CN101903401A

CN101903401A - 抗体的稳定性试验

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Publication number: CN101903401A
Application number: CN2008801220745A
Authority: CN
Inventors: B·埃泽尔; H·科尔; J·T·雷古拉; P·松德尔曼
Original assignee: Roche Glycart AG
Current assignee: Roche Glycart AG
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-18
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2028-12-18
Also published as: JP5458020B2; WO2009080278A1; JP2011505849A; CA2709029A1; CN101903401B; EP2225273A1; EP2225273B1; ES2388017T3; US20100261216A1

Abstract

抗体是生物学大分子，其可能进行修饰和降解过程。本申请中描述了新的基于LC/MS的方法，该方法用于分离和表征抗体特异性降解产物，其包括酶消化步骤以应用IdeS酶切割重链。

Description

抗体的稳定性试验

背景信息

近年来制药工业领域在以酶、抗体和细胞因子(例如促红细胞生成素、干扰素、纤溶酶原激活物等)为基础的产品方面取得巨大成功。全世界对蛋白质治疗药物的需求逐年增加。治疗性单克隆抗体(mAbs，monoclonalantibodies)在蛋白质治疗中是重要一类。它们被称为单克隆，因为相对于多克隆抗体，它们是由衍生自单个抗体形成细胞的免疫细胞(细胞克隆)分泌的。单克隆抗体的特征在于它们每个仅直接对抗免疫原性物质的一个表位，从而仅对抗一个抗原决定簇，并且因此在治疗疾病中可以非常特异地应用。蛋白质治疗的实例是Roche Diagnostics GmbH Company(罗氏诊断有限责任公司)的单克隆抗体曲妥单抗(商品名：赫赛汀(Herceptin))、达珠单抗(商品名：赛尼哌(Zenapax))和利妥昔单抗(商品名：美罗华(MabThera))，它们已经成功地用于治疗乳腺癌(曲妥单抗)、器官排斥反应(达珠单抗)和治疗非霍奇金淋巴瘤(利妥昔单抗)。

治疗性单克隆抗体是通过复杂的生物技术方法获得的。降解产物可以在它们制备、配制和贮存过程中产生，这常常是由于例如氧化和脱酰胺反应以及蛋白酶剪切过程引起的(Yan，B.等人，J.Chromatog.A 1164(2007)153-161)。由于分子中结构改变，生物制品的修饰可能导致活性和/或免疫原性的改变，即使它们仅轻微发生。

除了它的作用之外，生物制药产品的质量是决定性重要的。因此，为了安全应用它们作为治疗药物，除了详细研究作用方式之外，测定基于蛋白质的药物的同一性、纯度和活性是完全必需的。

尽管mAbs可以通过多种分离和试验技术来成功分析，但是长期以来还难以应用和优化RP-HPLC方法(RP-HPLC，反相高效液相色谱法)来分离抗体种类。但是，抗体的多种修饰常常同时存在于降解过程中，这使得更难以分析不同色谱和电泳条带。通过液相色谱分离方法联用高分辨质谱仪(LC/MS，液相色谱法/质谱法)的分析获得了多种种类准确质量的信息，并且因此便于鉴定抗体变体(Dillon，T.M.等人，J.Chromatogr.A，1053(2004)299-305)。

从人病原体化脓链球菌中获得的半胱氨酸内切蛋白酶IdeS(免疫球蛋白降解酶S)，其也称为Mac-1或sib-38，是半胱氨酸蛋白酶，其特异性切割G型免疫球蛋白(IgG)抗体的重链。IgG是迄今为止仅仅已知的IdeS底物(Vincents，B.等人，Biochem.43(2004)15540-15549)。IdeS包含339个氨基酸，包括含29个氨基酸的信号肽(von Pawel-Rammingen，U.等人，EMBOJ.21(2002)1607-1615)，其中RGD基序是由214至216位氨基酸形成的。IdeS在识别序列LLGGP中的236和237位氨基酸(Gly-Gly)间切割人IgG(G类免疫球蛋白)。人IgG2在识别基序PVAGP中的丙氨酸和甘氨酸间被切割。IgG2a和IgG3型鼠抗体也被切割(Vincents，B.等人，Biochem.43(2004)15540-15549)。

Hess，J.K.等人(Hess，J.K.等人，J.Microbiol.Meth.70(2007)284-291)报道了质谱方法，其借助SELDI-TOF质谱法测定IdeS的酶活性。在US2007/0237784中报道了从化脓链球菌中分离并且具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性的多肽。在欧洲专利申请EP 1 458 861中报道了形成抗体的Fc或Fab片段的方法。在WO 2006/131347中报道了来自A组链球菌的IdeS蛋白酶。

发明概述

本发明描述了用于检测样品中抗体和抗体片段或抗体修饰形式的方法，其特征在于包括下列步骤：

a)提供包含抗体和/或其切割产物的样品，

b)将a)项中提供的样品与下列物质温育

i)IgG特异性半胱氨酸蛋白酶，

ii)糖苷酶，

iii)还原剂，

c)将b)项中温育的样品通过联用的液相色谱法和质谱法进行分析以检测a)项提供的溶液中包含的完整的抗体和检测抗体片段或修饰形式。

在该方法的一个实施方案中，IgG特异性半胱氨酸蛋白酶是IdeS。在进一步的实施方案中，半胱氨酸蛋白酶IdeS衍生自化脓链球菌或齿垢密螺旋体。在进一步的实施方案中，IgG特异性半胱氨酸蛋白酶具有氨基酸序列SEQ ID NO：1。另一个实施方案包括与IgG特异性半胱氨酸蛋白酶在pH范围为5.5至8.5之间温育。在另一个实施方案中，pH范围为pH 7.0至8.0之间，并且在进一步的实施方案中在pH 7.5至8.0之间。在进一步的实施方案中，IgG特异性半胱氨酸蛋白酶与样品中包含的抗体和/或抗体片段的摩尔比为1∶25至1∶2500之间、优选1∶25至1∶100之间。在另一个实施方案中，糖苷酶是N-糖苷酶F(PNGase F)。另一个实施方案的特征在于N-糖苷酶F衍生自脑膜炎脓毒性黄杆菌(EC 3.2.2.18、EC 3.5.1.52)。在另一个实施方案中是糖苷酶Endo H并且在pH 6.0至6.5之间应用。在另一个实施方案中，糖苷酶具有氨基酸序列SEQ ID NO：2。在另一个实施方案中，该方法的特征在于：将a)项提供的样品在b)项中首先与IgG特异性半胱氨酸蛋白酶温育，随后与糖苷酶温育。在另一个实施方案中，还原剂是磷酸三氯乙酯(TCEP)。在另一个实施方案中，还原剂与甲酸同时加入，并且温育在两种试剂的存在下进行。在进一步的实施方案中，与还原剂的温育在温度为60℃或更高下进行。在进一步的实施方案中，质谱法是电喷射离子化飞行时间质谱法(ESI-TOF)。在进一步的实施方案中，液相色谱法是疏水性相互作用色谱法或π-π相互作用色谱法。在疏水性相互作用色谱法的情况中，另一个实施方案中的色谱配体是C8或C18配体，其是键合至色谱材料上的，具有300埃的孔径，或者在π-π相互作用色谱法的情况中，色谱配体是二苯基配体。在进一步的实施方案中，将Jupiter C18柱或Zorbax 300SB C8柱或Pursuit二苯基柱应用于液相色谱法。在另一个实施方案中应用Pursuit二苯基柱。在进一步的实施方案中，步骤c)中的液相色谱法是反相色谱法。本发明的另一个方面是检测抗体修饰形式的方法，其中步骤c)是通过疏水性相互作用色谱法分析b)项中温育的样品。

本发明还包括IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶在检测样品中的抗体或抗体片段中的用途，其特征在于将样品与IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶温育，并且与糖苷酶温育后，将获得的片段通过联用的液相色谱法和质谱法分析。

本发明的一个方面还是用于检测抗体或抗体片段的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含

i)来自化脓链球菌的IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶，和

ii)来自脑膜炎脓毒性黄杆菌的内切糖苷酶N-糖苷酶F。

发明详述

本研究关注治疗性单克隆抗体的降解产物和修饰物的分析，其是例如在抗体的生产、抗体的贮存过程中或者通过抗体配制过程中的应激条件形成的。

“多肽”是包含由肽键连接在一起的氨基酸的聚合物。其可以是通过酶解或合成产生的。包含小于20个氨基酸的多肽也称为“肽”。

“蛋白质”是大分子，其包含两个或多个多肽，或者它是包含超过100个氨基酸的多肽。蛋白质也可以包含非肽组分，例如碳水化合物。碳水化合物和其它非肽修饰物是通过表达蛋白质的细胞加入的，并且因此取决于细胞类型。在本申请中，蛋白质是通过它们的氨基酸序列来定义的。修饰物(例如碳水化合物)没有明确描述，但是经常存在。

本申请中同义应用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”表示包含至少两条轻多肽链(LC)和两条重多肽链(HC)的分子。每条轻和重多肽包含可变区(通常是多肽的氨基端)，其包含结合抗原的结合域。每条重和轻多肽包含恒定区(通常是多肽的羧基端)，其例如负责抗体与细胞的结合。轻多肽或轻链(LC)通常包含可变域V_L和恒定域C_L。重多肽或重链(HC)通常包含可变域V_H和恒定区，恒定区包含结构域C_H1、铰链区、C_H2、C_H3和任选的C_H4。抗体可以以多种形式出现，例如Fv、Fab和F(ab)₂以及单链(scFv)(例如Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)5879-5883；Bird，R.E.等人，Science 242(1988)423-426；和Hood，L.E.等人，Immunology，Benjamin N.Y.，第2版(1984)以及Hunkapiller，T.和Hood，L.，Nature 323(1986)15-16)。取决于抗体重链恒定区的氨基酸序列，将抗体(免疫球蛋白，Ig)分为多个种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些种类中的一些进一步细分为亚类(同种型)，例如IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；或者IgA分为IgA1和IgA2。取决于抗体所属的类型，将重链恒定区称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。

通用色谱方法是本领域技术人员已知的，例如Chromatography(色谱)，第5版，A部：Fundamentals and Techniques(原理与技术)，Heftmann，E.(编辑)，Elsevier Science Publishing Company，New York，(1992)；AdvancedChromatographic and Electromigration Methods in Biosciences(生物科学中的高等色谱和电迁移方法)，Deyl，Z.(编辑)，Elsevier Science BV，Amsterdam，The Netherlands，(1998)；Chromatography Today(今日色谱)，Poole，D.F.和Poole，S.K.，Elsevier Science Publishing Company，New York，(1991)；Scopes，Protein Purification：Principles and Practice(蛋白质纯化：原理与实践)(1982)；Sambrook，J.等人(编辑)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；或Current Protocols inMolecular Biology(分子生物学最新方法)，Ausubel，F.M.等人(编辑)，JohnWiley & Sons，Inc.，New York。

抗体是可以进行修饰和降解处理的生物大分子。这些可以基于酶(催化)或非酶(非催化)处理(Perkins，M.等人，Pharm.Res.17(2000)1110-1117)。以下描述了经常出现的非酶降解反应的实例。

氨基酸的氧化

抗体的氧化相应于重链和轻链的氨基酸的共价修饰，其是由活性氧类别诱导的。原则上，即使几乎所有氨基酸可以被氧化，但是甲硫氨酸(M)和色氨酸(W)是对氧化最敏感的。这些氨基酸的氧化(参见图1)是特别值得注意的，因为这出现在非常多的不同蛋白质中，并且经常降低或消除它们的生物学活性，诱导聚集并且促进蛋白质水解(Houde，D.等人，J.Chromatogr.A 1123(2006)189-198)。对于氧化的类别，甲硫氨酸简单氧化成甲硫氨酸亚砜产生质量差Δm＝+16Da。色氨酸通常被氧化两次，其产生质量差Δm＝+32Da。在进一步的反应中，色氨酸的两次氧化形式常常重排为犬尿氨酸，产生质量差Δm＝+4Da。

氨基酸的脱酰胺

抗体分子中氨基酸的脱酰胺可以发生在天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)上。但是，通常是天冬酰胺受到影响。另外，某些氨基酸序列和氨基酸组合(例如天冬酰胺和甘氨酸(NG)、天冬酰胺和丝氨酸(NS)以及天冬酰胺和苏氨酸(NT))是特别易感的。天冬酰胺的脱酰胺是贮存过程中生物分子降解的主要原因。折叠的完整抗体的脱酰胺最初仅在应激增高的条件下缓慢发生。当抗体的三维结构被破坏后(例如还原和酶切割后)，脱酰胺将变得容易，因为在这些情况中氨基酸更易与周围介质反应(图2)。天冬酰胺可以形成中间产物形式的环状酰胺(琥珀酰亚胺)，该中间产物自发水解为比例约3∶1的异天冬氨酰肽和天冬氨酰肽的混合物(Chelius，D.等人，Anal.Chem.77(2005)6004-6011)。该反应优选在碱性pH值下发生。对于脱酰胺的类别，天冬酰胺脱酰胺成天冬氨酸(aspartate)和异天冬氨酸(isoaspartate)的结果是出现质量差Δm＝+1Da。在分子量大于10kDa的肽和蛋白质的情况中，应用目前的质谱仪不可能或很难直接检测到Δm＝+1Da的质量差。另外，电荷分布的变化出现更准确的电荷异质性。

硫醚键的形成

非还原性硫醚键的形成是在单克隆抗体，特别是亚类IgG1中经常观察到的现象。这是基于二硫键中硫原子的丢失，二硫键将抗体的重链和轻链连接在一起或者稳定分子内轻链和重链。抗体的这种修饰在应激增高的条件下和特别是在pH值升高的情况中容易发生。认为该反应是β-消除(Cohen，S.L.等人，J.Am.Chem.Soc.，129(2007)6976-6977)。因为硫原子是在硫醚键形成过程中丢失的，所以对于非还原性修饰的抗体类别，这导致Δm＝-32Da的质量差。与之相反的是，该二硫键(S-S)在抗体的还原过程中被切割成两个SH基团。因此，还原的抗体组分产生的质量差Δm＝-34Da。

片段的形成

应激诱导的断裂反应通常基于蛋白质的多肽链(例如抗体的重链和轻链)中肽键的水解切割。蛋白质水解和肽键的水解原则上可以在所有的氨基酸之间发生，特别是如果易于水解的其它氨基酸存在空间张力或侧链。

_{抗体的特异性切割}

单克隆抗体是非常大的蛋白质，并且由于它们重链的糖结构，它们是非常不均一的(微观不均一性)。为了检查抗体形成的降解产物和修饰物，在分析前将它们切割成更小的片段，这是有利的。因此，作为样品制备的一部分，抗体的切割是进行分析研究的重要方法。在大多数情况中，通过还原二硫键，简单地将抗体分解为其重链和轻链。但是除此之外，还有用于切割抗体的其它方法。

二硫键的切割

IgG分子中出现的所有二硫键可以通过还原来切割。在还原过程中获得游离的抗体的重链和轻链。三(2-羧基乙基)-膦(TCEP)是常用的还原剂，因为抗体所有的二硫键在短时间内完全被切割，并且还原在整个pH范围内均可发生(参见例如Hau，J.C.和Hau，C.Y.，Anal.Biochem.220(1994)5-10)。在一个实施方案中，pH范围从1.5至8.5。二硫苏糖醇(DTT)也具有快速切割二硫键的特征。但是，DTT还原在酸性环境中进行很慢。为了完全分离重链和轻链，变性步骤通常是必要的。变性还使得二硫基更易受影响。变性可以例如借助盐酸胍或甲酸来进行。

酶切割

木瓜蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)相对非特异地切割精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)和酪氨酸(Y)之后的肽键。如果温育时间足够长，木瓜蛋白酶消化导致完全水解。但是，抗体可以在它们的铰链区通过限制性蛋白水解相对特异地被切割(Lottspeich，F.和Engels，J.W.，“Bioanalytik Spektrum Akademischer Verlag”Munich第2版(2006)201-214)。切割发生在将两条重链连接在一起的二硫键的N-端侧。二硫键在该过程中是得到保留的，从而在消化后获得三个片段(2个Fab片段、1个Fc片段)。两个N-端片段被称为抗原结合片段(Fab，抗原结合片段)，C-端片段被称为结晶片段(Fc，结晶片段)。每个Fab片段包含完整的轻链和氨基-端的半个重链。Fc片段包含两个仍然通过二硫键连接在一起的羧基-端的半个重链。

IdeS消化

IdeS(化脓链球菌的免疫球蛋白G-降解酶)是细胞半胱氨酸蛋白酶，其可以从致病菌化脓链球菌中分离。该酶直接在识别序列GPSVFLFP前高特异性切割人IgG。该序列位于IgG铰链区的将两条重链(HC)连接在一起的二硫键的C-端侧。切割产生两条重链的C-末端(2个HC-Fc片段)和Fab”片段，Fab”片段来自通过二硫键连接的轻链和重链的Fab片段的臂(图3)(von Pavel-Rammingen，U.等人，EMBO Journal 21(2002)1607-1615)。

如果将抗体的IdeS片段在消化之后用DTT或TCEP还原，那么获得两条抗体的轻链(2LC)和重链的N-端片段(2HC Fab)，而不是Fab”片段。重链的C-末端(HC-Fc)不受还原的影响。

去糖基化

N-糖苷酶F是所谓的内切糖苷酶并且在多肽链和近端的N-乙酰基葡糖胺残基之间完全切割糖蛋白(例如抗体的重链)的糖结构。

为了简化非常复杂的质谱图，这些质谱图通常是在分析多种蛋白质和肽类组分中通过预分离组分获得的，通常将质谱仪与液相色谱法组合(LC/MS)操作。为了这个目的，在质谱分析之前，根据它们的组成将高效HPLC系统用于分离溶解物质的混合物。分析混合物的色谱分离的结果是，组分在不同时间离开分离柱，并且这样可以通过质谱法按洗脱顺序进行分析。

洗脱图每个峰的质谱图是通过色谱法与质谱法联用而获得的。这样的优势在于不会获得分析物溶液中所有组分的复杂的整体图谱，而是在理想的情况下获得分离的组分的单一图谱。

电喷雾方法(ESI)是经常应用的电离方法，用于将溶解的分子转化为质谱法中的气体离子。这是通过将液体分散在静电场中获得的(电喷雾)。在这个过程中形成了很多细小的带电微滴，其包含分析物分子。

高度带电离子的形成是ESI方法的特征。因此，在确定的蛋白质类别的质谱图中，观察到完整系列的离子信号，根据它的分子量每个具有Δz＝1的电荷差(通常在正电荷模式中加上一个质子或在负电荷模式中减去一个质子)。蛋白质的图谱表现为分子离子的近似钟形的电荷分布的特征。最大的分布取决于ESI质谱仪的参数、溶剂的pH和蛋白质的变性状态。切割二硫键后并且作为变性的结果，蛋白质变成在空间上更展开的结构，从而分子可以接受(或释放)更多的电荷。因此，最大的电荷分布可以变成更高(更低)的电荷。

多电荷分子离子的电荷的数目n和分子量(M)可以通过电荷分布中任何两个相邻分子离子(m₂＞m₁)的测量的m/z比值(m)来计算：

式1：

m_{1} = \frac{M + nX}{n}

式2：

m_{2} = \frac{M + (n - 1) X}{(n - 1)}

在该等式中，X是电荷载体的质量，即对于加上一个质子X＝1(在正电荷模式中)和对于减去一个质子X＝-1(在负电荷模式中)。n的数值可以通过计算出变量n并且合并式1和2来计算：

式3：

n = \frac{m_{2} - X}{m_{2} - m_{1}}

分子离子的分子量可以通过计算出式2中的M并且通过应用式3中n的计算结果来计算：

式4：M＝n(m₁-X)

谱图通过是借助计算机程序来分析的，其可以用于测量所有信号或单独选择信号的分子量。因此获得所谓的重构，其表示对相应的分子量范围重新计算的给定的谱图(去卷积谱)。现在分子量可以直接从计算的峰上读出。

现在令人惊讶地发现用先前应用的方法出现的问题可以通过应用本发明方法来预防。还令人惊讶地发现应用酶IdeS对实现抗体的LC/MS分析是有利的。

因此，本发明的第一方面是检测样品中抗体和抗体片段以及抗体的修饰形式的方法，其特征在于包括下列步骤：

a)提供包含抗体和/或其切割产物和/或抗体的修饰形式的样品，

b)将a)项中提供的样品与下列物质温育，

i)IgG特异性半胱氨酸蛋白酶，

ii)糖苷酶，

iii)还原剂，

c)将b)项中温育的样品通过联用的液相色谱法和质谱法进行分析以检测a)项提供的溶液中包含的完整的抗体和检测抗体片段。

提供的样品可以例如是包含抗体的溶液，例如冻干的抗体制剂的重构溶液。修饰的抗体分子在贮存和冻干的过程中在该溶液中形成。其中这些修饰是单个氨基酸的氧化和脱酰胺、硫醚键的形成和抗体片段的形成。

本发明的方法包括将样品与不同的试剂温育。这些试剂用于将样品中包含的抗体分子和抗体片段分子转化为确定的片段。在该方法的一个实施方案中，第一个温育步骤是用IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶IdeS切割分子，优选来自化脓链球菌或齿垢密螺旋体的IdeS。在进一步优选的实施方案中，IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶具有氨基酸序列SEQ ID NO：1。在一个实施方案中，与IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶的温育在pH范围从pH 5.5至8.5之间进行。在一个实施方案中，温育在pH范围从pH 7.0至8.0之间。还发现IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶与抗体分子(包括抗体片段分子)的摩尔比应该在1∶25至1∶2500之间，在优选的实施方案中，在1∶25至1∶100之间。

在该方法的一个实施方案中，第二个温育步骤是用糖苷酶切割抗体片段的碳水化合物。在一个实施方案中，糖苷酶选自N-糖苷酶F、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶H、乙酰基-神经氨酰基(neuraminyl)水解酶或O-糖肽内-D-半乳糖基-N-乙酰基-a-半乳糖氨基水解酶。在一个实施方案中，糖苷酶是N-糖苷酶F，也称为PNGase F。在一个实施方案中，N-糖苷酶F衍生自脑膜炎脓毒性黄杆菌。在一个实施方案中，糖苷酶是内切糖苷酶F2，也称为Endo F2。在另一个实施方案中，内切糖苷酶F2衍生自脑膜炎脓毒性黄杆菌或脑膜脓毒性金黄杆菌。在另一个实施方案中，糖苷酶是内切糖苷酶H，也称为Endo H。在另一个实施方案中，内切糖苷酶H衍生自褶皱链霉菌(Streptomyces plicatus)。在另一个实施方案中，糖苷酶是乙酰基-神经氨酰基水解酶，也称为神经氨酸酶。在另一个实施方案中，乙酰基-神经氨酰基水解酶衍生自产气荚膜菌。在另一个实施方案中，糖苷酶是O-糖肽内-D-半乳糖基-N-乙酰基-a-半乳糖氨基水解酶，也称为O-糖苷酶。在一个实施方案中，O-糖肽内-D-半乳糖基-N-乙酰基-a-半乳糖氨基水解酶衍生自肺炎链球菌。在另一个实施方案中，糖苷酶是EC 3.2.218或EC 3.5.1.52或EC 3.2.1.96或EC 3.2.1.18或EC 3.2.1.97。在进一步的实施方案中，糖苷酶具有氨基酸序列SEQ ID NO：2。

首先将提供的样品与IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶温育，随后用糖苷酶处理，这是有利的。

在第三步中，将二硫键通过加入还原剂并且优选加入磷酸三氯乙酯(TCEP)来切割。在一个实施方案中，甲酸是与还原剂同时加入的。

液相色谱法和质谱法的组合用于分析获得的确定的抗体片段。单个片段是通过液相色谱法分离的，随后可以通过质谱法测定。在一个实施方案中，质谱法是电喷雾电离-飞行时间质谱法(ESI-TOF)。在一个实施方案中，液相色谱法是疏水相互作用色谱法或π-π相互作用色谱法。在疏水相互作用色谱法的情况中，在一个实施方案中，色谱配体是C8或C18配体，其位于300埃孔径的色谱材料上；或者在π-π相互作用色谱法的情况中，将二苯基配体用作色谱配体。在一个实施方案中，Jupiter C18柱或Zorbax300SB C8柱或Pursuit二苯基柱，在优选的实施方案中，Pursuit二苯基柱用于液相色谱法。

本发明还关注IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶在检测样品中的抗体或抗体片段中的用途，其特征在于将样品与IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶温育，并且在与糖苷酶温育后将获得的片段通过联用的液相色谱法和质谱法分析。

本发明的另一个方面是用于检测抗体或抗体片段的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含

i)来自化脓链球菌的IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶IdeS，和

ii)来自脑膜炎脓毒性黄杆菌的内切糖苷酶N-糖苷酶F。

为了优化IdeS消化的温育条件，首先试验减小酶∶抗体比例和温育时间。对于实际的原因，最短可能的温育时间和最小可能的酶∶抗体比例是需要的，因为消化的抗体分析物溶液中存在的酶组分可能在获得的质谱图中引起干扰信号。为了避免这种情况，用于抗体消化的酶的量应该尽可能少。同时必须确保抗体分子在消化后完全被切割。为了另外获得最高可能的样品处理量和优化试验时程，应该缩短温育时间同时确保完全消化。消化制备物的凝胶电泳分离的结果(参见图7)显示相应于IdeS切割的预期产物的两条主带(约100kDa和约25kDa)在所有消化条件下都能形成。分子量约100kDa的更大的主带相应于预期的抗体Fab”部分，其包含两条轻链(LC)和重链(HC)的Fab片段。分子量约25kDa的更小的主带是预期的HC的Fc片段。消化制备物的凝胶电泳分离的结果显示酶∶抗体的比例对IdeS消化具有更显著的影响。关于多种制备物的IdeS消化的效率，SDS-PAGE的结果显示在1∶50的酶∶抗体比例以及0.5小时和1小时的温育时间下仍然出现极小强度的完整抗体(2HC/2LC)的带(参见图7A，泳道6和9)。在相同的酶∶抗体比例以及2小时和5小时的温育时间下(参见图7B，泳道6和9)，完整抗体分子的带已经消失。因此优选的温育时间是在2小时至5小时之间，并且特别优选2小时。结果还显示18小时的温育时间和1∶50、1∶500、1∶2500、1∶10000的酶∶抗体比例与在相同酶∶抗体比例下5小时的温育相比没有差异。因此优选1∶25至1∶100的酶∶抗体比例。特别优选1∶50的酶∶抗体比例。

基于LC/MS的方法包括样品制备方法，该方法特别适于分离和检测应激诱导的降解产物。原则上存在四种可能的样品制备变通实施方案：

1.仅还原抗体；

2.去糖基化，随后还原抗体；

3.IdeS消化，随后还原抗体；

4.去糖基化，随后IdeS消化和还原抗体。

结果表明仅还原抗体的制备(变通实施方案1)和IdeS消化并且还原的抗体的制备(变通实施方案3)不适合抗体溶液的LC/MS分析，因为重链的糖结构而获得异质(heterogeneous)的图谱，这降低了LC/MS测量的灵敏度并且使得分析更加困难。

令人惊讶地发现IdeS-消化、去糖基、还原的样品制备优于去糖基、还原的样品制备，因为获得了更小的抗体片段，这些更小的抗体片段对LC/MS测量的质量分辨率具有正面影响，并且允许另外存在位于并归属为抗体的HC-Fc或HC-Fab部分的修饰。另外，由于重链的切割，可能放大应激诱导的修饰的作用，这可能发生在片段的色谱行为上，以便改善它们彼此的分离。同时应用两种酶IdeS和N-糖苷酶F不会产生任何问题。

由于实际原因，首先用IdeS消化抗体，然后去糖基化，这是特别有利的。由于实际原因，以该方式改变方法并且对分析结果没有显著影响。在加入TCEP溶液的同时加入甲酸，即甲酸和TCEP溶液均是在温育前加入的，因此两种组分存在于单个温育过程中。

为了明确并且简单地检测和定量形成的抗体溶液的降解产物，分离各自的降解类别是有利的。分析物溶液的分离质量特别受到固定相色谱性能的显著影响。色谱分离的质量是根据各自柱子的峰分辨率和峰锐度来评估的。

当选择柱时，为了分离，除了柱基质的极性之外其它重要参数必需考虑，例如粒度应当尽可能小，以获得最高可能的塔板数。另外，应当记住的是，抗体是非常大的分子。因此，当选择适合的柱时，基质颗粒的孔径也发挥决定性作用。基质颗粒的孔越大，越易于抗体组分扩散到孔里，从而改善分离。

与用作参比柱的Jupiter C18柱相比，在所用的色谱条件下，应用Vydac C4柱没有获得降解产物有效的分离改善。与Jupiter C18柱相比，Zorbax 300SB C8具有不同的色谱选择性，同时对于分离多种抗体片段获得较好的结果。相反，Pursuit二苯基柱表现出改善的分离结果。与JupiterC18柱的分离图相比，该柱的分离图显示出更多的峰和肩峰，这些峰在洗脱图中具有良好的分辨率和可接受的峰锐度。因此，该柱优选用于分离根据本发明方法获得的抗体的降解产物。

通过下列实施例、文献参考和图进一步说明本发明。实际的保护范围来自本发明附属的权利要求。

本发明是通过下列基于抗体实例(mAb IGF-1R)的实施例来描述的。这不构成本发明的限制，而仅旨在说明。

抗体(优选单克隆抗体)的实例是抗IGF-1受体的抗体(mAb IGF-1R)，例如WO 02/053596、WO 2004/071529、WO 2005/016967WO 2006/008639、US 2005/0249730、US 2005/0084906、WO 2005/058967、WO 2006/013472、WO 2006/00181、US 2003/0165502、WO 2005/082415、WO 2005/016970、WO 03/106621、WO 04/083248、WO 2003/100008、WO 2004/087756、WO 2005/005635、WO 2005/094376和WO 2007/115814中所描述的。

附图描述

图1：作为实例的甲硫氨酸(a)和色氨酸(b)的氧化反应(参见例如Taylor，S.等人，J.Biol.Chem.278(2003)19587-19590)。

图2：天冬酰胺的脱酰胺并且异构化为天冬氨酸；在碱性条件下(pH＞8)优选途径I，在酸性条件下(pH＜5)优选途径II。

图3：IgG1抗体的IdeS消化的示意图。

图4：在40℃下温育并且在-80℃下贮存的抗体的凝胶电泳分离结果

泳道1-样品缓冲液；

泳道2-分子量标准；

泳道3-样品缓冲液；

泳道4-未还原的标准；

泳道5-未还原的抗体(-80℃)；

泳道6-未还原的抗体(30天/40℃)；

泳道7-样品缓冲液；

泳道8-还原的标准；

泳道9-还原的抗体(-80℃)；

泳道10-还原的抗体(30天/40℃)；

泳道11-样品缓冲液；

泳道12-样品缓冲液。

图5：应激的抗体(1：40℃，30天)和未应激的抗体(2：-80℃)以及在40℃下温育的安慰剂缓冲液(3)叠加的SEC色谱图。

图6：应激的抗体(1：40℃，30天)和未应激的抗体(2：-80℃)溶液以及在40℃下温育的安慰剂缓冲液(3)的离子交换色谱法的色谱图。

图7：在多种酶与抗体比例(1∶50-1∶1250)和多种温育时间(0.5小时-5小时)下IdeS消化的抗体的分离：

泳道编号-凝胶A-凝胶B：

1-样品缓冲液-样品缓冲液；

2-分子量标准-分子量标准；

3-标准-标准；

4-未消化的抗体-未消化的抗体；

5-样品缓冲液-样品缓冲液；

6-1:50，0.5小时-1:50，2.0小时；

7-1:125，0.5小时-1:125，2.0小时；

8-1:1250，0.5小时-1:1250，2.0小时；

9-1:50，1.0小时-1:120，5.0小时；

10-1:125，1.0小时-1:125，5.0小时；

11-1:1250，1.0小时-1:1250，5.0小时；

12-样品缓冲液-样品缓冲液。

图8：应激的抗体和未应激的抗体在Jupiter C18标准柱(A)和Pursuit二苯基柱(B)上的叠加洗脱图。

图9：应激的抗体(1)和未应激的抗体(2)在Pursuit二苯基柱上的叠加洗脱图。

实施例1

材料与方法

本研究中用于试验的抗体是IgG1型人重组抗体。该抗体在CHO细胞中表达并且通过亲和色谱法和多种离子交换色谱法步骤纯化。

热应激

将约22mg的IgG1抗体通过在10mM Tris/HCl缓冲液(pH 8.5)中透析来更换缓冲液。将一部分更换缓冲液的抗体溶液在40℃下温育30天。将其它部分冻存在-80℃下作为对照。

透析

为了透析，将1.5mL抗体溶液(c＝14.6mg/mL)转移至slide A-Lyzer透析盒(容量：0.5-3mL，分子量排阻大小：10kDa)并且悬挂在透析缓冲液中。透析过程中连续搅拌缓冲液并且保持在约8℃下。为了确保最完全可能的缓冲液交换，在透析过程中数次更新透析缓冲液。表1显示更换缓冲液的时间表。

表1：更换抗体溶液的缓冲液的透析表

完全透析后，将抗体溶液从slide A-Lyzer透析盒转移至5mL反应容器中。透析的抗体溶液的体积通过在分析天平(AT261 Delta Range，Mettler-Toledo)上称重来测量。

灭菌过滤

透析后，将抗体溶液在低微生物水平条件下经Minisart单个注射器式滤器(0.2μm，Sartorius)过滤灭菌。测定样品浓度的取样页在低微生物水平条件下进行。

抗体浓度的测定

抗体浓度通过在Uvikon XL型分光光度计(Goebel Company)上测量280nm处的吸收来测定。所用的抗体的消光系数是1.55mL·mg^-1·cm^-1并且是根据Pace，C.N.等人(Protein Sci.4(1995)2411-2423)的方法来计算的。

SDS-PAGE

抗体溶液通过凝胶电泳分离，应用Power Ease 300电泳仪和InvitrogenCompany的凝胶、缓冲液和其它试剂。将Tris-甘氨酸4-20％梯度凝胶用于分离。将Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液(10×)用作运行缓冲液，应用前将其用二次蒸馏水按1∶10(v/v)稀释。

将已经在40℃下温育和在-80℃下贮存的抗体溶液在还原和未还原的条件下应用。为了测定待测样品的相对分子量，将5μL的Mark 12^TM蛋白质标志物也应用于凝胶中作为参考。电泳分离在125V电压下进行并且运行时间约95分钟。凝胶电泳后，根据供应商的说明将凝胶在Simply BlueSafe Stain(考马斯G 250染色液)中染色。随后，将凝胶在二次蒸馏水中脱色。

将染色的凝胶用Dry-Ease微型玻璃纸和干燥溶液(10％甘油(v/v)、40％甲醇(v/v)、10％乙酸(v/v)、40％水(v/v))保存。为了这个目的，将凝胶在干燥溶液中温育5分钟，并且加入两张玻璃纸后再温育10分钟。然后将除去气泡的凝胶放置在玻璃纸之间并且在固夹框中干燥。

对于未还原SDS-PAGE，将抗体溶液用10mM Tris/HCl缓冲液(pH 8.5)稀释至浓度约1mg·mL^-1。随后，将10μL(相应于10μg抗体)的稀释的抗体溶液与10μL的SDS样品缓冲液(2×)以1∶2(v/v)的比例混合，混合并且最后短暂离心。将样品在70℃下变性10分钟。然后将它们再次短暂离心。为了电泳分离，将16μL(相应于8μg抗体)的变性的样品应用于凝胶中。除了蛋白质标志物之外，应用稀释至浓度1mg·mL^-1并且随后用与抗体样品相同的方法处理的抗体参考标准品(c＝16.5mg·mL^-1)作为参考。

对于还原SDS-PAGE，也将抗体溶液用10mM Tris/HCl缓冲液(pH 8.5)稀释至浓度1mg·mL^-1。DTT(二硫苏糖醇)用于还原溶液。为了确保抗体的完全还原，将DTT溶液以100mM的浓度配制在SDS样品缓冲液(2×)中。随后将10μL(相应于10μg抗体)的稀释的溶液与10μL 2×SDS样品缓冲液+100mM DTT以1∶2(v/v)的比例混合，混合并且短暂离心。将样品在70℃下变性10分钟。然后将它们再次短暂离心。为了电泳分离，将16μL(相应于8μg抗体)的变性的样品应用于凝胶中。除了蛋白质标志物之外，应用稀释至浓度1mg·mL^-1并且随后用与抗体样品相同的方法处理的抗体参考标准品(c＝16.5mg·mL^-1)作为参考。

尺寸排阻色谱法(SEC)

根据组分的大小将Tosoh Bioscience Company的TSK凝胶G3000SWXL凝胶过滤柱(7.8×300mm；5μm，250

)用于色谱分离抗体溶液的组分。分离在Shimadzu-HPLC系统上进行。将样品组分用200mM磷酸钾、250mM氯化钾缓冲液(pH 7.0)以0.5mL·min^-1的流速并且历经30分钟等度洗脱。将TSK凝胶G3000 SWXL凝胶过滤柱的温度在分离过程中维持在25℃不变。自动进样器的温度是6℃。将样品组分在280nm波长下用二极管阵列检测器检测。

离子交换色谱法(IEC)

将Agilent Company的弱阳离子交换柱SynChropak WCX(4.6×250mm，6μm，300)用于离子色谱分离抗体溶液的组分。分离在ShimadzuHPLC系统上进行。将样品组分通过洗脱液A(10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0)和洗脱液B(10mM磷酸钠缓冲液，750mM氯化钠缓冲液，pH 7.0)的二元梯度系统在1mL·min^-1的流速并且55分钟的运行时间下洗脱。洗脱分布如表2所示。将SynChropak WCX阳离子交换柱的温度在分离过程中维持在25℃不变。自动进样器的温度是6℃。将样品组分在280nm波长下用二极管阵列检测器检测。

表2：通过IEC分离抗体溶液的梯度分布

实施例2

热应激

为了加速单克隆抗体的降解产物和修饰物的形成，将其在温育器(Venticell，MM-Medcenter)中进行规定的热应激。对于温育，将透析的抗体溶液在40℃下温育30天。另外，将250μL的抗体溶液分成10μL等份并且在-80℃下贮存。这些用作零点对照。

30天后，将进行热应激的各等份从温育器中取出并且目测微生物感染。将取出的各等份倾倒入在反应容器中，以获得均匀的应激的分析溶液。均一化通过仔细混合抗体溶液来进行(MS2微型混合器，IKA，Staufen)。将均匀的抗体溶液分成20μL等份并且在-80℃下贮存。

为了液相色谱法和质谱法分析，将约22mg抗体(c＝14.6mg·mL^-1)在10mM Tris/HCl缓冲液(pH 8.5)中更换缓冲液并且随后在40℃下温育30天。

热温育的安慰剂缓冲液的制备

为了在随后分析中确定因在40℃下贮存引起的抗体溶液观察到的变化不是归因于缓冲液的变化，将两个15mL等份的10mM Tris/HCl缓冲液在低微生物水平条件下通过过滤灭菌，并且也在40℃的温育器(Venticell，MM-Medcenter)中温育30天。随后的操作如抗体溶液那样进行。

热温育溶液的凝胶电泳分析

在40℃下温育并且在-80℃下贮存的抗体的凝胶电泳分离结果如图4中所示。在40℃下温育导致聚集物和抗体分子片段的形成(泳道6和10)。未温育的抗体样品在非还原条件下表现出典型的IgG1分子带型(参见泳道4和5)。主带相应于包含两条重链(HC)和两条轻链(LC)的完整抗体。对于没有完全保持结构的抗体类别，还能观察到其它条带。这些条带是缺乏轻链的2HC/LC类别、半抗体(HC/LC)、游离的重链(HC)和游离的轻链(LC)(参见泳道4和5)。

该典型的带型还主要出现在40℃下温育的非还原的抗体样品中(参见泳道6)。主带也是完整抗体(2HC/2LC)。在比-80℃下贮存的抗体样品更高的强度下，其它条带还出现在多种非完整抗体类别中(2HC/LC、HC/LC、HC、LC)。在应激的样品中还形成范围从约90kDa至＞200kDa的其它条带(参见泳道6)。低于主带出现的类别是抗体片段，并且高于主带的那些是聚集物。

对于LC/MS分析特别有意义的两条带出现在约21kDa区域(参见泳道6)。这是非共价的Fab片段，其中HC Fab片段(AA 1-220)和LC不是通过二硫键连接在一起的，而是通过非共价相互作用(离子相互作用、氢键、偶极-偶极相互作用、范德华力)连接在一起。由于样品是在变性条件下应用于凝胶的，HC Fab和LC在凝胶中以单带出现(参见泳道6)。在该组合中，凝胶中较高带是LC(LC^*)并且较低带是HC Fab片段(Cohen，S.L.等人，J.Am.Chem.Soc.，129(2007)6976-6977)。包含第二个Fab片段和Fc片段的残留的抗体可以归属为在97kDa和116kDa区域中弱强度出现的条带(参见泳道6)。

在还原条件下分离的主带是重链(HC)和轻链(LC)(参见泳道8、9和10)。除了两条主带之外，在未应激的抗体样品中，在范围约97kDa和120kDa之间出现较低强度的两条其它条带。这些是共价、未还原的聚集物(参见泳道8和9)。

在40℃下温育的抗体溶液显示出与未温育的抗体溶液相同的带型(参见泳道10)。在未应激的样品的情况中归属为未还原的类别的两条带在应激的样品中没有出现非常高的强度(参见泳道10)。在应激的抗体溶液中，除了已经提到的类别(HC、LC和两条共价、未还原的条带)之外，在约30kDa至200kDa范围内出现大量的其它条带。这些是还原的共价聚集物、未还原的类别和还原类别的片段(参见泳道10)。

在凝胶约90kDa至95kDa处出现并且可以归属为半抗体的未还原的聚集物类别的条带对于LC/MS分析是特别有意义。温育的结果是该条带的强度显著增加。该条带强度增加最可能是由于硫醚类别的形成。该类别是实际质量75kDa的半抗体分子，它的HC和LC不是通过二硫键连接在一起的，而是通过未还原的硫醚键连接的(Tous，G.I.等人，Anal.Chem.77(2005)2675-2682)。

热温育溶液的SEC分析

尺寸排阻色谱法(SEC)给出了应激诱导的片段和聚集物形成的概观。由于SEC是在天然条件下进行的，在分析中检测共价以及非共价聚集物。为了建立降解产物的形成和在40℃下温育之间的关系，除了应激抗体溶液之外，还分析在-80℃下贮存的未应激样品。

图5显示了在40℃下温育的安慰剂缓冲液、在40℃下温育的抗体和在-80℃下贮存的抗体的SEC结果。在每种情况中，将50μL或50μg抗体用于分析。分子量标准的分析结果作为测定抗体溶液组分的分子量大小的参考。它们列于表4中。表3显示了洗脱图中多种抗体类别的百分数。计算的百分数是基于某个类别的不同峰面积占出现的所有峰的面积总和的比例。

表3：应激和未应激抗体的SEC评价

表4：分子量标准的SEC色谱分离结果

应激抗体类别的洗脱图与SDS-PAGE的结果相关。SEC的结果也显示聚集物已经形成并且抗体在温育过程中已经降解(参见图5)。

保留时间约15-16.5分钟的主要类别(其可以归属为完整的抗体)在40℃下温育过程中从占总面积的约96％减少至72％(参见表3)。根据分子量标准，主要类别的保留时间(RT 15-16.5分钟)相应于分子量约150kDa(参见表4)。分子量＞158kDa的聚集物(参见表4)在约12-14.5分钟的时间窗口中洗脱。在40℃下温育的结果是，具有该洗脱时间的峰从占总面积的约3％增加至约12％(参见表3)。明显的肩峰在应激抗体洗脱图的主要类别峰的减少区域(RT约16.5-18分钟)中形成，其具有约11％的面积比例并且其在-80℃下贮存的抗体溶液中不会出现这种情况(参见图5)。在肩峰区域洗脱的抗体类别具有分子量约70kDa至120kDa(参见表4)。这些是例如半抗体(HC/LC)、失去轻链的抗体(2HC/LC)和Fab+Fc片段的类别。在保留时间约19-20分钟处还看到另一个峰，其可以归属为分子量在约20kDa至40kDa之间(参见表4)。非共价Fab片段的重链(HC)和轻链(LC)以及HCFab在这个时间窗口内洗脱。在40℃下温育的结果是，该峰从占总面积的约1％增加至5％(参见表3)。

在40℃下温育的安慰剂缓冲液与在40℃下温育的抗体溶液的洗脱图的比较表明缓冲液的温育没有出现峰。

热温育溶液的IEC分析

离子交换色谱法(IEC)适用于检测由于抗体分子的修饰引起的电荷变化。

为了能够鉴定抗体中应激相关的变化，除了在40℃下温育的抗体之外，还应用在-80℃下贮存的未应激的抗体。

图6表示在40℃下温育的应激和未应激抗体溶液以及安慰剂缓冲液的离子交换色谱法中获得的色谱图。在每种情况中将50μL或25μg抗体用于分析。洗脱图中多种类别的百分数显示在表5中。计算的百分数表示某个类别的不同峰面积占出现的所有峰的面积总和的比例。

表5：应激和未应激抗体的IEC评价

在-80℃下贮存的抗体与在40℃下温育的抗体的洗脱图的比较表明电荷显著位移至酸性范围是由温育诱导的(参见图6)。因此主要类别(保留时间RT约22-25分钟，其可以归属为完整抗体)的峰强度从占总面积的约61％显著地减少至约40％(参见表5)，然而洗脱图中酸性范围(RT 12-18分钟)的峰强度显著增加(从占总面积的约8％增加至约44％)。在未应激抗体样品的碱性范围(RT 26-32分钟)内看到的肩峰在40℃温育的过程中完全消失(参见图6)。相反，在应激抗体溶液的情况中，主峰(RT 19-22分钟)酸性部分的肩峰强度增加。在该情况中，面积从占总面积的约5％增加至约17％(参见表5)。在40℃下温育的安慰剂缓冲液与在40℃下温育的抗体溶液的洗脱图的比较表明缓冲液的温育没有出现峰。

抗体温育诱导的电荷位移至酸性范围通常主要是由于脱酰胺反应。在脱酰胺中，氨基被羟基代替，而羟基将额外的负电荷引入至分子中。IEC色谱图的结果表明由于在40℃下温育，脱酰胺和其它的电荷变化高度发生。

实施例3

IdeS消化的优化

酶IdeS以1mg/mL的浓度存在于50mM Tris/HCl缓冲液(pH 8.0)中。制备包含三个不同IdeS浓度的稀释系列，用于将酶加入至消化溶液中。预稀释液(V)中IdeS的终浓度是0.1mg·mL^-1(V1)、0.01mg·mL^-1(V2)和0.001mg·mL^-1(V3)。稀释应用50mM Tris/HCl缓冲液(pH 8.0)实现。

待分析的抗体是以15.5mg/mL的浓度存在于组氨酸-缓冲液，pH 6.0中。将抗体溶液用50mM Tris/HCl缓冲液(pH 8.0)稀释至浓度为c＝5mg·mL^-1，用于加入至消化溶液中。

制备消化溶液的吸量流程在表6中列出。

表6：制备IdeS消化溶液的吸量流程

将制备的消化溶液在37℃下温育0.5、1.0、2.0和5.0小时。制备没有加入酶的抗体溶液，作为零对照。对于对照溶液，将10μL(50μg)抗体通过移液管加入至40μL 50mM Tris/HCl缓冲液(pH 8.0)中。温育在37℃下进行5.0小时。

另外，将抗体参考标准溶液(抗体在20mM组氨酸、240mM海藻糖、0.02％吐温20，pH＝6.0，c＝16.5mg·mL^-1)用50mM Tris/HCl缓冲液(pH 8.0)稀释至浓度为1mg·mL^-1，作为另一个对照。参考标准溶液没有先前的温育而应用。

多种抗体消化溶液是在非还原条件下应用的。

实施例4

不同样品制备方法的比较

仅还原：

将43μg浓度为c＝1mg·mL^-1的抗体用0.43M磷酸三氯乙酯(0.5M，在H₂O中)还原。为了这个目的，将38μL TCEP溶液(0.5M，在H₂O中)加入至5μL未应激的抗体溶液(c＝8.55mg·mL^-1)中并且在37℃下温育30分钟。随后将抗体溶液用甲酸(1％，v/v)以1∶2(v/v)的比例稀释。用甲酸稀释后，抗体的浓度是0.5mg·mL^-1。甲酸的比例是0.5％(v/v)。将获得的溶液以13,400rpm离心(Minispin，Eppendorf)2分钟。将上清液用移液管小心取出并且转移至分析管中。在LC/MS试验中，将4μL(2μg)抗体应用至柱中。

IdeS消化和还原：

用IdeS消化是通过与43μg浓度为c＝1mg·mL^-1的抗体温育来实现的。为了这个目的，将5μL未应激的抗体溶液(c＝8.55mg·mL^-1)用34μL 50mMTris/HCl缓冲液(pH 8.0)稀释，加入4μL IdeS溶液(0.25mg·mL^-1，在50mMTris/HCl缓冲液(pH 8.0)中)并且将其在37℃下温育2小时。然后将其以0.5mg·mL^-1的浓度用0.25M TCEP(0.5M，在H₂O中)还原。为了这个目的，将35μL消化的抗体溶液(c＝1mg·mL^-1)加入至35μL TCEP溶液(0.5M，在H₂O中)中并且在37℃下温育30分钟。随后将抗体溶液用甲酸(1％，v/v)以1∶2(v/v)的比例稀释。用甲酸稀释后，抗体的浓度是0.25mg·mL^-1。甲酸的比例是0.5％。将获得的抗体溶液以13,400rpm离心(Minispin，Eppendorf)2分钟。将上清液用移液管小心取出并且转移至分析管中。在LC/MS试验中，将8μL(2μg)抗体应用至柱中。

实施例5

LC-MS分析方法

为了LC/MS分析表征抗体的降解产物，首先将抗体用IdeS消化，然后去糖基，随后还原。

IdeS消化

为了用IdeS消化，在每种情况中将4μL IdeS溶液(c＝0.25mg·mL^-1，在50mM Tris/HCl缓冲液中，pH 8.0)加入至7.9μL应激的抗体(c＝6.26mg·mL^-1)和5.8μL未应激的抗体(c＝8.55mg·mL^-1)中。将该溶液用50mMTris/HCl缓冲液(pH 8.0)稀释至抗体浓度为1mg·mL^-1，并且在37℃下温育2小时。酶∶抗体比例是1∶50。

用N-糖苷酶F去糖基化

抗体重链的糖结构是用酶N-糖苷酶F切割的。N-糖苷键合的糖是在IdeS消化后通过以在50mM Tris/HCl缓冲液(pH 8.0)中的0.5mg·mL^-1的抗体浓度温育切割的。切割是通过加入0.5μL(活性：10U·mL^-1)N-糖苷酶F来启动的。温育是在37℃下进行4小时。

还原-实施例1

还原是在IdeS消化和去糖基化后通过加入60μL TCEP(磷酸三氯乙酯；0.5M，在H₂O中)实现的。随后将混合物用甲酸(1％，v/v)以1∶2(v/v)的比例稀释，从而获得浓度为0.16mg·mL^-1的抗体在还原溶液中。TCEP的浓度是0.1M，溶液中甲酸的比例是0.5％(w/v)。温育是在甲酸和TCEP的存在下、在37℃下进行30分钟。随后将获得的抗体溶液以13400rpm离心(Minispin，Eppendorf)2分钟。将上清液用移液管小心取出并且转移至分析管中。在LC/MS试验中将13μL(2μg)抗体应用至柱中(图8)。

还原-实施例2

还原是在IdeS消化和去糖基化后通过加入60μL TCEP(磷酸三氯乙酯；0.5M，在H₂O中)实现的。随后将混合物用甲酸(1％，v/v)以1∶2(v/v)的比例稀释，从而获得浓度为0.16mg·mL^-1的抗体在还原溶液中。TCEP的浓度是0.1M，溶液中甲酸的比例是0.5％(w/v)。温育是在甲酸和TCEP的存在下、在70℃下进行10分钟。随后将获得的抗体溶液以13400rpm离心(Minispin，Eppendorf)2分钟。将上清液用移液管小心取出并且转移至分析管中。在LC/MS试验中将13μL(2μg)抗体应用至柱中(图9)。

RP-HPLC分离方法

制备物的RP分离是在安装有微脱气装置、毛细管泵、带温控单元的微自动进样器、柱温箱和多波长检测器的Agilent 1100 Cap-LC系统(Agilent，Waldbronn)上实现的。将3.5μm粒度、300

孔径并且具有直径1.0×250mm的Jupiter C18柱(Phenomenex，Aschaffenburg)用于标准分离，其表示参考点。色谱分离是在75℃下并且以40μL·min^-1的流速进行的。对于每个制备物，将2μg抗体应用至柱中。将样品组分用二元梯度洗脱，二元梯度是将洗脱液A(0.5％甲酸，在H₂O中(v/v))和洗脱液B(70％2-丙醇、20％乙腈、9.5％H₂O和0.5％甲酸(v/v))一起混合的。表7显示了洗脱所用的梯度分布。

表7：RP分离的梯度分布

将洗脱的样品组分用UV-检测器在波长280nm处检测。对于在线TOF质量分析，将HPLC系统与micromass LCT质谱仪(Waters，Eschborn)联用。空白值通过注射10μL洗脱液A来记录。

质谱分析

LC分离的洗脱物的在线ESI-TOF质谱分析是在安装有电喷雾源的micromass LCT质谱仪(Waters，Eschborn)上实现的。数据是在600-2000amu(原子质量单位)质量范围内、在正离子模式(ES⁺)下、在80℃的锥孔温度和100℃的脱溶剂温度下记录的。毛细管电压是3000V，锥孔电压是30V，RF透镜电压是400V并且提取锥孔电压是1V。ESI-TOF质量分析的其它参数设置归纳在表8中。

表8：LCT质谱仪的参数设置

参数	设置
		微孔电压(V)	2.0
加速电压(V)	200
		聚焦电压(V)	0.0

转向电压(V)	0.7
		离子能量(V)	29.0
管透镜电压(V)	28.0
		TOF飞行管电压(V)	4600.0
反射电压(V)	1770.0
		锥孔气流(L/hr)	64
脱溶剂气流(L/hr)	392
		分辨率	4000.0
锁定质量	0.0000
		质量窗口+/-	1.0000

单点校正(LTeff测定)是应用在50％乙腈中的0.085％H₃PO₄进行的，将其借助Hamilton泵(泵11，Harvard Apparatus)以5μL·min^-1的流速进入质谱仪。质量准确度是～100ppm。数据是借助Mass Lynx 4.0数据记录软件来评价的。

实施例6

Pursuit二苯基柱的质谱图与Jupiter C18的质谱图的比较

如Jupiter C18柱，Pursuit二苯基柱仅能部分分离氧化的HC-Fc类别(23778Da)，在峰1的前肩峰中(参见图8)。对于抗体轻链的焦谷氨酸类别，也没有获得分离改善。在Jupiter C18柱和Pursuit二苯基柱中，其在具有相当分辨率的峰3a中洗脱。HC-Fab片段(氨基酸(AA)1-220)在两种柱子中、在洗脱图的最后一个峰中还与完整的HC-Fab类别同时洗脱。因此在应用Pursuit二苯基柱的分离中，以分开的峰分离该片段也是不可能的。Jupiter C18和Pursuit二苯基柱的质量图的比较还表明Pursuit二苯基柱的峰3b的质量与Jupiter C18柱的峰4相关。两个峰均显示33630Da的质量，其可以归属为IdeS酶。另外，Pursuit DP柱的峰5与Jupiter C18柱的峰5相关。在两种情况中均出现了包含硫醚的HC-Fab-LC复合物的质量(48918Da)、不完全还原的HC-Fab片段的质量(25377Da)和N-糖苷酶F的质量(34783Da)。

相反，Pursuit二苯基柱的峰4不与Jupiter C18柱的任何峰相关，并且因此，对于Jupiter C18柱的洗脱图这构成一个差异。该峰显示质量48916Da，其可以归属为硫醚类别并且质量49118Da。该质量相应于抗体重链的分子量。因此，质量49118Da表示完整的、未被IdeS切割的抗体重链，其已经在样品制备过程中通过还原从残留抗体分子中分离。

两种柱子洗脱图比较中的差异还见于峰1a的情况中，该峰在JupiterC18柱的洗脱图中是检测不到的。质量20037Da的类别在Pursuit二苯基柱的峰1a中被分离。将其归属为HC片段是合理的，其是由于271位天冬氨酸(D271)和272位脯氨酸(P272)之间的Asp-Pro切割形成的。Asp-Pro切割的C-端片段的理论质量值是20033Da。由于该质量出现在应激和未应激的抗体的质谱图中，因此该切割产物不是在40℃下温育获得的降解产物。尽管该片段明确地不是由40℃温育形成的，然而其是抗体的降解产物，其仅能通过Pursuit二苯基柱分离。在Jupiter C18柱的情况中，该片段与氧化的类别一起出现在峰1的肩峰中，这表明Pursuit二苯基柱具有更好的分离行为。

Pursuit二苯基柱和Jupiter C18柱之间的比较表明Pursuit二苯基柱在特定方面比Jupiter C18柱具有更好的分离性质(参见峰1a和峰4)，并且在其它方面具有相当的结果。因此，有效地改善抗体类别的分离是可能的。

序列表

<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司

<120>抗体的稳定性试验

<130>24549 WO

<150>EP 07024863.8

<151>2007-12-21

<160>2

<170>PatentIn版本3.2

<210>1

<211>339

<212>PRT

<213>化脓链球菌

<400>1

Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val

1 5 10 15

Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe

20 25 30

Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val

35 40 45

Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln

50 55 60

Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr

65 70 75 80

Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala

85 90 95

Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp

100 105 110

Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn

115 120 125

Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys

130 135 140

Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala

145 150 155 160

Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val

165 170 175

Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly

180 185 190

Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe

195 200 205

Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg

210 215 220

His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys

225 230 235 240

Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala

245 250 255

Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp

260 265 270

Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn

275 280 285

Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly

290 295 300

Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala

305 310 315 320

Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn

325 330 335

Gln Thr Asn

<210>2

<211>314

<212>PRT

<213>Flavobacterium ameridies

<400>2

Ala Pro Ala Asp Asn Thr Val Asn Ile Lys Thr Phe Asp Lys Val Lys

1 5 10 15

Asn Ala Phe Gly Asp Gly Leu Ser Gln Ser Ala Glu Gly Thr Phe Thr

20 25 30

Phe Pro Ala Asp Val Thr Ala Val Lys Thr Ile Lys Met Phe Ile Lys

35 40 45

Asn Glu Cys Pro Asn Lys Thr Cys Asp Glu Trp Asp Arg Tyr Ala Asn

50 55 60

Val Tyr Val Lys Asn Lys Thr Thr Gly Glu Trp Tyr Glu Ile Gly Arg

65 70 75 80

Phe Ile Thr Pro Tyr Trp Val Gly Thr Glu Lys Leu Pro Arg Gly Leu

85 90 95

Glu Ile Asp Val Thr Asp Phe Lys Ser Leu Leu Ser Gly Asn Thr Glu

100 105 110

Leu Lys Ile Tyr Thr Glu Thr Trp Leu Ala Lys Gly Arg Glu Tyr Ser

115 120 125

Val Asp Phe Asp Ile Val Tyr Gly Thr Pro Asp Tyr Lys Tyr Ser Ala

130 135 140

Val Val Pro Val Val Gln Tyr Asn Lys Ser Ser Ile Asp Gly Val Pro

145 150 155 160

Tyr Gly Lys Ala His Thr Leu Ala Leu Lys Lys Asn Ile Gln Leu Pro

165 170 175

Thr Asn Thr Glu Lys Ala Tyr Leu Arg Thr Thr Ile Ser Gly Trp Gly

180 185 190

His Ala Lys Pro Tyr Asp Ala Gly Ser Arg Gly Cys Ala Glu Trp Cys

195 200 205

Phe Arg Thr His Thr Ile Ala Ile Asn Asn Ser Asn Thr Phe Gln His

210 215 220

Gln Leu Gly Ala Leu Gly Cys Ser Ala Asn Pro Ile Asn Asn Gln Ser

225 230 235 240

Pro Gly Asn Trp Thr Pro Asp Arg Ala Gly Trp Cys Pro Gly Met Ala

245 250 255

Val Pro Thr Arg Ile Asp Val Leu Asn Asn Ser Leu Ile Gly Ser Thr

260 265 270

Phe Ser Tyr Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Trp Thr Asn Asn Gly Thr Asn

275 280 285

Gly Asp Ala Phe Tyr Ala Ile Ser Ser Phe Val Ile Ala Lys Ser Asn

290 295 300

Thr Pro Ile Ser Ala Pro Val Val Thr Asn

305 310

Claims

1.检测样品中的抗体和抗体片段的方法，其特征在于包括下列步骤：

a)提供包含抗体和/或抗体片段的样品，

b)将a)项中提供的样品与下列物质温育

i)IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶，

ii)糖苷酶，和

iii)还原剂，

c)将b)项中温育的样品通过联用的液相色谱法和质谱法分析以检测a)项提供的样品中包含的完整的抗体和/或检测抗体片段。

2.权利要求1的方法，其特征在于IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶是IdeS。

3.权利要求1的方法，其特征在于IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶具有氨基酸序列SEQ ID NO：1。

4.上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于用IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶的温育在pH范围为pH 5.5至8.5之间进行。

5.权利要求4的方法，其特征在于pH范围为pH 6.5至8.5之间。

6.权利要求5的方法，其特征在于pH范围为7.0至8.0之间。

7.上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶与样品中包含的抗体和/或抗体片段的摩尔比为1∶25至1∶2500之间。

8.权利要求7的方法，其特征在于摩尔比为1∶25至1∶100之间。

9.上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于糖苷酶是N-糖苷酶F或Endo F2或Endo H或神经氨酸酶或O-糖苷酶。

10.权利要求9的方法，其特征在于糖苷酶是N-糖苷酶F。

11.权利要求10的方法，其特征在于N-糖苷酶F衍生自脑膜炎脓毒性黄杆菌。

12.权利要求1至8中任意一项的方法，其特征在于糖苷酶具有氨基酸序列SEQ ID NO：2。

13.上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于步骤b)-i)、b)-ii)和b)-iii)的温育是连续地。

14.上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于步骤b)-iii)是

iii)还原剂和甲酸。

15.上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于还原剂是磷酸三氯乙酯。

16.上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于液相色谱法是反相液相色谱法。

17.权利要求16的方法，其特征在于反相色谱法应用具有C8或C18残基的色谱材料。

18.权利要求1至14中任意一项的方法，其特征在于液相色谱法是疏水相互作用色谱法。

19.权利要求18的方法，其特征在于疏水相互作用色谱法应用具有二苯基残基的色谱材料。

20.来自化脓链球菌的IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶IdeS在检测样品中的抗体或抗体片段中的用途，其特征在于将样品与IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶温育，在与来自脑膜炎脓毒性黄杆菌的N-糖苷酶F温育后，将获得的片段通过联用的液相色谱法和质谱法分析。

21.用于检测抗体或抗体片段的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含

i)来自化脓链球菌的IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶IdeS，和

ii)来自脑膜炎脓毒性黄杆菌的糖苷酶N-糖苷酶F。

22.检测样品中修饰的抗体形式的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

a)提供包含抗体和/或其切割产物的样品，

b)将a)项中提供的样品与下列物质温育

i)IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶，

ii)糖苷酶，

iii)还原剂，

c)将b)项中温育的样品通过疏水相互作用色谱法分析，从而检测样品中修饰的抗体形式。