸균은 동결건조 및 재구성 전, 또는 이후에 수행할 수 있다. 경구 투여용 조성물은 동결 건조 형태 또는 용액으로 보관할 수 있다. 또한, 대체로, 비경구 조성물은 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘을 통해 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 위치된다.

본 발명의 약학 조성물은 이에 제한되는 것은 아니고, 경구, 정맥 내, 근육내, 동맥내, 수질내, 포막내, 심실내, 경피, 피하, 복막내, 비내, 비경구, 국소, 설하 또는 직장 방식을 포함하여, 본원에 기술된 바와 같이 임의의 다양한 경로로 투여될 수 있다.

약학 조성물을 제조한 후, 이들을 적절한 용기에 위치시키고 표시된 병태의 치료를 위해 라벨을 붙인다. 이러한 라벨링은 투여 방법, 양, 빈도를 포함한다.

(d) 치료 방법

본 발명은 IL-4 수용체 알파쇄에 결합하고 IL-4 및 IL-3 매개 활성을 억제하여 질환 증상을 완화시키는 방법을 제공한다. 이러한 질환은 제한없이, 천식과 관련된, 비만 세포, 호산구 및 림프구, 동원 및 활성화를 포함하는, 기도 과민증 및 기도 염증, 및 다른 면역학적 또는 알레르기성 질환을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제 및/또는 본 발명의 약학 조성물의 치료 유효량을 상기 질환 등 상승된 IL-4 및 IL-13 활성으로 특징되는 질환을 갖는 환자에게 투여된다.

(e) 치료 유효 용량의 결정

치료 유효량의 결정은 당분야의 당업자의 능력으로 충분하다. 치료 유효량은 치료 유효량이 없을 경우 분명한 효능과 비교하여 천식을 효과적으로 치료하는데 사용되는 길항제의 양이다.

치료 유효량은 초기에 동물 모델, 일반적으로 래트, 마우스, 토끼, 개, 돼지 또는 인간외 영장류에서 평가할 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는데 사용될 수 있다. 이후 이러한 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정하는데 사용될 수 있다.

치료 효능 및 독성, 예를 들어 인간 길항제의 ED₅₀(개체군의 50%에서 치료적으로 효과있는 용량) 및 LD₅₀(개체군의 50%에 치명적인 용량)는 실험 동물의 세포 배양물에서 표준 약학 절차를 통해 결정할 수 있다. 독성 대 치료 효과의 용량 비율이 치료 지수이고, 이 비율은 LD₅₀/ED₅₀로서 표시할 수 있다.

높은 치료 지수를 나타내는 약학 조성물이 바람직하다. 동물 실험으로 얻는 데이타는 인간에 사용하기 위한 용량 범위를 제제화하는데 사용된다. 이러한 조성물에 함유되는 용량은 바람직하게, 독성이 없거나 거의 없는 ED₅₀을 포함하는 순환 농도 범이 내이다. 용량은 사용되는 제형, 환자의 민감도 및 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 다양하다.

정확한 양은 치료를 요하는 환자와 관련된 인자들을 미루어, 의사가 결정하게 된다. 용량 및 투여는 충분한 수준의 길항제를 제공하거나 또는 원하는 효과를 유지하도록 조정된다. 고려할 수 있는 인자들은 질환 상태의 중증도, 피험체의 일반적인 건강 상태, 연령, 체중, 및 피험체의 성별, 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 감응도, 치료 내성/반응성 등을 포함한다. 장기 작용 약학 조성물은 특정 제형의 반감기 및 제거율에 따라서 3 내지 4주 마다, 매주 또는 2주에 한번 투여될 수 있다.

본 발명의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제를 제작하고, 이에 제한되는 것은 아니나, 트랜스페린-다양이온-매개 DNA 전달법, 나핵산 또는 캡술화 핵산에 의한 형질감염, 리포솜 매개 세포 융합, DNA 피복 라텍스 비드의 세포내 수송, 원형질체 융합, 바이러스 감염, 전기 영동, "유전자 총" 및 DEAE- 또는 인산칼슘-매개 형질감염을 포함하는 확립된 방법들을 사용하여 세포외 또는 세포 내로 세포에 도입시킬 수 있다.

길항제의 유효한 생체 내 용량은 환차 체중에 대해 약 5 ㎍∼약 50 ㎍/kg, 약 50 ㎍∼약 5 mg/kg, 약 100 ㎍∼약 500 ㎍/kg, 및 환자 체중에 대해 약 200∼ 약 250 ㎍/kg 범위이다. 길항제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 투여를 위해, DNA의 생체 내 유효 용량은 약 100 ng∼약 200 ng, 500 ng∼약 50 mg, 약 1 ㎍∼약 2 mg, 약 5 ㎍∼약 500 ㎍, 및 약 20 ㎍∼약 100 ㎍이다.

본 발명의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제-함유 약학 조성물의 투여 방식은 길항제를 숙주에게 전달하는 임의의 적절한 경로일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 비경구 투여, 즉 피하, 근육내, 정맥내, 기관내 또는 비내 및 폐 투여의 다른 방식에 특이 유용하다.

본원에 인용한 모든 특허 및 특허 출원은 참조하여 본원에 명백하게 포함시킨다. 상기 개시내용은 대체로 본 발명을 설명한다. 이하의 특정 실시예를 참조하여 보다 완벽하게 이해될 수 있을 것이나, 이하 실시예는 설명하고자 하는 목적으로 제공된 것이며 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니다.

실시예 1

IL -4- RA 및 IL -4- RE 시스테인 뮤테인의 재조합 제조

pET 방향성 TOPO^® 발현 시스템(Invitrogen)을 IL-4의 재조합 발현을 위해 선택하였다. 이 시스템을 높은 효율의 1단계 "TOPO^® Cloning" 전략을 사용하여 이.콜라이에서 목적하는 유전자의 고수준 및 IPTG-유도 발현을 위한 T7lac 프로모터 및 블런트(blunt) 말단 PCR 생성물을 직접적으로 클로닝하였다. 추가 특징은 기본 전사를 줄이기 위한 lacI 유전자, 플라스미드의 복제와 유지를 위한 pBR322 원점 및 선별용 암피실린 내성 유전자를 포함한다.

재조합 IL-4 단백질을 생성을 위해 IL-4를 pET101/D-TOPO 벡터에 클로닝하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 표 4에 나타내었다. 포워드 PCR 프라이머는 방향성 클로닝을 용이하기 하기 위한 5'CACC 오버행과 이후, 서브클로닝을 위한 고유한 NdeI 제한효소 부위 및 개시 ATG 출발 코돈을 갖도록 설계되었다. 리버스 PCR 프라이머는 C 말단 태그가 도입되지 않도록 2개의 중지 코돈 및 서브클로닝을 위한 고유한 BamHI 제한효소 부위를 포함하였다. 블런트 말단 IL-4 PCR 생성물은 주형으로서 앞서 클로닝된 인간 IL-4를 사용하여 생성시켰다. 생성물을 겔 정제하고 염 용액 및 TOPO^® 벡터와 5분 동안 실온에서 항온반응시켜 pET101/D-TOPO 벡터에 방향적으로 클로닝되도록 하였다. 이 재조합 벡터로 화학적 컴피턴트 One Shot TOP 10 이.콜라이를 형질전환시켰다. 재조합 플라스미드 DNA를 DNA 서열분석하여 올바른 서열임을 확인하였다.

IL-4/pET101/D-TOPO는 QuikChange^® 부위 지정 돌연변이유발법 키트 (Strategene)를 사용하여 IL-4 RE 시스테인 뮤테인을 생성하기 위한 주형으로서 제공된다. 각각 원하는 시스테인 돌연변이를 도입하기 위해 코돈 TGC 또는 GCA를 함유하고 벡터의 반대 가닥에 상보적인, 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 각 시스테인 뮤테인을 제조하였다. 표 4는 IL-4RE 뮤테인을 생성하기 위해 사용된 프라이머를 도시한 것이다. 스태거드 닉(staggered nick)을 포함하는 돌연변이된 플라스미드를 사이클링 파라미터 및 제조사의 프로토콜에 정의된 조건을 사용하여 생성시켰다. 생성물을 1시간 동안 37℃에서 DpnI 엔도뉴클레아제로 처리하여 메틸화된, 비돌연변이 모DNA 주형을 분해하였다. DpnI 처리된 DNA로 돌연변이된 플라스미드의 닉이 복구된 XL-1 Blue 수퍼컴피턴트 세포를 형질전환시켰다. 돌연변이유발 5 플라스미드 DNA를 표준 서열분석법에 따라 분석하여 올바른 서열을 확인하였다.

실시예 2

재조합 발현 및 정제

단백질 함유 플라스미드로 형질전환된 BL21 Star(DE3) One Shot 세포(Invitrogen)를 OD₆₀₀가 대략 0.4에 도달 할때까지 37℃에서 최적 발현 및 성장시키고 3시간 동안 37℃에서 1 mM IPTG(Invitrogen)로 유도시켰다. 1 리터의 세포를 13,000 rpm에서 10분간 펠렛화하고, 측량한 후 -80℃에서 보관하였다. 냉동 세포 펠렛을 세포 1 그람 당 8 mL 세포 파괴 완충액(0.1M 인산 완충액 pH 7.3, 0.1% Triton X100, lmM EDTA)에 재현탁시키고 1분 간격으로 1분간 4x 초음파처리하였다. 세포 용해물을 35,000 g에서 10분간 원심분리하여 제거하였다. 다음으로 세포 펠렛을 30 mL 세포 파괴 완충액 중에 재현탁하고, 1분간 초음파처리 후, 원심분리하여 세척하였다(2-3x). 최종 세포 펠렛, 봉입체를 -20℃에서 보관하였다. 봉입체를 세포 1 그람 당 5 mL 가용화 완충액(0.2M Tris pH 9, 7M 구아니딘 히드로클로라이드)에 재현탁하였다. 황산분해(sulphotolysis) 시약(세포 1 g 당 0.16 g 아황산나트륨, 0.08 g 칼륨 테트라티오네이트)를 부가하고 봉입체를 실온에서 2시간동안 교반하였다. 이후, 미용해된 성분들을 35,000 g에서 20분간 원심분리하여 제거하고 가용화된 봉입체를 남겼다. 봉입체를 Superdex200 크기 배제 컬럼(Akta) 상에서 통과시켜 단백질을 단리하였다. 컬럼을 1 mL/분의 유속으로 2 컬럼 부피(CV)의 6 M 구아니딘 히드로클로라이드/PBS pH 7로 평형과 시키고 단백질을 1.5 CV로 용리하였다. 피크 분획(각 1.5 mL)을 회수하고 12% 또는 4-20% Bis-Tris-SDS 겔 전기영동을 통해 스크리닝하였다. 단백질을 함유하는 분획을 모으고 최종 농도 7.5 mM DTT를 부가하여 단백질 분자를 환원시켰다. 실온에서 2시간 항온반응 후, 혼합물을 물로 5x 희석하고 4.5 L 3 mM NaH₂PO₄, 7 mM Na₂HPO₄, 2 mM KCl, 120 mM NaCl에 투석하였다. 3회 이상 새로운 완충액을 교제하면서 투석을 3-4일 동안 계속하였다. 투석된 물질을 2 ㎛ 필터를 통해 여과하고 아세트산을 사용하여 pH를 5로 조정하였다. 컬럼을 10 CV의 완충액 1(25 mM 아세트산암모늄 pH 5)으로 평형화한 후 주입 후 20분간 100% 완충액 B(25 mM 아세트산암모늄 pH5/1M NaCl)로의 농도 구배를 후속하였다. 피크 분획(각 0.5 mL)을 회수하고 12% 또는 4-20% Bis-Tris-SDS 겔 전기영동으로 스크리닝하였다. 생성물을 함유하는 분획을 모으고 완충액 A(0.1% TFA/물)로 2x 희석하였다. 다음으로 단백질을 다음의 프로그램을 사용하여 1 mL/분의 유속 및 5 mL 루프를 사용하여, C4 역상-HPLC(Beckman system Gold) 상에서 크로마토그래피하였다: 주입 동안 10% 완충액 A, 10분간 40% 완충액 B(0.1% TFA/ACN)까지의 농도 구배, 30분간 50% 완충액 B로 농도 구배, 및 5분간 100% 완충액 B로 농도 구배. 피크 분획(각 0.5 mL)를 회수하고 12% 또는 4-20% Bis-Tris-SDS 겔 전기영동으로 스크리닝하였다. 단백질 함유 분획을 건조시키고 분석 및 검사를 위해 0.1M MES pH 6.1에 재현탁하였다.

