CN101889630B - 一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法 - Google Patents

一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101889630B
CN101889630B CN 201010210065 CN201010210065A CN101889630B CN 101889630 B CN101889630 B CN 101889630B CN 201010210065 CN201010210065 CN 201010210065 CN 201010210065 A CN201010210065 A CN 201010210065A CN 101889630 B CN101889630 B CN 101889630B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chlorella
pcr
fatty acid
electric shock
transgenosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN 201010210065
Other languages
English (en)
Other versions
CN101889630A (zh
Inventor
王首锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN 201010210065 priority Critical patent/CN101889630B/zh
Publication of CN101889630A publication Critical patent/CN101889630A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101889630B publication Critical patent/CN101889630B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法。本发明步骤首先采用PCR扩增获得斑马鱼Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因全长cDNA；然后构建表达载体pBI121/DrFAD6，具体是制备大肠杆菌感受态细胞，纯化PCR产物；载体连接、热击转化、摇菌、抽提表达质粒pBI121/DrFAD6和酶切鉴定；再次转基因小球藻的筛选和检测；最后将小球藻液脱水、浓缩、干燥后即为富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料。本发明降低了生产成本，使得产品的附加值得以实现。

Description

一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法。
背景技术
高度不饱和脂肪酸(Highly unsaturated fatty acids，HUFAs)在维持机体的正常机能、促进生长、发育、繁殖和提高成活率等方面发挥重要的生理作用。特别是二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)还能防止动脉粥样化，具有抗血栓、降血脂、防止血小板聚结、舒张血管等功能。由于人和一些动物不能合成这些必需脂肪酸或合成不能满足其需要，必须从食物中摄取。海水鱼是人类获取EPA和DHA等HUFAs的最重要来源。但是，随着资源匮乏和捕渔业的衰退，鱼和鱼油的供应越来越有限，加之迅速发展的水产养殖也需要大量鱼粉用于传统饲料的配制，加剧了这个供求矛盾。海洋鱼类必需摄入HUFAs，尤其是DHA和EPA。HUFAs的数量和种类会直接影响海水仔稚鱼的神经发育、生长速度、成活率、应激能力和体内相关成分的组成。由于大多数海水鱼类缺乏合成HUFAs的关键酶——Δ6-脂肪酸去饱和酶，只能从鱼粉饲料中摄取。
目前研究已表明，Δ6-脂肪酸去饱和酶是合成HUFAs的关键酶，如果缺乏Δ6脂肪酸去饱和酶或该酶活性受到抑制，就会妨碍EPA和DHA合成。而海水鱼类由于缺乏Δ6-脂肪酸去饱和酶就不能将亚油酸和α-亚麻酸分别去饱和及延长生成EPA和DHA。做为食物链基础的海洋微藻是EPA和DHA的最初生产者，动物体内的这些EPA、DHA也是从微藻中转化而来，随着海洋渔业资源的日益衰减，海洋微藻将成为人类获得这些产物的主要资源。
微藻是多不饱和脂肪酸的初级生产者，但不同种属间差异很大：譬如三角褐指藻和微绿球藻，EPA含量很高但生物量很低，不能大规模生产；而象小球藻生物量很大已能大规模养殖，但DHA或EPA含量很低。通过分子生物学的方法改造微藻，有望解决这一矛盾，真正使微藻培养生产PUFAs工业化。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法。
本发明方法的具体步骤为：
步骤(1)采用PCR扩增获得斑马鱼(Danio rerio)Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因全长cDNA，具体是：
