CN101871017A - 病毒检测方法和用于使病毒核酸游离的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种病毒检测方法，是在同一溶液中由可能含有至少1种病毒的生物学样品同时且简便地特异性地分离病毒核酸后进行检测的方法，以及在该方法中使用的用于使病毒核酸游离的组合物。本发明涉及的病毒检测方法的特征在于，其包含：(a)将生物学样品与用于使病毒核酸游离的组合物混合而制备混合物的工序，和其它工序(b)～(e)，所述用于使病毒核酸游离的组合物的特征在于，包含：选自硫氰酸胍、盐酸胍和碘化钠中的至少一种的离液剂，阴离子性表面活性剂和还原剂。最适合于可能含有选自B型肝炎病毒、C型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒中的1种以上的病毒的生物学样品的检查。
Description
技术领域
本发明涉及一种在同一溶液中从可能含有选自B型肝炎病毒、C型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒中的至少1种病毒的生物学样品中特异性地分离病毒核酸然后进行检测的方法，以及在该方法中使用的用于使病毒核酸游离的组合物。
背景技术
以往，为了检测病毒而分离核酸的方法因各个病毒而不同(例如，参见专利文献1)。为了同时检测B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)等多种病毒，在同一溶液中使核酸从各自病毒中游离出来的操作是必须的。
但是，HBV的细胞壁和细胞膜(以下，也合称为“膜”)比其它病毒坚固，因此为了将HBV膜溶解而将核酸分离，必须使用苛刻的条件，例如添加高浓度改性剂、在高温或碱性环境下进行等。
另一方面，C型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒的膜在物理化学方面脆弱，因此上述HBV膜的溶解条件过于苛刻。另外，由C型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒中分离出的核酸为核糖核酸(RNA)，因此在上述HBV膜的溶解条件下游离的RNA分子被分解而形成短的片段，结果妨碍基因的检测。
对使HBV膜与HCV膜、HIV膜的溶解条件相同的方法正在研究中，一般探讨利用蛋白质分解酶的酶法。但是，在利用蛋白质分解酶的酶法中，在用后续的基因扩增反应检测游离的病毒核酸时，蛋白质分解酶将作用于基因扩增反应的酶分解，因此存在无法检测核酸的可能。即，存在这样的致命缺陷：溶解病毒的膜所必须的蛋白质分解酶在后续的核酸检测反应中变为阻碍物质。
另一方面，还提出在病毒溶出后，用热、碱使蛋白质分解酶失活，然后进入后续反应的方法。但是，如果用热或碱等物理化学的方法使这些蛋白质分解酶失活，则已经游离的C型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒的RNA也同时分解，结果存在无法检查病毒基因的问题。
如上所述，将B型肝炎病毒的膜溶解而使病毒核酸游离，同时将C型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒的膜溶解而使病毒核酸游离，使用这些病毒核酸进行基因检查的技术现在尚未确立。
专利文献1：日本特表2005-505289号公报
发明内容
本发明的目的在于，提供一种同时且简便地从可能含有选自B型肝炎病毒、C型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒中的至少1种病毒的生物学样品中特异性地分离出病毒核酸进行检测的方法，以及在该方法中使用的用于使病毒核酸游离的组合物。
本发明是为解决上述课题的至少一部分而作出的发明，能够以下述方式或适用例加以实现。
[适用例1]
本发明的病毒检测方法的一个方式为：
在同一溶液中从可能含有至少1种病毒的生物学样品中特异性地分离出病毒核酸后进行检测的方法，其包含以下工序：
(a)将所述生物学样品和用于使病毒核酸游离的组合物混合的工序，
(b)在所述工序(a)的混合物中，添加能够与所述病毒核酸的至少一部分序列杂交、且至少一方的末端被生物素化的寡核苷酸的工序，
(c)在所述工序(b)的混合物中，添加固相载体的工序，所述固相载体表面固定有抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，
(d)从所述工序(c)的混合物中将所述固相载体分离的工序，
(e)使用所述固相载体的水分散液用核酸扩增法检测所述病毒核酸的工序；
所述组合物含有：选自硫氰酸胍、盐酸胍和碘化钠中的至少一种离液剂，阴离子性表面活性剂和还原剂；所述工序(a)的混合物中的所述阴离子性表面活性剂的浓度为2.5质量％～30质量％。
[适用例2]
在适用例1中，检测的病毒可以为选自B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)中的至少一种。
[适用例3]
在适用例1或适用例2中，所述工序(e)可以进一步包含向所述工序(d)得到的固相载体添加溶出液、将所述病毒核酸溶出的工序。
[适用例4]
在适用例1或2中，
所述工序(e)可以包含使用所述工序(d)得到的固相载体，不分离病毒核酸，而用核酸扩增法检测每个固相载体的工序。
[适用例5]
本发明所的病毒检测方法的一个方式为：
在同一溶液中从可能含有至少1种病毒的生物学样品中特异性地分离出病毒核酸后进行检测的方法，其包含以下工序：
(f)将所述生物学样品和用于使病毒核酸游离的组合物混合，制备混合物的工序；
(g)在所述工序(f)的混合物中，添加固相载体并进行分散的工序，所述固相载体表面结合有与所述病毒核酸的至少一部分序列杂交的寡核苷酸；
(h)从所述工序(g)的混合物中将所述固相载体分离，用洗净缓冲液使所述固相载体再分散，得到所述固相载体的水分散液的工序；和
(i)使用所述固相载体的水分散液，用核酸扩增法检测所述病毒核酸的工序。
所述组合物含有：选自硫氰酸胍、盐酸胍和碘化钠中的至少一种离液剂，阴离子性表面活性剂和还原剂；所述工序(f)的混合物中的所述阴离子性表面活性剂的浓度可以为5质量％～30质量％。
[适用例6]
在适用例5中，检测的病毒可以为选自B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)中的至少一种。
[适用例7]
在适用例5或适用例6中，所述工序(i)可以进一步包含在所述工序(h)得到的固相载体的水分散液中添加溶出液，将所述病毒核酸溶出的工序。
[适用例8]
在适用例5或适用例6中，所述工序(i)可以包含使用所述工序(h)得到的固相载体的水分散液，不分离病毒核酸，而用核酸扩增法检测每个固相载体的工序。
[适用例9]
在适用例1～适用例8的任一例中，所述固相载体可以为具有0.5μm～15μm的平均粒径，且能够用重力或离心力进行固液分离的粒子。
[适用例10]
在适用例1～适用例8的任一例中，所述固相载体可以为具有0.5μm～15μm的平均粒径、且能够用电磁力进行固液分离的粒子。
[适用例11]
本发明的用于使病毒核酸游离的组合物，含有：选自硫氰酸胍、盐酸胍和碘化钠中的至少一种的离液剂，阴离子性表面活性剂，和还原剂；所述阴离子性表面活性剂的浓度为2.5质量％～30质量％。
[适用例12]
在适用例11中，所述阴离子性表面活性剂可以包含选自烯基琥珀酸二钾、N-十二烷基肌氨酸钠、烷基醚羧酸盐、烷酰基谷氨酸盐和聚氧乙烯烷基醚磷酸钾中的至少1种。
[适用例13]
在适用例11或适用例12中，所述还原剂可以包含选自2-巯基乙醇、硫甘油、二硫苏糖醇、2-巯基乙胺盐酸盐、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐、巯基乙酸和2-巯基丙酸中的至少1种。
根据上述的病毒检测方法，可以同时且简便地在同一溶液中从可能含有选自B型肝炎病毒、C型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒中的至少1种病毒的生物学样品中特异性地分离出病毒核酸，检测病毒。
