CN101880659B - 一种黄喉拟水龟微卫星分子标记及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄喉拟水龟微卫星分子标记，该微卫星分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。本发明还同时公开了该黄喉拟水龟微卫星分子标记的引物。该黄喉拟水龟微卫星分子标记能用于对黄喉拟水龟进行遗传结构分析、遗传图谱构建、基因定位、标记辅助选种或标记辅助育种。
Description
技术领域
本发明涉及基因组学、生物信息学和分子生物学三大领域，是根据FIASCO法开发的一种黄喉拟水龟微卫星分子标记及其用途。
背景技术
自Watson和Crick在1953年提出DNA双螺旋结构和60年代末发现限制性内切酶以来，分子生物学开始得到发展。如1980年Botstein等采用DNA限制性片段多态性(restrictionfragment length polymorphism，RFLP)作为一种新的遗传标记，从而开创了直接用DNA的多态性发展遗传标记的新阶段。接着出现了其他一些直接研究DNA多态性的分子遗传标记如微卫星、DNA指纹、RAPD等，这些分子标记的陆续出现为遗传多样性的研究开创了新的篇章。分子标记直接以DNA的形式表现，而DNA作为遗传物质在进行DNA水平多态性分析时，标记的数目多，多态性高，不仅可避免根据表型标记受到环境影响和数量有限的缺点，也可克服细胞学、生物化学等标记可能低估遗传多样性的不足。
其中微卫星标记(或称SSR)因其在评估遗传多样性、构建遗传连锁图谱、绘制系统发生树、疾病诊断和亲子鉴定等方面显示出的巨大优势，在人类和动植物的遗传研究中得到了广泛应用。由于微卫星的侧翼序列相对保守，很多非模式生物物种可以利用近缘物种的微卫星引物进行跨种扩增。但是对淡水龟类微卫星分子标记的开发还很少，而利用黄喉拟水龟自身基因组筛选的微卫星分子标记目前也尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种黄喉拟水龟微卫星分子标记，其能用于对黄喉拟水龟进行遗传结构分析、遗传图谱构建、基因定位、标记辅助选种或标记辅助育种。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种黄喉拟水龟微卫星分子标记，该微卫星分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
作为本发明的黄喉拟水龟微卫星分子标记的改进，该黄喉拟水龟微卫星分子标记引物为下列引物对：
上游5′-GGACTCACTTCCAAAACAA-3′
下游5′-TAACAGACCCTCCCCATC-3′。
本发明还同时提供了上述黄喉拟水龟微卫星分子标记的用途，用于对黄喉拟水龟进行遗传结构分析、遗传图谱构建、基因定位、标记辅助选种或标记辅助育种。
本发明是在磁珠富集法的基础上，利用FIASCO法从黄喉拟水龟核基因组DNA中筛选出一个稳定有效的微卫星分子标记。
本发明是通过这样的技术方案来实现的：
1.微卫星富集文库的构建：先通过标准的蛋白酶K消化和酚/氯仿抽提的方法从黄喉拟水龟的尾巴中后部提取基因组DNA。然后通过酶切、连接反应，PCR预扩增，PCR预扩增产物与生物素探针(CA)12进行杂交，生物素探针复合体与磁珠杂交，将单链的目标SSR DNA序列恢复成双链等步骤，获得了富含SSR重复序列的文库。
2.克隆及测序：将纯化过的双链产物与pMD18-T Vector载体连接，转化到感受态的大肠杆菌细胞中。采用菌落PCR法挑选出含有微卫星序列的阳性克隆，选取扩增产物为双带或三带的菌液送至上海生工测序，获得SSR序列。
3.序列整理和引物设计：选取重复次数大于5次的序列，并去除序列中的载体部分。针对微卫星侧翼序列的保守区进行引物设计。
4.PCR法验证引物的可用性：利用1-2个种群的30个黄喉拟水龟个体进行引物的稳定性和特异性检测。
最终筛选出的微卫星标记引物由下列核苷酸序列(5′-3′)组成：
上游5′-GGACTCACTTCCAAAACAA-3′
下游5′-TAACAGACCCTCCCCATC-3′
本发明所得到的微卫星标记位点，通过实验证明具有高度多态性，可应用于遗传多样性和种群遗传结构分析、遗传图谱构建和基因定位、标记辅助选种辅助育种等许多方面。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是8个种群根据Nei氏遗传距离构成的UPGMA树。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。
实施例1、
一、实验方法
首先通过标准的蛋白酶K消化和酚/氯仿抽提的方法，从黄喉拟水龟的尾巴中后部进行基因组DNA的提取。接着进行微卫星富集文库的构建、阳性克隆的筛选、序列整理和引物设计等步骤。
1.微卫星富集文库的构建
微卫星富集文库(CA)n的构建主要参考了Zane等的FIASCO方法(Fast Isolation byAFLP of Sequences Containing repeats)，具体的实验操作如下：
1.1酶切、连接反应
取2只黄喉拟水龟的基因组DNA，混合，进行酶切连接反应。该体系为25ul，包括：0.8ul混合的DNA、1ul AFLP接头受体、0.5ul MseI限制性内切酶、2.5ul 1×NEB Buffer、0.25ul BSA、2ul ATP、0.2ul T4ligation、灭菌的超纯水定容至25ul。将其用微量加样枪加入到进口的PCR小管中，轻摇混匀，并且用进口封口膜封口，以防止水浴加热时受到污染。将该体系放入事先预热好的37℃水浴锅中，温育3h。将温育后所得的消化连接产物保存到-20℃冰箱中待用，得消化连接液。
1.2PCR预扩增
先将消化连接液稀释十倍，然后以该稀释液为模板，MseI-N：5′-GATGAGTCCTGAGTAAN-3′为引物进行PCR扩增。反应体系为20ul，包含：5ul稀释后的消化连接液、1ul MseI-N引物、0.2ul Taq聚合酶、2ul Buffer、2ul dNTP、9.8ul H2O。该扩增条件为：94℃预变性5min，然后进行26个循环的94℃变性30s，53℃退火1min，72℃延伸1min；最后72℃终延伸8min。在这一过程中，我们对循环次数进行过多次的摸索，最终选择扩增效果较好的26次循环。PCR预扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行检测，发现条带清晰且弥散好，产物长度＞200bp。
1.3PCR预扩增产物与生物素探针进行杂交
通过上海生工合成的(CA)12探针，我们根据引物分子量计算后加入适量超纯水配置成浓度为100mmol/L的溶液。杂交反应体系为50ul，包含：10ul PCR预扩增产物、1ul(CA)12探针溶液、15ul 20×SSC、0.5ul 10％(质量浓度)SDS、23.5ul dd H2O。杂交反应在PCR仪中进行，条件为：95℃下变性5min，然后在68℃下杂交1h；得杂交反应体系。
1.4生物素探针复合体与磁珠杂交
平衡磁珠，形成悬液。用磁力架捕获磁珠，将管置于磁力架上，使磁珠集中于管的一侧，小心移除上清液。用0.5×SSC(每次300μl)洗涤磁珠3次。每次洗涤后，用磁力架捕获磁珠并小心移除上清液。重悬磁珠于100μl的0.5×SSC中。捕获并洗涤探针-目的片段的杂交液，获得富含SSR重复的单核苷酸序列，具体操作过程如下：
(1)将杂交反应体系(50ul)加入重悬的磁珠中，25℃温育10min，伴以每1-2min的翻转；
(2)用磁力架捕获磁珠并小心移除上清液。加入300μl的6×SSC(含0.1％SDS)于磁珠中，室温下洗脱10min；
(3)用磁力架捕获磁珠并小心移除上清液，加入300μl的6×SSC(含0.1％SDS)68℃下洗脱10min；
重复一次步骤(3)；
(4)300μl 6×SSC室温洗脱10min；
重复一次步骤(4)；
(5)300μl 3×SSC室温下洗脱10min；
重复一次步骤(5)；
这时向磁珠所在的离心管中加入50μl 0.15mol/L的NaoH，室温下洗脱20min，使DNA从磁珠表面分离下来，然后取上清液于一个灭菌过的离心管中，加入5.5μl TE和3.25μl1.25mol/L的乙酸中和NaOH，此时即可得到单链的目标SSR DNA序列，最后用纯化试剂盒清洁中和后的上清液。最终得清洁后的磁珠洗脱液。
1.5将单链的目标SSR DNA序列恢复成双链
以捕获的单链DNA为模板，MseI-N为引物，建立25μl DNA双链恢复PCR体系。反应物包括：2.5ul清洁后的磁珠洗脱液、1ul MseI-N引物、12.5ul 2×EasyTaq PCR SuperMix、9ul ddH2O。循环程序设置为：95℃预变性3分钟，接着5个循环包括95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，然后进行另外30个循环的92℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸55s，最后于72℃下延伸30分钟。用1.5％的琼脂糖凝胶检测PCR产物，产物为＞200bp的弥散带。产物用纯化试剂盒纯化，置于-20℃冰箱中备用。双链产物可以在-20℃的条件下保存几个月。若后续的蓝白斑克隆失败，可以从这一步接着往下做，节省了前面的很多繁琐步骤。
1.6连接T载体，进行克隆转化