실시예 3

부위 특이적 시스테인 PEG 화 및 정제

선형 22 kD 메톡시-폴리에틸렌 글리콜-말레이미드 유도체(Nektar Therapeutics)의 말레이미드 기와 단백질의 설프히드릴 간의 안정한 티오에테르 연결을 통해 시스테인 함유 IL4 RA 뮤테인을 PEG화하는 프로토콜을 확립하였다. 2배 몰의 과량 mPEG-MAL 22kD 시약을 반응 완충액(0.1M MES, pH 6) 중 용해된 60 μM의 단백질에 부가하였다. 실온에서 0.5 시간 반응 후, mPEG-MAL 22kD 보다 2배 몰 과량의 시스테인으로 반응을 종결시켰다(도 1). 양이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피를 통해서 미반응된 mPEG-MAL 22kD(시스테인으로 켄칭) 및 미반응 IL4 RA 시스테인 뮤테인으로부터 PEG화 단백질을 정제하였다. 미정제 반응 혼합물을 0.4 mL의 0.1 M MES(pH 6)로 평형화시킨 Vivapure Mini S 양이온 교환 컬럼(Vivascience)에 적용하였다. 컬럼을 0.4 mL의 0.1M MES, pH 6로 2회 세척한 후, 각 세척 후에 2,000 x g에서 원심분리하였다. 샘플을 0.4 mL의 0.6M NaCl/0.1M MES, pH6을 사용하여 컬럼으로부터 원심분리를 통해 용리하였다. 0.4 mL 용리물을 Beckman HPLC system Gold를 사용하여 TSK-GEL G2000SWXL HPLC 사이징 컬럼(Tosoh Biosep) 상에 충전하였다. 30분 동안 1 mL/분의 유속에서 인산 완충 염수(Dulbecco's PBS) 이동상을 사용하여 샘플을 분해하였다. 피크 분획(0.5 mL)을 회수하고 PEG화 단백질에 대해 4-12% Bis-Tris-SDS 겔 전기영동을 통해 평가하였다. 생성물을 함유하는 분획을 모으고 분석 및 시험관 내 검사를 위해 대략 60 μM(또는 ∼1 mg/mL)로 제조사의 프로토콜에 따라 Ultrafree Biomax-5 장치(Millipore)를 사용하여 농축하였다. PEG화 단백질에 대한 최종 농도는 아미노산 분석으로 측정하였다. 최종 수율을 하기 표 5에 나타내었다.

PEG화 IL4RA 시스테인 뮤테인에 대한 정제 수율
뮤테인	PEG화 (mg, 초기)	PEG화 (mg, 최종)	회수율%
IL4RA	ND	ND	ND
T28C	0.267	0.064	24.0
S36C	0.392	0.057	14.5
K37C	0.264	0.011	4.2
N38C	0.387	0.083	21.4
A104C	0.213	0.010	4.7
N105C	0.289	0.044	15.2
Q106C	0.125	0.023	18.4
평균	0.176	0.042	14.6

실시예 4

BiaCore IL -4 수용체 결합 분석

아민 커플링을 통해서 BIAcore CM5 연구 등급 센서 칩 상에 IL-4 수용체를 고정시켰다. 센서 표면을 EDC/NHS 펄스로 활성화시켰다. IL-4 수용체를 10 mM 아세테이트 완충액(pH 5.0)에 용해시키고 플로우셀2에 주입하고 1.0 M 에탄올아민-HCl의 펄스를 통해 표면을 불활성화시켰다. 수용체에 대한 고정화 정도는 ∼300 RU였다. 플로우셀 1을 또한 블랭크로서 기능하도록 리간드없이 활성화시켰다. Biacore Wizard를 사용하여 동역학 분석을 수행하였다. 후보물 IL4RE 길항제를 HBS-EP(러닝 완충액)에 희석하고 3분간 30 ㎕/분의 유속 및 15분의 해리 시간에서 주입하였다. 칩 재생은 농도 시리즈로 다음 주입 전에 베이스라인까지 10 mM 글리신 pH 2.5(100 ㎕/분의 유속)을 2회 30초 주입하여 수행하였다. 해리 상수(K_D) 값은 직접 결합 동력학을 기초로 각 후보물에 대해 계산하였다(표 5). 결과는 구성체 IL4-RE-A104C, IL4-RE-N105C, 및 IL4-RE-Q106C 모두 해리 상수가 0.6 nM보다 낮게 나타났다.

실시예 5

TF -1 세포 증식 분석

IL-4(0.5 ng/mL, 0.033 nM) 또는 IL-13(5 ng/mL, 0.416 nM)에 대한 TF-1 세포의 증식 반응을 사용하여 IL-4RE 분자의 기능적 길항제 활성을 평가하였다. 이러한 분석에서, IL-4 또는 IL-13 및 IL-4RE 분자가 존재하거나 또는 부재하는 RPMI + 10% 혈청 중 96웰 평판(1x10⁴/웰, 100 ㎕ 부피)에서 2 내지 4일 동안 TF-1 세포를 배양하였다. 양성 대조군으로서 GM-CSF 처리한 것을 사용하였다. 최종 판독 전 24시간 경, 10 ㎕ AlamarBlue(10% 부피)를 각 웰에 부가하였다. WALLAC Victor 2를 사용하여 530/590 nm에서 형광발광도를 측정하였다. 억제 농도 50%(IC₅₀)는 후보 IL-4RE 분자의 용량 역가를 기준으로 산출하였다. IL-4 및 IL-13 억제에 대한 TF-1 생분석 결과를 표 6에 요약하였다. 결과는 구성체 IL4-RE-K37C, IL4-RE-N38C 및 IL4-RE-A104C가 IL-4 또는 IL-13 존재하에서 IL-4-RA에 필적하는 IC₅₀ 값을 갖는 것을 보여준다.

TF-1 세포 증식 분석에서 IL4RA에 대한 PEG화 뮤테인의 PEG-IL4RE BIAcore 결합 분석 및 생활성 평가
뮤테인	BIAcore 친화성, nM	TF-l/IL-4 IC50, nM	TF-1 /IL-13 IC50, nM
BAY 16-9996 IL-4RA	0.11	0.56 + 0.86 (n=17)	1.17+ 1.77 (n=6)
IL4-RE-T28C	0.89	2.35 + 0.75 (n=2)	2.87 + 0 (n=l)
IL4-RE-S36C	1.15	1.20 + 0.02 (n=2)	1.21+0 (n=l)
IL4-RE-K37C	0.74	0.82 + 0.01 (n=2)	1.22 +0.58 (n=2)
IL4-RE-N38C	0.77	0.70 + 0.18 (n=2)	1.24 +0.58 (n=2)
IL4-RE-A104C	0.56	0.55 + 0.10 (n=2)	1.34+1.21 (n=2)
IL4-RE-N105C	0.59	2.26 + 0.20 (n=2)	2.11 +0(n=l)
IL4-RE-Q106C	0.52	2.44 + 0.68 (n=2)	1.95 + 0(n=l)

실시예 6

1차 세포 증식 분석

IL-4에 대해 인간 1차 세포(T-세포 및 B-세포)의 증식 반응도 IL-4RE 분자 사전처리 후에 평가하였다. 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 말초 혈액으로부터 단리하고 일부를 4일 동안 PHA로 처리하여 T 세포의 아세포 형성을 유도하였다. PBMC를 또한 항-CD40로 처리하여 B 세포 활성을 활성화시키고 곧바로 사용하였다. 세포들을 96-웰 평판(웰 당 10⁵ 세포)에 접종하였다. PHA T-세포의 아세포 및 B 세포 조제물을 다양한 농도의 IL-4RE 분자의 존재하에서 3일간 IL-4(10 ng/ml, 0.667 nM)로 자극하였다. 항온반응의 마지막 20시간 동안 트리튬처리 티미딘 유입을 증식 지표로서 사용하였다. 이러한 분석 결과를 표 7에 나타내었다. 결과는 모든 PEG화 구성체가 둘 모두의 1차 세포 분석에서 IL-4RA 보다 5배 많이 IC₅₀이 낮다는 것을 보여준다.

B-세포 및 T-세포의 아세포 증식 분석에서 PEG-IL4RE 생활성 평가
뮤테인	B-세포 IC50, nM	T-세포의 아세포 IC50, nM
BAY 16-9996 IL-4RA	0.86 + 0.42 (n=10)	3.22 + 3.26 (n=16)
IL4-RE-K37C	3.73 + 2.15 (n=2)	13.86+12.77 (n=2)
IL4-RE-N38C	3.33 + 2.68 (n=2)	9.94 + 8.99 (n=2)
IL4-RE-A104C	3.29 +1.46 (n=2)	4.67 + 4.65 (n=2)

실시예 7

래트 약동역학 실험

무게가 250 내지 350 g인 성체 숫컷 스프라그 다우리 래트를 사용하였다. 이 래트를 혈액 샘플 수집을 위해 경부 혈관 카테터의 캐뉼러에 연결하였다. 또한, 정맥내(IV) 용량 군의 래트에 약물 투여를 위해 대퇴부 혈관 카테터의 캐뉼러에 연결하였다.

래트에 각각 1 및 0.5 mg/kg의 용량으로 IL-4RA 또는 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제를 주었다. IV 및 SC(피하)의 투여 경로 둘 모두를 사용하였다. IV 용량은 유치 대퇴부 혈관 카테터로 직접 주사하였다. SC 용량은 배측흉부 영역에 주사하였다. 3마리 래트를 각 용량 군에 사용하였다.

단일 볼러스 주사(IV 또는 SC) 이후, 혈액 샘플을 사전투여 및 최대 168시간까지 투약 후 사전정해진 시점에서 회수하였다. 샘플 원심분리를 수집 1 시간 이내에 시작하였다. 혈장을 회수하고 드라이 아이스에 놓은 후 대략 -70℃에서 보관하였다.

IL-4RA 및 변형된 뮤테인의 혈장 농도는 효소 결합된 면역분석법으로 정량하였다. 항-IL-4 항체를 코팅 및 검출 시약으로서 사용하였다. 이 분석에서 정량의 최소치는 0.2 ng/mL이었다. 약동역학 변수는 WinNonlin(Pharsight, Mountain view, CA)을 사용하는 비구획 분석으로 유추하였다. 특히 흥미로운 것은 흡수된 양을 비롯하여 흡수 및 제거 동역학, 분포 부피의 평가이다.

실시예 8

이.콜라이-코딩된 IL -4 뮤테인

고순도 및 고수율 봉입체 발현은 직접적으로 제조 능력 및 비용에 영향을 준다. IL-4 삼중 뮤테인 분자는 이.콜라이에서의 발현에 적합한 적절한 플라스미드 벡터에 인간 DNA 코돈을 활용하는 IL-4 삼중 뮤테인 구성체를 포함시켜 실험실에서 제조할 수 있다는 것을 보여주었다. 소량의 봉입체를 인간 코돈을 사용하는 IL-4 삼중 뮤테인 구성체로부터 얻을 수 있지만, 이.콜라이 발효 과정은 강건하지 않다. 인간 코돈을 사용하는 IL-4 삼중 뮤테인 구성체의 발현은 이.콜라이 세포에 독성을 나타내어 용해를 야기시키고, 그 결과 봉입체 수율이 낮아지는 것이 관찰되었다. 일정 이론에 제한없이, 이러한 관찰 결과는 이.콜라이 내에서 제한된 양의 인간 코돈에 기인하는 것인 듯 하다. 프로세스를 개선시키기 위해, 이.콜라이-코돈 IL-4RA 플라스미드는 QuickChange(Strategene)를 사용하여 이.콜라이 코딩된 IL4-RE-T13D를 제조하기 위해 사용되었다. 간략하게, IL-4RA 플라스미드는 QuickChange 및 적절한 프라이머를 사용하여 알라닌 104(코돈 GCT) 위치 또는 아스파라긴 38(코돈 AAC) 위치를 시스테인(코돈 TGC)으로 변경하여 바꾸었다. IL-4TM(IL4-RE-T13D) 분자를 코딩하는 2종의 이.콜라이-코돈 IL4-RE-T13D 플라스미드를 제조하였다(표 8).

