CN101892196B

CN101892196B - 一种细胞分选磁珠及合成方法以及其在细胞分选中的应用

Info

Publication number: CN101892196B
Application number: CN201010226278A
Authority: CN
Inventors: 张新祥; 崔毅然; 高晓明; 洪超
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2010-07-14
Filing date: 2010-07-14
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2030-07-14
Also published as: CN101892196A

Abstract

本发明提供一种新型细胞分选磁珠，该磁珠为表面上以共价键偶联proteinA，并通过protein A与IgG的Fc段的特异性相互作用，定向偶联IgG型小鼠CD3抗体的50-70nm金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄Au纳米颗粒)。本发明涉及该磁珠的合成和修饰方法，以及使用该磁珠进行细胞分选的方法。本发明磁珠用于除去小鼠脾细胞中的CD3 T细胞，使CD3 T细胞在脾细胞中的含量由36.5％降为0.7％，分选效率极高。本磁珠还同时具有蛋白偶联量高和超顺磁性的优点，而且制备方法简单，环境友好，成本较低，具有较好的应用前景。

Description

一种细胞分选磁珠及合成方法以及其在细胞分选中的应用

技术领域

本发明涉及一种新型的细胞分选磁珠，包括该磁珠的合成和修饰方法，以及使用该新型磁珠进行细胞分选的方法，属于材料科学和生物化学中的纳米生物应用技术领域。

背景技术

细胞分选是生物学和免疫学实验中的常用技术，应用磁珠分选细胞是这一领域中常用的手段，在使用磁珠进行细胞分选的方法中，关键技术为磁珠的合成。目前常用的商品化微米级磁珠的蛋白偶联量小，而纳米级磁珠由于磁性小，不易被磁铁分离，操作复杂，分离成本高。

针对上述问题，在细胞分选领域，提供一种蛋白偶联量高、超顺磁性、易于分离的纳米级磁珠，从而简化操作、降低成本，同时提供高细胞分选效率，在这一领域具有很大的意义。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种新型的细胞分选磁珠用于除去小鼠脾细胞中的CD3 T细胞。本磁珠同时具有蛋白偶联量高和超顺磁性的优点，分选后CD3 T细胞在脾细胞中的含量由36.5％降为0.7％，分选效率极高。本磁珠还具有制备方法简单、环境友好、成本低的优点，具有较好的应用前景。

本发明的目的是提供一种应用于细胞阴性分选的磁珠，包括以下3个部分：

1、共沉淀法合成15nm Fe₃O₄纳米颗粒，并用羟胺还原HAuCl₄的方法，在Fe₃O₄表面修饰一层金，合成50-70nm金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒(以下以Fe₃O₄Au表示)；

2、用16-巯基十六酸将Fe₃O₄Au纳米颗粒表面羧基化，通过共价偶联的protein A，特异性吸附IgG型小鼠CD3抗体的Fc段，使其定向偶联在磁珠上；

3、应用该磁珠除去小鼠脾细胞中的CD3T细胞的方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

本发明提供的新型细胞分选磁珠，为表面上以共价键偶联protein A，并通过protein A与IgG的Fc段的特异性相互作用，定向偶联IgG型小鼠CD3抗体的50-70nm的金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄Au纳米颗粒)。

本发明涉及一种新型细胞分选磁珠，其特征在于50-70nm的金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄Au纳米颗粒)表面上以共价键偶联protein A，并进一步通过protein A与IgG的Fc段的特异性相互作用，定向偶联IgG型小鼠CD3抗体。该磁珠上CD3抗体偶联量为55-65(μg CD3抗体)/(mg磁珠)。

本发明还涉及上述新型细胞分选磁珠的合成方法，该方法包括以下步骤：(1)用共沉淀法制备15nm Fe₃O₄纳米颗粒，(2)用羟胺还原HAuCl₄的方法，在前述Fe₃O₄纳米颗粒表面包裹一层金，制得50-70nm的金包裹Fe3O4磁性纳米颗粒(Fe₃O₄Au纳米颗粒)，(3)用16-巯基十六酸将前述金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄Au纳米颗粒)表面羧基化，(4)将protein A以共价键偶联在前述被表面羧基化的颗粒上，(5)使IgG型小鼠CD3抗体通过Fc段定向固定在前一步骤制得的偶联有protein A的磁珠上。

本发明还涉及新型细胞分选磁珠的合成方法，包括以下步骤：(1)用共沉淀法制备Fe₃O₄纳米颗粒的步骤，具体为：将摩尔比为2∶1的FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O溶于40mmol/L HCl水溶液，制成铁盐水溶液(Fe³⁺与Fe²⁺的浓度分别为0.8mol/L和0.4mol/L)，在机械搅拌下，将制得的铁盐水溶液逐滴滴加至1.5mol/L NaOH水溶液中，前述过程中控制温度保持在80℃，将制得的Fe₃O₄磁性纳米颗粒用磁铁分离、收集后用纯净水洗涤4次，再将Fe₃O₄磁性纳米颗粒分散于纯净水中，制成0.1mol/L的Fe₃O₄储备液。本步骤中使用的铁盐水溶液与NaOH水溶液之间的体积比为1∶10。

(2)用羟胺还原HAuCl₄的方法，在前述Fe₃O₄纳米颗粒表面包裹一层金，制得50-70nm的金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄Au纳米颗粒)的步骤，具体为：将前述0.1mol/L的Fe₃O₄储备液与0.2mol/L的NH₂OH·HCl水溶液滴加至0.01mol/LTMAOH水溶液中，加热至80℃，在充分搅拌下，将0.1％(w/v)HAuCl₄水溶液滴加至上述溶液中，然后在2小时内缓慢滴加15mmol/L柠檬酸钠水溶液，滴加完成后继续加热搅拌3小时，该步骤中控制溶液温度保持在80℃；生成的金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄Au纳米颗粒)经磁铁分离后，先后分别用纯净水和乙醇各洗涤2次，9,000rpm离心15分钟，弃去洗涤液，在真空干燥箱中60℃放置1-2小时烘干，得到金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄Au纳米颗粒)，本步骤中使用的Fe₃O₄储存液、NH₂OH·HCl水溶液、TMAOH水溶液、HAuCl₄水溶液、柠檬酸钠水溶液之间的体积比为1∶0.3∶15∶8∶20。

(3)用16-巯基十六酸将前述金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄Au纳米颗粒)表面羧基化的步骤具体为：按重量(mg)∶体积(ml)为5∶2的比例取Fe₃O₄Au纳米颗粒超声分散于20mmol/L 16-巯基十六酸的乙醇溶液中，超声反应48h；反应完毕后将磁珠溶液用乙醇洗涤3次，9,000rpm离心15分钟后，再分散至乙醇中，制成2mg/mL羧基化的磁珠分散液。

(4)将protein A以共价键偶联在前述被表面羧基化的颗粒上的步骤，具体为：a.活化：取前述羧基化的磁珠分散液，磁铁分离后弃去乙醇，重新分散于含有EDC和NHS的、浓度分别为20mg/mL和10mg/mL的水溶液中，超声反应1小时，反应过程中每隔5分钟将反应液充分混匀一次，其中使用的磁珠分散液与含有EDC和NHS的水溶液两者体积比为1∶2，b.protein A偶联：将活化后的磁珠用磁铁分离后重新分散于含有150μg/mL protein A的PBS溶液中，置于摇床上在4℃下以40rpm的速度混匀反应12-14小时。

(5)使IgG型小鼠CD3抗体的Fc段定向固定在前一步骤制得的偶联有proteinA的磁珠上的步骤，具体为：将上一步骤获得的偶联有protein A的磁珠用磁铁分离后分散于含有100μg/mL小鼠CD 3抗体的PBS溶液中，置于摇床上在4℃下以40rpm的速度混匀反应12-14小时，使CD 3抗体的Fc段定向固定在偶联有proteinA的磁珠上。

本发明涉及的细胞分选磁珠的合成方法还包括将使用前述方法制得的该磁珠上未反应的活性位点进行封闭的步骤。其方法为：将固定有CD3抗体的Fc段的磁珠分散于细胞分选缓冲溶液中，置于摇床上在4℃下以40rpm的速度混匀反应12-14小时。

根据本发明的实施方案之四，本发明还涉及上述细胞分选磁珠的用途，以除去小鼠脾细胞中的CD3T细胞。

本发明还涉及一种小鼠脾细胞分选方法，该方法为使用本发明合成的磁珠进行小鼠脾细胞分选。

附图说明

图1(a)为在Fe₃O₄纳米颗粒上包裹金形成Fe₃O₄Au纳米颗粒的流程；

图1(b)Fe₃O₄Au纳米颗粒被在磁场中被分离；

图2为透射电子显微镜结果：(a)Fe₃O₄纳米颗粒；(b)Fe₃O₄Au纳米颗粒。

图3为X射线衍射图谱：(a)Fe₃O₄纳米颗粒；(b)Fe₃O₄Au纳米颗粒。

图4为聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果：1.纯化后的CD3抗体；2.BSA；3.Marker.

图5为纯化后的CD3抗体刺激小鼠T淋巴细胞的实验结果。

图6为小鼠CD3抗体在磁珠上的定向偶联流程图。

图7为小鼠脾细胞经磁珠分选前和分选后的流式细胞仪分析结果。

具体实施方式

本发明使用的实验试剂与原料为：

16-巯基十六酸(16-Mercaptohexadecanoic acid 90％，448303)、proteinA(P3838)购自Sigma-Aldrich公司。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC HCl 98+％，5002E19M)、N-羟基琥玻酰亚胺(NHS 98+％，10130571)购自Alfa Aesar公司。FeCl₃ 6H₂O购自国药集团化学试剂有限公司。FeCl₂ 4H₂O购自广东.汕头市西陇化工厂。盐酸羟胺(NH₂OH HCl)购自北京化工厂。柠檬酸钠.2H₂O、四甲基氢氧化胺(TMAOH)10％(w/v)水溶液购自北京化学试剂公司。HAuCl₄ 4H₂O购自沈阳有色金属研究院。抗小鼠CD3单克隆抗体杂交瘤细胞株由北京大学医学部医学免疫重点实验室保存。若无特别说明，在实验过程中使用的纯净水均由Milli-Q水纯化系统(Millipore公司，Molsheim市，法国)制备而成。其余未提到的试剂均为分析纯，并且使用前无需进一步的纯化。

10mM磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)的配制方法：将8.0g NaCl、2.9gNa₂HPO₄·12H₂O、0.2g KH₂PO₄和0.2g KCl溶于1L纯净水。细胞分选缓冲溶液为含有0.1％(w/v)BSA和0.05％(v/v)吐温20的PBS溶液。

本发明采用的实验仪器为：

Avanti J-25离心机购自美国Beckman Coulter公司。JEM-200CX型透射电子显微镜(TEM)购自日本JEOL公司。D/MAX-2400型X射线衍射仪(XRD)购自日本理学株式会社。NU-5500E型细胞培养箱购自美国NUAIR公司。凝胶电泳仪(Mini PROTEAN 3 Cell型电泳槽、Power Pac Universal 500V/2.5A/500W电源)购自美国Bio-Rad公司。CARY1E型紫外可见分光光度计购自澳大利亚Varian公司。FACS Calibur 101型流式细胞仪购自美国BD公司。QB-206型多用途旋转摇床购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司。透析袋由华美科技有限公司提供(北京，中国)。钕铁硼强磁铁的大小为40*15*5mm。TomTec公司96孔细胞收集仪。EG&G公司β-counter。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：Fe₃O₄Au纳米颗粒的制备与表征

