CN101891824A - 一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD - Google Patents
一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD Download PDFInfo
- Publication number
- CN101891824A CN101891824A CN 201010221471 CN201010221471A CN101891824A CN 101891824 A CN101891824 A CN 101891824A CN 201010221471 CN201010221471 CN 201010221471 CN 201010221471 A CN201010221471 A CN 201010221471A CN 101891824 A CN101891824 A CN 101891824A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- trxhis
- rgd
- hdll1
- fusion protein
- soluble fusion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD，它由人Delta-like1蛋白截短体即hDll1第127-225位氨基酸、血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD和TrxHis表达标签组成；表达载体是pET32a/hDll1-RGD。转化大肠杆菌BL21后采取28-30℃低温诱导24h实现与TrxHis可溶性融合表达，用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的TrxHis-hDll1-RGD蛋白。TrxHis-hDll1-RGD在体外可以通过基因工程进行大量生产，应用于体内时可以结合于血管内皮细胞表面，从而向内皮细胞和其他细胞提供针对Notch受体的激活型刺激，还可应用于在体外和体内研究Notch信号对细胞增殖、分化和凋亡的影响，以及治疗与血管新生相关的某些疾病如恶性肿瘤和视网膜黄斑变性。
Description
技术领域
本发明涉及一种可溶性融合蛋白，尤其是人Notch配体Delta-like1(hDll1)的截短体、血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD和氨基末端融合的TrxHis表达标签的一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD，属于医药技术领域。
背景技术
Notch信号途径广泛存在于多种生物体内，且进化上高度保守，在胚胎发育、血细胞发育及肿瘤形成等多种病理生理过程中发挥重要作用。
现已在哺乳动物中发现了四种Notch同源分子，即Notch 1-4，并发现了五种Notch配体，分别是Jagged1、2和Delta-like1、3、4。这些配体都是I型跨膜蛋白，N端有一个结合Notch受体必需的DSL结构域，由含6个半胱氨酸、3个甘氨酸的45个氨基酸组成；配体胞外区还含有数量不等的EGF样重复区；胞浆区很短，只有70-215个氨基酸残基，保守性差。其中，hDll1属于果蝇Delta配体在人的同源物，由723个氨基酸组成，其胞外段中有1个DSL结构域和8个EGF样重复区(Radtke F等，EMBO reports，2005，6：1120-1125；PfisterS等，J.Mol.Biol.，2003，333：229-35；Ascano JM等，J.Biol.Chem.，2003，278：8771-8779)。
Notch受体和配体都属于EGF样超家族分子。其细胞外区包含的多个EGF样重复序列可以参与邻近细胞表面的Notch配体和Notch受体之间相互作用。如Notch1的第11-12个EGF样重复序列可以与配体DSL结构域相互作用，从而激活Notch信号途径(Rebay I等，Cell，1991，67：687-699)。Notch信号的激活对细胞具有广泛而复杂的作用。在干细胞系统，Notch信号激活的主要作用是通过促进干细胞的增殖和存活、抑制干细胞的分化促使干细胞维持在低分化状态；在细胞的分化过程中，Notch信号途径的作用主要是辅助细胞在双向分化时选择其中的一个分化方向而抑制向另一个方向的分化，或者在细胞成熟过程中抑制细胞的成熟；在分化的细胞，Notch信号的激活可以影响细胞的功能状态。此外，Notch信号还参与多种复杂的病理过程，如肿瘤。研究发现，随着细胞所处状态不一，Notch信号激活可以抑制肿瘤或者促进肿瘤；Notch信号还是维持肿瘤干细胞的重要因素；此外，Notch信号途径对肿瘤微环境的形成和维持具有关键作用：Notch信号阻断可以破坏肿瘤新生血管的完整性，从而引起肿瘤组织缺氧而抑制肿瘤生长，Notch信号的激活还是巨噬细胞和树突状细胞发挥其抗肿瘤活性的关键因素。综上所述，建立激活或者阻断Notch信号途径的人工手段，具有重要的应用价值。
研究发现，Notch配体从N末端到DSL结构域的片段足以激活Notch信号途径(FitzgeraldK等，Development，1995，121：4275；Henderson ST等，Mol.Biol.Cell.，1997，8：1751；ParksAL等，Genetics，2006，174：1947-1961)。这些结果提示，如果能够在大肠杆菌中表达生产Notch配体的DSL结构域片段，有可能提供一种人工的刺激Notch信号途径的手段，用于在体外和体内研究Notch信号对细胞增殖、分化和凋亡的影响，以及治疗与血管新生相关的某些疾病如恶性肿瘤和视网膜黄斑变性。因此，近年来有多个研究组先后利用真核表达系统和原核表达系统，表达了不同的Notch配体的DSL结构域片段。但是活性分析的结果却不一致：有些表达产物可以激活Notch信号，有些则没有激活活性，有些甚至有抑制Notch信号激活的活性。总体来说，激活活性不佳，无法在实验研究中获得稳定结果，不能应用于体内。
可溶性Notch配体对Notch信号的激活活性不佳的主要原因是在Notch受体的激活过程中，在Notch受体的跨膜区附近要发生多个步骤的蛋白酶裂解反应。当Notch配体和Notch受体结合后，Notch跨膜区的S2位点暴露，并收到ADAM金属蛋白酶家族的TACE或Kuz的酶切。这时，切割产生的游离的胞外区必需在锚定于细胞表面的Notch配体的作用下，被表达Notch配体的细胞内吞(Endocytosis)。然后，在γ分泌酶的作用下，残存在细胞膜上Notch受体片段在跨膜区内发生裂解，向细胞内释放出Notch受体胞内段，引起Notch信号途径的激活。由这一过程可以看出，必需将Notch配体固定于固体(如细胞、塑料培养皿等)表面，才能有效地激活Notch受体。
血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD是以精氨酸(R)-甘氨酸(G)-门冬氨酸(D)为核心的多肽，可以特异识别血管内皮细胞表面的整合素分子，从而将与之融合的其他蛋白分子锚定于血管内皮细胞表面。
