CN101873893B - 基于荧光的移液器仪器 - Google Patents

Abstract

一种改进的移液器吸头(276)，包括在近端(277)和远端之间延伸的细长本体。该本体通常包括多个薄膜层(如154，156，102，158，202)，这些薄膜层被配置和布置为提供从远端朝向近端(277)延伸的流体路径。该改进的移液器吸头(276)包括一个探询区，在该探询区中探询沿流体路径流动的流体。一个可操作的探询布置，整体表示为(100)，包括一个被配置成允许探测由斯托克斯频移产生的辐射的结构。可选地，传感器部件可包括一个或多个电极(如248，250)，所述电极排布在流体路径中以接触其中的流体，用于电探询。移液器吸头(276)可用于：粒子计数，验证样本完整性(例如没有气泡)，监测样本流率，确认吸入体积，以及其他用途。

Description

基于荧光的移液器仪器

优先权要求

本申请要求于2007年11月27日提交的关于“Fluorescence-based pipette instrument(基于荧光的移液器仪器)”美国临时专利申请No.61/004,630的申请日的优先权，该申请的全部内容以参引的方式纳入本文。

技术领域

本发明涉及从散装流体容器提取流体样本用于随后或同时对样本进行光探询和/或电探询(interrogate)的装置。

背景技术

手持移液器用于精确的流体体积测量和递送，是目前科学家可使用的一些最普遍和广泛使用的实验室工具。许多要求对生物和化学液体样本的进行小体积流体处理的程序，依靠它们的使用方便，精确和可重复性，以保证准确、一致的实验处理。很多体积固定和体积可调的移液器在市场上可以买到。当在大规格、高通量试验中使用时，市场上可买到的移液器常常是多通道的，允许通过单次推压一个按钮，同时用于最高达12个不同样本的精确流体测量。典型的移液器仪器依靠正排量系统(positive displacement system)(如，人工操作的柱塞系统，或电子泵)来产生促使特定流体体积进入或离开一次性移液器吸头所需要的压力。一旦样本被排出，移液器吸头即被丢弃。现有水平的移液器仪器能够准确地测量小于1mL的流体体积，并使用伺服泵来进行体积控制和流体测量。带有集成电子控制装置的数字显示器提高了移液器仪器对于操作者的使用便利性。

在实验室，移液器通常见于湿式工作台环境中，并且在从流体混合到样本分离和预备的无数流体计量应用中使用。在实验细胞生物学中，移液器常规地用于分离小体积的培养细胞的悬浮液。在最常见的一个程序中，对精确测量的体积内的一小部分细胞进行人工计数(在显微镜下观察)允许使用者对全部体积的培养细胞作出总数以及细胞生存能力评估。遗憾的是，在显微镜下使用该方法计数细胞十分耗时和浪费资源，且计算准确度全部依赖于使用者愿意在给定体积内实际计数的细胞的数量。

在通过测量由流经导电流体的两容器间小孔的粒子导致的阻抗偏差而进行的粒子检测方面的开拓性工作公开在W.H，Coulter的US2,656,508中。该发明人的名字现在与随着粒子挡住孔的一部分而导致电阻抗变化的粒子原理联系在一起。自从他的专利的公布后，已投入了相当大的努力用于发展和改善在库尔特原理下运行的传感装置。相关美国专利包括Fisher的5,376,878；Gascoyne等人的6,703,819；Krulevitch等人的6,437,551；Mehta的6,426,615；Frazier等人的6,169,394；Weigl等人的6,454,945和6,488,896；Holl等人的6,656,431；和Blomberg等人的6,794,877。所有上述提到的文档就其技术和各种传感器布置的公开内容通过引用的方式在此被纳入，就如同在本文中以其整体详细阐释一样。

特定粒子能够在与所施加的激励频率不同的频率处发出辐射的能力通常称为斯托克斯频移(Stokes-shift)。公开了与这种现象的探询相关的结构的最近的美国专利包括：7,450,238；7,444,053；7,420,674；7,416,700；7,312,867；7,300,800和7,221,455。所有上述提到的文档就其技术和各种传感器布置的公开内容通过引用的方式在此被纳入，就如同在本文中以其整体详细阐释一样。

提供如下的精密流体探询设备将是一个改进，该精密流体探询设备能够计量非常精确数量的散装流体以提取流体样本，并能够探询该样本(光探询和/或电探询)以确定该样本的一个或多个特征，如每单位体积的粒子数。对于该设备的进一步的优势则是该装置能够被实施为低成本的、一次使用的、坚固的、用后可丢弃的装置。

发明内容

本发明提供了用于探询在流体样本中携带的粒子的设备和方法。某些目前优选的实施方案可以从流体的散装容器中提取该样本。目前优选的实施方案可操作用于对该流体样本的一个或多个部分进行某些试验，如每单位体积粒子数目，并且/或者可以验证样本或者其一部分的体积的大小或流动速度，或者其他功能。试验或探询，可以包含辐射测试和电学性能测定中一个或两个。

一个目前优选的实施方案形成一个移液器吸头，该移液器吸头具有一个在近端和远端之间延伸的细长本体，其中一个穿过细长本体的流体路径从远端朝向近端延伸。该优选的实施方案被构造为允许检测从穿过探询区的激发的或受激的相关粒子发出的辐射。一般来说，探询区布置为接近于被配置成迫使粒子形成近似单列行进的结构。可选地，某些实施方案可电探询沿流体路径流动的流体。理想地，一个可运行传感器部件的实施方案被配置和布置为确定体积粒子数目。有时，传感器部件可能被配置和布置为在沿流体路径的一个或多个特定位置处探测流体边界边缘的存在。在这样的装置中，传感器部件可能被配置和布置为允许确定沿流体路径的流体流率。

