CN101890042B

CN101890042B - 中药复方制剂砷靛参及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN101890042B
Application number: CN 200910051409
Authority: CN
Inventors: 陈竺; 陈赛娟; 王兰; 周光飚; 刘舒畅; 刘萍
Original assignee: Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Current assignee: Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date: 2009-05-18
Filing date: 2009-05-18
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2029-05-18
Also published as: CN101890042A

Abstract

本发明涉及一种中药复方制剂砷靛参及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。其中该中药复方制剂中的活性组分四硫化四砷、靛玉红和丹参酮IIA的重量比为1～10∶1∶1。本发明的中药复方制剂砷靛参可以在制备抗肿瘤的药物中应用。药理实验结果显示，中药复方制剂砷靛参可治疗多种肿瘤疾病。

Description

中药复方制剂砷靛参及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其是四硫化四砷As₄S₄(A)、丹参酮IIA(T)、靛玉红(I)组成的中药复方制剂砷靛参及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

白血病是一组基因组发生异常的造血干/祖细胞疾病，根据自然病程和白血病细胞的成熟程度，分为急性白血病和慢性白血病。根据细胞系列的不同，急性白血病分急性淋巴细胞性白血病(Acute Lymphoid Leukemia，ALL)与急性髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)，后者又分M0～M7几个亚型；慢性白血病又分成慢性粒细胞性白血病(Chronic Myeloid Leukemia，CML)和慢性淋巴细胞性白血病(Chronic Lymphoid Leukemia，CLL)。

英法美协作组(FAB协作组)于1976和1985年先后提出了AML的形态学诊断标准及修改建议，1991年又增补一特殊亚型，即AML微分化型。

(1)M0(急性髓系白血病微分化型)：骨髓中原始细胞≥90％(NEC)，胞浆大多透亮或中度嗜碱，五嗜天青颗粒及Auer小体，核仁明显，类似ALL-12型，细胞化学过氧化酶及苏丹黑B染色＜3％；免疫表型髓系标志CD33及(或)CD13可阳性。淋系抗原阴性，但可有CD7+，Td T+；电镜髓过氧化酶(MPO)阳性。

(2)M1(急性白粒细胞白血病未化型)：原始细胞(I+II型)≥90％(NEC)，其中至少有3％的原粒细胞过氧化酶或苏丹黑染色阳性，早幼粒细胞以下的各阶段粒细胞或单核细胞＜10％。

(3)M2(急性粒细胞性白血病部分分化型)：原粒细胞(I+II型)占30％～90％(NEC)，早幼粒细胞以下至中性分叶核粒细胞＞10％，单核细胞＜20％；如有的早期粒细胞形态特点既不像原粒细胞I型或II型，也不像早幼粒细胞(正常的或多颗粒型)，核染色质很细，有1～2个核仁，胞浆丰富，嗜碱性，有不等量的颗粒，有时颗粒聚集，这类细胞＞10％时，亦属此型。

(4)M3(急性早幼粒细胞白血病)：骨髓中以异常的多颗粒早幼粒细胞为主。

(5)M4(急性粒单核细胞白血病)：有下列多种情况。

1)骨髓原始细胞＞30％(NEC)，原粒细胞加早幼、中性中幼及其他中性粒细胞占30％～80％，不同成熟阶段的单核细胞(常为幼稚及成熟单核细胞)＞20％。

2)骨髓如上所述，外周血中单核细胞系(包括原始、幼稚及成熟单核细胞)≥5×10⁹个/L。

3)骨髓如上所述，外周血单核细胞系＜5×10⁹个/L，而血清溶菌酶以及细胞化学支持单核细胞数量显著者。

4)骨髓类似M2，而单核细胞系＞20％，或血清溶菌酶超过正常(11.5±4)mg/L的3倍，或尿溶菌酶超过正常(2.5mg/L)的3倍。

5)骨髓类似M2，而外周血单核细胞系≥5×10⁹个/L时亦可划分为M4。M4EO(急性粒单核细胞白血病伴嗜酸粒细胞增多)：除具有上述M4个性特点外，骨髓嗜酸粒细胞＞5％(NEC)，其形态除有典型的嗜酸颗粒外，还有大而不成熟的嗜碱颗粒，核常不分叶，细胞化学氯乙酸脂酶及PAS染色明显阳性。

(6)M5(急性单核细胞白血病)：又分为两种亚型。

M5a：骨髓原单核细胞I+II型≥80％(NEC)。

M5b：骨髓原单核细胞I+II型＜80％(NEC)，其余为幼稚及成熟单核细胞等。

(7)M6(红白血病)：骨髓原始细胞(原粒细胞或原单核细胞，NEC)I+II型≥30％，红细胞系≥50％。

(8)M7(急性巨核细胞白血病)：骨髓原巨核细胞≥30％，如原始细胞呈未分化型，形态不能确定时，应做电镜血小板过氧化物酶活性检查，或用血小板膜糖蛋白IIb/IIIa或VIIIR；Ag以证明其为巨核细胞系。如骨髓干抽，有骨髓纤维化，则需骨髓活体组织检查。用免疫酶标记技术证实有巨核细胞增多。

急性早幼粒细胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia，APL)是AML的M3型。在APL中，骨髓中以颗粒增多的异常早幼粒细胞增生为主，占非幼红细胞的＞30％，其胞核大小不一，胞浆中有大小不等的颗粒，又分二个亚型：M3a为粗颗粒型，嗜苯胺兰颗粒粗大，密集甚或融合；M3b为细颗粒型，嗜苯胺兰颗粒密集而细小。

APL是临床上第一个应用诱导分化治疗取得成功和第一种针对肿瘤特异性标志分子进行治疗的人类恶性肿瘤。95％以上APL患者具有特征性的非随机染色体易位t(15；17)。该易位使15号染色体上的早幼粒细胞白血病(PML)基因与17号染色体上的维甲酸受体α(RARα)基因发生融合，表达PML-RARα融合蛋白。少数变异型APL患者产生染色体易位t(11；17)，该易位使11号染色体上的早幼粒细胞白血病锌指(PLZF)b与17号染色体上同样的RARα基因发生融合，表达为PLZF-RARα融合蛋白。分化诱导剂全反式维甲酸(ATRA)可引起PML-RARα蛋白的降解，可以使大多数APL患者取得完全缓解。三氧化二砷(As₂O₃，ATO)可以通过促进PML-RARα蛋白的降解，有效地治疗白急性早幼粒细胞血病。最近报道，ATRA/ATO联用可以使90％APL病人达到4年无病生存率。

慢性粒细胞性白血病(Chronic Myelogeous Leukemia，CML)，是一种以费城染色体(Philadephia，Ph)为特征发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。CML约占成人白血病的15％～20％，在各年龄段均可发病，以中老年病例为常见。CML以t(9，22)(q34，q11)染色体异位形成的融合基因BCR-ABL(breakpoint cluster，BCR)为主要标志，短小的22号染色体称为费城染色体。BCR-ABL融合基因表达BCR-ABL蛋白。BCR-ABL激酶在细胞信号转导和转化中发挥重要作用，它通过磷酸化和活化一系列下游底物，促使BCR-ABL阳性白血病发病。

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是浆细胞的恶性肿瘤。骨髓瘤细胞在骨髓内克隆性增殖，引起溶骨性骨骼破坏，骨髓瘤细胞分泌单株免疫球蛋白，正常的多株免疫球蛋白合成受抑制，本周蛋白随尿液排出，常伴有贫血，肾衰竭和骨髓瘤髓外侵润所致的各种损害。治疗的主要目的仍是减轻症状、延长生存期及改善生存质量。2000年ATO被美国FDA批准用于治疗MM，其单药治疗复发性和顽固性MM的总反应率约为30％。MM的骨髓微血管明显增多，新生血管在MM发病机制中起重要作用。多数研究认为，ATO治疗MM即可通过直接和间接途径抑制血管生成。

恶性淋巴瘤是一组淋巴系统增殖性疾病，其发病率近年在世界范围内呈上升趋势，其中主要是非霍奇金淋巴瘤(NHL)发病率的增加，化疗是NHL的主要治疗手段，常规方案化疗未缓解或缓解后很快复发的NHL是临床治疗的难题，目前迫切需要不断挖掘和探索新的药物，尤其是作用机制不同于常规的化疗药物。三氧化二砷(As₂O₃)对多种淋巴瘤细胞株具有诱导凋亡作用，并通过下调血管内皮生长因子(VEGF)产生抗血管新生的效益从而抑制增殖。砷剂对复发难治性恶性淋巴瘤有较好疗效，能克服常规化疗药物耐药性；大多数情况下毒性反应温和，采取积极措施可以有效地预防严重肾毒性，是治疗恶性淋巴瘤的又一选择，值得临床试用。

骨髓增生异常综合症(Myelodysplastic Syndrome MDS)，是骨髓造血干细胞疾病，常发生在老年人，骨髓造血细胞在质和量上发育异常，导致病态造血，而周围血表现为一系、二系或全血细胞减少、依赖输血和进展为急性白血病为特点的一组恶性克隆性疾病除异基因骨髓移植外尚无有效治疗方法，但异基因骨髓移植受供者来源限制，并且移植相关并发症和死亡率很高，限制了其在老年MDS患者的应用。目前MDS的标准治疗是支持治疗。体外试验提示，亚砷酸对MDS患者的骨髓单个核细胞有促凋亡和诱导分化的作用，是具有潜力的治疗MDS的新药，而且老年人对砷剂的耐受性好。

肺癌是一种常见的肺部恶性肿瘤，其死亡率已占癌症死亡率之首。绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮。肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，一般可分为原发性肝癌和转移性肝癌。胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，死亡率高。食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2％，我国是食管癌的高发地区。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种中药复方制剂砷靛参ATI。

本发明的另一个目的是提供上述的中药复方制剂砷靛参ATI的制备方法。

本发明的又一目的在于提供上述的中药复方制剂砷靛参ATI在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明的中药复方制剂砷靛参ATI，其中的活性组分四硫化四砷、靛玉红和丹参酮IIA的重量比为1～10∶1∶1。

优选地，本发明的中药复方制剂砷靛参ATI，其中的活性组分四硫化四砷、靛玉红和丹参酮IIA的重量比为2～7∶1∶1。

更优选地，本发明的中药复方制剂砷靛参ATI，其中的活性组分四硫化四砷、靛玉红和丹参酮IIA的重量比为4～5∶1∶1。

本发明的中药复方制剂砷靛参ATI的制备方法为：将四硫化四砷、靛玉红和丹参酮IIA的粉末按重量比混合均匀后，加入药学上可接受的辅料制成。

本发明的中药复方制剂砷靛参ATI可以在制备治疗肿瘤的药物中应用，具体地，可以在制备治疗白血病(包括急性淋巴性细胞白血病、急性髓性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症及肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌、肠癌等实体瘤或淋巴瘤的药物中应用。

上述的急性髓性白血病包括M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6和M7亚型。

本发明所述的中药复方制剂砷靛参ATI在制备治疗上述疾病的药物时，ATI中的三种活性组分具有协同增效的作用，其中A为主要活性成分，T和I为辅助活性成分。

中药复方制剂砷靛参ATI能够抑制白血病细胞增殖、诱导白血病细胞分化凋亡、引起PML-RARα致癌蛋白增强泛素化和降解以及引起APL细胞周期G0/G1阻滞。

本发明所述的中药复方制剂砷靛参ATI可以诱导体内和体外APL细胞终末分化，对ATRA耐药的NB4-R2细胞株亦有明显的诱导分化作用。

本发明所述的中药复方制剂砷靛参ATI可以上调AQP9蛋白，从而有利于提高细胞对As的吸收。

中药复方制剂砷靛参ATI在治疗AML M3即APL时的分子机制在于：在分子水平上作用于PML-RARα肿瘤蛋白，可使其增强泛素化并降解，从而抑制APL白血病细胞的增殖、生长，并诱导其凋亡。中药复方制剂砷靛参ATI中的三种成分对人体APL细胞分化具有协同增效作用，其中A为主要活性成分，T和I为辅助活性成分，中药复方制剂砷靛参ATI能够诱导APL细胞周期G0/G1阻滞；T和I通过与A共同作用上调跨膜蛋白AQP9从而提高As的吸收度。

特异地，中药复方制剂砷靛参ATI在治疗慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤及肝癌、肺癌、胃癌、食管癌等实体瘤或淋巴瘤时的分子机制在于：ATI下调CDK2，降低磷酸化组蛋白H1、上调P27，抑制细胞从G1到S期、上调P27Rb，抑制细胞进入S期，从而抑制肿瘤细胞增殖，达到治疗以上各类恶性肿瘤的目的。

本发明提供了中药复方制剂砷靛参ATI在临床医学上作为治疗肿瘤尤其是白血病、骨髓增生异常综合症、多发性骨髓瘤及肝癌、肺癌、胃癌、食管癌等实体瘤或淋巴瘤药物的用途。中药复方制剂砷靛参ATI为白血病患者提供了新的治疗药物，可进一步提高白血病患者的疗效，具有剂量小、价格低、副作用小的特点。中药复方制剂砷靛参ATI可用于AML M3即APL初发、复发期的治疗，还可以用于慢性期、加速期和急变期的治疗，也可以用于耐ATRA的急性早幼粒白血病的治疗。

附图说明

图1是ATI中各组分的不同组合处理的APL小鼠生存期图。

图2是ATI中各组分的不同组合处理的APL小鼠体重变化的曲线图。

图3是ATI中各组分的不同组合处理的APL小鼠骨髓和外周血中Gr-1和Mac-1阳性细胞比例图。

图4是ATI中各组分的不同组合处理的APL细胞形态图。

图5是ATI中各组分的不同组合处理的细胞NBT阳性率和CD11b/CD14表达流式检测图。

图6是ATI中各组分的不同组合体外处理的白血病细胞CD11b表达图。

图7是ATI中各组分的不同组合处理NB4和NB4-R2细胞后，PML-RARα蛋白降解图。

图8是ATI中各组分的不同组合的蛋白质印迹图。

图9是ATI中各组分的不同组合在蛋白水平上对NB4细胞分化调控子作用图。

图10是ATI中各组分的不同组合在mRNA水平上对NB4细胞分化调控子作用图(半定量RT-PCR测定)。

图11是ATI中各组分的不同组合上调RARβ2图(RT-PCR测定)。

图12是ATI中各组分的不同组合导致RARβ2从HADC1上解离图。

图13是ATI中各组分的不同组合处理NB4和NB4-R2细胞后的G0/G1期的比例图。

图14是ATI中各组分的不同组合对NB4和NB4-R2细胞周期调控子的作用图。

图15是说明ATI中各组分的不同组合下调CDK2，导致H1磷酸化水平降低的图。

图16是ATI中各组分的不同组合处理的NB4细胞内As浓度图。

图17是说明ATI中各组分的不同组合作用在转录水平上调AQP9的图。

图18是说明ATI中各组分的不同组合作用在蛋白水平上调AQP9的图。

图19是ATI中各组分的不同组合处理后的NB4细胞对AQP9表达的免疫荧光分析图。

图20是ATI中各组分的不同组合处理后的AQP9特异siRNA下调AQP9表达分析图。

图21是AQP9特异siRNA干扰的NB4细胞(NB4-AQP9-Si)与未被siRNA干扰的NB4细胞(NC)被ATI中各组分的不同组合处理后，细胞内As浓度的对比图。

图22是对AQP9特异siRNA干扰的NB4细胞(NB4-AQP9-Si)与未被siRNA干扰的NB4细胞(NC)被ATI中各组分的不同组合处理后，CD11b表达分析图。

具体实施方式

制备实施例

四硫化四砷为中药雄黄中的主要活性成分，靛玉红为中药青黛中的主要活性成分，丹参酮IIA为中药丹参中的活性成分。在制备实施例中，可以使用从上述中药中提纯的有效成分，也可以使用上述中药的提取物。

制备实施例1

将四硫化四砷、靛玉红和丹参酮IIA的粉末以重量比5∶1∶1混合均匀后，加入淀粉后制成胶囊。其剂量单位中含四硫化四砷250mg、靛玉红50mg和丹参酮IIA 50mg。

制备实施例2

将四硫化四砷、靛玉红和丹参酮IIA的粉末以重量比1∶1∶1混合均匀后，加入糊精后压成片剂。其剂量单位中含四硫化四砷50mg、靛玉红50mg和丹参酮IIA 50mg。

制备实施例3

将四硫化四砷、靛玉红和丹参酮IIA的粉末以重量比10∶1∶1混合均匀后，加入淀粉后制成颗粒剂。其剂量单位中含四硫化四砷250mg、靛玉红25mg和丹参酮IIA 25mg。

试验实施例

本发明通过中药复方制剂砷靛参ATI抑制白血病细胞增殖、诱导白血病细胞凋亡达到治疗AML M3即急性早幼粒白血病的目的；中药复方制剂砷靛参ATI下调CDK2，降低磷酸化组蛋白H1、上调P27，抑制细胞从G1到S期、上调P27Rb，抑制细胞进入S期，从而抑制肿瘤细胞增殖，达到治疗慢性粒细胞白血病、骨髓增生异常综合症、多发性骨髓瘤及肝癌、肺癌、胃癌、食管癌等实体瘤或淋巴瘤的目的。

在下述的实施例中，中药复方制剂砷靛参ATI中各组分的不同组合包括A、T、I单用，两两合用及ATI三者联用。联用的意思是不同的组分组合后一起使用。A、T、I在实验中的重量比为5∶1∶1，即将上述制备实施例1中的制剂给予动物。其中，四硫化四砷给药剂量相当于250mg/kg；靛玉红和丹参酮IIA给药剂量相当于50mg/kg，每天3～4次，口服给药。

材料与方法

(1)试剂和仪器

四硫化四砷(As₄S₄)购自美国Alfar公司，用0.1N NaOH溶解，HCl调节pH至7.35，0.22μM滤器过滤，储存浓度为1mmol/L，保存于-20℃备用。靛玉红(Indirubin)、丹参酮II_A(Tanshinone II_A)均购自中国药品生物制品检定所，溶于二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，0.22μM滤器过滤，储存浓度为5mmol/L，-20℃保存。碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品，PI用三蒸水配成250μg/mL的储存液，4℃避光保存。RPMI1640粉末为Gibco-BRL产品，胎牛血清购自美国Hyclone公司。相差显微镜为日本奥林巴斯公司生产，离心细胞涂片机购自英国Shandon公司。

(2)细胞来源与培养

NB4和NB4-R2细胞株为瑞金医院上海血液学研究所冻存，以2×10⁵个/mL的起始浓度接种于含10％胎牛血清的RPMI1640细胞培养液中，37℃、5％CO₂饱和湿度条件下常规培养。在对数生长期时，使用药物处理，空白对照组加同等浓度的DMSO，观察各组细胞分化情况。

(3)形态学观察

8×10⁴个细胞经离心细胞涂片机离心(500rpm，5min)涂片，瑞氏-姬姆萨染料(Wright’s-Giemsa)染色观察细胞形态。

(4)硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验

取5×10⁵个培养的细胞，去除培养液后以磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)洗涤2遍，加入含1μg/ml佛波酯(PMA)的0.1％NBT溶液(PBS配制)500μl，37℃水浴孵育30分钟，PBS洗涤2遍后离心涂片镜检观察。于400×放大视野中观察，每份标本随机计数200个细胞，胞浆中含有灰色至黑色甲簪颗粒的细胞计为NBT还原阳性细胞，计算其百分率。实验重复3次。

(5)细胞表面分化抗原检测

5×10⁵个细胞去除培养液后用预冷的PBS洗涤两遍，重悬于100μl PBS中加入异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人CD11b、CD14单克隆抗体和相应同型抗体(均购自Coulter-Immunotech，法国巴黎)，室温下避光孵育30min，PBS清洗后上机检测。以PBS洗涤后以

XL^TM流式细胞仪(Beckman Coulter，美国)检测，XL^TMSYSTEM II^TM软件进行数据采集及分析。

(6)流式细胞仪检测细胞周期

取1×10⁶个细胞，PBS洗2次，逐滴加入70％(V/V)的冰乙醇，4℃固定过夜，次日用PBS清洗细胞，加入1％的核糖核酸分解酶Tris-HCl(pH7.4)(终浓度200μg/ml)消化，碘化丙啶(PI)20μg/ml染色，室温孵育30min，100目滤网过滤后用

XL^TM流式细胞仪(Beckman Coulter，美国)检测不同DNA含量分布，经Multicycle软件分析(版本1.0，Beckman Coulter，美国)细胞周期。

(7)免疫印迹(westen blot)

1)收获细胞，用预冷1×PBS洗涤2次，每1×10⁶个细胞加入80μL蛋白裂解液(1×十二烷基硫酸钠(SDS)蛋白上样缓冲液)，轻轻混匀，沸水煮5～8分钟，上样或分装冻存在-20℃；

2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，根据目的蛋白分子量的不同选择合适的凝胶浓度(8％～12％)，常规电泳条件(80V电压溴酚蓝至分离胶后改用150V)；

3)应用湿转方法将凝胶中的蛋白质转移到0.22μm硝酸纤维素膜上，条件根据目的蛋白的大小决定(70V 2h，80V 2h，80V 3h)；

4)硝酸纤维素膜用5％脱脂奶粉-Tris缓冲液(TBS)封闭过夜；

5)抗体孵育一抗孵育，选用多克隆或单克隆特异性抗体孵育硝酸纤维素膜，室温，2h，70rpm震摇；用TBS-吐温(Tween)(0.1％)洗膜15分钟，两次；二抗孵育，选用对应的二抗孵育硝酸纤维素膜，室温，1.5h，70rpm震摇；用TBS-Tween(0.1％)洗膜15分钟，两次；

6)显色，应用带有辣根过氧化物酶底物的显色系统显色；

7)X线片感光，显影，定影。

(8)免疫荧光

细胞经细胞旋转离心制备得到后，在-20℃用甲醇固定5分钟，PBS洗后，1％BSA(PBS配制)封闭，与抗AQP9抗体(1∶100)孵育1小时，PBS洗后，再与488驴抗兔荧光标记二抗孵育30分钟。在荧光显微镜下进行观察。

(9)半定量RT-PCR

总的RNA用Trizol(Invitrogen公司生产)提取，用随机引物和Superscript II逆转录酶(Invitrogen公司生产)逆转录为cDNA。本试验中所用到的引物为：GAPDH，5’-TCACCAGGGCTGCTTTTA-3’和5’-AAGGTCATCCCTGAGCTGAA-3’；AQP9，5’-GGAGGGGTCATCACTATCAAT-3’和5’-ACAGGAATCCACCAGAAGTT-3’。循环参数：94℃5分钟；94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，共28个循环；72℃5分钟。

试验实施例1：ATI中各组分的不同组合对APL小鼠模型的体内治疗效果

分离hMRP8-PMLRARa转基因可移植鼠模型发病后脾脏细胞，尾静脉注入FVB/NJ小鼠体内，1×10⁵个/只，观察A、T、I单用、两两联用及ATI三者联用和空白对照分别处理过的小鼠的生存期。结果发现，ATI联用极大地延长了患病小鼠的生存期，减轻小鼠脾脏和肝脏浸润，但小鼠体重无明显降低(见图1和图2)。与此相一致，ATI治疗后的小鼠骨髓和脾脏中，表达粒细胞分化抗原Gr-1和Mac-1的细胞比其他治疗组高(见图3)。

试验实施例2：ATI中各组分的不同组合对APL细胞分化的协同效果

A、T和I单用、两两联用和ATI联用分别处理NB4细胞株(维甲酸敏感)、耐ATRA的NB4-R2细胞株(维甲酸耐药)和APL患者的原代细胞，形态学发现ATI联用能够更明显地诱导细胞成熟(见图4)；同样，通过NBT还原及流式检测，发现与A、T单用或A、T、I两两联用相比，ATI联用处理后的细胞分化率及CD11b/CD14显著上调(见图5和图6)。通过分析单用、两两合用、ATI联用的剂量-效果曲线，用Median-effect方法计算出合用系数(CombinationIndex，CI)，发现A、T、I在浓度0.25～1.0M时，合用系数CI＜1，说明ATI之间在对APL治疗中存在协同作用。

试验实施例3：ATI中各组分的不同组合引起PML-RARα蛋白的泛素化水平增高及PML-RARα蛋白降解

A能够引发PML-RARα肿瘤蛋白的降解，T或者I能够增强A的这一作用；ATI联用更加增强了PML-RARα蛋白的降解(见图7)。通过蛋白质印迹分析胞浆和核基质的PML-RARα蛋白，发现是A而不是T或者I引起了PML-RARα蛋白从胞浆到核基质的迁移及其泛素化(见图8)。

试验实施例4：ATI中各组分的不同组合解除转录的抑制

转录因子如CCAAT/增强子结合蛋白(CEBP/s)和PU1，对于正常髓细胞和粒细胞成熟至关重要，但在APL中是受到抑制的。实验表明ATI联用处理后的NB4细胞，CEBP/α在蛋白水平上第二天被上调，随后下降，而CEBP/β1/2和CEBP/ε被上调(见图9和10)。进一步的分析表明，A和T单用能调节这些蛋白，ATI联用增强这种效果(见图9)。原癌基因C-Myc阻断髓细胞分化，它的下调是髓细胞分化的关键。与A、T和I单用或两两联用相比，ATI联用处理的细胞能够检测到C-Myc在蛋白和mRNA上的下调(见图9和10，其中GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶)。RARβ2是RAR的靶基因，它在启动子中包含最强的天然RA响应元件(βRARE)。实验表明，T和A均能上调RARβ2，而ATI联用更能加强RARβ2上调的效果(见图11)。染色质免疫共沉淀检测，证实了RARβ2从组蛋白去乙酰化酶1(HADC1)上解离(见图12，其中CHIP为染色质免疫沉淀分析)，这可能有助于RARβ2转录的活化。PML-RARα抑制转录因子参与APL的致病，ATI联用可能缓解对APL细胞转录元件正常功能的抑制，证实了ATI在治疗白血病中的应用的合理性。

试验实施例5：ATI中各组分的不同组合通过作用于细胞周期关键调控子诱导G0/G1阻滞

T单独使用增加在G0/G1期的细胞数，AT、AI和TI两两联用进一步引起G0/G1阻滞。ATI处理的NB4细胞约有83.7％±6.7％处在G0/G1期，显示出ATI联用加强抑制G1/S的过渡(见图13)。实验表明A和I下调NB4和NB4-R2细胞中的CDK2，而ATI联用进一步加强了这一效果(见图14)。CDK2能够磷酸化组蛋白H1，而从G1到S期过程中，磷酸化的组蛋白H1的量增加。ATI能够显著的降低磷酸化的H1(见图15，其中IP表示免疫共沉淀)。P27是CDK的抑制剂，它抑制从G1到S期的进程。实验表明ATI对NB4联用，大量上升的是P27蛋白水平，而不是mRNA水平(见图10和14)。ATI也能上调NB4细胞的P27(见图14)、Rb抑制细胞进入S期，实验表明在在NB4细胞中，含有T的治疗组中Rb蛋白的表达量有少量上升，而在ATI治疗组中磷酸化Rb被显著上调(见图14)。以上结果表明，A、T和I在诱导细胞G0/G1阻滞中具有协同/叠加作用。

试验实施例6：ATI中各组分的不同组合作用上调跨膜蛋白AQP9提高As的细胞吸收度

NB4细胞用不同方法预处理四天，洗涤后和2.5M A共培养4小时。用原子吸收法测定细胞内As浓度。结果发现，ATI处理后的细胞内As浓度最高，AT和AI分别处理的比单用A处理的细胞内As浓度高，而TI处理的比单用A处理的细胞内As浓度低(见图16)。这说明，T和I有助于As吸收。ATI处理的细胞，在24-96小时后AQP9大量表达(见图17和18)。进一步分析发现，T、I和A共同作用在mRNA(见图17)和蛋白水平(见图18)上调AQP9，而TI轻微引起AQP9的上升。免疫荧光检测证实T和I共同作用上调AQP9的表达(见图19)，ATI联用的效果最强。

为了证实AQP9在As吸收过程中的重要性，RNA干扰(RNAi)用来抑制AQP9的表达。

转染AQP9 siRNA表达载体到NB4中，导致AQP9下降约一半(见图20)。AQP9沉默导致A、AT、AI和ATI联用分别处理过的细胞内As浓度下降(见图21)。再者，由CD11b表达揭示，AQP9敲除抑制ATI诱导的细胞成熟(见图22)。这些结果说明AQP9对As的转运至关重要，T和I通过上调AQP9促进了As的吸收。

通过上述的试验实施例可以看出，本发明的中药复方制剂砷靛参ATI可以在制备治疗肿瘤的药物中应用，具体地，可以在制备治疗白血病(包括急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症及肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌、肠癌等实体瘤或淋巴瘤的药物中应用。

Claims

1.一种中药复方制剂砷靛参ATI，其特征在于，其中的活性组分四硫化四砷、靛玉红和丹参酮IIA的重量比为1~10:1:1。

2.根据权利要求1所述的中药复方制剂砷靛参ATI，其特征在于，其中的活性组分四硫化四砷、靛玉红和丹参酮IIA的重量比为2~7:1:1。

3.根据权利要求2所述的中药复方制剂砷靛参ATI，其特征在于，其中的活性组分四硫化四砷、靛玉红和丹参酮IIA的重量比为4~5:1:1。

4.权利要求1~3中任一项所述的中药复方制剂砷靛参ATI的制备方法，其特征在于，将四硫化四砷、靛玉红和丹参酮IIA的粉末按重量比混合均匀后，加入药学上可接受的辅料制成。

5.权利要求1~3中任一项所述的中药复方制剂砷靛参ATI在制备抗白血病药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的白血病包括急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性粒细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的急性髓性白血病包括M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6和M7亚型。