发明内容
本发明的目的是提供一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD，该蛋白可以结合于血管内皮细胞表面，有效地刺激细胞的Notch受体的激活。
本发明的技术方案是：一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD，其特征是：它是由人Delta-like1即hDll1蛋白截短体、血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD和融合的TrxHis表达标签组成；其中hDll1蛋白截短体是hDll1第127-225位氨基酸。
所述的hDll1第127-225位氨基酸包含负责与Notch受体结合的DSL结构域和部分上游序列；所述的血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD是该可溶性融合蛋白的羧基末端；所述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性融合蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是No1，并由No2的核酸序列编码：
No1：TrxHis-hDll1-RGD的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirg
iptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdsp
dlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygeg
csvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry；
No2：TrxHis-hDll1-RGD的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtc
gatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggc
aaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgact
ctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctc
gacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttct
ggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacg
acaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactc
atcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggcc
gcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtcc
ccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggcc
ctactgcacagagccgatctgccgaggagattgcggagttcgatat。
所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列编码：
No3：hDll1的DSL和上游片段的氨基酸序列
lhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrprddafghftc
gergekvcnpgwkgpyctepi；
No4：hDll1的DSL和上游片段的核酸序列
ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacccagaggc
acctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcctaccgct
tcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcggccacttca
cctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatc。
所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD具有No5的氨基酸序列，并由No6的核酸序列编码：
No5：RGD基序的氨基酸序列
crgdcgvry；
No6：RGD基序的核酸序列
tgccgaggagattgcggagttcgatat。
所述氨基末端融合的TrxHis表达标签，包含No7的氨基酸序列，并由No8的核酸序列编码：
No7：TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirg
iptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdsp
dlgtddddkamadigs；
No8：TrxHis的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtc
gatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggc
aaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgact
ctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctc
gacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttct
ggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacg
acaaggccatggctgatatcggatcc。
所述血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD是在大肠杆菌BL21中用低温诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的TrxHis-hDll1-RGD蛋白。
本发明的特点是：TrxHis-hDll1-RGD在体外可以通过基因工程进行大量生产，应用于体内时可以结合于血管内皮细胞表面，从而向内皮细胞和其他细胞提供针对Notch受体的激活型刺激，可应用于在体外和体内研究Notch信号对细胞增殖、分化和凋亡的影响，以及治疗与血管新生相关的某些疾病如恶性肿瘤和视网膜黄斑变性。
附图说明
图1、融合蛋白的结构、构建和作用模式图；