根据GENEBANK中已发表的斑马鱼Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因编码序列，设计特异引物P1和P2，上游引入EcoRI位点，下游引入XhoI位点。所述的特异引物P1和P2由上海生物工程有限公司合成；
(P1：5’-TAGGCTATGGGTGGCGGAGGACAGCAG-3’；
P2：5’-AACTGCTTATTTGTTGAGATACGCATC-3’)
以斑马鱼第一链cDNA为模板，用PCR方法(反应体系：cDNA模板1μl，10×PCR缓冲液5μl，10mmol/L dNTP 1μl，20pmol/L P1引物1μl，20pmol/LP2引物1μl，高保真的Taq Plus DNA聚合酶1μl，重蒸水31μl，反应体系总体积50μl；反应条件：94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟，35个循环)扩增出1335bp斑马鱼Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因编码序列，该序列标记为：Dr-FAD6，测序表明：该序列与GENEBANK中已发表的编码序列完全相同。
步骤(2)构建表达载体pBI121/DrFAD6，具体是：
首先制备大肠杆菌感受态细胞，然后纯化PCR产物，PCR产物经双酶切和割胶回收后与同样经双酶切且含有CaMV35S启动子和npt II选择标志基因的空表达载体pBI 121载体连接、热击转化、摇菌、抽提表达质粒pBI121/DrFAD6和酶切鉴定。上述的技术均按常规方法进行。
步骤(3)转基因小球藻的筛选和检测。
a、小球藻的电击转化，具体是：
取培养至第3～5d的小球藻培养液，在4000～6000r/min，离心10min条件下收集小球藻细胞；用高渗缓冲液(0.4mol/L甘露醇，0.4mol/L山梨醇)处理1h，4000～6000r/min离心5～10min，收集小球藻细胞；加电击缓冲液调细胞数至108个/mL，加入终浓度为6μg/mL的质粒DNApBI121/DrFAD6与150mL的鲑精DNA混合均匀，冰上放置5～10min后进行电击处理。电击条件：脉冲次数为211次，脉冲电压为5kV，循环次数为90次，脉冲持续时间为0.05s；电击缓冲液：0.4mol/L甘露醇，0.4mol/L山梨醇，0.08mol/L KCl，0.005mol/L CaCl2和0.0l mol/L HEPES。
b、转基因小球藻的培养筛选，具体是：
转化后的小球藻采用G418抗性平板筛选法初筛，即将电击转化后的小球藻液直接涂布于含100～150μg/mL G418固体培养基的平板上，置于光照培养箱中培养(温度25±0.5℃，光照强度3.0x10lx，光暗周期14h/10h)。
c、转基因小球藻的PCR检测，具体是：
挑取初筛呈阳性的小球藻，转入液体培养基中进行扩增培养(培养温度25±0.5℃，转速100r/min，光强3.0×10lx，持续光照；用离心法收集小球藻细胞，以CTAB法提取小球藻基因组DNA，并用引物P1和P2对小球藻基因组DNA进行PCR检测。与对照组相比较，被检测的样品中出现了1335bp的条带，则说明Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因已转入小球藻细胞中。
d、转基因小球藻的Southern杂交分析，具体是：
选取5～10株有代表性的PCR检测为阳性的小球藻藻株，扩大培养并提取总DNA，，进行Xba I、Sac I双酶切，以P1和P2为引物扩增的PCR片段杂交；结果显示，5个样品均出现大小为1.335kb的杂交带，而作为阴性对照的小球藻样品无任何杂交带，进一步确认所获得的小球藻藻株已经被成功转入/Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因。
步骤(4)转基因小球藻表达产物的样品测定，包括测定前的预处理和测定过程，具体是：
测定前的预处理：小球藻经去离子水洗涤三次，50℃烘干、研碎后，加入5％(重量比)的KOH-CH3OH溶液，70℃反应3h，再加入14％(体积比)BF3-CH3OH，70℃反应1.5h，形成脂肪酸甲酯。用氯仿和己烷的混合液(氯仿∶己烷＝1∶4)抽提两次，合并提取液。加人适量无水Na2SO4干燥提取液，静置1h，去掉Na2SO4，用氮气吹干。用少许正己烷回溶，备用。
测定过程：以Sigma公司生产的GLA甲酯为标准品，正己烷为溶剂测定样品。仪器：岛津GC-7A，柱子：DEGS 0.25ham×25m，分流比：100∶1，柱温：180℃，尾吹：50ml/min，气化室温度：250℃，检测器：氢火焰离子化检测器。
通过GC-7A对3个小球藻株所含的全部脂肪酸进行色谱分析，结果表明，EPA和DHA的平均含量占总脂肪酸的40.5％，比未处理的小球藻高出5倍。
步骤(5)将小球藻液脱水、浓缩、干燥后即为富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料。
本发明与背景技术相比，具有的有益的效果是：
1、小球藻是集环保、安全、节能和便于食用为一体的理想的转基因宿主；转基因藻一般可供人们直接口服，免去了繁杂昂贵的下游产物的提纯工艺，大大降低了生产成本，将具有很好的社会和经济效益。
2、小球藻是自然界少数具有从头合成PUFAs能力的生物，我们选用饵料单胞藻小球藻为受体，通过基因工程将Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因转入小球藻，筛选获得高含量EPA和DHA的藻株，使藻体DHA或EPA成分增加，实现小球藻的高效产出和产品的高值化。
