CN110564622B - 一种提高球等鞭金藻培养密度的方法 - Google Patents

一种提高球等鞭金藻培养密度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体为一种提高球等鞭金藻培养密度的方法。本发明方法包括：海杆菌菌种的活化；海杆菌菌液的培养；球等鞭金藻藻种的无菌化处理；球等鞭金藻种子培养液的生产，球等鞭金藻的密度≥10×105个/mL；球等鞭金藻的正式培养生产，其密度在1.5×107cell/mL以上。本发明中球等鞭金藻和海杆菌共培养体系可以发生协同作用，不仅能够使培养基的成分得到充分利用，而且各自本身所具有的生理生态特点使二者同时受益，促进共同生长。本发明在球等鞭金藻和海杆菌混合培养的条件下，能够使球等鞭金藻持续快速生长，最终获得比常规方法更高的生物量，可为相关水产养殖饵料和获取DHA用藻提供有效技术支持。

Description

一种提高球等鞭金藻培养密度的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高球等鞭金藻培养密度的方法。
背景技术
随着人们对多不饱和脂肪酸 (Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs)研究的不断深入，人们逐渐认识到PUFAs作为一类具有独特生物活性的物质在生理健康、营养补给和药物开发等方面有着十分重要的作用。其中以α-亚麻酸（α-Linolenic Acid, ALA）、二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic, EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid, DHA）为代表的ω-3 PUFAs在大脑发育、预防心血管疾病、和改善视力等方面已经成为目前研究的热点。
但目前PUFAs主要来源于海洋鱼类，其来源十分贫乏，远不能满足市场需求。因此，寻找更为持续、稳定的PUFAs来源成为当务之急。从鱼油中提取PUFAs主要面临3个问题：（1）产量不稳定：鱼油中PUFAs含量随着鱼的种类、捕捞季节、温度气候等限制因子的不同而波动很大。（2）产品质量低：氢化处理工艺降低了鱼油中PUFAs产量，且含有鱼腥味，限制了产品在食品市场中的应用。（3）提炼成本高：对于鱼油中难以除去的胆固醇、脂溶性维生素以及高达80%的饱和脂肪酸，使得纯化PUFAs的工艺复杂化，从而提高了提炼成本。
但是有研究发现，海洋鱼类并不是PUFAs的直接生产者，而是通过捕食一些含有PUFAs的海洋微藻后在体内实现PUFAs的富集，因此海洋微藻才是PUFAs最直接的生产者。
球等鞭金藻（Isochrysis galbana）由于其个体小，无细胞壁，易消化，总脂含量45%左右，其中PUFAs含量占总脂含量的50%以上，且富含DHA、EPA、胡萝卜素和多糖等活性物质，是水产养殖中重要的饵料微藻，也被视为是生产DHA潜力藻种。然而，因其生长密度一直维持在一个较低水平，无法突破生长密度的上限，使得产能低下，培养成本高，无法为工业生产DHA提供经济上有竞争力的原材料。因此，球等鞭金藻的高密度培养是一个具有重要应用价值和亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够克服现有培养技术最大密度瓶颈的提高球等鞭金藻培养密度的方法。
本发明提供的提高球等鞭金藻培养密度的方法，具体步骤如下：
（1）海杆菌菌种的活化：将海杆菌-甘油菌种从-80℃冰箱中取出，待融化后接种于装有海杆菌海水培养基的试管中，置于恒温摇床中培养，温度25-30℃，转速100-200rpm，培养48-72h，待培养基由透明变为浑浊，即得到活化的海杆菌菌种；
（2）海杆菌菌液的培养：将步骤（1）中活化后的菌种接种至盛有海杆菌海水液体培养基的三角烧瓶中，置于恒温摇床中培养，培养条件同上，培养48-72h，检测OD650≥1.2；
（3）球等鞭金藻藻种的无菌化处理：将配置好的青霉素、硫酸链霉素、氯霉素、庆大霉素以及卡那霉素母液，加入适量至200mL按常规方法培养至7天的球等鞭金藻培养液中，各类抗生素最终浓度保持在为100-200I.U./mL，再培养120-148h后从中取20-30mL含藻培养液加入至新配置的藻类培养基中，同时再追加前述各类抗生素一次，培养120-148h，再按前述方法重复一次,培养120-148h后进行无菌检测，即取球等鞭金藻培养液0.1mL涂布营养琼脂培养基平板，平行涂布三板，于20-30℃培养96-120h，观察有无细菌菌落出现。经初步认定无菌后，在不加抗生素的情况下再进行2-5次传代培养，消除残留抗生素影响；
（4）球等鞭金藻种子培养液生产：将前述无菌化过程获得的球等鞭金藻接种到盛有培养基的三角烧瓶中进行活化纯培养,置于光照培养箱中，光照为3000-4500lux,温度为25-30℃,光暗比为12L：12D，不充气培养,每天手工摇瓶3-4次，待球等鞭金藻的密度≥10×105个/mL即可；
（5）正式培养生产：取前述方法得到的球等鞭金藻种子培养液接种于盛有发酵培养基的总容积为250mL的三角烧瓶中，得到金藻与发酵液的混合液，之后将前述方法所得海杆菌菌液经9000-12000rpm、3-5℃（优选4℃）下高速冷冻离心8-15 min，弃上清后用混合液将浓缩后的海杆菌溶解洗涤到三角烧瓶中。置于光照培养箱中培养，培养温度25-30℃，光照强度为：3000-4500lux，光暗比为12L：12D，培养312-336 h，其密度可达1.5×107cell/mL以上，远高于传统培养方法所能达到的密度。此时可灌装，包装成品。
其中，所述的海杆菌培养基配方为:蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，柠檬酸铁0.1g/L，氯化钠10g/L。用盐酸/氢氧化钠调PH至7.0，121℃灭菌20分钟。
其中，所述的球等鞭金藻液体培养基配方为: 硝酸钠0.1g，磷酸二氢钾0.01g，微量元素1ml，硅酸钠0.005g，海水1L。用盐酸/氢氧化钠调PH至7.0，121℃灭菌15分钟。
其中，所述的发酵培养基配方为：硝酸钠0.1g，磷酸二氢钾0.02g，微量元素1ml，硅酸钠0.005g，丁二酸钠1.5g,氯化铵1.0g，硫酸镁0.1g，氯化钙0.075g，海水1L, 用盐酸/氢氧化钠调PH至7.0，121℃灭菌20分钟。
其中，所述的微量元素组成为：硫酸锌23mg，钼酸钠7.3mg，氯化锰178mg，氯化钴12mg，硫酸铜10mg，柠檬酸铁3.9g，EDTA二钠4.35g，蒸馏水1000mL。121℃灭菌20分钟。
本发明提出的球等鞭金藻和海杆菌共培养体系可以产生很好的协同作用。如海杆菌分泌的有机代谢物和呼吸作用产生的二氧化碳可以被金藻利用，同时金藻通过光合作用产生的氧气有助于细菌通过好氧方式利用有机物。因此，球等鞭金藻与海杆菌共同培养不仅能够使培养基的成分得到充分利用，而且各自本身所具有的生理生态特点使二者同时受益，促进共同生长。
本发明的优点在于：在球等鞭金藻和海杆菌混合培养的条件下，能够使球等鞭金藻持续快速生长，且最终获得比常规方法更高的生物量，可以为相关水产养殖饵料和获取DHA用藻提供技术支持。
附图说明
图1为添加不同海杆菌时球等鞭金藻的生长情况。图中曲线由下往上依次记为：A、B、C、D、E、F。
图2为本发明方法与传统方法（无海杆菌添加）培养密度比较。
具体实施方式
（1）将海杆菌菌种从-80℃冰箱中取出少许，待融化后接种于装有10mL海杆菌海水培养基的试管中并置于恒温摇床中培养，温度30℃，转速150rpm，培养3天，待培养基由透明变为浑浊，得到活化的海杆菌菌种。
（2）将步骤（1）中活化后的菌种接种至盛有海杆菌海水液体培养基的三角烧瓶中，并置于恒温摇床中培养，温度30℃，转速150rpm，培养至第3天，检测OD650为1.25，活菌数为6.5×108cfu/mL，备用于正式培养实验。
（3）将分别配置好的青霉素、硫酸链霉素、氯霉素、庆大霉素以及卡那霉素母液，分别加入适量至200mL按常规方法培养至7天的球等鞭金藻培养液中，各类抗生素最终浓度保持在200I.U./mL，再培养5天后从中取含藻培养液20mL加入至180mL新配置的藻类培养基中，同时再追加前述各类抗生素一次，培养5天后，再按前述方法重复一次,培养5天后进行无菌检测，即取球等鞭金藻培养液0.1mL涂布营养琼脂培养基平板，平行涂布三板，于30℃培养5天，观察有无细菌菌落出现。经初步认定无菌后，在不加抗生素的情况下再进行3次传代培养（接种量1:9，各代培养5天），消除残留抗生素影响。
（4）取100mL上述（3）中无菌化处理获得的球等鞭金藻接种到盛有500mL金藻培养基的总容积为1L的三角烧瓶中进行扩大培养,置于光照培养箱中，光照为3000lux,温度为25℃,光暗比为12L：12D，不充气培养,每天手工摇瓶4次（8、12、16、20点各一次），每次1min。培养7天，待球等鞭金藻的密度为11×105个/mL后，作为种子培养液用于后面与海杆菌的混合培养。
（5）取灭菌后容积大小为250mL的三角烧瓶共18只，每只盛150mL发酵培养基，然后再向每个三角烧瓶内加入按前述方法得到的球等鞭金藻种子培养液50mL进行接种，得到总量为200mL的混合培养液。将每3个烧瓶作为一个平行组，共计A、B、C、D、E、F 6个组，其中A组为空白对照组，也是传统方式培养办法（即无海杆菌添加组），B-F为添加海杆菌的实验组。海杆菌添加方法为：取一定体积的海杆菌菌液，经12000rpm、4℃条件下高速冷冻离心10min，弃上清后用上述混合培养液将浓缩后的海杆菌溶解洗涤到上述三角烧瓶中。海杆菌添加量以离心浓缩前的海杆菌菌液体积计，分别为2、10、20、30和40mL，即分别为上述混合培养液体积的1%、5%、10%、15%和20%。置于光照培养箱中培养，培养温度25℃，光照强度为：3000 lux，光暗比为12L：12D，培养观察15天。
（6）结果
结果表明（图1），海竿菌的加入对球等鞭金藻的生长起到了显著的促进作用，并且海杆菌液添加量在培养体积的20%以下时，随着添加量的增加，其促进效果也随之增加。在添加量为20%时，对球等鞭金藻的生长促进效果最大，藻细胞生长密度在培养13天时达到最大，为1.595×107cell/mL，相对于空白对照的5.877×106cell/mL，是其2.71倍，即增加了171.4%。

Claims (5)

1.一种提高球等鞭金藻培养密度的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）海杆菌菌种的活化：将海杆菌-甘油菌种从-80℃冰箱中取出，待融化后接种于装有海杆菌培养基的试管中，置于恒温摇床中培养，温度为25-30℃，转速为100-200rpm，培养48-72h，待培养基由透明变为浑浊，即得到活化的海杆菌菌种；
（2）海杆菌菌液的培养：将步骤（1）中活化后的菌种接种至盛有海杆菌培养基的三角烧瓶中，置于恒温摇床中培养，培养条件同上，培养48-72h，检测OD650≥1.2；
（3）球等鞭金藻藻种的无菌化处理：将配置好的青霉素、硫酸链霉素、氯霉素、庆大霉素以及卡那霉素母液，加入适量至200mL按常规方法培养至7天的球等鞭金藻藻液中，各类抗生素最终浓度保持在100-200 IU/mL，再培养120-148h，然后从中取20-30mL含藻培养液加入至新的球等鞭金藻培养基中，同时再追加前述各类抗生素一次，培养120-148h；再按前述方法重复一次,培养120-148h；然后进行无菌检测，即取球等鞭金藻藻液0.1mL涂布营养琼脂培养基平板，平行涂布三板，于20-30℃培养96-120h，观察有无细菌菌落出现；经初步认定无菌后，在不加抗生素的情况下再进行2-5次传代培养，消除残留抗生素影响；
（4）球等鞭金藻种子培养液的生产：将步骤（3）中无菌化处理的球等鞭金藻藻种接种到盛有球等鞭金藻培养基的三角烧瓶中进行活化纯培养,置于光照培养箱中，光照为3000-4500lux,温度为25-30℃,光暗比为12L：12D，不充气培养,每天手工摇瓶3-4次，待球等鞭金藻的密度≥10×105个/mL；
（5）球等鞭金藻的正式培养生产：取前述步骤（4）得到的球等鞭金藻种子培养液接种于盛有发酵培养基的总容积为250mL的三角烧瓶中，得到球等鞭金藻与发酵液的混合液，之后将步骤（2）所得海杆菌菌液经9000-12000rpm、3-5℃下高速冷冻离心8-15 min，弃去经过离心后的海杆菌菌液上清液后，用球等鞭金藻与发酵液的混合液将离心后的海杆菌溶解洗涤到三角烧瓶中；置于光照培养箱中培养，培养温度25-30℃，光照强度为：3000-4500lux，光暗比为12L：12D，培养312-336 h；
所述球等鞭金藻种子培养液的初始接种密度在1.5×107cell/mL以上。
2.根据权利要求1所述的提高球等鞭金藻培养密度的方法，其特征在于，所述的海杆菌培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，柠檬酸铁0.1g/L，氯化钠10g/L。
3.根据权利要求1所述的提高球等鞭金藻培养密度的方法，其特征在于，所述的球等鞭金藻培养基配方为：硝酸钠0.1g，磷酸二氢钾0.01g，微量元素1ml，硅酸钠0.005g，海水1L。
4.根据权利要求1所述的提高球等鞭金藻培养密度的方法，其特征在于，所述的发酵培养基配方为：硝酸钠0.1g，磷酸二氢钾0.02g，微量元素1ml，硅酸钠0.005g，丁二酸钠1.5g,氯化铵1.0g，硫酸镁0.1g，氯化钙0.075g，海水1L。
5.根据权利要求3所述的提高球等鞭金藻培养密度的方法，其特征在于，所述的微量元素组成为：硫酸锌23mg，钼酸钠7.3mg，氯化锰178mg，氯化钴12mg，硫酸铜10mg，柠檬酸铁3.9g，EDTA二钠4.35g，蒸馏水1000mL。
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