图2、目的基因(hDll1-RGD)的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳；
图3、表达载体pET32a-hDll1-RGD的结构示意图；
图4、表达载体pET32a-hDll1-RGD的酶切鉴定图；
图5、TrxHis-hDll1-RGD融合蛋白表达的蛋白电泳图；
图6、TrxHis-hDll1-RGD融合蛋白的纯化的电泳图及免疫印迹检测；
图7、TrxHis-hDll1-RGD融合蛋白与血管内皮细胞系的结合；
图8、游离的TrxHis-hDll1-RGD融合蛋白对Raji细胞Notch信号的激活作用；
图9、游离的TrxHis-hDll1-RGD融合蛋白对Raji细胞Notch信号的激活作用；
图10、与血管内皮细胞系结合的TrxHis-hDll1-RGD融合蛋白对Raji细胞Notch信号的激活作用；
图11、与血管内皮细胞系结合的TrxHis-hDll1-RGD融合蛋白对Raji细胞Notch信号的激活作用。
具体实施方式
以下通过附图结合实施例对本发明做详尽的说明。
1、构建表达载体。图1是融合蛋白的结构、构建和作用模式图。根据hDll1的序列、RGD九肽的序列(CRGDCGVRY)和其对照DGR九肽的序列(CDGRCGVRY)设计引物，P1：5’-CGGGATCCCTCCACACAGATTCTCCTG-3’；P2：5-CGGAATTCATATCGAACTCCGCAATCTCCTCGGCAGATCGGCTCTGTGCAGTAG-3’；P3：5’-CGGAATTCATATCGAACTCCGCATCGTCCATCGCAGATCGGCTCTGTGCAGTAG-3’。以pET32a-hDll1(127-225)(Shi ZX等，Protein Expr Purif.，2008，59：242-248)为模板，聚合酶链反应扩增编码hDll1-RGD和对照hDll1-DGR氨基酸的多核苷酸序列(其中hDll1为其氨基酸的127-225位)(图2)，1％琼脂糖电泳回收后与pMD18-T载体16℃连接2小时，热休克转化大肠杆菌XL10，扩增后将目的片段亚克隆至表达载体pET32a(+)，构建pET32a-hDll1-RGD(图3)和pET32a-hDll1-DGR，限制性酶切(图4)、测序鉴定。
图1、融合蛋白的结构、构建和作用模式图。
图2为目的基因(hDll1-RGD)的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，1道(M)是分子量标志(DL2000)，2和3道(PCR)分别是扩增hDll1的127-225位氨基酸片段融合DGR基序(hDll1-DGR)和hDll1的127-225位氨基酸片段融合RGD基序(hDll1-RGD)，箭头所指为扩增片段。
图3、表达载体pET32a-hDll1-RGD的结构示意图。
图4为表达载体pET32a-hDll1-RGD的酶切鉴定图；(质粒分别用限制性内切酶EcoRI+NotI和EcoRI+BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳观察结果。M道是marker DL2000，1-5道分别是不同克隆的酶切结果)
2、诱导表达融合蛋白。将表达载体pET32a(+)、pET32a-hDll1、pET32a-hDll1-DGR和pET32a-hDll1-RGD分别以热休克法转化大肠杆菌BL21，涂布含100μg/ml氨苄青霉素LB平板，37℃培养12小时后挑取单克隆接种到含100μg/ml氨苄青霉素LB液体培养基，200rpm，37℃培养12h，以1％转接到新鲜LB(+)培养基中，200rpm，37℃培养3h后，加入终浓度1.0mM的IPTG，200rpm，28-30℃培养24h。
3、获得TrxHis-hDll1-RGD和TrxHis-hDll1-DGR的包涵体蛋白。离心收集细菌，200μl/ml培养基PBS重悬细菌，超声裂菌，加入1％Triton-X100，混匀，4℃静置30分钟，4℃离心收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测发现，TrxHis-hDll1能以可溶形式存在于裂解上清中，而TrxHis-hDll1-RGD和TrxHis-hDll1-DGR蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中(图5)。
图5为TrxHis-hDll1-RGD融合蛋白表达的蛋白电泳图。将质粒pET32a(+)、pET32a-hDll1、pET32a-hDll1-DGR和pET32a-hDll1-RGD分别转化大肠杆菌BL21，小体积培养后IPTG诱导融合蛋白的表达，然后取全细菌裂解物、裂解上清(可溶性组分)和裂解沉淀(即包涵体)分别进行SDS-PAGE分析。M是分子量标志(由上到下分别是250KD，150KD，100KD，75KD，50KD，37KD，25KD，20KD)
4、纯化包涵体蛋白。pET32a(+)空载体蛋白TrxHis从细菌裂解上清中纯化，TrxHis-hDll1-DGR和TrxHis-hDll1-RGD以镍离子螯合柱(Invitrogen ProBondTM)纯化包涵体蛋白，为了减小误差，将TrxHis-hDll1也从包涵体中纯化，所有纯化步骤以ProBondTM纯化手册操作。纯化后的蛋白进行SDS-PAGE，然后用抗His标签抗体进行免疫印迹实验(Immuno-blot)，见在TrxHis-hDll1、TrxHis-hDll1-DGR、TrxHis-hDll1-RGD都可检测到大小正确的蛋白条带(图6)。
图6为TrxHis-hDll1-RGD融合蛋白的纯化及免疫印迹检测。从转化有质粒pET32a-hDll1、pET32a-hDll1-DGR和pET32a-hDll1-RGD的转化大肠杆菌BL21的裂解上清或过复性上清用镍金属螯合柱纯化含有His标签的蛋白，进行SDS-PAGE分析。M道是蛋白分子量标志。下图是融合蛋白免疫印迹检测结果，一抗是抗His标签抗体。
5、蛋白活性测定。
A.ECV304细胞爬片的免疫荧光染色。24孔板底部铺一片圆形盖玻片，然后接种1×105ECV304，分别在各孔加入5μg/ml表达的蛋白：TrxHis、TrxHis-hDll1、TrxHis-hDll1-DGR和TrxHis-hDll1-RGD，48h后弃去培养基，4％多聚甲醛固定，抗His的单抗染色过夜，第二天用PBS洗涤后，抗小鼠IgG-FITC染色两小时，之后PBS洗涤，Hoechst染色10min，PBS洗涤，50％甘油封片，荧光显微镜下观察并采集图像。见只有加入TrxHis-hDll1-RGD的细胞呈现绿色荧光信号，且定位于细胞表面(图7)。
图7为TrxHis-hDll1-RGD融合蛋白与血管内皮细胞系的结合。体外培养内皮细胞系ECV304，加入纯化的蛋白TrxHis、TrxHis-hDll1、TrxHis-hDll1-DGR和TrxHis-hDll1-RGD，48h后用抗His抗体进行免疫荧光染色，Hoechst染色细胞核，荧光显微镜观察。B.实时定量检测重组蛋白TrxHis-hDll1-RGD激活Notch下游基因Hes的表达。六孔板接种1×106Raji细胞，分别在各孔加入5μg表达的蛋白：TrxHis和TrxHis-hDll1-RGD，12h后TRzol法提取RNA，反转录成cDNA后，实时定量PCR检测Notch下游基因Hes1和Hes5的表达变化。结果显示TrxHis-hDll1-RGD可以有效地刺激Hotch信号下游基因Hes1和Hes5的表达(图8，图9)，提示具有激活Notch信号的活性。
图8为游离的TrxHis-hDll1-RGD融合蛋白对Raji细胞Notch信号的激活作用。培养Raji细胞，向培养基中加入纯化的蛋白TrxHis和TrxHis-hDll1-RGD，12h后收获细胞，提取总RNA，用实时定量RT-PCR检测Notch下游基因Hes1的表达水平(＊P＜0.05)。
图9为游离的TrxHis-hDll1-RGD融合蛋白对Raji细胞Notch信号的激活作用。培养Raji细胞，向培养基中加入纯化的蛋白TrxHis和TrxHis-hDll1-RGD，12h后收获细胞，提取总RNA，用实时定量RT-PCR检测Notch下游基因Hes5的表达水平(＊P＜0.05)。
为了更进一步确定表达的TrxHis-hDll1-RGD事结合于整合素分子，并且能更好的激活Notch信号，将培养皿接2×105ECV304细胞，48h后加入终浓度为10μg/ml的丝裂霉素作用2.5h后弃去培养液，PBS洗一遍后，换新的培养液，接种1×106ECV304细胞，分别在各孔加入5μg/ml表达的蛋白：TrxHis、TrxHis-hDll1、TrxHis-hDll1-DGR和TrxHis-hDll1-RGD，12h后TRzol法提取RNA，反转录成cDNA后，实时定量PCR检测Notch下游基因Hes1和Hes5的表达变化。结果显示与非细胞表面锚定的TrxHis-hDll1相比，TrxHis-hDll1-RGD可以更有效地有效地刺激Notch信号下游基因Hes1和Hes5的表达(图10，图11)，提示具有激活Notch信号的活性。
图10为与血管内皮细胞系结合的TrxHis-hDll1-RGD融合蛋白对Raji细胞Notch信号的激活作用。培养ECV304细胞，用丝裂霉素C抑制细胞增殖，向培养液加入纯化的蛋白TrxHis、TrxHis-hDll1、TrxHis-hDll1-DGR和TrxHis-hDll1-RGD，2.5h后换液，在加入Raji细胞，培养12h后收获Raji细胞，提取总RNA，用实时定量RT-PCR检测Notch下游基因Hes1的表达水平(＊P＜0.05)。
图11为与血管内皮细胞系结合的TrxHis-hDll1-RGD融合蛋白对Raji细胞Notch信号的激活作用。培养ECV304细胞，用丝裂霉素C抑制细胞增殖，向培养液加入纯化的蛋白TrxHis、TrxHis-hDll1、TrxHis-hDll1-DGR和TrxHis-hDll1-RGD，2.5h后换液，再加入Raji细胞，培养12h后收获Raji细胞，提取总RNA，用实时定量RT-PCR检测Notch下游基因Hes5的表达水平(＊＊P＜0.01)。
由以上可制得本发明这种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD，它是由人Delta-like1即hDll1蛋白截短体、血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD和融合的TrxHis表达标签组成；其中hDll1蛋白截短体是hDll1第127-225位氨基酸。
所述的hDll1第127-225位氨基酸包含负责与Notch受体结合的DSL结构域和部分上游序列；所述的血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD是该可溶性融合蛋白的羧基末端；所述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性融合蛋白的氨基末端。其中，氨基酸序列是No1，并由No2的核酸序列编码：
No1：TrxHis-hDll1-RGD的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirg
iptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdsp
dlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygeg
csvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry；
No2：TrxHis-hDll1-RGD的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtc
gatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggc
aaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgact
ctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctc
gacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttct
ggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacg
acaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactc
atcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggcc
gcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtcc
ccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggcc
ctactgcacagagccgatctgccgaggagattgcggagttcgatat。
所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列编码：
No3：hDll1的DSL和上游片段的氨基酸序列
lhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrprddafghftc
gergekvcnpgwkgpyctepi；
No4：hDll1的DSL和上游片段的核酸序列
ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacccagaggc
acctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcctaccgct
tcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcggccacttca
cctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatc。
所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD具有No5的氨基酸序列，并由No6的核酸序列编码：
No5：RGD基序的氨基酸序列
crgdcgvry；
No6：RGD基序的核酸序列
tgccgaggagattgcggagttcgatat。
所述氨基末端融合TrxHis表达标签，包含No7的氨基酸序列，并由No8的核酸序列编码：
No7：TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirg
iptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakdwferqhmdsp
dlgtddddkamadigs；
No8：TrxHis的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtc
gatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggc
aaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgact
ctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctc
gacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttct
ggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacg
acaaggccatggctgatatcggatcc。
所述血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD是在大肠杆菌BL21中用低温诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的TrxHis-hDll1-RGD蛋白。
本发明的一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD在体外可以通过基因工程进行大量生产，应用于体内时可以结合于血管内皮细胞表面，从而向内皮细胞和其他细胞提供针对Notch受体的激活型刺激，还可应用于在体外和体内研究Notch信号对细胞增殖、分化和凋亡的影响，以及治疗与血管新生相关的某些疾病如恶性肿瘤和视网膜黄斑变性。
序列表：
序列号No1：TrxHis-hDll1-RGD的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirg
iptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdsp
dlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygeg
csvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry
序列号No2：TrxHis-hDll1-RGD的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtc
gatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggc
aaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgact
ctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctc
gacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttct
ggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacg
acaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactc
atcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggcc
gcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtcc
ccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggcc
ctactgcacagagccgatctgccgaggagattgcggagttcgatat
序列号No3：hDll1的DSL和上游片段的氨基酸序列
lhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrprddafghftc
gergekvcnpgwkgpyctepi
序列号No4：hDll1的DSL和上游片段的核酸序列
ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacccagaggc
acctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcctaccgct
tcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcggccacttca
cctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatc
序列号No5：RGD基序的氨基酸序列
crgdcgvry
序列号No6：RGD基序的核酸序列
tgccgaggagattgcggagttcgatat
序列号No7：TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirg
iptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdsp
dlgtddddkamadigs
序列号No8：TrxHis的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtc
gatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggc
aaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgact
ctgctgctgttcaaaaacggtgtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctc
gacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttct
ggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacg
acaaggccatggctgatatcggatcc
SEQUENCE LISTING
<110>中国人民解放军第四军医大学
<120>一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD
<130>无
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>273
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met
145 150 155 160
Ala Asp Ile Gly Ser Leu His Thr Asp Ser Pro Asp Asp Leu Ala Thr
165 170 175
Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile Ser Arg Leu Ala Thr Gln Arg His Leu
180 185 190
Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser Gln Asp Leu His Ser Ser Gly Arg Thr
195 200 205
Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly
210 215 220
Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly His
225 230 235 240
Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly Glu Lys Val Cys Asn Pro Gly Trp Lys
245 250 255
Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro Ile Cys Arg Gly Asp Cys Gly Val Arg
260 265 270
Tyr
<210>2
<211>819
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360
catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480
gctgatatcg gatccctcca cacagattct cctgatgacc tcgcaacaga aaacccagaa 540
agactcatca gccgcctggc cacccagagg cacctgacgg tgggcgagga gtggtcccag 600
gacctgcaca gcagcggccg cacggacctc aagtactcct accgcttcgt gtgtgacgaa 660
cactactacg gagagggctg ctccgttttc tgccgtcccc gggacgatgc cttcggccac 720
ttcacctgtg gggagcgtgg ggagaaagtg tgcaaccctg gctggaaagg gccctactgc 780
acagagccga tctgccgagg agattgcgga gttcgatat 819
<210>3
<211>99
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>3
Leu His Thr Asp Ser Pro Asp Asp Leu Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg
1 5 10 15
Leu Ile Ser Arg Leu Ala Thr Gln Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu
20 25 30
Trp Ser Gln Asp Leu His Ser Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser
35 40 45
Tyr Arg Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val
50 55 60
Phe Cys Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Gly Glu Lys Val Cys Asn Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys Thr
85 90 95
Glu Pro Ile
<210>4
<211>297
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>4
ctccacacag attctcctga tgacctcgca acagaaaacc cagaaagact catcagccgc 60
ctggccaccc agaggcacct gacggtgggc gaggagtggt cccaggacct gcacagcagc 120
ggccgcacgg acctcaagta ctcctaccgc ttcgtgtgtg acgaacacta ctacggagag 180
ggctgctccg ttttctgccg tccccgggac gatgccttcg gccacttcac ctgtggggag 240
cgtggggaga aagtgtgcaa ccctggctgg aaagggccct actgcacaga gccgatc 297
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
Cys Arg Gly Asp Cys Gly Val Arg Tyr
1 5
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tgccgaggag attgcggagt tcgatat 27
<210>7
<211>165
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met
145 150 155 160
Ala Asp Ile Gly Ser
165
<210>8
<211>495
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360
catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480
gctgatatcg gatcc 495
Claims (6)
1.一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD，其特征是：它是由人Delta-like1即hDll1蛋白截短体、血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD和融合的TrxHis表达标签组成；其中hDll1蛋白截短体是hDll1第127-225位氨基酸。