具体实施方式
步骤(1)采用PCR扩增获得斑马鱼(Danio rerio)Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因全长cDNA，具体是：
根据GENEBANK中已发表的斑马鱼Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因编码序列，设计特异引物P1和P2，上游引入EcoRI位点，下游引入XhoI位点。所述的特异引物P1和P2由上海生物工程有限公司合成；
(P1：5’-TAGGCTATGGGTGGCGGAGGACAGCAG-3’；
P2：5’-AACTGCTTATTTGTTGAGATACGCATC-3’)
以斑马鱼第一链cDNA为模板，用PCR方法(反应体系：cDNA模板1μl，10×PCR缓冲液5μl，10mmol/L dNTP 1μl，20pmol/L P1引物1μl，20pmol/LP2引物1μl，高保真的Taq Plus DNA聚合酶1μl，重蒸水31μl，反应体系总体积50μl；反应条件：94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟，35个循环)扩增出1335bp斑马鱼Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因编码序列，该序列标记为：Dr-FAD6，测序表明：该序列与GENEBANK中已发表的编码序列完全相同。
步骤(2)构建表达载体pBI121/DrFAD6，具体是：
首先制备大肠杆菌感受态细胞，然后纯化PCR产物，PCR产物经双酶切和割胶回收后与同样经双酶切且含有CaMV35S启动子和npt II选择标志基因的空表达载体pBI 121载体连接、热击转化、摇菌、抽提表达质粒pBI121/DrFAD6和酶切鉴定。上述的技术均按常规方法进行。
步骤(3)转基因小球藻的筛选和检测。
a、小球藻的电击转化，具体是：
取培养至第3～5d的小球藻培养液，在4000～6000r/min，离心5～10min条件下收集小球藻细胞.用高渗缓冲液(0.4mol/L甘露醇，0.4mol/L山梨醇)处理1h，4000～6000r/min离心5～10min，收集小球藻细胞；加电击缓冲液调细胞数至108个/mL，加入终浓度为6μg/mL的质粒DNApBI121/DrFAD6与150mL的鲑精DNA混合均匀，冰上放置5～10min后进行电击处理。电击条件：脉冲次数为211次，脉冲电压为5kV，循环次数为90次，脉冲持续时间为0.05s；电击缓冲液：0.4mol/L甘露醇，0.4mol/L山梨醇，0.08mol/L KCl，0.005mol/L CaCl2和0.01mol/L HEPES。
b、转基因小球藻的培养筛选，具体是：
转化后的小球藻采用G418抗性平板筛选法初筛，即将电击转化后的小球藻液直接涂布于含100～150μg/mL G418固体培养基的平板上，置于光照培养箱中培养(温度25±0.5℃，光照强度3.0x10lx，光暗周期14h/10h)。
c、转基因小球藻的PCR检测，具体是：
挑取初筛呈阳性的小球藻，转入液体培养基中进行扩增培养(培养温度25±0.5℃，转速100r/min，光强强度3.0×10lx，持续光照；用离心法收集小球藻细胞，以CTAB法提取小球藻基因组DNA，并用引物P1和P2对小球藻基因组DNA进行PCR检测。与对照组相比较，被检测的样品中出现了1335bp的条带，则说明Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因已转入小球藻细胞中。
d、转基因小球藻的Southern杂交分析，具体是：
选取5～10株有代表性的PCR检测为阳性的小球藻藻株，扩大培养并提取总DNA，，进行Xba I、Sac I双酶切，以P1和P2为引物扩增的PCR片段杂交；结果显示，5个样品均出现大小为1.335kb的杂交带，而作为阴性对照的小球藻样品无任何杂交带，进一步确认所获得的小球藻藻株已经被成功转入Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因。
步骤(4)转基因小球藻表达产物的样品测定，包括测定前的预处理和测定过程，具体是：
测定前的预处理：小球藻经去离子水洗涤三次，50℃烘干、研碎后，加入5％(重量比)的KOH-CH3OH溶液，70℃反应3h，再加入14％(体积比)BF3-CH3OH，70℃反应1.5h，形成脂肪酸甲酯。用氯仿和己烷的混合液(氯仿∶己烷＝1∶4)抽提两次，合并提取液。加人适量无水Na2SO4干燥提取液，静置1h，去掉Na2SO4，用氮气吹干。用少许正己烷回溶，备用。
测定过程：以Sigma公司生产的GLA甲酯为标准品，正己烷为溶剂测定样品。仪器：岛津GC-7A，柱子：DEGS 0.25ham×25m，分流比：100∶1，柱温：180℃，尾吹：50ml/min，气化室温度：250℃，检测器：氢火焰离子化检测器。
通过GC-7A对3个小球藻株所含的全部脂肪酸进行色谱分析，结果表明，EPA和DHA的平均含量占总脂肪酸的40.5％，比未处理的小球藻高出5倍。
步骤(5)将小球藻液脱水、浓缩、干燥后即为富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料。