在一些情况中，细长本体被构造为包括多个层，这些层被配置和布置为提供该流体路径的至少一部分。在某些该种情况下，一个可使用的传感器部件可由在第一和第二相邻层间所载的第一导电轨迹的一部分形成。第一传感器部件可由被排布为接触沿流体路径流动的流体的第一迹线的第一延伸部形成。此外，第二导电迹线可被载于相邻层之间，其中第二轨迹的至少一伸展部被排布为接触沿流体路径流动的流体作为第二传感器部件。有时，第一传感器部件和第二传感器部件可沿流体路径隔开，并被载于相同层间。其他时候，第一传感器部件和第二传感器部件沿流体路径隔开并载于不同层间。根据需要，多个这样的传感器部件可被设置在多个所需的位置处。

在某些实施方案中，流体路径的一部分由一段管腔限定，该管腔包含在不同的点之间的已知体积。此外，传感器部件可被排布在这些不同的点上，以有效地指示一定量的流体穿过移液器吸头的行进，该一定量的流体包括对应于已知体积的样本体积。流体前缘在沿流体通道隔开的传感器部件之间的渡越时间可用于确定探询样本的体积流率，所述流体通道在所述传感器部件之间具有已知容积。

根据本发明的某些原理构造的移液器吸头可有利地与被配置和布置为与该移液器吸头的近端接合的移液器组合使用。理想地，将吸头和移液器组合在一起能有效地将探询区定向，以允许将激发辐射应用至该区，以及探测来自区的发射辐射，还允许将吸力应用至流体路径的近端。进一步地，有时，对于将吸头结合至移液器的动作，理想的是将传感器部件放置为与电探询设备电路连通。

一些实施方案可包括适应于当吸头安装在移液器内时允许检测移液器吸头的结构。不同的移液器吸头可被构造为具有不同的可检测特性，如在电接触点针之间，或者被排布为直接电连通的不同的接触点之间所引起的不同电阻值，该接触点可用作触发器，例如其依靠获得的移液器吸头特性，可用于进行特定的试验。

通过将一个根据本发明的某些原理构造的移液器吸头连接至一个配合构造的移液器，以有效地将移液器吸头放在适当位置，用于通过探询装置来探询通过移液器吸头探询区的粒子，以及有效地使得穿过该移液器吸头的流体路径的近端与一个吸入源连通，来使用一种装置。然后，施加流体原动压力，以有效地将样本吸入移液器吸头。随着一部分样本沿流体路径流动并经过传感器部件，至少该一部分的样本被探询。由传感器部件采集的数据可在一个和移液器关联的显示屏上显示，和/或被传送到计算机，或者其他数据搜集设备，以进一步分析或存储。在完成流体样本分析后，使用过的移液器吸头被丢弃。

施加吸力的优选方法包含产生过量的吸入压力，该吸入压力随后通过和移液器相关联的结构被下调，有效地施加：i)第一吸入压力，其可操作用于将样本吸入移液器吸头，并ii)随后所希望的随时间变化的吸入压力分布。

从结合附图的以下详细描述的考虑，本发明的这些特征、优势以及替代方面对于本领域普通技术人员将是明了的。

附图说明

附图示出了目前所认为的实施本发明的最好模式，在附图中：

图1是穿过第一实施方案的横截面示意图，示出了本发明一般操作原理。

图1A是示出了频率-辐射波长的图表；

图2是立面横截面图，示出了可与一个探询平台的特定结构相关的可使用的管路布置(plumbing arrangement)的特定细节；

图3是在图2中示出的管路布置的俯视图；

图4是立面横截面图，示出了与一个探询平台的特定结构相关的另一个可使用的管路布置的特定细节；

图5是一个可运行探询平台的特定结构的目前优选布置的立面横截面图；

图6是一个组装的移液器吸头的立体图，该移液器构造为探询在所流经的流体中携带的粒子并允许对特定的这些粒子的荧光探测；

图7是图6中移液器吸头的其中最上面两层被移走的俯视图；

图8是图6中移液器吸头的分解组件俯视立体图；

图9是图8中移液器吸头的分解组件仰视立体图；

图10是穿过一个根据本发明的特定原理来构造的装置的横截面图；

图11是一个移液器的立体图，该移液器被构造为用于和如图6所示的移液器吸头一起使用的探询平台；

图12是如图11所示的移液器的吸头接口部分的局剖特写侧视图；以及

图13是为移液器吸头的探询部件布置的立体图。

具体实施方案

现在将参考附图，图中本发明的不同元件会给出数字标识，并且，在图中会讨论本发明以使本领域普通技术人员能够制造和使用本发明。应理解，接下来的描述仅仅是本发明原理的示例，并不应该被视为缩小了所附的权利要求。

正如本公开内容通常使用的，除非在上下文中原本是明显的，术语“流体”可以包括单独的液体，在混合物中的一种或多种液体，或者一种或多种液体和携带或悬浮在其中的粒子。在特定的例子中，液体会有电解特性。一个散装流体容器只是如下一个容器，该容器尺寸被加工为能够盛放足够量的流体，以形成至少一个将采用本装置的实施方案来探询的流体样本。

术语“粒子”和其变体意在包括小块的(a small piece of)物质--非排他的包括活的或死的生物细胞--和分子。除非上下文中原本是明显的，“压力”和“吸力”一般意指相对于本地大气压力测量的。

“受控辐射探询区”意味着至少一个可操作的控制测量在该区域中相关的粒子的行进过程中进行。一个可操作的控制水平物理地组织粒子进入一个布置，该布置足够允许检测有效区分或量化穿过该受控辐射探询区行进的相关个体粒子的发射辐射。这样的控制完全不同于非受控辐射，例如激发辐射冲击进包括许多相关粒子的测试管的情况。在这些例子中，从一个粒子发出的斯托克斯频移辐射可被探测到，但是将会不可控，并且人们将不能区分或量化相关的个体粒子。人们仅仅能提取有限的信息，即在测试管中存在至少一些相关粒子。