2.根据权利要求1所述的一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD，其特征是：所述的hDll1第127-225位氨基酸包含负责与Notch受体结合的DSL结构域和部分上游序列；所述的血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD是该可溶性融合蛋白的羧基末端；所述的融合的TrxHis表达标签是该可溶性融合蛋白的氨基末端；其中，氨基酸序列是No1，并由No2的核酸序列编码：
No1：TrxHis-hDll1-RGD的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirg
iptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdsp
dlgtddddkamadigslhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygeg
csvfcrprddafghftcgergekvcnpgwkgpyctepicrgdcgvry；
No2：TrxHis-hDll1-RGD的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtc
gatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggc
aaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgact
ctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctc
gacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttct
ggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacg
acaaggccatggctgatatcggatccctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactc
atcagccgcctggccacccagaggcacctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggcc
gcacggacctcaagtactcctaccgcttcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtcc
ccgggacgatgccttcggccacttcacctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggcc
ctactgcacagagccgatctgccgaggagattgcggagttcgatat。
3.根据权利要求1所述的一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD，其特征是：所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD具有No3的氨基酸序列，并由No4的核酸序列编码：
No3：hDll1的DSL和上游片段的氨基酸序列
lhtdspddlatenperlisrlatqrhltvgeewsqdlhssgrtdlkysyrfvcdehyygegcsvfcrprddafghftc
gergekvcnpgwkgpyctepi；
No4：hDll1的DSL和上游片段的核酸序列
ctccacacagattctcctgatgacctcgcaacagaaaacccagaaagactcatcagccgcctggccacccagaggc
acctgacggtgggcgaggagtggtcccaggacctgcacagcagcggccgcacggacctcaagtactcctaccgct
tcgtgtgtgacgaacactactacggagagggctgctccgttttctgccgtccccgggacgatgccttcggccacttca
cctgtggggagcgtggggagaaagtgtgcaaccctggctggaaagggccctactgcacagagccgatc。
4.根据权利要求1所述的一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD，其特征是：所述的血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD具有No5的氨基酸序列，并由No6的核酸序列编码：
No5：RGD基序的氨基酸序列
crgdcgvry；
No6：RGD基序的核酸序列
tgccgaggagattgcggagttcgatat。
5.根据权利要求2所述的一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD，其特征是：所述氨基末端融合TrxHis表达标签，包含No7的氨基酸序列，并由No8的核酸序列编码：
No7：TrxHis的氨基酸序列
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirg
iptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdsp
dlgtddddkamadigs；
No8：TrxHis的核酸序列
atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtc
gatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggc
aaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgact
ctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctc
gacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttct
ggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacg
acaaggccatggctgatatcggatcc。
6.根据权利要求1所述的一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD，其特征是：所述血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD是在大肠杆菌BL21中用低温诱导方法实现可溶性表达，并用针对His标签的镍金属螯合柱纯化，蛋白裂解后获得纯的TrxHis-hDll1-RGD蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102214717A CN101891824B (zh) | 2010-07-08 | 2010-07-08 | 一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102214717A CN101891824B (zh) | 2010-07-08 | 2010-07-08 | 一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101891824A true CN101891824A (zh) | 2010-11-24 |
| CN101891824B CN101891824B (zh) | 2012-05-09 |
Family
ID=43101194
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010102214717A Expired - Fee Related CN101891824B (zh) | 2010-07-08 | 2010-07-08 | 一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101891824B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104479029A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-04-01 | 中国人民解放军第四军医大学 | Notch配体Delta-like1融合蛋白的纯化与复性的方法 |
| CN104869987A (zh) * | 2012-09-07 | 2015-08-26 | 麻省眼耳医院 | 用于再生毛细胞和/或支持细胞的方法及组合物 |
-
2010
- 2010-07-08 CN CN2010102214717A patent/CN101891824B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 《细胞与分子免疫学杂志》 20081231 黄斯勇等 人Delta-like1ext-Fcc融合蛋白......构建及表达 450-452 1-6 第28卷, 第5期 2 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104869987A (zh) * | 2012-09-07 | 2015-08-26 | 麻省眼耳医院 | 用于再生毛细胞和/或支持细胞的方法及组合物 |
| CN104869987B (zh) * | 2012-09-07 | 2020-10-16 | 麻省眼耳医院 | 用于再生毛细胞和/或支持细胞的方法及组合物 |
| CN112359018A (zh) * | 2012-09-07 | 2021-02-12 | 麻省眼耳医院 | 用于再生毛细胞和/或支持细胞的方法及组合物 |
| CN104479029A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-04-01 | 中国人民解放军第四军医大学 | Notch配体Delta-like1融合蛋白的纯化与复性的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101891824B (zh) | 2012-05-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102121023B (zh) | 突变型人纤溶酶原kringle5及其制备方法及应用 | |
| CN110845603B (zh) | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 | |
| CN109575126B (zh) | 多肽、其生产方法和用途 | |
| CN102153653B (zh) | 肿瘤血管靶向多肽与组织因子的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN101717449B (zh) | 重组TRAIL-Fc融合蛋白及其制备和应用 | |
| KR20170042366A (ko) | 디스인테그린 변이체 및 이의 약학적 용도 | |
| CN101003788A (zh) | 一种蝎抗肿瘤转移肽及其制备方法和应用 | |
| CN107987153A (zh) | 高亲和力的可溶性pd-1分子 | |
| CN101643511B (zh) | 抑制端粒酶活性的融合蛋白、其制备及应用 | |
| CN107446022B (zh) | 一种可拮抗parp1蛋白rna结合活性的多肽pip-14及其应用 | |
| CN101671396B (zh) | 与胶原蛋白特异结合的血管内皮生长因子及其应用 | |
| CN101891824B (zh) | 一种血管靶向可溶性融合蛋白TrxHis-hDll1-RGD | |
| CN107236046A (zh) | 一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN104726461A (zh) | 甲鱼胶原蛋白基因功能片段及其重组蛋白和应用 | |
| CN102898514B (zh) | 重组人神经生长因子缺失突变体及其制备方法和用途 | |
| CN107446024B (zh) | 一种可拮抗ddx3蛋白rna结合活性的多肽dip-13及其应用 | |
| CN114605501B (zh) | 一种可拮抗fus蛋白rna结合活性的多肽fip-21及其应用 | |
| CN101092452A (zh) | 肿瘤抑素抗血管生成小分子多肽、融合蛋白及两者制备方法 | |
| CN101897953B (zh) | 无创性高穿透性表皮生长因子及其应用 | |
| CN109400711A (zh) | 一种PDGFRβ靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途 | |
| CN103865899B (zh) | 具有vegfr2/kdr受体特异性的融合毒素及其编码基因与应用 | |
| CN108295244A (zh) | 用于治疗乳腺肿瘤的多肽 | |
| CN102648977B (zh) | 滤泡素抑制素样蛋白1在调节钠钾atp酶活性中的用途 | |
| CN105367663A (zh) | 一种长效白细胞介素-1受体拮抗剂重组融合蛋白及其制备方法和用途 | |
| CN106674353A (zh) | 一种新的天花粉融合蛋白及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120509 Termination date: 20150708 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |