CN101914524B - 从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法，包括以下步骤：将cDNA进行PCR扩增；得到的cDNA片段用5’端带有生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增后得到的cDNA双链进行变性处理，然后用磁珠技术进行cDNA双链分离；对分离得到的cDNA单链进行复性，形成具有具有不同二级结构的单链cDNA，分别回收，进行PCR反应形成双链；将PCR片段经限制酶酶切，克隆测序。本发明采用的测序方法能够更为有效地提高miRNA克隆测序的效率。

Description

从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法

技术领域

本发明涉及一种从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法，具体涉及一种基于microRNA前体二级结构特性的单链cDNA文库分离技术，属于分子生物学领域。

背景技术

microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。目前首选的microRNA(miRNA)实验室鉴定方法是对依大小分离的cDNA文库进行测序分析。最初的试剂盒是用来克隆约22nt的小干涉RNA分子，但似乎对内源性的小RNA分子也有作用。于是，许多这样的试剂盒也被用来克隆miRNA。克隆小RNA的试剂盒发展很快，当前许多已知的miRNA就是用这些试剂盒鉴定出来的。所有试剂盒的原理都相同，仅在操作的细节上有所不同。简而言之，将总RNA样本用变性的聚丙烯酰胺凝胶分离，回收20-25nt大小的RNA。将5’和3’接头分子(Adapter)连接到RNA上，以接头分子为引物进行RT-PCR，PCR产物克隆到载体，构建cDNA文库。最后将每个克隆进行测序，分析起源于基因组的小RNA。

对于单链的cDNA合成，需要将3’接头连接到成熟的miRNA，引入一个反转录引物的退火位点。在寡核苷酸的化学合成过程中，为了防止成熟miRNA和接头自我成环，在连接前小RNA通常要经脱磷酸处理，要在3’接头的3’羟基末端连接上一个非核苷基团。另外一个很普遍的作法是，将3’接头5’端腺苷酸化，免去了小RNA脱磷酸的步骤。还有的是用poly(A)连接酶将poly(A)尾巴来代替3’接头分子连接到小RNA分子上，就用oligo(dT)来当反转录的引物。

通过克隆测序发现miRNA共同的局限性是：由于小RNA文库中的siRNA(小的干涉RNA)较多，导致克隆效果大大降低，对于低水平表达，或特定时期，或稀有细胞类型中的miRNA难以找到。例如McDaneld等(McDaneld，T.G，Smith，T.P.，Doumit，M.E.，Miles，J.R.，Coutinho，L.L.，Sonstegard，T.S.，Matukumalli，L.K.，Nonneman，D.J.，Wiedmann，R.T.MicroRNA transcriptomeprofiles during swine skeletal muscle development.BMC Genomics.2009，10：77-88)用小RNA的cDNA文库测序的方法来研究micorRNA在猪骨骼肌中的表达，一共做了5000个克隆测序，在得到的600个不同的克隆序列中，只确认了约150个已知的microRNA序列和约70个未知的microRNA序列，其余大部分不是microRNA序列。可见新microRNA的筛选采用小RNA的cDNA文库克隆测序的方法还是可行的，只是效率较低，测序结果中重复的序列较多。在5000个克隆中仅有约600个不同的小RNA序列(12％)，而且这600个中也只有一小部分(36％)是miRNA序列。

因此需要寻求一种更为有效地分离miRNA前体的方法，以此提高miRNA的克隆测序效率。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用microRNA前体的发夹二级结构特性来从小RNA合成的cDNA文库分离microRNA前体cDNA的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法，该方法包括以下步骤：将合成的cDNA进行PCR扩增，扩增后将PCR片段经限制酶酶切，克隆测序；该方法在进行PCR扩增之后、PCR片段酶切之前还需要对所获得的PCR产物进行microRNA前体片段的不同二级结构单链分离；所述分离过程包括以下步骤：

(1)将得到的cDNA片段用5’端带有生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增后得到的cDNA双链进行变性处理，然后用磁珠技术进行cDNA双链分离；

(2)对步骤(1)中得到的单链进行复性，得到具有microRNA前体片段的二级结构的cDNA；

(3)通过电泳分离步骤(2)中得到的cDNA，得到具有不同二级结构的单链cDNA，分别回收，进行PCR反应形成双链。

其中，步骤(1)中PCR扩增引物为：F：5’-AAAGATCCTGCAGGTGCGTCA-3’，R：5’-GTCTCTAGCCTGCAGGATCGATG-3’；扩增后得到的cDNA双链变性处理条件为95℃时5min。

步骤(2)中单链cDNA复性过程为在以下条件下依次进行：94℃时2min，60℃时30sec，72℃时1min，4℃时5min。

步骤(3)中电泳分离采用聚丙烯酰胺电泳或二维电泳，电泳结束后银染。

与现有技术相比，本发明提供的单链cDNA文库分离克隆测序方法具有以下有益效果：本发明利用了miRNA前体的发夹形二级结构特点来分离miRNA前体，提高了miRNA的克隆测序效率；同时本发明在电泳时未加任何染料，在电泳结束后再进行银染，保证了具有不同二级结构的DNA分子达到更好的分离效果。

附图说明

附图为本发明从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA方法的流程图。

具体实施方式

实施例1

1、小RNA提取

使用罗氏公司的小RNA(＜100bp)提取试剂盒(High Pure miRNA IsolationKit，Cat.No.05 080 576 001)。具体操作步骤如下：

1)加400μL 20％结合缓冲液(Binding Buffer)到一个2mL的空试管中；

2)加1～50mg的肌肉组织样品到试管中，用匀浆机将组织打碎；

3)将试管在4℃下，14000rpm离心2min，后取上清液约150-188μL到另一个新的1.5mL的试管中；

4)加312μL的Binding Buffer，震动3×5s；

5)将试剂盒中的滤管和收集管组装好，将混合液吸入上面的滤管中；

6)13000×g离心30s，收集下面收集管中的液体；

7)再加200μL的结合增强缓冲液(Binding Enhancer)到收集管中，震动3×5s；

8)将试剂盒中的滤管和收集管组装好，将混合液吸入上面的滤管中；

9)13000×g离心30s，倒掉收集管中的液体；

10)加500μL的冲洗缓冲液(Wash Buffer)工作液到滤管中；

11)13000×g离心30s，倒掉收集管中的液体；

12)加300μL的Wash Buffer工作液到滤管中；

13)13000×g离心30s，倒掉收集管中的液体；

14)13000×g离心1min；

15)将滤管置于一个新的1.5mL的试管中，加100μL洗脱缓冲液(ElutionBuffer)(为了提高RNA浓度，加50μL Elution Buffer也行，但会损失产量约30％)，在15～25℃下孵化1min；

16)13000×g离心1min；

17)这样＜100nt miRNA就提出来了，可以直接做RT-PCR或者保存于-80℃下以备用。

2、小RNA的细菌碱性磷酸酶(Bacterial Alkaline Phosphatase，BAP)处理

小RNA的克隆要使用小RNA克隆试剂盒(Small RNA Cloning Kit)。具体操作步骤如下：

1)在1～100ng的小RNA中加入去核糖核酸酶的双蒸水(RNase freeddH₂O)，总量至42μL。

2)在小试管(Microtube)中配制如下反应液：

Small RNA                            42μL

核糖核酸酶抑制剂(RNase Inhibitor)    1μL

10×BAP Buffer                       5μL

BAP                                  2μL

Total                                50μL

3)使用微量移液管(Micropipetman)轻轻混匀后，37℃反应1小时。

4)加入50μL的RNase free ddH₂O，将总体积调至100μL后，再加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇，在振荡器上振荡5～10秒钟，使其充分混匀。

5)4℃15,000rpm离心5分钟，将上清(水层)转移到新的Microtube中。注意不要取到中间层。

6)再次加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇混匀后，离心回收上层。

7)加入等量的氯仿/异戊醇，在振荡器上混匀5～10秒钟。

8)4℃15,000rpm离心5分钟，将上清(水层)转移到新的Microtube中。

9)向上清中加入1/10体积的3M醋酸钠(Sodium Acetate)、4μL的Dr.GenTLE沉淀载体(Dr.GenTLE Precipitation Carrier)、2.5倍体积的乙醇，充分混匀。

10)-80℃放置1小时后，4℃15,000rpm离心1小时，轻轻倒掉上清，保留沉淀。

11)用80％乙醇清洗沉淀。

12)风干后(注意不要过于干燥)，用14μL的RNase free ddH₂O溶解。

13)用微量紫外分光光度计检测RNA质量。

3、3’接头分子(Adaptor)的连接

1)在Microtube中配制如下反应液。

0.1％牛血清白蛋白(bovine     3μL

serum albumin，BSA)

RNase Inhibitor              1μL

3’Adaptor                   1μL

BAP处理Small RNA             14μL

Total                        19μL

2)加入30μL的T4的核糖核酸连接缓冲液(T4 RNA Ligation Buffer)，用Micropipetman混匀(此Buffer比较粘，操作时要注意)。

3)加入1μL的T4RNA Ligase，用Micropipetman充分混匀。

4)15℃反应1小时。

4、MAGNOTEX-SA的吸附

1)移取210μL的2×B/W Buffer到Microtube中，再加入210μL的RNase free ddH₂O配制成1×B/W Buffer。

2)将磁性-生物素-链霉亲和素系统(MAGNOTEX-SA，Magnet Beads)充分混匀后，取10μL至新的离心Microtube中。

3)将Tube置于磁力分离架(Magnetight Separation Stand)上，静置30秒钟后去上清。

4)加入10μL的2×B/W Buffer，在振荡器上轻轻混匀后，置于MagnetightSeparation Stand上，静置30秒钟。(B/W Buffer中含有Tritonx-100，易起泡，但对反应没有影响。)

5)弃上清，加入50μL的2×B/WBuffer。

6)向上述2、的连接反应液中加入50μL上述5)中制备的Magnetbeads，充分混匀。

7)25℃静置1小时。

8)反应结束后，将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟。

9)弃上清后，加入100μL的1×B/W Buffer，用Vortex短时间振荡，使Beads混匀。

10)将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟，弃上清。

11)加入100μL的RNase free ddH₂O，轻轻混匀。此水溶液在进行下步实验之前不要去除。

5、5’末端磷酸化

1)在Microtube中于冰上配制如下反应液。

RNase free ddH₂O               38μL

RNase Inhibitor                1μL

T4的多聚核苷酸激酶             10μL

(Polynucleotide Kinase，PNK)缓冲

液(5×T4PNK Buffer)

T4 Polynucleotide Kinase       1μL

Total                          50μL

2)将上述试验操作4的步骤11)中制备的Beads水溶液在MagnetightSeparation Stand上静置30秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入50μL上述1)配制的反应液，用Micropipetman轻轻混匀。

3)37℃反应30分钟。

4)在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟。

5)弃上清，加入100μL的1×B/W Buffer，短时间在Vertex上振荡使Beads混匀。

6)将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟，弃上清。

7)加入100μL的RNase free ddH₂O，轻轻混匀。此水溶液在进行下步实验之前不要去除。

6、5’Adaptor的连接

1)在Microtube中于冰上配制如下反应液，充分混匀。

RNase free ddH₂O           14μL

T4RNA Ligation Buffer^*     30μL

0.1％BSA                   3μL

5’Adaptor                 1μL

RNase Inhibitor            1μL

T4 RNALigase               1μL

Total                      50μL

*此Buffer比较粘，操作时要注意。

2)将上述实验操作5的步骤7)中制备的Beads水溶液在MagnetightSeparation Stand上静置30秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入上述1)配制的反应液，用Micropipetman轻轻混匀，15℃反应1小时。

3)加入50μL的RNase free ddH₂O充分混匀后，在Magnetight SeparationStand上静置30秒钟。

4)弃上清，加入100μL的1×B/W Buffer，短时间在Vertex上振荡使Beads混匀。

5)将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟，弃上清。

6)加入100μL的RNase free ddH₂O，轻轻混匀。此水溶液在进行下步实验之前不要去除。

7、反转录反应

1)在Microtube中于冰上配制如下反应液。

5×反转录缓冲液(5×RT Buffer)                  4μL

dNTP混合液(dNTP Mixture)                       4μL

RNase Inhibitor                                1μL

PCR-R和反转录引物(PCR-R&RT-Primer)             1μL

M-MLV反转录酶(M-MLV，莫洛尼鼠白血病逆转录病毒) 1μL

Total                                          11μL

PCR-R&RT-Primer：5’-GTCTCTAGCCTGCAGGATCGATG-3’

2)将上述实验操作6的步骤7)中制备的Beads水溶液在MagnetightSeparation Stand上静置30秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入9μL的RNase free ddH₂O，75℃处理5分钟后，冰上静置1～2分钟。

3)再向其Microtube中加入上述1)中配制的反应液11μL，均匀混合后42℃反应1小时。

4)在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟。

5)去除上清，加入100μL的1×B/W Buffer，短时间在Vertex上振荡使beads混匀。

6)将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟，弃上清。

7)加入100μL的RNase free ddH₂O，轻轻混匀。此水溶液在进行下步实验之前不要去除。

8、PCR扩增

1)在Microtube中于冰上配制如下反应液。

RNase free ddH₂O        12μL

2×PCR Buffer           25μL

dNTP Mixture            5μL

PCR引物(PCR-Primer)F    1μL

PCR-R&RT-Primer         1μL

Taq酶                   1μL

Total                   45μL

2)将上述实验操作7的步骤7)中制备的Beads水溶液在MagnetightSeparation Stand上静置30秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入5μL的0.1N NaOH，用手指轻弹Microtube混匀(注意不能用Micropipetman混匀，因为磁珠会吸附于Tip壁上)。

3)25℃放置5分钟后，在Magnetight Separation Stand上静置30秒。

4)取上清移至0.2mLPCR反应管中。

5)加入45μL上述1)中配制的反应液，充分混匀。

6)在Thermal Cycler PCR仪上按以下条件进行PCR反应。

94℃  2min

72℃  3min

4℃   ∞

7)电泳检测PCR产物结果。

8)胶回收连接了接头的成熟miRNA片段(较小)和接了接头的miRNA前体片段(较大)并纯化。这些DNA片段以备用。

9、miRNA前体片段的不同二级结构单链分离

1)在Microtube中于冰上配制如下反应液：

RNase free ddH₂O            12μL

2×PCR Buffer               25μL

dNTP Mixture                5μL

PCR-Primer-F(5’生物素标记) 1μL

PCR-Primer-R                1μL

Taq酶                       1μL

回收的miRNA前体片段         5μL

Total                       50μL

PCR-Primer-F：5’-AAAGATCCTGCAGGTGCGTCA-3’

PCR-Primer-R：5’-GTCTCTAGCCTGCAGGATCGATG-3’

2)PCR反应程序：

94℃ 2min

72℃ 3min

4℃  ∞

3)取5μLPCR产物进行电泳检测：约120bp。

4)如果电泳检测条带较好，再进行以下实验。将PCR产物在PCR仪上进行变性处理：95℃5min，将PCR产物取出后速置于冰水之中，以后操作都在冰上进行。

5)MAGNOTEX-SA的吸附

a、移取210μL的2×B/W Buffer到Microtube中，再加入210μL的RNasefree ddH₂O配制成1×B/W Buffer。

b、将磁性-生物素-链霉亲和素系统(MAGNOTEX-SA，Magnet Beads)充分混匀后，取10μL至新的离心Microtube中。

c、将Tube置于Magnetight Separation Stand上，静置30秒钟后去上清。

d、加入10μL的2×B/W Buffer，在振荡器上轻轻混匀后，置于MagnetightSeparation Stand上，静置30秒钟。(B/W Buffer中含有Tritonx-100，易起泡，但对反应没有影响。)

e、弃上清，加入45μL的2×B/WBuffer。

f、向上述4的变性PCR产物中加入45μL上述e中制备的Magnet beads，充分混匀。

g、25℃静置1小时。

h、反应结束后，将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟。

i、吸取上清到一个新的PCR管(存起备用)后，加入100μL的1×B/WBuffer，用Vortex短时间振荡，使Beads混匀。

j、将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟，弃上清。

k、加入100μL的RNase free ddH₂O，轻轻混匀。此水溶液在进行下步实验之前不要去除。

6)将上述操作制备的Beads水溶液在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟后去上清，然后向其Microtube中加入5μL的0.1N NaOH，用手指轻弹Microtube混匀(注意不能用Micropipetman混匀，因为磁珠会吸附于Tip壁上)。25℃放置5分钟后，在Magnetight Separation Stand上静置30秒。取上清移至0.2mLPCR反应管中。