孔可以被宽泛地定义为包括当粒子行进通过移液器吸头的一部分时能有效地将相关粒子组织或排布进入所希望的紧凑横截面的任何一种收缩结构。在一个目前优选的实施方案中，孔本质上是一个贯穿板的洞(hole-through-a-plate)。理想地，通过孔的结构，迫使相关的粒子以至少大致单列顺序行进。

图1中在100处总体示出了在本发明特定的实施方案中所使用的一般可操作的结构布置。如图所示，实施方案100包括一个放置在辐射源104和辐射探测器106之间的不透明部件，整体表示为102。有时，不透明部件102可称作探询层，因为层102和一个探询区相关。至少一个孔108布置在不透明部件102里，以在第一侧(整体表示为110)和第二侧(整体表示为112)之间提供流体路径。孔108可被表征为具有一个贯穿轴线114，流体可在不透明部件102的第一侧110和第二侧112之间沿着该贯穿轴线流动。

不透明部件的厚度T1和孔的特征尺寸D1典型地尺寸被确定为与相关粒子的尺寸一致，以促进通过不透明部件的粒子的单列行进，以及以基本上一次在孔中只有一个粒子。在设备用作探询血细胞的情况中，不透明部件的厚度可以典型地在大约10微米和大约300微米之间的范围内，其中大约125微米的厚度是目前优选的。孔的直径或其他特征尺寸可以在大约5微米和大约200微米之间的范围内，其中大约50微米是目前优选的。

可操作不透明部件102可部分地用于减少从源104发出的初级辐射118(或有时为激发辐射)的量，该初级辐射被辐射探测器106接收和探测。初级辐射118被图示为一个有方向的矢量。理想地，阻止基本所有的初级辐射118被辐射探测器106探测到。在任何情况下，可操作实施方案被构造成为防止探测器106对于初级辐射118饱和。如图1中的布置所示，初级辐射118可以只穿过孔108以供辐射探测器106接收。因此，正如将在下面进一步描述的，特定实施方案会使用一个或多个选择性的辐射滤光片作为控制由探测器106接收辐射的措施，或替代地，相对于探测器106倾斜地引导初级辐射118。

图1中示出的不透明部件102包括核心元件122，该核心元件122载有布置在第一侧110上的第一涂层124以及布置在第二侧112上的第二涂层126。可替换的核心元件可以由在单侧有涂层的核心元件形成。所示出的涂层124，126协作地对通过核心元件122的激励辐射的传输形成屏障。当然，替换地使用一个本身对辐射传输有固有抵抗的裸露核心的元件也是在构思的范围内。一个目前优选的核心包括不透明聚酰胺薄膜，穿过该薄膜能够传输非常少的光，所以，不需要敷金属，或其他屏障元件。然而，特定的实施方案可能甚至需要一个对初级辐射118基本透明的探询层102。

用于检测小尺寸粒子的可使用的核心122可以由薄聚合物膜构成，如厚度大约为0.005英寸的PET。这种聚合物材料基本上是可透过辐射的，所以一个或多个涂层，如涂层124和126二者之一或二者都能被用于此种核心材料，如果需要的话。可使用的涂层包括可如通过溅镀，气相沉淀或其他众所周知的技术作为薄层而被涂覆的金属或金属合金。理想的，这样的层是初级辐射波长的至少大约2倍厚，如在一个可操作实施方案中为大约1μm。产生的金属化薄膜基本上不透过辐射的传输，除了在被孔中断的地方。铝是一种应用在核心122作为涂层124和/或126的一种合适的金属。

设备100被配置成迫使一些粒子130以基本单列通过孔108。随着粒子接近、穿过以及离开孔108，粒子130典型地通过激发区。值得注意的，带粒子的流体流的方向可以是穿过孔108的两个方向中任一个。激发区典型地包括由孔108限定的贯穿通道(through-channel)。激发区可还包括由下云134表示的体积，下云134包含粒子可位于其中且可在其中与初级辐射相接触的体积。激发区可进一步包括由上云136表示的体积，上云136包含粒子可位于其中且可在其中与初级辐射相接触的体积。

在特定的情况中，例如，在有多个孔的情况下，术语“区”可包括多个这样分布的区。也就是，在多个液压并联区内执行探询。然而，术语“区”的适当含义被认为在上下文中是“aduceable”的。在激发区，初级辐射108冲击粒子导致特定粒子发荧光(经历斯托克斯频移)，因此基本在所有三个纵坐标方向上发出与初级辐射108相比为不同波长的辐射。由那些特定粒子发出的荧光辐射接着被辐射探测器106探测到。

需要注意的是，为了本公开的目的，术语“波长”通常并非必定仅指单个特定波长，而是可包含围绕一个特征化的、代表性的波长分组的一个波长范围。参考图1A，初级辐射118的特征波长F1(如激发波长)十分不同于荧光(如发射波长)的特征波长F2，以实现二者之间的差别。进一步地，希望这些特征波长，或斯托克斯频移差异之间的差别足够地不同，以保证在特定的实施方案中，包括在辐射源104和探测器106之间的选择性通道滤光片元件，该选择性通道滤光片元件能有效地阻止朝向探测器的初级辐射的传输，同时允许荧光通过选择性通道滤光片传输到探测器。

再次参考图1，实施方案100可本质上被放置一个适宜尺寸的容器中，该容器被不透明部件分成两部分。经过孔108的流体流(以及携带在流体中的粒子)可被分开的两部分之间的压力差控制。然而，通常希望在孔108附近处在粒子的流动路径上提供比这个实施方案允许的更多的控制。例如，靠近孔108的入口或出口布置的一簇粒子能将一个相关粒子屏蔽使其免受初级辐射118达到荧光不发生的程度，因此导致计数错误或阻止探测一个被屏蔽的相关粒子。

具有多层的实施方案--整体表示为140并在图2中示出--提供了一管路布置，该管路布置被构造成阻止粒子在孔108附近聚集，并阻止因而缺少的对相关粒子的探测。多层组件140被构造成迫使流体流在这样的方向上穿过孔108，该方向基本正交于在与孔108相邻且在其上游和下游的通道部分中的流体流。这样的流体流阻止粒子在管路布置140厚度方向上的堆积，并因此减少了相关粒子未被检测到的可能性。

管道布置140包括五层，该五层被配置和布置为形成一个管道系统，该管道系统有效地将承载粒子的流体的流动从供应腔142、穿过不透明部件102中的孔108、朝向废物腔144引导。理想地，流体引导通道146和148的深度的尺寸被加工为与粒子150的尺寸大体一致，以阻止粒子在孔108附近的“堆积”。通过在腔142和144间施加压力差，或在位于不透明部件102中的孔108两端施加压力差，流体可以在装置140上到处移动。例如，正压可被施加在供应腔142。或者，负压可被施加到废物腔144。在特定的情况中，可以施加正压和负压两者。替代的流体原动元件例如一个或多个泵，可用来控制粒子穿过不透明部件102的行进。

尽管供应腔142和废物腔144两者都被示为与大气连通，在本构思内，供应腔142和废物腔144中的一个或两者被布置为基本包含在一个包括多层元件104的管道装置中的流体样本。也值得注意的是，尽管图2示出了从上到下的流体流，流体流可在经过孔108的两个方向中任一个方向上建立。在一个反流布置中，供应腔142和废物腔144的位置应仅仅和它们的被示出的位置相反。在一个替代的反流布置中，辐射源104和探测器106的位置将和它们的被示出的位置相反。

如图2和图3所示出的多层管道布置140，包括顶盖层154，顶通道层156，不透明部件102，底通道层158，和底盖层160。这些层可被冲压出，如冲切出，或通过使用激光或水射流(water jet)，或其他机械加工技术如微细加工，蚀刻或其他类似技术来制造。在一个用于探询血细胞的目前优选的实施方案140中，各个层中的某些层通常由薄聚合物膜制成，这些聚合物膜然后被结合在一起形成多层组件。理想地，至少通道层156，158的厚度和相关粒子的特征大小近似，以促进粒子单列行进通过探询区。在用于探询血细胞的目前优选装置中这些层的可使用厚度典型地在大约10微米到大约300微米之间的范围内。

在任何情况下，至少底层160的一部分适合于形成一个底窗162，激励辐射118可穿过该底窗162被传输到激发区。类似的，顶层154包括一个形成窗164的部分，荧光可穿过该窗被传输。因此，组件140被布置为形成一个允许辐射穿过其厚度的窗。这样的窗包括窗部分162、164，通道146和148的布置于孔108附近的特定部分和孔108本身。辐射可以因此被导向穿过位于孔108附近的组件140的厚度。

在图4所示出的、整体表示为170的管道布置，包括顶层172，该顶层载有一个刻出的流体流通道(carved-out fluid-flow channel)174。底盖层176类似地包括一个刻出的通道178。不透明部件102适于排布用于通道174和178之间流体连通的孔108。底层176由一种如下材料形成，该材料允许在适当频谱中的辐射传输，以实现穿过和孔108相关联的激发区的粒子被初级辐射118激发。顶层172由一种如下材料形成，该材料允许处于适当频谱中的辐射传输，以实现荧光180向辐射探测器的传输。顶层172也适合于阻止初级辐射118的传输。同样，该流体和粒子流也可在与图所示相反的方向上。

如图4所示，有时一个管路布置例如布置170可通过一个光纤光缆182被结合至，或关联至一个辐射源和/或辐射探测器。光纤光缆182可被排布为起到一个透镜的作用，其有效地捕获穿过该管道布置170传输的大部分荧光。替代地，该光纤元件可简单地以管道朝向或者远离该激发区输送辐射，以允许一个源或探测器在远离激发区的一个所需距离处布置。

由于荧光基本在所有方向上从一个被标记和受激的有关粒子传播，初级辐射118从一侧被导向激发区，而不是仅直接从该区的下方。现参考图5，有时优选的是，以相对于孔108的轴线114成一锐角A1来施加初级辐射118。在这种情况下，不透明部件102可甚至基本作为一个可运行滤光片，来阻止初级辐射118直接传输到辐射探测器。如图所示，辐射向量118可被导向通过、或部分地进入孔108而不被辐射探测器106探测到。然而，当被标记粒子150在激发区(例如如图所示的孔108)内出现时，所引起的荧光180仍可被辐射探测器106探测到。同时可使用角度A1可以在0到90度之间的范围内，对于角A1目前优选的是在大约15到大约75度之间。

辐射源104可由一个广谱辐射发射器形成，例如一个白光源。在这种情况下，通常优选地是包括一个预过滤器188，该过预滤器188适于在一个相对窄的频带内传送或传输辐射，该相对窄的频带包含将与一个相关粒子相关联的特定荧光剂激发所需要的特征值。一般情况下的一个好的想法是，限制在激发波长外所施加的辐射118的量，以减小辐射探测器非期望的饱和以及因而不能探测相关粒子的可能性。

在适用于探询血细胞的一个实施方案中，目前优选的是使用一个红色二极管激光器，并包括一个短通滤光片(short pass filter)(在二极管激光器后)，该短通滤光片可通过波长短于642nm的初级光辐射。目前也优选地是，包括一个带通滤光片(在光电探测器前)，该带通滤光片具有一个和具体选定的荧光峰值匹配的峰值。市场上可买到的染料可以获得具有在660、694、725和775纳米的特征荧光峰值。也常常使用长通滤光片来代替在光电探测器之前的带通滤光片。移液器吸头“盖层”和“基底”也可被设计成充当光滤光片以辅助传统激发和发射滤光片，或消除它们的需要。在本公开内容中，“后置滤光片”可以更常见地被称为“发射滤光片”。

继续参考图5，有时，优选地是包括一个可以阻止在荧光180特征波长之外的辐射传输的后置滤光片190。这样的布置减少了背景噪声并帮助避免表示在激发区存在相关粒子的错误读数。此外，为帮助获得一个强信号，可以包括一个光学增强件如透镜192，以收集荧光180并将该辐射导向辐射探测器106。所示出的透镜192可被表征为一个非球面集光透镜(或双合透镜(doublet))，并通常地被布置为聚焦在位于孔108里的一点。

预期的是，根据本发明的某些原理构造的装置可包括或可不包括一个或多个传感器部件例如电极，所述一个或多个传感器部件以各种形式且在不同位置被布置，用于与流经该装置中管道的流体接触，例如用于基于阻抗的粒子探询。这种探询结构的选定的可操作布置公开在2007年5月4日提交的题为“薄膜粒子传感器(Thin film particlesensor)”的美国专利申请序号11/800,167中，该专利申请的全部内容如同他们全部在本文描述一样被纳入本文。

图6-9示出了一个根据本发明的某些原理构造的目前优选的实施方案的构造细节。该实施方案是一个在单次使用后可丢弃的移液器吸头，整体表示为200，尽管在某些情况下该吸头200会使用多于1次。移液器吸头200由载于一个注塑基底202上的多个薄聚合物膜层形成。在图7中，为了更加清晰，省略了顶盖层154和顶通道层156。

参考图6，可以提供横向突出的翼结构以形成一个整体表示为206的夹持区域，该夹持区域有效地辅助将一个吸头200安装进移液器中。如图所示，夹持区域206的近端可被配置为形成一个肩部--整体表示为208，该肩部有效地限制插入深度，以促进该吸头200在移液器接收套内的一致的固定接合。

可用于构造一个根据本发明的某些原理的设备的某些元件是市场上可买到的。例如，一个可操作辐射源104包括红光二极管激光器，其可根据零件编号VPSL-0639-035-x-5-B购买自在1537 Centre PointDrive，Milpitas，CA 95035具有营业场所的Blue Sky Reasearch。滤光片元件188，190可购买自在21 Omega Dr.，Delta Campus，Brattleboro，VT 05301具有营业场所的Omega Optical。优选的滤光片包括零件编号660NB5(带通滤光片)和640ASP(短通滤光片)。一个可操作的辐射探测器包括一个光电倍增管，该光电倍增管可根据零件编号H5784-01从在360 Foothill Rd.，Bridgewater，NJ 08807具有营业场所的Hamamatsu公司购买。Molecular Probes(Invitrogen公司的一个分部，www.probes.invitrogen.com)提供多种染料，这些染料适用于标记特定相关粒子，以使用根据本发明构造的实施方案来探询。特别地，AlexaFluor 647，AlexaFluor 700和APC-AlexaFluor 750可用于血细胞的探询。这些染料也可普遍用于流式细胞术应用，并具有特定的激发和发射特征。每个染料可被很容易的结合到抗体，用于标注或标记不同的细胞类型。

所示出的移液器吸头200可用于使用阻抗或荧光之一，或二者结合来探询粒子。所示出的不透明部件102(有时或者被称作探询层或探询板)载有导电迹线，如210，该导电迹线被配置为形成一个与电接触点214(见图7)进行电通信的电极传感器部件212，该电极传感器部件适于与一个探询电路通信。例如，可包括该探询电路作为目前优选的移液器或其他探询设备的一部分。

如图7和图8所示出的接触点--整体以218示出--被配置为与一个市场可买到的10针边缘连接器相连接，例如可从Samtec购买的零件编号为SEI-110-02的边缘连接器，该公司在SAMTEC USA，P.O.Box 1147，New Albany，IN 47151-1147具有营业场所以及一个万维站点www.samtec.om。该边缘连接器可以与传统形式的电探询设备电路连通。其他可使用的连接器包括触地探针，以及在本技术领域已知的其他导电的接触形式的探针。值得注意的是，接触点214可设置在探询层如探询层102的一侧或两侧。

一般来说，术语“流体”在本公开文本中用于包括在流体中携带的粒子。有时，流体可能是电解液。参考图8和图9，通过在流体出口或通气孔222施加吸力，流体通常被吸入输入储蓄器220。流体沿该储蓄器220，以及在底通道层158处形成的可选择的流体通道224的流动方向以箭头226示出。理想地包括该流体通道224，以帮助肉眼观察样本流体流进移液器吸头，并限制(最大程度上)生物样本暴露于暴露的粘合剂。流体流继续横向穿过流体通路227、可选的滤光片元件228和流体通路229，到达在层156中的通道231的远端。流体在通道231中的流动方向以箭头232示出。

在通道231中流动的流体连续地将第一驱动电极233和第一探询电极234弄湿。在横向穿过在探询板102中的孔108后，流体随后在布置于底通道板158的通道236中沿所示方向235流动，并且将第二探询电极238和第二驱动电极240连续地弄湿。

在通道236的远端242，流体连续地弄湿第一电极248和第二电极250。电极248和电极250被配置为协作地指示流体前缘(fluid front)存在于沿着从装置200的远端向近侧延伸的流体管的一个已知位置。正如所示出的，电极248和250可以指示流体的前沿到达在一个已知位置(实际上在位于基底202的流体通道252的入口)。例如，可以监测电极248和250之间的阻抗以探测开路状况的变化。该监测信号随着流体边界弄湿第二电极250示出了开路值的不连续性，该监测信号可被用作开始记录或处理数据的触发信号，以随着流体继续被吸入装置200探询流体。可监测这些电极之间的阻抗信号以探测流体边界前缘或流体边界后缘。由于和刺激电极248极为接近，在试验的持续时间内可监测在测量电极250处可获得的电极信号，以探测在样本中存在的空气泡。除其他用途之外，后边界信号的缺失可被用作验证泡在流体样本中的自由移动。

例如，对流体样本的探询可被所监测到的后来的触发信号终止，以确定已知体积流体的探询的完成。在所示出的装置200中，在已知的体积(电极250的下游，且由箭头251示出)已经进入基底通道252后，相关流体前缘将一个确认电极254(见图9)弄湿，以发出一个测试体积完成的信号。应注意，一个体积确认流体通路256穿过底通道板158延伸，以允许当所需要的已知体积被吸入进装置200时，在通道252中的流体弄湿确认电极254。作为一个非限制性示例，触发信号可以通过监测在电极254与电极248或250二者之一间的阻抗来获得。额外量的吸入流体可以被容纳在存储腔255内。

来自所示出的确认电极254的触发信号可被用作终止施加于通气孔222的吸力，以阻止被吸入完全通过装置200的流体对移液器或其他探询装置的潜在污染。另外，或者替代地，在构思范围内，提供一个流体抵抗屏障或隔膜(未示出)，该流体抵抗屏障或隔膜被布置为阻止流体在装置200内超过期望位置--例如在存储腔255的出口处--的进一步流动。一种可使用的该种屏障允许空气分子通过，但阻止吸入的流体通过，以阻止将吸入的流体抽入移液器或其他探询装置中。

提供验证信号的结构可被包括在装置200中，以确认移液器吸头200被正确安装在移液器中。例如，电接触点#1和电接触点#10之间的电连续信号可提供预期的反馈。如图9所示，导电迹线258在电接触点#1和电接触点#10之间电通信。因此，吸头200正确插入移液器中，可在这些接触点之间产生预期的验证反馈信号(电连续性验证)。

现参考图9，某些移液器吸头200可包括适合便利于将已安装的移液器吸头从移液器移除的结构。所示出的斜坡260提供了一个整体表示为261的工作后表面，吸头-抽取结构可以接合靠在该后工作面上以把吸头从移液器移走。

图10示出了一个探询经历了斯托克斯频移的粒子的可使用的布置，整体示为264。辐射-探询布置264包括一个载于基底268上的薄膜组件266。目前优选的基底268由聚碳酸酯材料注塑制成，尽管也可使用其他材料。基底268理想地被构造为为组件264提供足够的刚性，以便于材料的处理。

如图10所示，可提供一个窗265以便利辐射束(如激光束)的透过，用于将辐射118撞击到位于一个和孔108相关联的探询区内的粒子上。所示出的窗265被成形为一个朝向基底268的底部开口的插口(socket)，并在孔108附近提供减少的基底厚度。在一个替代的布置中(未示出)，可以在一个被构造为贯穿基底厚度延伸的插口的窗265上提供一个薄膜窗盖。

图10中示出的薄膜组件266包括：顶盖板154；顶通道板156；不透明部件102；和底通道板158。理想地，顶通道板156和底通道板158由基本平面材料的板形成，所述板具有的厚度使得流体引导通道231和流体引导通道236的尺寸被加工为避免相关的粒子在孔108附近聚集。这些通道的宽度(如图示，深入页面之中)也可被设置大小以阻止该种聚集。同样，需要注意，在一个替代的可使用的布置中，流226和232的方向可与所示出的方向相反。

目前优选的是，利用使用已知的多层构造技术而结合在一起的薄聚合物膜的堆叠板来制造薄膜组件，例如图10中的组件266。用于流体穿过组件流动的通道可使用微机械加工技术，如激光切割或水切割、冲压，或其他类似技术来形成。目前优选的是，通过激光钻孔操作来形成探询孔108。某些层可载有预涂覆的粘合剂，或者粘合剂可在一个或多个层之间涂覆。多个构成部件，如图7中的导电迹线210，可被分布在一个板的区域上，以在当板(通常是薄膜)被以堆叠配准被组装时形成成组的多个组件266。理想地，在个体的板中提供对准结构，以便利于与相邻的板以恰当的配准而堆叠。多个个体组件可随后从成组的组件中分离。

在一个在血细胞探询方面所使用的示例性传感器组件266中，目前优选的是使用由聚酰胺或迈拉(Mylar)薄膜制成的层。对于聚酰胺层，一个可使用的厚度范围被认为是大约0.1微米到大约500微米。目前优选的聚酰胺盖层154的厚度大约是52微米。目前优选的是，探询层102也由聚酰胺制成。然而，较便宜的替代性材料，如聚酯薄膜或Kapton也是可以使用的。对于通道层156，158，大约125微米的膜厚度被发现在用于探询血细胞的传感器中是可行的。理想地，隔离层的厚度大约与将要探询的主要的粒子的粒子尺寸近似。一个可使用的范围目前被认为在大约一个粒子大小到15倍粒子大小的范围内，尽管更大的范围也是可行的。

图10中的辐射探询组件264包括一个辐射源104，如激光器，该辐射源被引导为撞击在一个辐射探询区的相关粒子270上。由在斯托克斯频移转化9中受激发的粒子发出的辐射180被辐射探测器106，如光电二极管探测到。线272以传统形式连接至具有探询电路的合适的电子装置。理想地，布置有一个光增强元件如透镜192，以收集和聚焦用于被探测器106的探测的荧光180。一个或多个滤光片，如发射滤光片192，和/或预滤光片273(或激发辐射滤光片)，可以被包括在辐射探询组件中。通过合适的后滤光片，激发辐射118可以穿过孔108被直接引导(对比所示出的迎角A1)，而不会使辐射探测器106饱和。

图11示出了安装在移液器--整体表示为278--中的一个探询粒子的移液器吸头276，该移液器被构造成一个探询平台。近端277通常使用滑动配合被安装进移液器的远端。移液器278可被构造成采用电探询、辐射探询或二者兼用来探询通常在电解液流体中所承载的粒子。理想地，探询移液器278包括显示装置，如屏幕280，该显示装置能够显示特定的测试结果和/或状态，如测试的开始或结束状态。显示可以以柱状图，数值，饼图，条形图和类似图形的方式呈现。理想地，移液器278被构造成与一个计算机相通信，以允许将探询数据上传用以存储，和/或附加处理。使用者可握住手柄282，用拇指按下柱塞284，以从散装容器提取样本。

图12示出了一个可使用的移液器288的特定结构，该移液器288被布置用于探询在移液器吸头例如吸头290中的粒子。移液器288适合使用荧光和/或电阻抗来探询。流体通过由移液器288经管腔292所施加的减小的压力或吸力被吸入注入吸头290。O形环294在吸头290和管腔292之间形成密封接头，以允许和通气孔222相连通。边缘连接器296理想地被包括在某些移液器288中，以借助于与一个或多个接触点214接触--在所安装的移液器吸头上存在这些接触点的条件下--将电探询电路(其理想地被载于移液器内)，与载于移液器吸头上的传感器部件接合。

探询结构可以替代的方式来布置，如可以包含光纤光缆以将来自更远的源104的辐射朝向探询区传输。这种布置可允许移液器288的远端部分的构造，呈现出更细长的形状系数。类似的，这种光缆也可用于替代的装置中，以将辐射从探询区传输到位于远处的辐射探测器106。

图13示出了提供一个替代的整体表示为300的辐射探询布置的移液器吸头的部分组合段。辐射探询布置300包括一个“带尾纤的”二极管激光器104(理想地被包括在移液器中)，其具有向移液器吸头接合处延伸的小段光纤。该一次性的移液器吸头自己具有光纤302(或光导管)，该光纤302在插入移液器吸头时“对接接合”至移液器中的光纤。在该一次性的移液器吸头中的光纤302将被夹在层压材料层之间。

移液器吸头中的光纤302(或光导管)会将激光直接传送到探测孔108的附近，并直接照耀掠过孔108，基本横切于流体在孔108中流动方向。粒子(或细胞)会随着他们进入(或离开)探测孔108而流经此光路。由于激发辐射118在和探询层102基本平行的方向发出，横切定位的探测器106在该辐射的路径之外。因此，层102可甚至由对激发辐射完全可透的材料制成。从经历斯托克斯频移的粒子发出的辐射(在全部方向上)将仍会被探测器106探测到。同样，根据要求，可以包括一个透镜192和/或滤光片190。

根据本发明的某些原理构造的装置可被用在一种探询一个或多个粒子的方法中。为在一个这样的方法中使用此装置，使用者会被提供一种装置，该装置被构造成迫使粒子--被携带在流经该装置的辐射探询区的流体中--朝向基本单列行进，以允许在该辐射探询区中探测由经历了斯托克斯频移的粒子发出的发射辐射。使用者将使用该装置从流体的散装容器中提取流体样本。包括第一特征波长的激发辐射将作为流经该辐射探询区的流体样本的一部分，冲击进入辐射探询区。具有第二波长的辐射，对应于来自经历斯托克斯频移的粒子发出的辐射，会检测到，有效地获得关于粒子的信息。

在装置的一种使用中，移液器吸头276被插入进移液器278的远端，以形成通气孔228的空气密封，以及以在一次性荧光感应移液器吸头和移液器光学器件之间建立必要的校准。接下来，按下柱塞284，从散装流体容器中抽取过量体积的将被分析的样本。在分析之前，此样本通常被存储在输入储存器220中，尽管同步的分析也是有可能的。然后，释放柱塞284，和/或可以激活第二按钮或其他控制装置，以开始细胞计数或探询。受控的真空分布图(controlled vacuum profile)理想地将被施加至传感器/移液器吸头276，以穿过该荧光探测区提取细胞。可以加入单色或多色的荧光探测方法。荧光粒子被探测和计数。一般来说，固定体积的流体被探询。探询可被光学地完成，或使用多个电极和电阻抗来实现。这样使得可以进行容积细胞计数。分析结果可在小显示屏280上显示，通常以柱状图或散布图的形式显示。最后，移液器吸头被丢弃。

施加吸力的优选方法包含产生过量的吸入压力，该吸入压力随后通过和移液器相关联的结构被向下调节，有效地施加：i)第一吸入压力，其可操作用于将样本吸入移液器吸头，以及ii)随后所希望的随时间变化的吸入压力分布，以引起穿过该移液器吸头的传感器部分流动的所需流体。

根据本发明的某些原理构造的实施方案可被用于：粒子计数；验证样本完整性(如没有气泡)；估计或监测样本流率；确认吸入体积；决定在已知体积的液体悬浮液中单个细胞的细胞活性；识别/探测用荧光染料(如抗体结合物染料)染色的特定细胞；以及决定已知体积的液体悬浮液中荧光分析物或粒子的存在，以及其他用途。

虽然本发明已参考某些示出的实施方案进行了描述，但这些描述并非意在限制本发明的范围。在不偏离本发明主旨和基本特征的前提下，本发明还可以以其它具体的形式被实施。对于非限制性实例而言，层还可能具有非平坦的形态，并可仅沿移液器吸头长度的仅一部分延伸。所述实施方案仅应被视为示例性而非限制性。因此，本发明的范围由所附权利要求表明，而非由前述说明书表明。所有在权利要求的等同物的含义和范围内的变化方案均将包括在权利要求的范围内。

Claims (20)

1.一种类型的移液器吸头，其改进在于，该类型的移液器吸头可结合至移液器，以通过将流体样本吸入导管中来从流体容器中抽取流体样本，该导管从移液器吸头的远端延伸到移液器吸头的近端，所述改进包括：

与所述导管相关联的流体引导结构，该流体引导结构被配置和布置为提供一个受控的辐射探询区，以有效地允许对在被吸入所述导管的流体中携带的一个或多个相关粒子发出的斯托克斯频移辐射进行检测，其中：

所述移液器吸头包括多个堆叠的薄膜层；并且

所述导管的一部分由一个在至少一个薄膜层中形成的通道限定，所述通道具有一长度轴线，流体沿该长度轴线流动。

2.根据权利要求1所述的移液器吸头，其中：

所述流体引导结构包括排布在所述辐射探询区附近的孔，所述孔被配置为迫使相关粒子成为至少近似单列，用于通过所述孔行进。

3.根据权利要求1所述的移液器吸头，其中：

所述流体引导结构包括对激发辐射基本不透明的屏障，所述流体引导结构还包括一个孔，该流体引导结构被配置为迫使所述流体流在如下一个方向上穿过所述孔，该方向基本正交于在与所述孔相邻且在其上游和下游的通道部分中的流体流。

4.根据权利要求3所述的移液器吸头，其中：

所述孔被配置成迫使行进的相关粒子形成基本单列，用于通过所述屏障行进。

5.根据权利要求1所述的移液器吸头，其中：

和其中一个所述层相关联的结构形成一个屏障，该屏障至少基本上对传输经过该屏障的激发辐射不透明。

6.根据权利要求5所述的移液器吸头，进一步包括：

一个窗，其被配置为便于激发辐射透过，用于将这些辐射撞击到位于所述辐射探询区内的粒子上。

7.根据权利要求6所述的移液器吸头，其中：

所述窗包括在一个基底中减少厚度的区域，在所述基底上载有所述堆叠的薄膜层。

8.根据权利要求1所述的移液器吸头，进一步包括：

第一电探询部件，其被排布为允许对沿所述导管流动的流体进行电探询。

9.根据权利要求8所述的移液器吸头，其中：

所述第一电探询部件被构造为允许检测流体边界边缘是否到达沿所述导管的一特定位置。

10.根据权利要求8所述的移液器吸头，其中：

所述第一电探询部件被配置和布置为与一个第二电探询部件相协调，以允许估计沿所述流体路径的流体流率。

11.根据权利要求8所述的移液器吸头，其中：

所述第一电探询部件被配置和布置为与一个第二电探询部件相协调，以允许验证已知体积的流体是否经过探询区。

12.根据权利要求8所述的移液器吸头，其中：

所述第一电探询部件被配置和布置为与一个或多个其他电探询部件相协调，以允许随着流体被从所述散装容器吸取并且进入所述移液器吸头，来确定一个或多个相关粒子的体积粒子数。

13.根据权利要求1所述的移液器吸头，其中：

所述移液器吸头沿长度轴线是细长的；并且

所述导管的通气孔被排布为通过所述移液器吸头的一个表面连通于所述移液器，该表面具有大致横切于所述长度轴线的法线。

14.根据权利要求1所述的移液器吸头，进一步包括：

一个辐射传导元件，其夹在形成所述移液器吸头的层之间，并被配置和布置为将辐射朝向所述受控的辐射探询区传输。

15.根据权利要求14所述的移液器吸头，其中：所述辐射传导元件包括一个光纤光缆，该光纤光缆排布为与所述移液器吸头的探询层平行，以使得辐射可从所述光缆的终端在一个与流体流经所述探询层中探询孔的方向横切的方向上被排出。

16.根据权利要求1所述的移液器吸头，进一步包括：

一个手持移液器，所述手持移液器被配置和布置为与所述移液器吸头的所述近端相结合，以有效地：

允许施加吸力到所述导管的近端；以及

相对于一个辐射源将所述辐射探询区定向，以使得来自所述源的辐射可撞击到在穿过所述辐射探询区流动的流体中所携带的粒子上。

17.根据权利要求16所述的移液器吸头，其中：

所述手持移液器包括一个辐射源和一个协作布置的辐射探测器。

18.一种装置，包括：

一个在近端和远端之间延伸的细长本体，所述本体包括多个堆叠的层；

一个管腔，流体可在其中流动，所述管腔从在所述本体的所述远端布置的开口朝向所述本体的所述近端延伸，所述管腔的一部分由一通道限定，所述通道被布置在所述层中的至少一个层中并具有一长度轴线，流体沿该长度轴线穿过该通道流动，所述管腔的一个收缩部被配置和布置为迫使在流动通过该收缩部的流体中所携带的粒子成为基本单列行进；

一个辐射探询区，其被排布为与所述收缩部可操作地相关联；

一个窗，其被配置为允许发射辐射从在所述辐射探询区中经历斯托克斯频移的粒子朝向一个排布在所述本体之外的辐射探测器传输；以及

辐射传输结构，其被配置成允许激发辐射撞击到在所述辐射探询区存在的粒子上。

19.一种探询一个或多个粒子的方法，包括：

提供一个一次性装置，该装置被构造为迫使在穿过所述装置的辐射探询区的流动流体中携带的粒子成为基本单列行进，以允许对由在辐射探询区中经历斯托克斯频移的粒子发出的发射辐射进行探测；

使用所述装置从一个散装流体容器中抽取一个流体样本，使得所述流体样本被吸入经过所述探询区；

随着所述流体样本的一部分流过所述辐射探询区，使得包括第一特征波长的激发辐射进入所述辐射探询区；以及

探测具有对应于所述发射辐射的第二特征波长的辐射，有效地获得关于所述粒子的信息。

20.根据权利要求1所述的移液器吸头，其中：

所述移液器吸头被构造成允许在从所述容器中抽取所述流体样本的同时，对所述流体样本的一部分进行基于荧光的探询。

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