[표 8a]

[표 8b]

실시예 9

PEG화 IL -4/ IL -13 억제제

IL-4TM-N38C 또는 IL-4TM-A104C를 말레이미드-PEG(20 kDa 선형(Nektar, Dow 또는 NOF); 30 kDa 선형(Nektar, Dow 또는 NOF); 40 kDa 선형(Nektar, Dow 또는 NOF); 또는 40 kDa 분지형(Necktar 또는 NOF))으로 PEG화하는 경우, BIAcore 방법, TF-1 세포-기반 분석 또는 말초 혈액 유래 1차 B 또는 T 림프구를 사용한 분석시 활성이 상당히 감소하였다(도 2).

추가적으로, 추가 시스테인이 존재하는 위치가 중요하다는 것이 관찰되었다. 표 9에 나타낸 바와 같이, TF-1 활성 분석에서 PEG화 104C는 PEG화 38C 보다 활성이 약 2배 손실되었다.

PEG화 IL-4TM과 IL-4DM의 활성 비교
분자	IL-4DM		N38C-40B		104C-40B
사이토카인 분석	IL-4	IL-13	IL-4	IL-13	IL-4	IL-13
EC50 평균	0.386	2.23	2.08	11	2.49	12.1
EC50 표준 편차	0.275 n=18	1.08 n=18	1.32 n=11	7.39 n=11	0.73 n=5	4.55 n=6
>95% 억제율 평균	24.6	154	140	529	360	1060
>95% 억제율 표준편차	14.4 n=7	106 n=14	89.6 n=7	272 n=7	22.4 n=5	545 n=5

이러한 활성 손실을 보상하기 위해서, 추가적인 T13D 돌연변이를 QuikChange, 적절한 프라이머, 및 이.콜라이-코돈 N38C 플라스미드를 사용하여 IL-4TM-N38C에 포함시켰다. 이 T13D 돌연변이는 이전에 IL-4Rα에 대한 결합 친화성이 증가한 것으로 확인되었다(예를 들어, U.S. 특허 제6,028,176호 참조, 본원에 이를 참조하여 포함시킴). 도 3에 도시한 바와 같이, 40 kDa 분지형 PEG로 PEG화된 T13D-N38C는 미PEG화된 IL-4DM(R121D/Y124D)와 동등한 BIAcore를 갖지만, 그 데이타는 세포 기반 분석 결과를 정확하게 예측할 수 없는데 PEG화가 모든 PEG화 IL-4TM 분자의 온-비율(on-rate)에 영향을 미치기 때문이다. 대체로 오프율(off-rate)이 생분석에서 역가-결정적이다. TF-1 세포-기반 분석을 사용하여, 40 kDa 분지형 PEG를 사용해 PEG화된 T13D-N38C은 IL-4DM와 동등한 활성을 갖는다.

유사한 결과가 1차 T 세포 분석에서 관찰되었다. 이 분석에서, 10 도너 유래의 전혈을 수집하고 PBMC를 단리하였다. PBMC를 4일 동안 PHA-P와 항온반응시키고, 이들 "아세포(blast)"를 분석에 사용하였다. 아세포를 3일간 IL-4에 더하여 IL-4TM 시험 화합물의 12 희석물 중 하나와 항온반응시켰다. 마지막 18시간 동안, 3H-티미딘을 배양물에 부가하였다. 세포를 회수하고 3H-티미딘이 유입된 DNA를 b-계측기 상에서 정량하였다. 표 10은 104C와 비교하여 38C에서 PEG화로부터 얻은 역가의 개선 및 PEG화에 따른 역가 손실을 보여주는 것이다.

후보물	IC50 (nM)	>95% 억제율(nM)	IC50 의 배수 증가 (IL-4DM 대비)
104C 40B	8.0 ± 2.07	∼171.4	7.4
104C 30L	4.93± 0.79	∼135.7	4.6
38C 40B	2.43± 0.5	∼55.7	2.3
T13D 40B	3.28 ±1.428	∼38.6	3.1
T13D	0.714 ± 0.214	∼10.7	0.67
IL4-DM	1.071 ± 0.714	∼22.1	1

1차 B 세포에서 실험을 또한 수행하였다. 유사하게, 5 도너로부터 전혈을 회수하고 PBMC를 단리하였다. PBMC를 3일 동안 마우스 항-인간 CD40, IL-4, 및 IL-4TM 화합물의 12 희석물 중 하나와 항온반응시켰다. 마지막 18시간 동안, 3H-티미딘을 배양물에 부가하였다. 세포를 회수하고 3H-티미딘이 도입된 DNA를 b-계측기 상에서 정량하였다(표 11).

후보물	IC50 (nM)	>95% 억제율 (nM)	IC50의 배수 증가 (IL-4DM 대비)
104C 40B	19.42 ± 6.28	~335.6	11.3
104C 30L	13.0 ± 5.21	~142.8	7.6
38C 40B	6.85 ± 2.21	~96.4	4.0
T13D 40B	2.43 ± 1.07	~22.1	1.4
T13D	0.5 ± 0.143	~7.14	0.3
IL-4DM	1.71 ± 0.64	~25.7	1

IL-4DM(R121D/Y124D)와 비교하여, 각각 T13D 및 T13D 40B 구성체의 증가되거나 또는 유사한 역가를 비롯하여, 104C 위치와 비교하여 38C 위치에서 PEG화의 개선이 또한 관찰되었다.

실시예 10

IL -4/ IL -13 억제제의 리폴딩 수율 개선

IL-4TM(T13D/R121D/Y124D)는 38C 또는 104C 위치의 단백질 서열에 7번째 시스테인 잔기를 함유한다. 이 홀수 시스테인은 봉입체로부터 IL-4TM 리폴등을 효과적으로 감소시킨다. IL-4TM 리폴딩 완충액에 글루타티온의 부가는 IL-4TM 리폴딩 수율을 최적화하는 한편 말레이미드-연결된 PEG 분자에 의해 PEG화되는 38C 또는 104C의 능력을 보존시켰다. 리폴딩 혼합물에 글루타티온을 부가하는 것 이외에도, PEG화에 대해 IL-4TM의 수율을 최적화하기 위해 리폴딩의 시간 의존성이 존재한다. 최대화된 단백질 리폴딩 수율은 BIAcore 분석으로 모니터링하였다. 최대 리폴딩 수율이 얻어지면, 시스테인 산화 화학반응이 더이상 효과적이지 않은 pH로 산을 이용하여 리폴딩 용액의 pH를 낮추었다. 시스테인-말레이미드 결합이 형성되는 보다 중성의 PH에서 IL-4TM이 말레이미드-PEG와 반응할 때까지 낮은 pH를 유지하였다.

참조 문헌

1. Ying, S., M. Humbert, J. Barkans, C.J. Corrigan, R. Pfister, G. Menz, M. Larche, D.S. Robinson, S.R. Durham and A.B. Kay. 1997. Expression of IL-4 and IL-5 mRNA and protein product by CD4+ and CD8+ T cells, eosinophils, and mast cells in bronchial biopsies obtained from atopic and nonatopic (intrinsic) asthmatics. J. Immunol . 158: 3539-3544.

2. Huang, S.K., H.Q. Xiao, J. Kleine-Tebbe, G. Paciotti, D.G. Marsh, L.M. Lichtenstein and M.C. Liu. 1995. IL-13 expression at the sites of allergen challenge in patients with asthma. J. Immunol . 155: 2688-2694.

3. Zhu, Z., RJ. Homer, Z. Wang, Q. Chen, G.P. Geba, J. Wang, Y. Zhang and J.A. Elias. 1999. Pulmonary expression of interleukin-13 causes inflammation, mucus hypersecretion, subepithelial fibrosis, physiologic abnormalities, and eotaxin production. J. Clin . Invest . 103: 779-788.

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5. Sambrook (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1995.

서열 목록을 본 명세서에 전자적으로 첨부하고 미국 특허청의 전자 출원 시스템을 통해 전송한다. 서열 목록이 전체 내용을 참조하여 본원에 포함시킨다. 파일 상세명은 다음과 같다: (a) "AERO1210_4SEQLIST.txt" - 32 Kilobytes

서열 목록, "AERO1210_4SEQLIST.txt"는 2007년 11월 14일 작성되어 2007년 11월 14일에 전송되었다.

본 발명을 상기 예들을 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 범주 내에서 변형 및 변화들이 포함된다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항에 의해서만 제한된다.

SEQUENCE LISTING <110> AEROVANCE, INC. BOISVERT, David BURMEISTER-GETZ, Elise DELARIA, Kathy LONGPHRE, Malinda TOMKINSON, Adrian WONG, Teresa Mo-Fun <120> MODIFIED IL-4 MUTEIN RECEPTOR ANTAGONISTS <130> AERO1210-4WO <140> PCT/US2008/083589 <141> 2008-11-14 <150> US 11/940,217 <151> 2007-11-14 <160> 37 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Modified human sequence <400> 1 atgcacaagt gcgatatcac cttacaggag atcatcaaaa ctttgaacag cctcacagag 60 cagaagactc tgtgcaccga gttgaccgta acagacatct ttgctgcctc caagaacaca 120 actgagaagg aaaccttctg cagggctgcg actgtgctcc ggcagttcta cagccaccat 180 gagaaggaca ctcgctgcct gggtgcgact gcacagcagt tccacaggca caagcagctg 240 atccgattcc tgaaacggct cgacaggaac ctctggggcc tggcgggctt gaattcctgt 300 cctgtgaagg aagccaacca gagtacgttg gaaaacttct tggaaaggct aaagacgatc 360 atggacgaga aagactcaaa gtgttcgagc taataa 396 <210> 2 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Modified human sequence <400> 2 atgcacaagt gcgatatcac cttacaggag atcatcaaaa 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aagccaacca gagtacgttg gaaaacttct tggaaaggct aaagacgatc 360 atggacgaga aagactcaaa gtgttcgagc taataa 396 <210> 6 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Modified human sequence <400> 6 atgcacaagt gcgatatcac cttacaggag atcatcaaaa ctttgaacag cctcacagag 60 cagaagactc tgtgcaccga gttgaccgta acagacatct ttgctgcctc caagaacaca 120 actgagaagg aaaccttctg cagggctgcg actgtgctcc ggcagttcta cagccaccat 180 gagaaggaca ctcgctgcct gggtgcgact gcacagcagt tccacaggca caagcagctg 240 atccgattcc tgaaacggct cgacaggaac ctctggggcc tggcgggctt gaattcctgt 300 cctgtgaagg aatgcaacca gagtacgttg gaaaacttct tggaaaggct aaagacgatc 360 atggacgaga aagactcaaa gtgttcgagc taataa 396 <210> 7 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Modified human sequence <400> 7 atgcacaagt gcgatatcac cttacaggag atcatcaaaa ctttgaacag cctcacagag 60 cagaagactc tgtgcaccga gttgaccgta acagacatct ttgctgcctc caagaacaca 120 actgagaagg aaaccttctg cagggctgcg actgtgctcc ggcagttcta cagccaccat 180 gagaaggaca ctcgctgcct 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Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly 85 90 95 Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn 100 105 110 Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Asp Glu Lys Asp Ser Lys Cys 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 11 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Modified human sequence <400> 11 Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp 20 25 30 Ile Phe Ala Ala Cys Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg 35 40 45 Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr 50 55 60 Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu 65 70 75 80 Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly 85 90 95 Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn 100 105 110 Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Asp Glu Lys Asp Ser Lys Cys 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 12 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Modified human sequence 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Cys 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 15 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Modified human sequence <400> 15 Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp 20 25 30 Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg 35 40 45 Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr 50 55 60 Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu 65 70 75 80 Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly 85 90 95 Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Cys Gln Ser Thr Leu Glu Asn 100 105 110 Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Asp Glu Lys Asp Ser Lys Cys 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 16 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Modified human sequence <400> 16 Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp 20 25 30 Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg 35 40 45 Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr 50 55 60 Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu 65 70 75 80 Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly 85 90 95 Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Cys Ser Thr Leu Glu Asn 100 105 110 Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Asp Glu Lys Asp Ser Lys Cys 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer <400> 17 gaagactctg tgcaccgagt tgtgcgtaac agacatcttt gc 42 <210> 18 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer <400> 18 gcaaagatgt ctgttacgca caactcggtg cacagagtct tc 42 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer <400> 19 gtaacagaca tctttgctgc ctgcaagaac acaactgag 39 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer <400> 20 ctcagttgtg ttcttgcagg cagcaaagat gtctgttac 39 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer <400> 21 ccgtaacaga catctttgct gcctcctgca acacaactga gaagg 45 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer <400> 22 ccttctcagt tgtgttgcag gaggcagcaa agatgtctgt tacgg 45 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer <400> 23 gacatctttg ctgcctccaa gtgcacaact gagaaggaaa cc 42 <210> 24 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer <400> 24 ggtttccttc tcagttgtgc acttggaggc agcaaagatg tc 42 <210> 25 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer <400> 25 gaattcctgt cctgtgaagg aatgcaacca gagtacgttg g 41 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer <400> 26 ccaacgtact ctggttgcat tccttcacag gacaggaatt c 41 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer <400> 27 cctgtgaagg aagcctgcca gagtacgttg gaaaacttc 39 <210> 28 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer <400> 28 gaagttttcc aacgtactct ggcaggcttc cttcacagg 39 <210> 29 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer <400> 29 cctgtcctgt gaaggaagcc aactgcagta cgttggaaaa cttc 44 <210> 30 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Amplification primer <400> 30 gaagttttcc aacgtactgc agttggcttc cttcacagga cagg 44 <210> 31 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Modified human sequence <400> 31 atgcacaaat gcgatatcac cctgcaggaa atcatcaaag acctgaattc tctgaccgaa 60 cagaaaaccc tgtgcaccga actgaccgtt accgacatct tcgctgcttc gaaatgcacc 120 accgaaaaag aaaccttctg ccgtgctgct accgttctgc gtcagttcta ctctcaccac 180 gaaaaagaca cccgttgcct gggtgctacc gctcagcagt tccaccgtca caaacagctg 240 atccgtttcc tgaaacgtct ggaccgtaac ctgtggggtc tggctggtct gaacagctgc 300 ccggttaaag aagctaacca gtctaccctg gaaaacttcc tggaacgtct gaaaaccatc 360 atggacgaaa aagactctaa atgctcttct 390 <210> 32 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Modified human sequence <400> 32 Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Asp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp 20 25 30 Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg 35 40 45 Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr 50 55 60 Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu 65 70 75 80 Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly 85 90 95 Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn 100 105 110 Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Asp Glu Lys Asp Ser Lys Cys 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 33 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Modified human sequence <400> 33 Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Asp Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp 20 25 30 Ile Phe Ala Ala Ser Lys Cys Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg 35 40 45 Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr 50 55 60 Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu 65 70 75 80 Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly 85 90 95 Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn 100 105 110 Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Asp Glu Lys Asp Ser Lys Cys 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 34 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Modified E.coli sequence <400> 34 atgcacaaat gcgatatcac cctgcaggaa atcatcaaaa ccctgaattc tctgaccgaa 60 cagaaaaccc tgtgcaccga actgaccgtt accgacatct tcgctgcttc gaaaaacacc 120 accgaaaaag aaaccttctg ccgtgctgct accgttctgc gtcagttcta ctctcaccac 180 gaaaaagaca cccgttgcct gggtgctacc gctcagcagt tccaccgtca caaacagctg 240 atccgtttcc tgaaacgtct ggaccgtaac ctgtggggtc tggctggtct gaacagctgc 300 ccggttaaag aatgcaacca gtctaccctg gaaaacttcc tggaacgtct gaaaaccatc 360 atggacgaaa aagactctaa atgctcttct taataa 396 <210> 35 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Modified E.coli sequence <400> 35 atgcacaaat gcgatatcac cctgcaggaa atcatcaaaa ccctgaattc tctgaccgaa 60 cagaaaaccc tgtgcaccga actgaccgtt accgacatct tcgctgcttc gaaatgcacc 120 accgaaaaag aaaccttctg ccgtgctgct accgttctgc gtcagttcta ctctcaccac 180 gaaaaagaca cccgttgcct gggtgctacc gctcagcagt tccaccgtca caaacagctg 240 atccgtttcc tgaaacgtct ggaccgtaac ctgtggggtc tggctggtct gaacagctgc 300 ccggttaaag aagctaacca gtctaccctg gaaaacttcc tggaacgtct gaaaaccatc 360 atggacgaaa aagactctaa atgctcttct taataa 396 <210> 36 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Modified E.coli sequence <400> 36 atgcacaaat gcgatatcac cctgcaggaa atcatcaaag acctgaattc tctgaccgaa 60 cagaaaaccc tgtgcaccga actgaccgtt accgacatct tcgctgcttc gaaatgcacc 120 accgaaaaag aaaccttctg ccgtgctgct accgttctgc gtcagttcta ctctcaccac 180 gaaaaagaca cccgttgcct gggtgctacc gctcagcagt tccaccgtca caaacagctg 240 atccgtttcc tgaaacgtct ggaccgtaac ctgtggggtc tggctggtct gaacagctgc 300 ccggttaaag aagctaacca gtctaccctg gaaaacttcc tggaacgtct gaaaaccatc 360 atggacgaaa aagactctaa atgctcttct 390 <210> 37 <211> 4257 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Modified E.coli sequence <400> 37 aaatgctctt cttaataagg atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc 60 tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag 120 gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cggataattc ttagaaaaac tcatcgagca 180 tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc 240 gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca taggatggca agatcctggt 300 atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa 360 aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca 420 aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca gccattacgc tcgtcatcaa 480 aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg cgcctgagcg agacgaaata 540 cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga atgcaaccgg cgcaggaaca 600 ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata ttcttctaat acctggaatg 660 ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc atcaggagta cggataaaat 720 gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt tagtctgacc atctcatctg 780 taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa caactctggc gcatcgggct 840 tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac attatcgcga gcccatttat 900 acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg cctcgagcaa gacgtttccc 960 gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat gtaagcagac agttttattg 1020 ttcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 1080 aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 1140 aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 1200 ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 1260 tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 1320 ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 1380 cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 1440 agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 1500 gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 1560 ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 1620 tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 1680 tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 1740 cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 1800 tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 1860 gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 1920 aatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc 1980 gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 2040 gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg 2100 gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta 2160 aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag 2220 ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg ataaagcggg ccatgttaag 2280 ggcggttttt tcctgtttgg tcactgatgc ctccgtgtaa gggggatttc tgttcatggg 2340 ggtaatgata ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata cgggttactg atgatgaaca 2400 tgcccggtta ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg gtatggatgc ggcgggacca 2460 gagaaaaatc actcagggtc aatgccagcg ctcatgagcc cgaagtggcg agcccgatct 2520 tccccatcgg tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg cacctgtggc gccggtgatg 2580 ccggccacga tgcgtccggc gtagaggatc gagatccatt tacgttgaca ccatcgaatg 2640 gtgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt 2700 gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac 2760 cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga 2820 agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa 2880 acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat 2940 tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt 3000 agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt 3060 cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc 3120 ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat 3180 tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca 3240 ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc 3300 tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga 3360 ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc 3420 cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga 3480 gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag 3540 ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac 3600 cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt 3660 gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggctcga gaaatcataa aaaatttatt 3720 tgctttgtga gcggataaca attataatag attcaattgt gagcggataa caatttcaca 3780 catctagaaa taattttatt taactttaag aaggagatat acatatgcac aaatgcgata 3840 tcaccctgca ggaaatcatc aaagacctga attctctgac cgaacagaaa accctgtgca 3900 ccgaactgac cgttaccgac atcttcgctg cttcgaaatg caccaccgaa aaagaaacct 3960 tctgccgtgc tgctaccgtt ctgcgtcagt tctactctca ccacgaaaaa gacacccgtt 4020 gcctgggtgc taccgctcag cagttccacc gtcacaaaca gctgatccgt ttcctgaaac 4080 gtctggaccg taacctgtgg ggtctggctg gtctgaacag ctgcccggtt aaagaagcta 4140 accagtctac cctggaaaac ttcctggaac gtctgaaaac catcatggac gaaaaagact 4200 ctaaatgctc ttcttaataa ggatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgag 4257

Claims (18)

1. IL-4의 28, 36, 37, 38, 104, 105, 106 위치의 아미노산 잔기에서 비단백질 중합체와 커플링되는 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제로서, 13, 121 및 124 위치의 아미노산은 아스파르트산이고, 여기서 아미노산은 야생형 인간 IL-4에 따라서 번호화되며, 비단백질 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌인, 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
2. 제1항에 있어서, 비단백질 중합체는 IL-4의 37, 38 또는 104 위치의 아미노산 잔기에서 커플링되는 것인 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
3. 제1항에 있어서, 서열 번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
4. 제1항에 있어서, 비단백질 중합체는 폴리에틸렌 글리콜인 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
5. 제4항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 선형인 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
6. 제4항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 분지형인 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
7. 제6항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 3 kD∼50 kD인 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
8. 제7항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 40 kD인 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
9. a) 제1항의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제; 및
   b) 약학적으로 허용되는 담체
   를 포함하는 약학 조성물.
10. a) 제8항의 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제; 및
    b) 약학적으로 허용되는 담체
    를 포함하는 약학 조성물.
11. 제1항에 있어서, 약 0.1 nM∼약 10 μM, 약 0.5 nM∼약 1 μM, 또는 약 1.0 nM∼약 100 nM의 K_D로 IL-4 수용체 알파 사슬에 결합하는 것인, 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
12. 제1항에 있어서, 약 0.1 nM∼약 10 μM, 약 0.5 nM∼약 1 μM, 또는 약 1.0 nM∼약 100 nM의 IC₅₀으로 IL-4에 대한 TF-1 세포의 증식성 반응을 억제하는 것인, 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
13. 제1항에 있어서, 약 0.1 nM∼약 10 μM, 약 0.5 nM∼약 1 μM, 또는 약 1.0 nM∼약 100 nM의 IC₅₀으로 IL-13에 대한 TF-1 세포의 증식성 반응을 억제하는 것인, 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
14. 제1항에 있어서, 약 0.1 nM∼약 10 μM, 약 0.5 nM∼약 1 μM, 또는 약 1.0 nM∼약 100 nM의 IC₅₀으로 IL-4에 대한 인간 B 세포의 증식성 반응을 억제하는 것인, 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
15. 제1항에 있어서, 약 0.1 nM∼약 10 μM, 약 0.5 nM∼약 1μM, 또는 약 1.0 nM∼약 100 nM의 IC₅₀으로 IL-4에 대한 인간 T 세포의 증식성 반응을 억제하는 것인, 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
16. 제1항에 있어서, 비변형된 IL-4 수용체 길항제보다 혈장 반감기가 약 2∼10배 이상 높은 것인 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
17. 제16항에 있어서, 비변형된 IL-4 수용체 길항제보다 혈장 반감기가 약 10∼100배 이상 높은 것인 변형된 IL-4 뮤테인 수용체 길항제.
18. 서열 번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 정제된 폴리뉴클레오티드.

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