Claims (5)

1.一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
步骤(1)采用PCR扩增获得斑马鱼△6-脂肪酸脱饱和酶基因全长cDNA；
步骤(2)构建表达载体pBI121/DrFAD6，具体是：
首先制备大肠杆菌感受态细胞，然后纯化PCR产物；PCR产物经双酶切和割胶回收后与同样经双酶切且含有CaMV35S启动子和npt II选择标志基因的空表达载体pBI121载体连接、热击转化、摇菌、抽提表达质粒pBI121/DrFAD6和酶切鉴定；
步骤(3)转基因小球藻的筛选和检测；首先电击转化小球藻，其次培养筛选转基因小球藻，然后进行转基因小球藻的PCR检测，最后进行转基因小球藻的Southern杂交分析；
步骤(4)培养得到转基因小球藻，将小球藻液脱水、浓缩、干燥后即为富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的小球藻的电击转化为：取培养至第3～5天的小球藻培养液，在4000～6000r/min，离心5～10min条件下收集小球藻细胞；用高渗缓冲液处理1h，4000～6000r/min离心5～10min，收集小球藻细胞；加电击缓冲液调细胞数至108个/mL，加入终浓度为6μg/mL的质粒DNA pBI121/DrFAD6与150mL的鲑精DNA混合均匀，冰上放置5～10min后进行电击处理；
所述的电击缓冲液由0.4mol/L甘露醇，0.4mol/L山梨醇，0.08mol/L KCl，0.005mol/L CaCl2和0.01mol/L HEPES组成；
所述的电击条件为脉冲次数为211次，脉冲电压为5kV，电击循环次数为90次，脉冲持续时间为0.05s；
所述的高渗缓冲液由0.4mol/L甘露醇和0.4mol/L山梨醇组成。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的转基因小球藻的培养筛选为：转化后的小球藻采用G418抗性平板筛选法初筛，即将电击转化后的小球藻液直接涂布于含100～150μg/mL G418固体培养基的平板上，置于光照培养箱中培养。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的转基因小球藻的PCR检测为：挑取初筛呈阳性的小球藻，转入液体培养基中进行扩增培养；用离心法收集小球藻细胞，以CTAB法提取小球藻基因组DNA，并用引物P1和P2对小球藻基因组DNA进行PCR检测；
所述引物P1的核苷酸序列：5’-TAGGCTATGGGTGGCGGAGGACAGCAG-3’；
所述引物P2的核苷酸序列：5’-AACTGCTTATTTGTTGAGATACGCATC-3’。.
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的转基因小球藻的Southern杂交分析为：选取5～10株有代表性的PCR检测为阳性的小球藻藻株，扩大培养并提取总DNA，进行XbaI、Sac I双酶切，以P1和P2为引物扩增的PCR片段杂交；
所述引物P1的核苷酸序列：5’-TAGGCTATGGGTGGCGGAGGACAGCAG-3’；
所述引物P2的核苷酸序列：5’-AACTGCTTATTTGTTGAGATACGCATC-3’。
CN 201010210065 2010-06-28 2010-06-28 一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法 Expired - Fee Related CN101889630B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010210065 CN101889630B (zh) 2010-06-28 2010-06-28 一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010210065 CN101889630B (zh) 2010-06-28 2010-06-28 一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101889630A CN101889630A (zh) 2010-11-24
CN101889630B true CN101889630B (zh) 2013-06-05

Family

ID=43099119

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201010210065 Expired - Fee Related CN101889630B (zh) 2010-06-28 2010-06-28 一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101889630B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104542389B (zh) * 2014-12-23 2017-01-25 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101289659A (zh) * 2008-06-19 2008-10-22 中国海洋大学 一种海洋微藻delta6脂肪酸去饱和酶及其应用
CN101353661A (zh) * 2007-07-25 2009-01-28 中国科学院遗传与发育生物学研究所 具有△6脂肪酸脱氢酶功能的基因及其应用
WO2009124070A1 (en) * 2008-03-31 2009-10-08 Kuehnle Agrosystems, Inc. Nuclear based expression of genes for production of biofuels and process co-products in algae

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101353661A (zh) * 2007-07-25 2009-01-28 中国科学院遗传与发育生物学研究所 具有△6脂肪酸脱氢酶功能的基因及其应用
WO2009124070A1 (en) * 2008-03-31 2009-10-08 Kuehnle Agrosystems, Inc. Nuclear based expression of genes for production of biofuels and process co-products in algae
CN101289659A (zh) * 2008-06-19 2008-10-22 中国海洋大学 一种海洋微藻delta6脂肪酸去饱和酶及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张小宇等.利用椭圆小球藻硝酸还原酶缺失突变体为 生物反应器表达兔防御素NP-1蛋白.《遗传》.2006,第28卷(第12期),1580-1584. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101889630A (zh) 2010-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Narala et al. Comparison of microalgae cultivation in photobioreactor, open raceway pond, and a two-stage hybrid system
Cui et al. Phaeodactylum tricornutum microalgae as a rich source of omega-3 oil: Progress in lipid induction techniques towards industry adoption
Varfolomeev et al. Microalgae as source of biofuel, food, fodder, and medicines
EP2292782B1 (en) Method for producing biodiesel by two-stage culture of chlorella from autotrophy to heterotrophy
Gilmour Microalgae for biofuel production
JP5052652B2 (ja) ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法
US9506100B2 (en) Production of astaxanthin and docosahexaenoic acid in mixotrophic mode using Schizochytrium
Grant Burgess et al. An optical fibre photobioreactor for enhanced production of the marine unicellular alga Isochrysis aff. galbana T-Iso (UTEX LB 2307) rich in docosahexaenoic acid
Krichnavaruk et al. Enhanced productivity of Chaetoceros calcitrans in airlift photobioreactors
Zhu et al. Cultivation of aquaculture feed Isochrysis zhangjiangensis in low-cost wave driven floating photobioreactor without aeration device
Misra et al. Way forward to achieve sustainable and cost-effective biofuel production from microalgae: a review
Li et al. Effect of nitrogen limitation on cell growth, lipid accumulation and gene expression in Chlorella sorokiniana
Barclay et al. Commercial production of microalgae via fermentation
Xie et al. Mixotrophic cultivation of Platymonas subcordiformis
JP2014515935A (ja) 混合栄養培養方式でＥＰＡ及びＤＨＡを生産するためのオドンテラ（Ｏｄｏｎｔｅｌｌａ）属の新規微細藻類株
CN102311920A (zh) 一种小球藻的培养方法
Liu et al. Heterotrophic production of algal oils
Ran et al. Swine digestate treatment by prior nitrogen-starved Chlorella vulgaris: The effect of over-compensation strategy on microalgal biomass production and nutrient removal
Golmakani et al. Effect of alternative C 2 carbon sources on the growth, lipid, and γ-linolenic acid production of spirulina (Arthrospira platensis)
CN105366814A (zh) 一种利用光合细菌和单细胞藻类改善水质的方法及其应用
CN105198635A (zh) 大规模培养海水小球藻的大量元素营养液
Mahmoud et al. Closed photobioreactor for microalgae biomass production under indoor growth conditions
El-Sayed et al. Application of bagasse extract in economic Nannochloropsisoculata mass production
CN101889630B (zh) 一种富含高度不饱和脂肪酸的开口饵料制备方法
CN110564622B (zh) 一种提高球等鞭金藻培养密度的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130605

Termination date: 20160628

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee