CN101880397A - 一种交联聚合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种交联聚合物，在其分子中至少具有式(I)结构的第一重复单元和式(II)结构的第二重复单元，其中，1＜n＜25；Q为烷基或芳香基；R1为分子量为100～2000的聚乙烯亚胺；所述交联聚合物的分子量为5000～100000。本发明还提供了一种交联聚合物的制备方法。与现有技术相比，本发明提供的交联聚合物中的两个重复单元使得本发明提供的交联聚合物具有较大分子量，从而提高了其基因传递效率。同时，该两个重复单元均具有较低的细胞毒性，因此，所述交联聚合物细胞毒性较低。实验表明，本发明提供的交联聚合物作为基因载体用于体外转染时，其转染效率比PEI25k高十倍甚至几十倍。
Description
技术领域
本发明涉及高分子聚合物技术领域，尤其涉及一种交联聚合物及其制备方法。
背景技术
基因治疗是近年来新兴的一种治疗手段，通过将正常基因引入患者细胞内，纠正致病基因的缺陷从而达到治疗遗传疾病或癌症的目的。在基因治疗中，最关键的问题是将DNA转入靶细胞，然后进入细胞核，最终实现基因的转录与表达。目前，最常用的介导基因传递的载体是病毒类载体，如腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体等，但是，病毒类载体制备过程复杂，成本较高，而且存在引起免疫反应或基因突变的安全隐患，因此，制备方便、价格低廉、无毒、无免疫反应的非病毒类载体成为研究热点之一。
目前，现有技术公开了多种非病毒类载体，如脂质体复合物、阳离子聚合物等，其中，阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)由于具有电荷集中、对基因药物的复合能力强等优点，在体内和体外转染实验中得到了广泛的应用。但是，低分子量的PEI基因传递效率低，而高分子量的PEI虽然基因传递效率高，但细胞毒性较大、不可降解。
聚乙二醇(PEG)是无毒无免疫原性的水溶性大分子，具有优良的生物相容性，尤其是分子量为4000以下的PEG能够被机体迅速排出。研究发现，将PEG引入基因载体体系中，能够增强载体在体内循环的稳定性，延长循环时间。但是，PEG的反应官能团位于其分子链段的两端，不易与其他分子发生反应。
因此，本发明人考虑将小分子量的聚乙烯亚胺接枝在活化后的PEG上获得分子量较大且可降解的聚合物，该聚合物作为基因载体时，基因传递效率较高，细胞毒性较低。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种交联聚合物及其制备方法，本发明提供的交联聚合物用作基因传递载体时，基因传递效率较高，细胞毒性较低。
本发明提供了一种交联聚合物，在其分子中至少具有式(I)结构的第一重复单元和式(II)结构的第二重复单元：
其中，1＜n＜25；
Q为烷基或芳香基；
R1为分子量为100～2000的聚乙烯亚胺；
所述交联聚合物的分子量为5000～100000。
优选的，所述Q为式1)-式4)结构中的任意一种：
优选的，所述R1为分子量为200～1000的聚乙烯亚胺。
与现有技术相比，本发明提供的交联聚合物至少具有式(I)结构的第一重复单元和式(II)结构的第二重复单元，其中，第一重复单元为交联结构单元，第二重复单元为小分子量的PEI接枝结构单元，这两个重复单元使得本发明提供的交联聚合物具有较大分子量，从而提高了其基因传递效率。同时，该交联聚合物主要由低细胞毒性的小分子量PEI和具有良好生物相容性的聚乙二醇组成，细胞毒性较低。此外，该交联聚合物具有氨酯结构，易于降解。实验表明，本发明提供的交联聚合物作为基因载体用于体外转染时，其转染效率比PEI25k高十倍甚至几十倍。
本发明还提供了一种交联聚合物的制备方法，包括：
a)将聚乙二醇双丙烯酸酯与氨基乙醇混合，在无水无氧条件下进行聚合反应，得到第一中间产物；
b)将所述第一中间产物与二异氰酸酯混合，加热至50℃～60℃反应，得到第二中间产物，所述第一中间产物上的羟基与二异氰酸酯的摩尔比为1∶1.1～4；
c)将所述第二中间产物加入到聚乙烯亚胺溶液中，进行接枝反应，得到分子量为5000～100000的交联聚合物，所述聚乙烯亚胺的分子量为100～2000。
优选的，所述聚乙二醇双丙烯酸酯的分子量为150～1000。
优选的，所述二异氰酸酯为六次甲基二异氰酸酯、2，4-甲苯二异氰酸酯、2，6-甲苯二异氰酸酯或4，4-二苯基二异氰酸酯。
优选的，所述步骤a)中，反应的温度为0℃～50℃。
优选的，所述步骤a)中，反应的时间为1天～5天。
优选的，所述步骤b)中，反应的时间为5h～48h。
优选的，所述步骤c)具体为：
将所述第二中间产物加入聚乙烯亚胺溶液中，冰浴反应6h～15h后，升温至室温继续反应20h～30h，得到分子量为5000～100000的交联聚合物。
本发明首先使聚乙二醇双丙烯酸酯与氨基乙醇发生聚合反应，生成线型聚合物；再用与所述线型聚合物上的羟基摩尔比为1.1～4∶1的二异氰酸酯进行交联和活化，得到具有活化官能团的交联聚合物；所述具有活化官能团的交联聚合物上的官能团与小分子量的PEI反应，得到至少具有式(I)结构的第一重复单元和式(II)结构的第二重复单元的交联聚合物。通过控制各反应物的摩尔比和反应条件，可以得到不同分子量的交联聚合物，从而满足不同的使用要求。
附图说明
图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种交联聚合物，在其分子中至少具有式(I)结构的第一重复单元和式(II)结构的第二重复单元：
其中，1＜n＜25；
Q为烷基或芳香基；
R1为分子量为100～2000的聚乙烯亚胺；
所述交联聚合物的分子量为5000～100000。
按照本发明，所述第一重复单元为交联结构单元，使所述交联聚合物具有较大的分子量。
在所述第一重复单元中，所述Q为烷基或芳香基，优选为式1)-式4)结构中的任意一种：
按照本发明，所述第二重复单元为接枝结构单元，其中，R1为分子量为100～2000的聚乙烯亚胺，优选分子量为200～1000的聚乙烯亚胺。
为了使所述交联聚合物作为基因载体时具有更高的基因传递效率，本发明提供的交联聚合物的分子量为5000～100000，优选为5000～60000。
本发明还提供了一种交联聚合物的制备方法，包括：
a)将聚乙二醇双丙烯酸酯与氨基乙醇混合，在无水无氧条件下进行聚合反应，得到第一中间产物；
b)将所述第一中间产物与二异氰酸酯混合，加热至50℃～60℃反应，得到第二中间产物，所述第一中间产物上的羟基与二异氰酸酯的摩尔比为1∶1.1～4；
c)将所述第二中间产物加入到聚乙烯亚胺溶液中，进行接枝反应，得到分子量为5000～100000的交联聚合物，所述聚乙烯亚胺的分子量为100～2000。
按照本发明，首先将聚乙二醇双丙烯酸酯与氨基乙醇混合，在无水无氧条件下发生聚合反应，得到第一中间产物，该第一中间产物为线型结构的氨酯类聚合物(L-PAE)，反应式如下：
其中，1＜n＜25，1＜m＜20。分子量在4000以下的聚乙二醇能够被机体迅速排出而不产生任何毒副作用，因此，本发明使用的聚乙二醇双丙烯酸酯的分子量优选为150～1000，更优选为200～800。
按照本发明，所述聚乙二醇双丙烯酸酯与氨基乙醇发生聚合反应的过程如下：
分别将聚乙二醇双丙烯酸酯与氨基乙醇溶解于有机溶剂中；
将得到的溶液混合，使之发生聚合反应。
按照本发明，所述有机溶剂优选为氯仿、二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺；所述聚合反应的反应温度优选为0℃～50℃，更优选为20℃～50℃；所述聚合反应的反应时间优选为1天～5天。
聚合反应完成后，将得到的反应混合物冲入石油醚或乙醚中沉淀，将沉淀干燥后，得到线型结构的第一中间产物(L-PAE)。
得到线型结构的第一中间产物后，使用二异氰酸酯进行交联和活化，具体包括以下步骤：
将第一中间产物和二异氰酸酯分别溶解于有机溶剂中；
然后将得到的溶液混合，使第一中间产物上的羟基和二异氰酸酯的摩尔比为1∶1.1～4；
将混合后的溶液加热至50℃～60℃使第一中间产物和二异氰酸酯发生反应，得到第二中间产物。二异氰酸酯的结构如式(IV)所示，含有两个异氰酸官能团，其中，部分二异氰酸酯的两个异氰酸官能团均与第一中间产物的羟基发生反应，发挥交联剂的作用，得到具有式(I)结构的第一重复单元；部分二异氰酸酯只有一个异氰酸官能团与第一中间产物的羟基发生反应，得到具有式(III)结构的重复单元。由此，得到的第二中间产物为包括式(I)结构的第一重复单元和式(III)结构的重复单元的交联聚合物，即第二中间产物为网状结构的氨酯类聚合物(N-PAE)。
O＝C＝N-Q-N＝C＝O
(IV)
为了得到包含式(I)结构的第一重复单元和式(III)结构的重复单元的第二中间产物，所述第一中间产物上的羟基和二异氰酸酯的摩尔比为1∶1.1～4，优选为1∶1.5～3；所述反应时间优选为5h～48h，更优选为10h～30h，最优选为20h～25h。
按照本发明，所述二异氰酸酯优选为六次甲基二异氰酸酯、2，4-甲苯二异氰酸酯、2，6-甲苯二异氰酸酯或4，4-二苯基二异氰酸酯；所述有机溶剂优选为氯仿、二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺。
得到第二中间产物后，使第二中间产物与聚乙烯亚胺进行接枝反应，得到最终产物，优选包括以下步骤：
冰浴条件下，将第二中间产物加入到聚乙烯亚胺溶液中，冰浴反应6h～15h后，升温至室温继续反应20h～30h，得到反应混合液；
将所述反应混合液在乙醚中沉降，将沉降固体溶解后超滤，冷冻干燥后，得到分子量为5000～100000的交联聚合物。
在进行接枝反应时，首先在冰浴条件下反应，目的是降低异氰酸基团与PEI上的氨基的反应活性，使接枝反应有效进行而尽量避免PEI与第二中间产物发生交联；然后在室温条件下反应，使第二中间产物上的异氰酸酯基活性基团全部发生反应，提高反应率和接枝率。
在此过程中，聚乙烯亚胺与第二中间产物中式(III)结构的重复单元发生接枝反应，得到式(II)结构的第二重复单元；而式(I)结构的第一重复单元不发生变化，由此，得到至少包含式(I)结构的第一重复单元和式(II)结构的第二重复单元的交联聚合物，该交联聚合物为网状结构的聚氨酯接枝聚乙烯亚胺的共聚物(N-PAE-g-PEI)。
为了得到低细胞毒性的交联聚合物，所述聚乙烯亚胺的分子量为100～2000，优选为200～1000。本发明对所述聚乙烯亚胺的结构没有特殊限制，可以为线型结构的聚乙烯亚胺，也可以为支化结构的聚乙烯亚胺。
本发明提供的交联聚合物用作基因载体时，基因传递效率较高，细胞毒性较低，且可降解，实验表明，将其用于体外转染的基因载体时，转染效率是PEI25k和商业化转染试剂LipofectamineTM2000的十倍甚至几十倍，同时表现出较低的细胞毒性。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的交联聚合物及其制备方法进行详细描述。
实施例1
在无水无氧条件下，分别将0.61g氨基乙醇和分子量为258的聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)溶解于无水二氯甲烷中，其中PEGDA与氨基乙醇的摩尔比为1∶1，得到氨基乙醇二氯甲烷溶液和PEGDA二氯甲烷溶液，将所述两种溶液混合，50℃反应1天后，在1000mL乙醚中沉降，将固体干燥后得到淡黄色产物，所述淡黄色产物为线型结构的聚氨酯L-PAE1，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果参见表1，表1为本发明实施例制备的L-PAE及其分子量。
实施例2
使用与实施例1相同的原料和步骤进行操作，但是反应时间为3天，得到淡黄色产物L-PAE2，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果参见表1，表1为本发明实施例制备的L-PAE及其分子量。
实施例3
使用与实施例1相同的原料和步骤进行操作，但是反应时间为5天，得到淡黄色产物L-PAE3，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果参见表1，表1为本发明实施例制备的L-PAE及其分子量。
实施例4
使用与实施例1相同的条件和步骤进行操作，但是原料为分子量为600的聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)，得到淡黄色产物L-PAE4，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果参见表1，表1为本发明实施例制备的L-PAE及其分子量。
实施例5
使用与实施例4相同的原料和步骤进行操作，但是反应时间为3天，得到淡黄色产物L-PAE5，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果参见表1，表1为本发明实施例制备的L-PAE及其分子量。
实施例6
使用与实施例4相同的原料和步骤进行操作，但是反应时间为5天，得到淡黄色产物L-PAE6，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果参见表1，表1为本发明实施例制备的L-PAE及其分子量。
表1本发明实施例制备的L-PAE及其分子量
实施例7
取六次甲基二异氰酸酯和0.5g实施例1制备的L-PAE1分别溶解于干燥的氯仿中，得到L-PAE1氯仿溶液和六次甲基二异氰酸酯氯仿溶液，其中，L-PAE1中的羟基与六次甲基二异氰酸酯的摩尔比为1∶2；将所述两种溶液混合，控制溶液中反应物总浓度为0.05g/mL，50℃反应24h，反应完成后恢复到室温，直接封存，得到网状结构的聚氨酯N-PAE1，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的N-PAE及其分子量。
实施例8
使用与实施例7相同的原料和步骤进行操作，但是将反应物总浓度控制为0.1g/mL，得到N-PAE2，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的N-PAE及其分子量。
实施例9
使用与实施例7相同的条件和步骤进行操作，但是原料为甲苯二异氰酸酯，得到N-PAE3，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的N-PAE及其分子量。
实施例10
使用与实施例9相同的原料和步骤进行操作，但是将反应物总浓度控制为0.1g/mL，得到N-PAE4，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的N-PAE及其分子量。
实施例11
使用与实施例7相同的条件和步骤进行操作，但是原料为4，4′-二苯基二
异氰酸酯，得到N-PAE5，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，
表2为本发明实施例制备的N-PAE及其分子量。
实施例12
使用与实施例11相同的原料和步骤进行操作，但是将反应物总浓度控制为0.1g/mL，得到N-PAE6，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的N-PAE及其分子量。
实施例13
使用与实施例7相同的条件和步骤进行操作，但是原料为实施例4制备的L-PAE4，得到N-PAE7，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的N-PAE及其分子量。
实施例14
使用与实施例13相同的原料和步骤进行操作，但是将反应物总浓度控制为0.1g/mL，得到N-PAE8，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的N-PAE及其分子量。
实施例15
使用与实施例9相同的条件和步骤进行操作，但是原料为实施例4制备的L-PAE4，得到N-PAE9，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的N-PAE及其分子量。
实施例16
使用与实施例15相同的原料和步骤进行操作，但是将反应物总浓度控制为0.1g/mL，得到N-PAE10，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的N-PAE及其分子量。
实施例17
使用与实施例11相同的条件和步骤进行操作，但是原料为实施例4制备的L-PAE4，得到N-PAE11，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的N-PAE及其分子量。
实施例18
使用与实施例17相同的原料和步骤进行操作，但是将反应物总浓度控制为0.1g/mL，得到N-PAE12，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表2，表2为本发明实施例制备的N-PAE及其分子量。
表2本发明实施例制备的N-PAE及其分子量
实施例19
无水无氧条件下，分别将实施例7制备的N-PAE1和分子量为423的线型聚乙烯亚胺(线型PEI423)溶解于无水氯仿中，无水、无氧、冰浴条件下，将N-PAE1氯仿溶液滴加到线型PEI423氯仿溶液中，冰浴反应10h后室温反应24h。反应结束后，将反应液用1000mL乙醚沉降，将固体物质溶解于水中后，用截留分子量为3500的超滤管超滤，然后冻干，得到交联聚合物，即网状结构的聚氨酯接枝聚乙烯亚胺的共聚物N-PAE-g-PEI1，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。
实施例20
使用与实施例19相同的条件和步骤进行反应，但是原料为分子量为600的支化聚乙烯亚胺(支化PEI600)，得到N-PAE-g-PEI2，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。
实施例21
使用与实施例19相同的条件和步骤进行反应，但是原料为实施例8制备的N-PAE2，得到N-PAE-g-PEI3，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。
实施例22
使用与实施例21相同的条件和步骤进行反应，但是原料为支化PEI600，得到N-PAE-g-PEI4，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。
实施例23
使用与实施例19相同的条件和步骤进行反应，但是原料为实施例13制备的N-PAE7，得到N-PAE-g-PEI5，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。
实施例24
使用与实施例23相同的条件和步骤进行反应，但是原料为支化PEI600，得到N-PAE-g-PEI6，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。
实施例25
使用与实施例19相同的条件和步骤进行反应，但是原料为实施例14制备的N-PAE8，得到N-PAE-g-PEI7，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。
实施例26
使用与实施例25相同的条件和步骤进行反应，但是原料为支化PEI600，得到N-PAE-g-PEI8，用凝胶渗透色谱(GPC)计算分子量，结果见表3，表3为本发明实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。
表3本发明实施例制备的N-PAE-g-PEI及其分子量。
实施例27
本发明实施例19制备的N-PAE-g-PEI1介导的荧光酶质粒对人宫颈癌细胞(HeLa细胞)的体外转染实验
27.1HeLa细胞的培养
取HeLa细胞置于含体积百分数为10％的胎牛血清的培养基中，在37℃、含体积百分数为5％的二氧化碳的孵育箱中连续培养。
27.2体外转染
转染前24h内，取对数生长期的HeLa细胞，将其用胰酶消化后置于达尔伯克改良伊格尔培养基中稀释，然后按每孔1×104个细胞的密度将HeLa细胞接种于96孔培养板中，置于37℃、含体积百分数为5％的二氧化碳的孵育箱中继续培养至汇合度达到80％～90％；
转染时，吸弃培养板中的培养基，更换为200μL含体积百分数为10％的胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基，然后向培养基中加入复合物颗粒，继续培养48h，所述复合物颗粒由本发明实施例19制备的N-PAE-g-PEI1与荧光素酶质粒(pGL3)以氮磷比为15的比例混合形成；
转染完毕后，取出培养板，吸去培养基，用磷酸盐缓冲溶液洗涤2次，加入细胞裂解液使细胞裂解，然后加入荧光素酶底物，用光度计测定转染效率，以每毫克蛋白的发光单元数(TLU/mg Protein)表示，结果见表4，表4为本发明实施例及比较例提供的不同基因载体材料的转染效率结果。
实施例28
采用与实施例27相同的条件和步骤进行体外转染实验，但是加入的复合物颗粒是由本发明实施例20制备的N-PAE-g-PEI2与荧光素酶质粒(pGL3)以氮磷比为10的比例混合形成，其转染效率参见表4，表4为本发明实施例及比较例提供的不同基因载体材料的转染效率结果。
实施例29
采用与实施例27相同的条件和步骤进行体外转染实验，但是加入的复合物颗粒是由本发明实施例21制备的N-PAE-g-PEI3与荧光素酶质粒(pGL3)以氮磷比为15的比例混合形成，其转染效率参见表4，表4为本发明实施例及比较例提供的不同基因载体材料的转染效率结果。
实施例30
采用与实施例27相同的条件和步骤进行体外转染实验，但是加入的复合物颗粒是由本发明实施例22制备的N-PAE-g-PEI4与荧光素酶质粒(pGL3)以氮磷比为10的比例混合形成，其转染效率参见表4，表4为本发明实施例及比较例提供的不同基因载体材料的转染效率结果。
实施例31
采用与实施例27相同的条件和步骤进行体外转染实验，但是加入的复合物颗粒是由本发明实施例26制备的N-PAE-g-PEI8与荧光素酶质粒(pGL3)以氮磷比为10的比例混合形成，其转染效率参见表4，表4为本发明实施例及比较例提供的不同基因载体材料的转染效率结果。
实施例32
实施例19制备的N-PAE-g-PEI1的细胞毒性测试
取HeLa细胞置于含体积百分数为10％的胎牛血清的培养基中，在37℃、含体积百分数为5％的二氧化碳的孵育箱中连续培养。
测试前24h内，取对数生长期的HeLa细胞，将其用胰酶消化后置于达尔伯克改良伊格尔培养基中稀释，然后按每孔1×104个细胞的密度将HeLa细胞接种于96孔培养板中，置于37℃、含体积百分数为5％的二氧化碳的孵育箱中继续培养至汇合度达到80％～90％；
将培养基分为8组，第一组中不加任何试剂继续培养24h，其他7组中分别向培养基中加入10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL和70mg/mL实施例19制备的N-PAE-g-PEI1溶液与细胞共同培养24h；
向每组培养基中加入20μL含质量百分数为0.5％的噻唑蓝的磷酸盐缓冲溶液，37℃继续培养4h后吸除培养基，加入200μL二甲基亚砜溶解噻唑蓝甲臜结晶10min后，用酶标仪测定培养板各孔的吸收，重复测定三次，取平均值，并计算细胞存活率，测试结果见图1，图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲线图，其中，曲线a是本发明实施例19制备的N-PAE-g-PEI1的浓度与细胞存活率曲线。其中，测试波长选用492nm，细胞存活率按照下列公式计算：
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)*100％
其中，A样品是N-PAE-g-PEI1溶液与细胞共同培养的细胞样品孔的吸收；
A空白是未添加试剂的细胞空白孔的吸收。
实施例33
按照实施例32的条件和步骤对实施例20制备的N-PAE-g-PEI2进行细胞毒性测试，结果见图1，图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲线图，其中，曲线b是本发明实施例20制备的N-PAE-g-PEI2的浓度与细胞存活率曲线。
实施例34
按照实施例32的条件和步骤对实施例21制备的N-PAE-g-PEI3进行细胞毒性测试，结果见图1，图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲线图，其中，曲线c是本发明实施例21制备的N-PAE-g-PEI3的浓度与细胞存活率曲线。
实施例35
按照实施例32的条件和步骤对实施例22制备的N-PAE-g-PEI4进行细胞毒性测试，结果见图1，图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲线图，其中，曲线d是本发明实施例22制备的N-PAE-g-PEI4的浓度与细胞存活率曲线。
实施例36
按照实施例32的条件和步骤对实施例26制备的N-PAE-g-PEI8进行细胞毒性测试，结果见图1，图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲线图，其中，曲线e是本发明实施例26制备的N-PAE-g-PEI8的浓度与细胞存活率曲线。
比较例1
采用与实施例27相同的条件和步骤进行体外转染实验，但是加入的复合物颗粒是由分子量为25kDa的PEI(PEI25kDa)与荧光素酶质粒(pGL3)以氮磷比为10的比例混合形成，其转染效率参见表4，表4为本发明实施例及比较例提供的不同基因载体材料的转染效率结果。
比较例2
采用与实施例27相同的条件和步骤进行体外转染实验，但是加入的复合物颗粒是由商业化转染试剂LipofectamineTM2000与荧光素酶质粒(pGL3)混合形成，其转染效率参见表4，表4为本发明实施例及比较例提供的不同基因载体材料的转染效率结果。
表4本发明实施例提供的不同基因载体材料的转染效率结果
由表4可知，本发明实施例提供的交联聚合物N-PAE-g-PEI作为基因载体进行体外转染时，转染效率高于PEI作为载体和商业化转染试剂LipofectamineTM2000的转染效率。
比较例3
按照实施例32的条件和步骤对分子量为25kDa的PEI(PEI25kDa)进行细胞毒性测试，结果见图1，图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲线图，其中，曲线f是分子量为25kDa的PEI(PEI25kDa)的浓度与细胞存活率曲线。
比较例4
按照实施例32的条件和步骤对商业化转染试剂LipofectamineTM2000进行细胞毒性测试，结果见图1，图1为本发明实施例提供的细胞毒性实验中试剂浓度与细胞存活率的曲线图，其中，曲线g是商业化转染试剂LipofectamineTM2000的浓度与细胞存活率曲线。
由图1可知，本发明实施例提供的交联聚合物的细胞毒性远远低于PEI25kDa和商业化转染试剂LipofectamineTM2000。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种交联聚合物，在其分子中至少具有式(I)结构的第一重复单元和式(II)结构的第二重复单元：
其中，1＜n＜25；
Q为烷基或芳香基；
R1为分子量为100～2000的聚乙烯亚胺；
所述交联聚合物的分子量为5000～100000。
2.根据权利要求1所述的交联聚合物，其特征在于，所述Q为式1)-式4)结构中的任意一种：
3.根据权利要求1所述的交联聚合物，其特征在于，所述R1为分子量为200～1000的聚乙烯亚胺。
4.一种交联聚合物的制备方法，包括：
a)将聚乙二醇双丙烯酸酯与氨基乙醇混合，在无水无氧条件下进行聚合反应，得到第一中间产物；
b)将所述第一中间产物与二异氰酸酯混合，加热至50℃～60℃反应，得到第二中间产物，所述第一中间产物上的羟基与二异氰酸酯的摩尔比为1：1.1～4；
c)将所述第二中间产物加入到聚乙烯亚胺溶液中，进行接枝反应，得到分子量为5000～100000的交联聚合物，所述聚乙烯亚胺的分子量为100～2000。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇双丙烯酸酯的分子量为150～1000。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述二异氰酸酯为六次甲基二异氰酸酯、2，4-甲苯二异氰酸酯、2，6-甲苯二异氰酸酯或4，4-二苯基二异氰酸酯。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中，反应的温度为0℃～50℃。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中，反应的时间为1天～5天。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中，反应的时间为5h～48h。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c)具体为：
将所述第二中间产物加入聚乙烯亚胺溶液中，冰浴反应6h～15h后，升温至室温继续反应20h～30h，得到分子量为5000～100000的交联聚合物。
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