1、Fe₃O₄(15nm)纳米颗粒的制备

a.5.2g FeCl₃ 6H₂O，2.0g FeCl₂ 4H₂O溶于40mmol/L HCl水溶液，制成铁盐溶液；

b.在充分的机械搅拌下，将制得的铁盐溶液逐滴滴加至250mL 1.5mol/L NaOH水溶液中，整个过程中温度保持在80℃；

c.制得的Fe₃O₄纳米颗粒被磁铁分离，收集后用200mL纯净水洗涤4次，分散于100mL纯净水中，制成0.1mol/L的Fe₃O₄储存液。

2、Fe₃O₄Au(50-70nm)纳米颗粒的制备(图1)

a.5mL 0.1mol/L的Fe₃O₄储存液与1.5mL 0.2mol/L的NH₂OH HCl水溶液滴加至75mL 0.01mol/L TMAOH水溶液中，加热至80℃；

b.在充分搅拌下，40mL 0.1％(w/v)HAuCl₄水溶液滴加至上述溶液中，然后在2h内缓慢滴加100mL 15mmol/L柠檬酸钠水溶液，滴加完成后继续加热搅拌3h。该步骤中溶液温度保持在80℃；

c.生成的Fe₃O₄Au经磁铁分离后，用50mL纯净水洗涤2次，50mL乙醇洗涤2次，9,000rpm离心15min，弃去洗涤液，在真空干燥箱中60℃放置1-2h烘干。

3、Fe₃O₄Au(50-70nm)纳米颗粒的表征

Fe₃O₄与Fe₃O₄Au纳米颗粒的TEM表征如图2所示，Fe₃O₄纳米颗粒约为15nm，经金包裹后，Fe₃O₄Au纳米颗粒约为50-70nm。Fe₃O₄与Fe₃O₄Au纳米颗粒的XRD表征如图3所示，在金包裹后b图中出现了Au的三个特征衍射峰(111)、(200)和(220)，证明Au在Fe₃O₄外的包裹成功。

实施例2：小鼠CD3单克隆抗体的制备与纯化

1、小鼠CD3单克隆抗体的制备

a.将抗小鼠CD3单克隆抗体杂交瘤细胞株置于细胞培养基中，培养条件37℃和5％CO₂，每隔2天换一次细胞培养液，待细胞浓度大于10⁵个/孔时停止换液；

b.在抗体大量制备前几天，向健康Balb/c小鼠腹腔中注入石蜡油。将一定数量的单克隆细胞用无菌PBS溶液吹下，1,000rpm以下离心3-5min，细胞沉淀重悬于0.5mL PBS中，注入小鼠腹腔内；

c.单克隆细胞注入小鼠7-10天后，小鼠腹部可见明显胀大，取其腹水。用左手固定小鼠，用75％酒精消毒其腹部，再于小鼠下方放置一支试管，将灭菌的16号注射针头刺入小鼠下腹部，让腹水滴入试管内，当腹水停滴时，轻轻移动针头，并轻柔其腹部，使腹水继续滴出。一次可得到约1-3mL腹水。1,000rpm离心5min，吸取上层透明清液，冻于-20℃。

2、小鼠CD3单克隆抗体的纯化

a.制得的腹水从-20℃冰箱中取出后置于4℃冰箱使其融化，用等体积的10mMpH 7.4PBS溶液稀释。向腹水稀释液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵(50％饱和度)，置于4℃冰箱中过夜。将腹水稀释液11,000rpm离心，弃上清，用等体积的PBS溶液溶解沉淀；

b.将硫酸铵饱和度变为33％重复上述沉淀-溶解步骤2次，11,000rpm离心，弃去上清。沉淀用适量PBS溶解，置于PBS溶液中透析过夜；

c.纯化得到的抗体经SDS-PAGE分析，抗体纯度在85％以上(图4)。

3、CD3抗体对T淋巴细胞的刺激活性测试

a.将Balb/c小鼠脾细胞中分选出T淋巴细胞，以4×10⁵/孔的细胞数在96孔细胞培养板中，37℃，5％CO₂环境下培养96小时，同时加入1μg/ml的CD3抗体，设置不加抗体的孔作为对照，实验组与对照组各设三个平行孔。

b.终止培养前8小时每孔加入0.2μCi ³H-TdR。用96孔板细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维素滤纸上，测定放射活度，实验结果如图5所示。

实施例3：小鼠CD3抗体在磁珠上的定向偶联(图6)

1、Fe₃O₄Au纳米颗粒的表面羧基化

a.称取25mg Fe₃O₄Au纳米颗粒超声分散于10mL含有20mmol/L 16-巯基十六酸的乙醇溶液中，超声反应48h；

b.反应完毕后将磁珠溶液用乙醇洗涤3次，9,000rpm离心15min，重新分散至12.5mL乙醇中，制成2mg/mL羧基化的磁珠分散液。

2、CD3抗体在磁珠上的偶联

a.取500μL 2mg/mL羧基化的磁珠分散液，磁铁分离后弃去乙醇，重新分散于1mL含有20mg/mL EDC和10mg/mL NHS的水溶液中，超声反应1h，反应过程中每隔5min将反应液充分混匀一次；

b.将活化后的磁珠用磁铁分离后重新分散于1mL含有150μg/mL protein A的PBS溶液中，置于摇床上在4℃下以40rpm的速度混匀反应过夜。proteinA上的氨基与磁珠上活化的羧基反应生成肽键，使protein A以共价键偶联在磁珠上；

c.将偶联有protein A的磁珠用磁铁分离后重新分散于1mL含有100μg/mL CD3抗体的PBS溶液中，置于摇床上在4℃下以40rpm的速度混匀反应过夜，使CD3抗体的Fc段定向固定在偶联有protein A的磁珠上；

d.将定向偶联有CD3抗体的磁珠用磁铁分离，取清液用考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度，测得CD3抗体的偶联量为60±5(μg CD3抗体)/(mg磁珠)。将分离出的磁珠重新分散于1mL细胞分选缓冲溶液中，置于摇床上在4℃下以40rpm的速度混匀反应过夜，封闭磁珠上未反应的活性位点；

e.反应完毕后用1mL细胞分选缓冲溶液，洗涤磁珠两次，分散于1mL细胞分选缓冲溶液中，分装后置于-20℃冰箱中保存。

实施例4：小鼠脾细胞的磁性分选

1、将2×10⁶个小鼠脾细胞收集于EP管中，3,000rpm离心3min，用细胞分选缓冲溶液洗涤一次。加入400μL的CD3磁珠，将细胞重悬，室温孵育30min；

2、将EP管置于磁场中10min，吸出不含磁珠的细胞清液。将分选后的细胞溶液离心，弃去上清，加入100μL CD3-PE抗体染色，室温孵育15min，同时设置未分选的脾细胞作为对照；

3、用细胞分选缓冲溶液洗涤细胞2次，由流式细胞仪分析细胞组成，结果如图7所示，分选后CD3 T细胞在脾细胞中的含量由36.5％降为0.7％。

尽管上面的描述及图1-7以及公开了本申请的优选实施例，但是，可以设想，本领域的技术人员可在所附权利要求的精神和范围内设计对本发明的各种修改，上述内容均应落入本专利保护范围之内。

Claims

1.一种用于细胞阴性分选的磁珠的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)用共沉淀法制备15nm Fe₃O₄纳米颗粒，具体包括：

将摩尔比为2:1的FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O溶于40mmol/L HCl水溶液，制成铁盐水溶液；在机械搅拌下，将制得的铁盐溶液逐滴滴加至1.5mol/L NaOH水溶液中，该过程中控制温度保持在80℃；将制得的Fe₃O₄磁性纳米颗粒用磁铁分离、收集后用纯净水洗涤4次，再将Fe₃O₄磁性纳米颗粒分散于纯净水中，制成0.1mol/L的Fe₃O₄储备液，本步骤中使用的Fe³⁺、Fe²⁺与NaOH之间的摩尔比为2:1:37.5；

(2)用羟胺还原HAuCl₄的方法，在前述Fe₃O₄纳米颗粒表面包裹一层金，制得50-70nm的金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒，具体包括：

将前一步骤中制得的0.1mol/L的Fe₃O₄储备液与0.2mol/L的NH₂OH·HCl水溶液滴加至0.01mol/L TMAOH水溶液中，加热至80℃，在充分搅拌下，滴加0.1%(w/v) HAuCl₄水溶液，然后在2小时内缓慢滴加15mmol/L柠檬酸钠水溶液，滴加完成后继续加热搅拌3小时，该步骤中控制溶液温度保持在80℃；生成的金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒经磁铁分离后，先后分别用纯净水和乙醇各洗涤2次，9,000rpm离心15分钟，弃去洗涤液，在真空干燥箱中60℃放置1-2小时烘干，得到金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒，本步骤中使用的Fe₃O₄储备液、NH₂OH·HCl水溶液、TMAOH水溶液、HAuCl₄水溶液、柠檬酸钠水溶液之间的体积比为1:0.3:15：8:20，Fe₃O₄、NH₂OH·HCl、TMAOH、HAuCl₄和柠檬酸钠之间的摩尔比为5:3:7.5:1.2:15；

(3)用16-巯基十六酸将前述金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒表面羧基化，具体包括：

按重量(mg):体积(mL)为5:2的比例取金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒超声分散于20mmol/L 16-巯基十六酸的乙醇溶液中，超声反应48h；反应完毕后将磁珠溶液用乙醇洗涤3次，9,000rpm离心15分钟后，再分散至乙醇中，制成2mg/mL羧基化的磁珠分散液；

(4)将protein A以共价键偶联在前述被表面羧基化的颗粒上，具体包括：

a.活化：取前述羧基化的磁珠分散液，磁铁分离后弃去乙醇，重新分散于含有20mg/mL的EDC和10mg/mL的NHS的水溶液中，超声反应1小时，反应过程中每隔5分钟将反应液充分混匀一次，其中使用的磁珠分散液与含有EDC和NHS的水溶液两者体积比为1:2；

b.protein A偶联：将活化后的磁珠用磁铁分离后重新分散于含有150μg/mL protein A的PBS溶液中，置于摇床上在4℃下以40rpm的速度混匀反应12-14小时；

(5)使IgG型小鼠CD3抗体通过Fc段定向固定在前一步骤制得的偶联有protein A的磁珠上，具体包括：

将上一步骤获得的偶联有protein A的磁珠用磁铁分离后分散于含有100μg/mL小鼠CD3抗体的PBS溶液中，置于摇床上在4℃下以40rpm的速度混匀反应12-14小时，使CD3抗体通过Fc段定向固定在偶联有protein A的磁珠上；

(6)将使用前述方法制得的磁珠上未反应的活性位点进行封闭，具体包括:

将固定有CD3抗体的Fc段的磁珠分散于细胞分选缓冲溶液中，置于摇床上在4℃下以40rpm的速度混匀反应12-14小时。

2.采用权利要求1所述合成方法制备的用于细胞阴性分选的磁珠。

3.如权利要求2所述的磁珠在除去小鼠脾细胞中CD3 T细胞的用途。

4.一种小鼠脾细胞分选方法，其特征在于使用权利要求2所述的磁珠除去小鼠脾细胞中CD3 T细胞。