将纯化过的双链产物与pMD18-T Vector载体连接，根据载体试剂盒说明书建立了8μl的连接体系，包括：4.7ul双链产物、0.3ul pMD18-T Vector、3ul Ligation solution I，在16℃水浴中连接12h-16h。连接产物可以通过连接PCR来检测目的片段是否和载体连接上。该PCR体系为20ul，包括：0.7ul连接产物、0.4ul M13(F/R各0.4ul)、10ul 2×EasyTaq PCRSuperMix、8.5ul ddH2O。扩增条件为：95℃预变性5min，30个循环的95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s；最后进行10min的72℃延伸。通过1.5％的琼脂糖凝胶检测发现产物为＞200bp的弥散带，确认目的片段和载体已连接上。
连接成功率很高，一般情况下也可以省去PCR检测的过程，直接做下一步。
连接产物准备好之后，我们做转化实验的准备工作。
首先把枪、枪头、LB液体培养基、消毒用的酒精棉等放入超净工作台，打开超净工作台的紫外灯灭菌20min。打开37℃摇床、42℃水浴锅备用。转化的具体操作如下：
(1)取一只1.5ml灭菌过的进口离心管，加入100ul感受态细胞(从-70℃冰箱中取出，取出后马上置于手掌心使其升温，有利于增强活性)，再将8ul的连接产物加入到管中。轻轻旋动、摇匀。
(2)将该混合液置于冰上，静置30min。
(3)42℃水浴90s，拿出后马上置于冰上，骤冷3min。这一过程很关键，一定要做到时间准、速度快。
(4)骤冷之后，加入200ul LB(Amp-)液体培养基，颠倒混匀。
(5)37℃摇床，180r/min，1h；得转化培养液。
(6)涂平板。(倒平板之前，先在LB固体培养基中加入Amp+、X-gal、IPTG。以100ml培养基为例，加入60-100ul Amp+(0.1mg/ml)、200ul X-gal、250ul IPTG)。吸取100ul转化培养液到平板上，涂匀。
(7)37℃烘箱培养12-16h，视菌落的大小决定。温育后将平板置于4℃冰箱中4h以上，这将有助于蓝白斑的表达。
该过程的注意事项如下：涂平板时，推棒在酒精灯上烧过之后，去掉冷凝水的同时使推棒冷却。推时朝一个方向，不可来回反复，同时转动培养皿。涂好平板之后，先在37℃恒温烘箱中正放20min，待菌液干后，反放培养。
经过蓝白斑筛选，挑选白色菌落于200μl LB(Amp+)液体培养基中，37℃摇床，250r/h，大约5h，进行扩大培养，理想状态菌液呈发烟状。
2.阳性克隆的PCR法筛选
我们采用菌落PCR法来挑选出含有微卫星序列的阳性克隆。扩增体系为：0.5μL菌液，0.25ul M13(上下游各0.25ul)、0.25ul不加生物素的(CA)12探针、7.5ul 2×EasyTaq PCRSuperMix，加ddH2O至15μL。扩增程序：95℃预变性5分钟，23个循环的95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s；最后于72℃下延伸10分min。
选取扩增产物为双带或三带的菌液送至上海生工测序。
3.序列整理和引物设计
由生工测序回来的序列，经过整理后发现，有的序列不含有重复片段，有的序列重复次数过少(＜5次)，并且有两两序列间发生重复的可能。在该实验中，我们先利用DNA star软件(http://www.dnastar.com/)编辑序列，去除序列中的载体部分，然后再利用SSRHunter软件找出含有多次重复的微卫星序列(重复次数≥5)。挑选出的微卫星序列，其两侧翼区都应该足够长，这样有利于后续的引物设计。引物设计的软件采用primer premier5.0；最终确定的黄喉拟水龟微卫星分子标记，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
4.多态性检测
设计黄喉拟水龟微卫星分子标记引物为下列引物：
上游5′-GGACTCACTTCCAAAACAA-3′
下游5′-TAACAGACCCTCCCCATC-3′。
用设计好的引物对30个黄喉拟水龟个体进行多态性检测。值得注意的是，我们在送生工合成引物的时候，要在其中一条引物的5′端或者3′端加上一段没有远红外荧光标记的M13序列。15μl的PCR反应体系包括如下试剂：0.5ul基因组DNA、0.2ul引物(上下游各0.2ul)、1ul Mg+、1ul dNTP、1.5ul Buffer、0.1ul rTaq、0.4ul荧光标记的M13引物[eitherIRD700or IRD800(LI-COR)]，10.1ul ddH2O。PCR循环条件如下：95℃预变性5min，接着32个循环的95℃变性30s，位点特异性退火温度(52℃)30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸10min。PCR产物在LI-COR4300遗传自动分析仪上进行基因分型，配合使用内置的STR分子量标准(STR Marker，LI-COR Bioseienee)和软件SAGAGT自动判读条带，辅以人工校正。
二、数据分析
用CERVUS 2.0计算等位基因数目(number of alleles，NA)，多态信息含量(PIC)，观测杂合度(observed heterozygosities，HO)和期望杂合度(expeeted heterozygosities，HE)。
三、结果
通过上述软件的分析，得到了该对引物在30个黄喉拟水龟个体中的遗传信息包括NA，HO，HE，PIC值。具体如表1所示。
表1、
多态信息含量(PIC)是衡量基因变异程度高低的指标，当PIC＞0.5时，该基因座位为高度多态性；0.25＜PIC＜0.5时，为中度多态；PIC＜0.25时为低度多态性。该发明得到的这个微卫星标记其PIC值为0.608，说明该标记具有高度多态性，可作为有效的遗传标记应用于黄喉拟水龟的遗传多样性和遗传结构分析，并为种质资源调查和辅助育种提供有利的分子工具。
实施例2、
用上述这对微卫星引物扩增来自8个采样点的120个个体，检测其遗传多样性。具体操作如下：
(1)用于遗传分析的黄喉拟水龟样本120只。采样点及代号见表2。
表2、黄喉拟水龟样本信息
(2)黄喉拟水龟DNA的提取
通过标准的蛋白酶K消化和酚/氯仿抽提的方法，从尾部提取基因组DNA。
(3)微卫星DNA的PCR扩增
PCR反应在15ul的体系中进行，包括：大约50-100ng基因组DNA，7.5ul Ex Taqpremix buffer，本发明的上下游引物各0.4ul，0.4pmol荧光标记的M13引物[either IRD700or IRD800(LI-COR)]，加ddH2O补齐到15ul。PCR扩增条件为：95℃预变性5min，紧接着32个循环的95℃变性30s，位点特异性退火温度(52℃)30s，72℃延伸30s；最后72℃终延伸8min。PCR扩增产物在LI-COR4300遗传自动分析仪上进行基因分型，配合使用内置STR分子量标准(STR Marker，LI-COR Bioseienee)和软件SAGAGT自动判读条带，辅以人工校正。
(4)数据分析
用CERVUS 2.0计算等位基因数目(number of alleles，NA)，多态信息含量(PIC)，观测杂合度(observed heterozygosities，HO)和期望杂合度(expeeted heterozygosities，HE)。哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)偏离测试和位点间的连锁不平衡检验(linkage disequilibrium，LD)使用GENEPOP version3.4软件完成。
(5)结果如下表3：
表3、8个黄喉拟水龟种群在Mmul位点的多态信息情况
注：表中带*表示该种群显著偏离哈迪-温伯格平衡。
由表3可以看出，8个种群在Mmul位点的等位基因范围在9-16之间，平均每个种群12.5个，含量丰富。PIC值最小为0.52，最大为0.91，均大于0.5，表明多态性丰富。另外经过哈迪-温伯格平衡检测发现，8个种群中有2个种群偏离了平衡，一方面可能是样本量不足所引起；另一方面微卫星位点数较少也是一个影响因素。
从图1看出，该8个种群聚为2大支系，其中浙江金华、浙江丽水、浙江海宁、江苏苏州、安徽南陵聚为一支；湖北荆州、湖南汉寿、湖南益阳聚为一支。
实验证明本发明得到的Mmul微卫星位点体现出了高度的种群遗传多样性，聚类分析结果能很好的反映这8个种群的实际状况。由此可见，该微卫星标记能很好的用于黄喉拟水龟遗传多样性分析和遗传结构的检测，并用于种质资源的调查和辅助育种。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
本发明得到的SSR序列(去掉载体)：
SEQ ID No：1
1 ctctgaacag gagtatttca tccctgattg actctgcccc ctcaggaaat gagtgaggac
61 aagtagcagg ggcctggagc atttatgtgt attgagagca atcgggaggg actcacttcc
121 aaaacaagtg tgtctgaccc agatacattt cacacacaca cacacacaca cacacacaca
181 cacacacaca cagaatcaat gtctgagccg ccagctgaat acaccactgg ccacttgctt
241 gacgtctggg atggggaggg ctgttacat
Claims (2)
1.一种黄喉拟水龟微卫星分子标记，其特征是：该微卫星分子标记的核苷酸序列为SEQID NO：1。
2.根据权利要求1所述的黄喉拟水龟微卫星分子标记的用途，其特征是：用于对黄喉拟水龟进行遗传结构分析、遗传图谱构建、基因定位、标记辅助选种或标记辅助育种。
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