CN101899414A - 一株广谱有机磷农药降解基因工程菌株的构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株广谱有机磷农药降解基因工程菌株的构建与应用，属于生物工程技术领域。该工程菌株lgmp是利用随机整合系列载体pUTTns，将两种具有不同底物降解谱的有机磷水解酶基因mpd和oph先后插入到乐果高效降解菌Paracoccus sp.L3的染色体上，并通过反筛选标记将抗性基因删除，构建了广谱降解有机磷农药的工程菌株Paracoccus sp.lgmp，降解谱测定表明工程菌株能够高效降解目前国内普遍使用的17种有机磷农药，该工程菌株遗传稳定、生态安全，具有非常大的潜在应用前景。

Description

一株广谱有机磷农药降解基因工程菌株的构建与应用 

一、技术领域

本发明涉及一株广谱有机磷农药降解基因工程菌的构建及其应用，属于生物工程技术领域。 

二、背景技术

有机磷农药可以抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使乙酰胆碱(一种神经传导物质)在肌体组织中积累起来，从而引起某些神经功能紊乱等一系列中毒症状，严重者可使神经麻痹，以致死亡。有机磷农药的使用对人体健康或生态环境构成潜在威胁，很多国家将乐果、敌敌畏、对硫磷等有机磷农药确定为环境优先污染物。80年代初期，美国因农药污染地下水引起中毒事故，而开始对农药污染地下水问题进行调查，在某些地区检测出50多种农药残留，其中属于有机磷的农药及最高检出量(μg/L)为二嗪磷：9；乐果：190；马拉硫磷：23；对硫磷：4；甲拌磷：20。美国EPA在PGWDB中统计了1971-1999年间所报道的有关地下水农药监测资料，有机磷农药共监测72种，检出的有17种，均为用量大、使用广泛的品种。国内研究者对此也进行大量的研究，徐炜采用高效液相色谱，直接进水检测5份水样中的8种有机磷农药，检出乐果和甲基对硫磷。康跃惠用C18固相萃取法萃取、GC-FPD测定自来水厂源水中有机磷农药，结果表明：源水可检出敌敌畏、敌百虫、久效磷、乐果、对硫磷、甲基对硫磷。尹明泉研究了德州市农药对地下水污染，检测四个井水的敌敌畏、乐果、马拉硫磷和对硫磷，结果表明有机磷农药对监测区地下水的污染很普遍，最高质量浓度分别为敌敌畏：13μg/L；乐果：22.0μg/L；对硫磷：11.8μg/L；马拉硫磷：6.3μg/L。张秋菊等于2000年5月选择喀什地区产棉大县莎车和英吉沙两县，根据地下水水层分布，选择不同深度的地下水层布20个采样点采集水样，分别测定了水中的敌敌畏、敌百虫、甲拌磷、六六六、滴滴涕、功夫菊酯、久效磷、氧化乐果等农药。检测结果表明，20份水样中检出1种、2种和3种农药的份数分别为5份、6份和3份，总检出率为70％。 

综上所述，有机磷农药污染是一个复杂的多有机磷农药混和污染，降解单一有机磷农药的微生物菌剂已经不能满足生物修复的需求，因此，通过基因工程的手段有目的的将降解不同农药的基因构建于同一株菌中，获得遗传稳定的，符合环境释放条件，同时能降解多种农药的工程菌株。构建基因工程菌的方法主要有基因改造法和质粒转移法两种。质粒的不稳定性会导致外源基因和尤其是抗生素抗性基因的迁移，将外源基因构建于质粒载体而获得的基因工程菌的方法越来越受到限制，因此必须将外源目的基因整合到受体菌的染色体上去。将外源目的基因整合到受体菌染色体上的常用方法主要有同源重组和转座子随机插入。同源重组必须要拥有同源序列才能进行整合，因此，该方法有一定的局限性。应用转座子随机插入通常情况下应用抗生素抗性基因作为正向筛选标记，导致抗性基因的引入，存在环境风险。因此，迫切需要发展能将 外源基因整合到受体菌染色体上且不带入外源抗性基因的整合技术，构建生态安全型的基因工程菌株应用于实践。 

随机插入载体pUT mini-Tn5已经被用来作为插入工具构建工程菌株，但国际上还未见最终不带有外源抗性基因的转座子随机插入载体。反向筛选标记是作为去除抗性基因的常用方法^[16-20]，果聚糖蔗糖酶基因sacB可以将蔗糖转换成大分子的果聚糖并使其在阴性菌的周质空间大量积聚而阻止宿主菌与外界的物质传递与运输，从而致使宿主菌停止生长或死亡，只有那些发生了交换事件将sacB基因和抗生素抗性基因删除的菌株才会在添加了蔗糖的选择性平板上生长而得以被筛选出来，本专利利用反向筛选标记sacB基因以pUT mini-Tn5为基础，构建出了染色体无标记随机整合系列载体，并利用该载体构建出遗传稳定、生态安全的广谱有机磷农药降解工程菌株。 

三、发明内容

技术问题  本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，构建遗传稳定的、符合环境释放条件、同时能降解多种农药的工程菌株，为多种有机磷农药污染的修复提供良好的生物材料。 

技术方案 

一种基因工程菌株，该菌株lgmp为副球菌(Paracoccus sp.)，2010年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.3639。 

有机磷农药降解基因工程菌株lgmp，构建方法如下： 

1)有机磷农药水解酶基因mpd和oph插入到载体pUTTnsTet 

将pUTTnsTet载体在LB培养基中培养至对数后期，提取质粒，用限制性内切酶ApaI对质粒pUTTnsTet进行单酶切，回收线性片段；从有机磷农药降解菌Psedudomonasputida DLL-1中用PCR的方法扩增获得mpd基因(引物序列：正向gggcccatatgctccgtccaatctccgcc；反向gggcccgcggccgctatcacttggggttgac，PCR方法：扩增反应体系如下：10×Taq聚合酶反应缓冲液5μL，dNTP(20mmol/L)5μL，引物(25pmol/μL)各2μL，Mg²⁺(25mmol/L)4μL，菌体DNA(约50ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，加H₂O至50μL。反应条件：95℃变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；最后72℃延伸20min)，两端引入用ApaI酶切位点，在通过酶切酶连将mpd基因整合进pUTTnsTet，获得的载体命名为pUTTnsTet-mpd。 

从有机磷农药降解菌Arthrobacter scl-2中用PCR的方法扩增扩增获得oph基因(引物序列：正向atggcatcactgttgtttcg；反向tcatcccgcgaccgccgatg，PCR方法：扩增反应体系如下：10×Taq聚合酶反应缓冲液5μL，dNTP(20mmol/L)5μL，引物(25pmol/μL)各2μL，Mg²⁺(25mmol/L)4μL，菌体DNA(约50ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，加H₂O至50μL。反应条件：95℃变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；最后72℃延伸20min)，T/A克隆至pMD18-T载体后命名为pMD18-T-oph，重新设计引物(5’-gggcccagcgcccaatacgcaaaccg-3’)/(5’-gggccctcatcccgcgaccgccgat-3’)从 pMD18-T-oph载体上扩增出前端带有lacZ启动子的oph，(PCR方法：扩增反应体系如下：10×Taq聚合酶反应缓冲液5μL，dNTP(20mmol/L)5μL，引物(25pmol/μL)各2μL，Mg²⁺(25mmol/L)4μL，菌体DNA(约50ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，加H₂O至50μL。反应条件：95℃变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；最后72℃延伸20min)将LacZ启动子作为oph基因的启动子，同时在引物的两端引入ApaI酶切位点(划线部位)，通过酶切酶连将oph基因整合进pUTTnsTet，获得的载体命名为pUTTnsTet-oph。 

2)三亲结合将有机磷农药水解酶基因mpd插入受体菌Paracoccus sp.L3染色体中 

将供体菌E.coli DH5αλpir(pUTTnsTet-mpd)、辅助菌E.coli(pRK600)、受体菌Paracoccus sp.L3分别在LB培养基中培养至对数后期，5000rpm离心回收菌体，用无菌水洗涤1次，浓缩后混合三种菌液于0.25μm微孔滤膜上，置于不含抗生素的LB培养基上30℃培养，24h后用无菌水洗下菌体，直接涂布于含100μg/mL链霉素、100μg/mL四环素的LB平板上，48h后挑选长出的单菌落即为获得的接合子。 

3)筛选发生同向重复序列交换剔除外源抗生素基因的整合子 

将获得的接合子在10％(w/v)蔗糖的LB培养基中培养过夜，涂布于蔗糖平板，挑取单菌落，同时点接SLB平板(加10％蔗糖、200mg/kg甲基对硫磷)和TLB平板(100mg/kg四环素)，挑选能在SLB平板上生长(且能产生水解圈)，而不能在TLB平板生长的菌落即为成功构建的不含外源抗性基因的工程菌Paracoccus sp.L3-mpd。 

4)三亲结合将将有机磷农药水解酶基因oph插入受体菌Paracoccus sp.L3-mpd染色体中 

将供体菌E.coli DH5αλpir(pUTTnsTet-oph)、辅助菌E.coli(pRK600)、受体菌Paracoccus sp.L3-mpd分别在LB培养基中培养至对数后期，5000rpm离心回收菌体，用无菌水洗涤1次，浓缩后混合三种菌液于0.25μm微孔滤膜上，置于不含抗生素的LB培养基上30℃培养，24h后用无菌水洗下菌体，直接涂布于含100μg/mL链霉素、100μg/mL四环素的LB平板上，48h后挑选长出的单菌落即为获得的接合子。 

5)筛选发生同向重复序列交换剔除外源抗生素基因的整合子 

将获得的接合子在10％(w/v)蔗糖的LB培养基中培养过夜，涂布于蔗糖平板，挑取单菌落，同时点接SLB平板(加10％蔗糖、200mg/kg甲基对硫磷)和TLB平板(100mg/kg四环素)，挑选能在SLB平板上生长(且能产生水解圈)，而不能在TLB平板生长的菌落即为成功构建的不含外源抗性基因的工程菌Paracoccus sp.lgmp。 

有益效果 

遗传稳定的工程菌株Paracoccus sp.lgmp能够降解降解目前国内普遍使用的17种有机磷农药，转化50mg·kg-1水胺硫磷、甲基对硫磷和乐果仅需36、30和12h。 

四、附图说明

图1Paracoccus sp.lgmp和Paracoccus sp.L3的生长曲线 

图2PCR扩增工程菌株中mpd基因片段电泳图 

图3PCR扩增工程菌株中oph基因片段电泳图 

图4工程菌在含农药平板上的水解圈照片 

图5工程菌株对靶标农药的实验室摇瓶降解 

图6工程菌株对靶标农药在土壤中的残留降解 

五、具体实施方式

1.广谱有机磷农药降解基因工程菌株的构建 

1)有机磷农药水解酶基因mpd和oph插入到载体pUTTnsTet 

将含载体(pUTTnsTet)(Rong Li，Guangli Wang，Bin Shen，Rong Wang，Yao Song，Shunpeng Li，Jiandong Jiang，Random transposon vectors pUTTns for the markerless integration of exogenous genesinto gram-negative eubacteria chromosomes，Journal of Microbiological Methods，2009(79)：220～226)的大肠杆菌在LB培养基中培养至对数后期，提取质粒，用限制性内切酶ApaI对载体pUTTnsTet进行单酶切，回收线性片段；从有机磷农药降解菌Psedudomonas putidaDLL-1(刘智，孙建春，李顺鹏.甲基对硫磷降解菌DLL-1的分离、鉴定及降解性研究.应用与环境生物学报，1999，147-151)中用PCR的方法扩增获得mpd基因(引物序列：正向gggcccatatgctccgtccaatctccgcc；反向gggcccgcggccgctatcacttggggttgac，PCR方法：扩增反应体系如下：10×Taq聚合酶反应缓冲液5μL，dNTP(20mmol/L)5μL，引物(25pmol/μL)各2μL，Mg²⁺(25mmol/L)4μL，菌体DNA(约50ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，加H₂O至50μL。反应条件：95℃变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；最后72℃延伸20min)，两端引入用ApaI酶切位点，在通过酶切酶连将mpd基因整合进pUTTnsTet，获得的载体命名为pUTTnsTet-mpd。从有机磷农药降解菌Arthrobacter scl-2(Li Rong et al.，Isolation of an Isocarbophos-Degrading Strain ofArthrobacter sp.scl-2and Identification of the Degradation Pathway，Journal of Microbiology andBiotechnology，200911；19(11)：1439～1446.)中用PCR的方法扩增扩增获得oph基因(引物序列：正向atggcatcactgttgtttcg；反向tcatcccgcgaccgccgatg，PCR方法：扩增反应体系如下：10×Taq聚合酶反应缓冲液5μL，dNTP(20mmol/L)5μL，引物(25pmol/μL)各2μL，Mg²⁺(25mmol/L)4μL，菌体DNA(约50ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，加H₂O至50μL。反应条件：95℃变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；最后72℃延伸20min)，克隆至pMD18-T载体后命名为pMD18-T-oph载体，重新设计引物(5’-gggcccagcgcccaatacgcaaaccg-3’)/(5’gggccctcatcccgcgaccgccgat-3’)从pMD18-T-oph载体上扩增出前端带有lacZ启动子的oph，(PCR方法：扩增反应体系如下：10×Taq聚合酶反应缓冲液5μL，dNTP(20mmol/L)5μL，引物(25pmol/μL)各2μL，Mg²⁺(25mmol/L)4μL，菌体DNA(约50ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，加H₂O至50μL。反应条件：95℃变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；最后72℃延伸20min)将LacZ启动子作为oph基因的启动子，同时在引物的两端引入ApaI酶切位点(划线部位)，通过酶切酶连将oph基因整合进pUTTnsTet，获得的载体命名为pUTTnsTet-oph。 

2)三亲结合将有机磷农药水解酶基因mpd插入受体菌Paracoccus sp.L3染色体中 

将供体菌E.coli DH5αλpir(含有载体pUTTnsTet-mpd)、辅助菌E.coli pRK600、受体菌Peacocks sp.L3(王堃等，乐果降解菌L3的分离、鉴定及降解性能，中国环境科学)分别在LB培养基中培养至对数后期，5000rpm离心回收菌体，用无菌水洗涤1次，浓缩后混合两种菌液于0.25μm微孔滤膜上，置于不含抗生素的LB培养基上30℃培养，24h后用无菌水洗下菌体，直接涂布于含100μg/mL链霉素、100μg/mL四环素的LB平板上，48h后挑选长出的单菌落即为获得的接合子。 

3)筛选发生同向重复序列交换剔除外源抗生素基因的整合子 

将以上获得的接合子在10％(w/v)蔗糖的LB培养基中培养过夜，涂布于蔗糖平板，挑取单菌落，同时点接SLB平板(LB培养基固体平板加10％蔗糖、200mg/kg甲基对硫磷)和TLB平板(LB培养基固体平板加100mg/kg四环素)，挑选能在SLB平板上生长(且能产生水解圈)，而不能在TLB平板生长的菌落即为成功构建的不含外源抗性基因的工程菌Paracoccus sp.L3-mpd。 

4)三亲结合将将有机磷农药水解酶基因oph插入受体菌Paracoccus sp.L3-mpd染色体中 

将供体菌E.coli DH5a λpir(pUTTnsTet-oph)、辅助菌E.coli(pRK600)、受体菌Paracoccus sp.L3-mpd分别在LB培养基中培养至对数后期，5000rpm离心回收菌体，用无菌水洗涤1次，浓缩后混合两种菌液(等浓度混合)于0.25μm微孔滤膜上，置于不含抗生素的LB培养基上30℃培养，24h后用无菌水洗下菌体，直接涂布于含100μg/mL链霉素、100μg/mL四环素的LB平板上，48h后挑选长出的单菌落即为获得的接合子。 

5)筛选发生同向重复序列交换剔除外源抗生素基因的整合子 

将获得的接合子在10％(w/v)蔗糖的LB培养基中培养过夜，涂布于蔗糖平板，挑取单菌落，同时点接SLB平板(LB培养基固体平板加10％蔗糖、200mg/kg甲基对硫磷)和TLB平板(LB培养基固体平板加100mg/kg四环素)，挑选能在SLB平板上生长(且能产生水解圈)，而不能在TLB平板生长的菌落即为成功构建的不含外源抗性基因的工程菌Paracoccus sp.lgmp。 

2.广谱有机磷农药降解基因工程菌株的应用 

1)工程菌株的生长 

在27个1L的三角瓶中加入300mL的LB培养基，分别以体积比2％的接种量接入Paracoccus sp.Lgmp(OD₆₀₀＝2.0)和野生菌株Paracoccus sp.L3(OD₆₀₀＝2.0)，30℃、150rpm摇床振荡培养，每隔6h用无菌移液管取样3mL，立即放入4℃冰箱储存，最后同时在600nm波长处测定OD值。用未接种的细菌培养基作空白对照，从最早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用细菌培养基适当稀释后测定，使其OD600值在0.1～0.8之间(在测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)，每个 处理三次重复。测定结果如图1，六株工程菌株和野生型菌株的生长没有显著差异，表明外源基因的插入对工程菌株的生长没有显著影响。 

2)工程菌株中目的片段的PCR验证 

利用PCR方法来验证Paracoccus sp.lgmp插入片段的大小，mpd基因插入片段大小：引物采用SacBDR的上游引物与mpd基因的下游引物扩增(引物序列：正向cctgcaggcatgcgacaacag；反向gccgctatcacttggggttgac，PCR方法：扩增反应体系如下：10×Taq聚合酶反应缓冲液5μL，dNTP(20mmol/L)5μL，引物(25pmol/μL)各2μL，Mg²⁺(25mmol/L)4μL，菌体DNA(约50ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，加H₂O至50μL。反应条件：95℃变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.2min，30个循环；最后72℃延伸20min)，如图2所示，在工程菌中扩增出与理论大小大约1.3kb一致的片段，而野生菌中未扩增出相应片段。；oph基因插入片段大小：引物采用SacBDR的上游引物与oph基因的下游引物扩增(引物序列：正向cctgcaggcatgcgacaacag；反向tcatcccgcgaccgccgatg，PCR方法：扩增反应体系如下：10×Taq聚合酶反应缓冲液5μL，dNTP(20mmol/L)5μL，引物(25pmol/μL)各2μL，Mg²⁺(25mmol/L)4μL，菌体DNA(约50ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，加H₂O至50μL。反应条件：95℃变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.2min，30个循环；最后72℃延伸20min)，如图3所示，在工程菌中扩增出与理论大小大约2.1kb一致的片段，而野生菌中未扩增出相应片段。 

3)工程菌株的稳定性实验 

将工程菌株在LB平板上分别连续传代培养100代，然后分别随机挑取50个单菌落，测定它们对甲基对硫磷和水胺硫磷的降解特性，结果显示菌株都表现出相应的有机磷农药降解特性，表明mpd基因和oph基因得到稳定表达。 

4)工程菌株对靶标农药的降解 

将Paracoccus sp.lgmp点接到含200mg·kg^-1甲基对硫磷平板和400mg·kg^-1甲基异柳磷的LB平板上，点接出发菌株和大肠杆菌作为对照。从图中看出工程菌株能够很好的降解甲基对硫磷和甲基异柳磷。 

在液体LB试管中培养菌株Paracoccus sp.lgmp和野生菌株Paracoccus sp.L3，取对数生长后期的菌液，12000rpm离心5min，无菌水洗涤一次后加入等体积的无菌水，制成菌悬液。按1％的接种量接入到分别含100mg·L^-1水胺硫磷、100mg·L^-1甲基对硫磷、100mg·L^-1乐果的无机盐培养基中，水胺硫磷和甲基对硫磷共18瓶，不接菌的18瓶作为对照。30℃、150rpm培养，每6h取样一次，每次6瓶(3个处理、3个对照)，测定OD₆₀₀值，用液相色谱法测定样品中农药的含量，Paracoccus sp.lgmp转化50mg·kg^-1水胺硫磷、甲基对硫磷和乐果分别需要36、30和12h(图4)。 

5)工程菌株对17种有机磷农药的降解 

在液体LB试管中培养菌株scl-2，取对数生长后期的菌液，12000rpm离心5min，无菌水洗涤一次后加入等体积的无菌水，制成菌悬液。按1％的接种量加入到含100 mg·L^-1不同有机磷农药的的无机盐培养基中，30℃，150rpm培养1d后，同时对样品中残留农药进行提取，用液相色谱法检测样品中各种有机磷农药的含量。结果如表1，野生型菌株Pseudomonas sp.DLL-1、Paracoccus sp.L3和Arthrobacter sp.scl-2的降解谱列于表3-3，Pseudomonas sp.DLL-1编码有机磷农药水解酶基因mpd，Arthrobacter sp.scl-2编码有机磷农药水解酶基因oph，Paracoccus sp.L3为原始出发菌株，三株菌的降解谱 

都有很大的缺陷，Pseudomonas sp.DLL-1有8种农药不能降解，分别为甲基异柳磷、水胺硫磷、异柳磷、亚胺硫磷、三唑磷、苯线磷、乐果、氧乐果；Arthrobacter sp.scl-2虽然只有敌敌畏、敌百虫、乐果、氧乐果不能降解，但是它对许多农药的降解效率都不是很高，如甲基对硫磷等；出发菌株Paracoccus sp.L3只能降解乐果和氧乐果；本研究最终构建的工程菌株Paracoccus sp.lgmp对这17种农药都有很好的降解效果，是一株广谱的工程菌株。 

表1Paracoccus sp.L3-mpd-oph的降解谱及与原始菌株的比较 

注：“+”代表降解能力“-”代表不能降解 

6)工程菌株Paracoccus sp.lgmp在土壤中对靶标农药的降解 

将土壤置于阴凉、通风处吹干至恒重，研磨后，过60目筛。准确称取100g土样于盆钵中。然后，分别加入相应体积1000mg·L^-1的不同有机磷农药，混匀，使土壤中 不同有机磷的浓度为20mg·kg^-1，置通风橱中吹干，共设添加菌液和农药，不添加菌液添加农药的对照。将Paracoccus sp.lgmp接种到LB液体培养基中，30℃培养48～72h至对数期，4000rpm离心10min，收集菌体，用无机盐培养基洗涤两次后。按7.4×10⁶CFU·g^-1干土添加降解菌株，对照中添加相同体积的无菌水。经1、2、3、4d后取土样分别检测农药浓度。从图6中可以看出，对照在土著微生物以及光化学等的作用下，农药浓度有一定程度的降低，但降低得较慢，7d后土壤中仍然残留一定量的农药，接种降解菌株后农药浓度快速下降，表明接种的降解菌株能够迅速加快农药的降解。从土壤降解实验结果可以推断Paracoccus sp.lgmp能够迅速加快土壤中甲基对硫磷、水胺硫磷、乐果的降解，投加菌株的土壤中甲基对硫磷、水胺硫磷、乐果很快就会降解至未检出。 

SEQUENCE LISTING

<110>南京农业大学

<120>一株广谱有机磷农药降解基因工程菌株的构建与应用

<130>说明书

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<400>1

gggcccatat gctccgtcca atctccgcc    29

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>Psedudomonas putida DLL-1

<400>2

gggcccgcgg ccgctatcac ttggggttga c    31

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<400>3

atggcatcac tgttgtttcg    20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<400>4

tcatcccgcg accgccgatg    20

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工

<400>5

gggcccagcg cccaatacgc aaaccg    26

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<400>6

gggccctcat cccgcgaccg ccgat    25

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<400>7

cctgcaggca tgcgacaaca g    21

Claims (3)

1.一种基因工程菌株，该菌株lgmp为副球菌(Paracoccus sp.)，保藏号为CGMCCNO.3639。

2.根据权利要求1所述基因工程菌株，其构建方法为：

1)pUTTnsTet-mpd和pUTTnsTet-oph的构建

取含载体pUTTnsTet的大肠杆菌，划线于含100mg/kg的四环素、氨苄青霉素的LB平板，37℃培养24h，挑单菌入含相同抗生素的LB液体试管，37℃ 150rpm转摇18h，碱裂解法提取质粒pUTTnsTet，用限制性内切酶ApaI对质粒pUTTnsTet进行单酶切，回收线性片段；采用PCR扩增的方法分别从有机磷农药降解菌Psedudomonasputida DLL-1和Arthrobacter sp.scl-2中扩增出mpd基因和oph基因，引物两端引入ApaI酶切位点，通过酶切酶连连入pUTTnsTet，分别命名为pUTTnsTet-mpd和pUTTnsTet-oph；

2)三亲结合将有机磷农药水解酶基因mpd插入到受体菌Paracoccus sp.L3染色体中将含载体pUTTnsTet-mpd的供体菌E.coli DH5αλpir、辅助菌E.coli pRK600、受体菌Paracoccus sp.L3分别在LB培养基中培养至对数后期，5000rpm离心回收菌体，用无菌水洗涤1次，浓缩后混合三种菌液于0.22μm微孔滤膜上，置于不含抗生素的LB培养基上30℃培养，24h后用无菌水洗下菌体，直接涂布于含100mg/kg链霉素、100mg/kg四环素的LB平板上，48h后挑选长出的单菌落即获得接合子；

3)蔗糖选择压力反向筛选发生同向重复序列交换剔除外源抗性基因的整合子Paracoccus sp.L3-mpd

将获得的接合子在含质量体积比10％蔗糖的LB培养基中培养过夜，涂布于蔗糖平板，挑取单菌落，同时点接LB培养基添加10％蔗糖、200mg/kg甲基对硫磷的SLB平板和LB培养基添加100mg/kg四环素的TLB平板，挑选能在SLB平板上生长且能产生水解圈，且不能在TLB平板生长的菌落即为成功构建的不含外源抗性基因的工程菌株Paracoccus sp.L3-mpd；

4)三亲结合将有机磷农药水解酶基因oph插入受体菌Paracoccus sp.L3-mpd染色体中将含载体pUTTnsTet-oph的供体菌E.coli DH5αλpir、辅助菌E.coli pRK600、受体菌Paracoccus sp.L3-mpd分别在LB培养基中培养至对数后期，5000rpm离心回收菌体，用无菌水洗涤1次，浓缩后混合三种菌液于0.22μm微孔滤膜上，置于不含抗生素的LB培养基上30℃培养，24h后用无菌水洗下菌体，直接涂布于含100mg/kg链霉素、100mg/kg四环素的LB平板上，48h后挑选长出的单菌落即获得接合子；

5)蔗糖选择压力反向筛选发生同向重复序列交换剔除外源抗生素基因的整合子Paracoccus sp.lgmp

将获得的接合子在质量体积比10％蔗糖的LB培养基中培养过夜，涂布于蔗糖平板，挑取单菌落，同时点接SLB平板和TLB平板，挑选能在SLB平板上生长且能产生水解圈，且不能在TLB平板生长的菌落即为成功构建的不含外源抗性基因的工程菌株lgmp。

3.权利要求1或2所述的基因工程菌在降解农药方面的应用。

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