7)将上述的PCR管置于PCR仪中：94℃2min，60℃30sec，72℃1min，4℃5min。使得miRNA的发夹前体形成。

8)将上述的PCR产物进行未变性的聚丙烯酰胺电泳或二维电泳，银染(注意要用银染，EB不能染单链DNA)，拍照。

9)将电泳结果进行分析，跑在最前面的为引物二聚体，发夹结构的单链DNA在中间，非发夹结构的单链DNA在最后。

10)分别将凝胶中不同位置的DNA进行回收，回收滤液后进行乙醇沉淀。

11)以回收的单链DNA为模板，还是用原来的引物，进行PCR反应，得到双链后，电泳纯化回收PCR产物，乙醇沉淀。

10、PCR片段的Sse8387 I酶切及克隆测序

由于克隆的片段较小，易产生假阳性，故需要进行酶切后再用专用的载体进行克隆，以提高克隆效率。

1)在Microtube中配制如下反应液。

dH₂O                        34μL

10×M Buffer                5μL

0.1％BSA                    5μL

上述实验操作9-11)的PCR产物  5μL

Sse8387I(10U/μL)           1μL

Total                       50μL

2)37℃过夜反应。

3)加入5μL的3M NaOAc(pH5.2)、125μL的100％乙醇混匀后，-80℃放置30分钟。

4)4℃15,000rpm离心15分钟后，轻轻倒掉上清。

5)用80％乙醇清洗沉淀。

6)风干后(注意不要过于干燥)，将沉淀用5μL的TE Buffer溶解。

7)加入1μL的6×载样缓冲液(Loading Buffer)(36％Glycerol、30mMEDTA、0.05％BPB、0.050％XC)进行15％的聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamidegel)(未变性)电泳(Marker：20bp DNA Ladder)。

8)BPB泳动至4/5胶长时即停止电泳。把胶放入新配制的染色液EtBr中进行染色。

9)用干净刀片，把目的片段切出。目的片段长度是RNA长度+PCR PrimerF+RT-Primer之和再用Sse8387I酶切后的片段长度(Sse8387 I酶将切去22bp)。例如：RNA长度为70mer，PCR片段长度为120bp；用Sse8387I酶切后的长度为98bp。

10)在0.5mL Microtube底部用18G的针扎一个孔，插入1.5mL或者2mL Microtube内，用封口膜等把配套的Microtube固定。

11)将切取的胶块放入配套好的0.5mL Microtube底部，4℃15,000rpm离心2min。通过本方法能把胶破碎，破碎胶将移至下部管的底部。如果0.5mL管底部还有胶残留，可以再离心2min。

12)取出0.5mL Microtube，在下部Microtube中加入50～100μL的1×MBuffer(10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，1mM DTT，50mM NaCl)。

13)25℃放置1小时(中间反复颠倒混合数次)。

14)把胶液加入SUPREC-01中，4℃15,000rpm离心2min，回收滤液后进行乙醇沉淀。

15)将纯化后的PCR Sse8387I酶切片段和50ng Pst I酶切后的Vector(pUC118 Pst I/BAP)适量混合后，加入等量的Solution I中(DNA LigationKit Ver.2.0)，Solution I请于冰中融解。16℃反应30分钟。

16)取连接液的一部分转化至E.coli JM109 Competent Cells中。

①全量(10μL)加入至100μL的JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。

②42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1-2分钟。

③加入890μL的SOC培养基，37℃振荡培养60-120分钟。

SOB培养基：

配制每升培养基，在950mL去离子水中加入：

胰化蛋白胨    20g

酵母提取物    5g

NaCl          0.5g

摇动容器使溶质完全溶解。加10mL 250mmol/L KCl溶液(将1.86gKCl用100mL去离子水溶解即配成250mmol/L KCl溶液)。用5mol/LNaOH调pH值至7.0。用去离子水定容至1L。在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min。该溶液在使用前，加入5mL灭菌的2mol/LMgCl2[2mol/L MgCl2溶液的配制方法如下：用90mL去离子水溶解19g MgCl2，用去离子水调整体积为100mL，在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min]。

SOC培养基：

SOC培养基除含有20mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同。SOB培养基经高压灭菌后冷至60℃或60℃以下，加20mL除菌的1mol/L葡萄糖溶液(1mol/L葡萄糖溶液的配制方法是：用90mL去离子水溶解18g葡萄糖，完全溶解后，用去离子水定容至100mL，用0.22μm滤器过滤除菌)。

④8000rmp，离心1min，轻轻吸去800μL上清液，留下约200μL上清液，用灭菌枪头重悬沉淀，将菌混匀，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，X-Gal)、异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(ISOPROPYL B-D-1-THIOGALACTOPYRANOSIDE，IPTG))、Amp的L-琼脂平板培养基上分两次涂板培养12～20h，形成单菌落。

LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基：

组份浓度

1％(W/V)          蛋白胨(Tryptone)

0.5％(W/V)        酵母提取物(Yeast Extract)

1％(W/V)          NaCl

0.1mg/mL          氨苄青霉素(Ampicillin)

0.5％(W/V)        IPTG

0.04mg/mL         X-Gal

1.5％(W/V)        琼脂粉(Agar)

配制量1L

配制方法：

a、称取下列试剂，置于1L烧杯中。

Tryptone          10g

Yeast Extract     5g

NaCl    10g

b、加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。

c、滴加5NNaOH溶液(约0.2mL)，调节pH值至7.0。

d、加水离子水将培养基定容至1L后，加入15gAgar。

e、高温高压灭菌后，冷却至60℃左右。

f、加入1mL Ampicillin(100mg/mL)、1mL IPTG(24mg/mL)、2mL X-Gal(20mg/mL)后均匀混合。

g、铺制平板(30～35mL培养基/90mm培养基)。

h、4℃保存平板。

⑤将平板用封口胶封住，放入4℃冰箱中显色1h，计数白色、蓝色菌落。

⑥用灭菌枪头挑选白色菌落放入已加入10μL灭菌超纯水的PCR管中，取1-2μL悬液作为模板，使用菌液PCR法等确认载体中插入片段的长度大小。

⑦取重组阳性菌落悬浊液5μL放入2mL SOC液体培养基(含Amp100ug/mL)，37℃、振荡培养12-20h。

17)涂平板后进行37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行PCR鉴定。PCR鉴定引物用BcaBEST^TM Sequencing Primers或M13Primers，不易产生假阳性。

18)经PCR鉴定后的阳性克隆经扩培后，培养的菌液(1mL左右)送上海Invitrogen公司进行测序。

测序结果：PCR鉴定得到的136个阳性单克隆的菌液，有111个阳性单克隆的菌液测序成功，其中有3个序列为重复序列，共测得108个不重复序列。

实施例2

采用本方法来研究猪的miRNA，分离回收了凝胶中两个不同区的cDNA单链，恢复为双链后再进行克隆测序。测序结果用BioEdit和RNAfold软件分析后，发现A区和B区克隆测序结果中发夹序列的比率明显不同。在A区的63个测序结果中，所有序列几乎全部为“三叶草”型二级结构，无一基本符合miRNA前体的发夹型二级结构标准。这说明，这一区的小RNA多不是miRNA前体。而在B区的45个测序结果中，共找到了5个基本符合miRNA前体发夹型二级结构的序列，但其他大部分序列仍不符合miRNA前体发夹型二级结构的定义要求(表1)。A区和B区的发夹结构序列数目经SPSS 13.0软件的卡方检验表明差异显著(P＜0.05)(N＝108，最小期望频数为2.08，2×2表格采用连续校正的卡方值为5.039，双尾P值为0.025＜0.05)。

表1A区和B区的单克隆测序结果对比

结果表明，这种方法完全可以将不同二级结构的小RNA cDNA单链分离回收，具有明显的效果。

Claims (1)

1.一种从小RNA合成的cDNA文库分离出microRNA前体cDNA的方法，包括以下步骤：将合成的cDNA进行PCR扩增，扩增后将PCR片段经限制酶酶切，克隆测序，其特征在于：该方法在进行PCR扩增之后、PCR片段酶切之前还需要对所获得的PCR产物进行具有microRNA前体片段的不同二级结构单链分离；所述分离过程包括以下步骤：

(1)将得到的cDNA片段用5’端带有生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增后得到的cDNA双链进行变性处理，然后用磁珠技术进行cDNA双链分离；

(2)对步骤(1)中得到的cDNA单链进行复性，得到具有microRNA前体片段的二级结构的cDNA；

(3)通过电泳分离步骤(2)中得到的cDNA，得到具有不同二级结构的单链cDNA，分别回收，进行PCR反应形成双链；

其中步骤(1)中PCR扩增引物为：F：5’-AAAGATCCTGCAGGTGCGTCA-3’，R：5’-GTCTCTAGCCGCAGGATCGATG-3’；

步骤(1)中的cDNA双链变性处理条件为95℃时5min；

步骤(2)中单链复性为在以下条件下依次进行：94℃时2min，60℃时30sec，72℃时1min，4℃时5min；

步骤(3)中电泳分离采用聚丙烯酰胺电泳或二维电泳，电泳结束后银染。

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