具体实施方式
以下，对于本发明优选的实施方式，进行详细说明。
1.病毒的检测方法
1.1第一实施方式
本发明第1实施方式的病毒检测方法为，在同一溶液中从可能含有选自B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)中的至少1种的病毒的生物学样品中特异性地分离病毒核酸，然后进行检测的方法，其包含以下工序：
(a)将所述生物学样品和用于使病毒核酸游离的组合物混合，制备混合物的工序；
(b)在所述工序(a)的混合物中，添加能够与所述病毒核酸的至少一部分序列杂交、且至少一方的末端被生物素化的寡核苷酸，将该混合物升降温的工序；
(c)在所述工序(b)的混合物中，添加表面固定有抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的固相载体并进行分散的工序；
(d)从所述工序(c)的混合物中将所述固相载体分离，用洗净缓冲液使所述固相载体再分散，得到所述固相载体的水分散液的工序；和
(e)使用所述固相载体的水分散液、用核酸扩增法检测所述病毒核酸的工序。
所述组合物含有：选自硫氰酸胍、盐酸胍和碘化钠中的至少一种的离液剂，阴离子性表面活性剂和还原剂。
根据本发明的病毒检测方法，可以在同一溶液中从可能含有选自B型肝炎病毒、C型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒中的至少1种的病毒的生物学样品中特异性地分离病毒核酸，检测病毒。
在本发明中，“生物学样品”是指，动植物组织、细胞裂解液、血液、血浆、血清、尿、唾液等各种体液，培养细胞裂解液等，可以列举可能存在病毒的物质。这样的样品可以是采取后原样的状态，也可以是用缓冲液等稀释的状态。
以下，对各工序进行详细说明。
1.1.1.工序(a)
本工序为将上述生物学样品与用于使病毒核酸游离的组合物混合，制备混合物，由上述生物学样品中所含的病毒使核酸游离的工序。
以下，对在本工序中使用的用于使病毒核酸游离的组合物(以下，也简称为“组合物”)进行说明。
用于本工序的组合物通过与可能含有选自B型肝炎病毒、C型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒中的至少1种病毒的生物学样品混合，能够将病毒膜溶解使病毒核酸游离于溶液中。
上述组合物为至少含有离液剂、阴离子性表面活性剂和还原剂的水溶液。
上述组合物含有选自硫氰酸胍、盐酸胍和碘化钠中的至少一种作为上述离液剂。离液剂的含量为，在使用硫氰酸胍时，作为与上述生物学样品混合后的浓度，优选为0.5M～6.0M，更优选为0.8M～5.5M，特别优选为1.0M～5.0M。在使用盐酸胍时的含量为，作为与上述生物学样品混合后的浓度，优选为0.5M～8.0M，更优选为1.0M～7.5M，特别优选为1.5M～7.0M。在使用碘化钠时的含量为，作为与上述生物学样品混合后的浓度，优选为3.0M～8.0M，更优选为4.0M～7.5M，特别优选为5.0M～7.0M。如果离液剂含量在上述范围内，则可以可靠地溶解HBV、HCV和HIV的膜，且由HCV和HIV游离出来的病毒RNA不会被分解。如果离液剂含量低于上述下限，则存在无法使HBV膜完全溶解，或者由HCV、HIV游离出来的RNA被分解RNA的酶RNase分解的可能。另一方面，如果离液剂含量超过上述上限，则用于使病毒核酸游离的组合物的制备变得困难，即使能够制备用于使病毒核酸游离的组合物其粘性也变高，难以准确称量，因此不实用，不优选。此外，尿素作为离液剂是众所周知的，但由于具有阻碍在后述工序(b)中要分离的病毒核酸的杂交的作用，因此不适用于本发明。
作为上述阴离子性表面活性剂，优选一般具有作为亲水性基团的磺酸基、羧基、磷酸基等的物质。作为具有磺酸基的物质，例如可以列举十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸盐等。作为具有羧基的物质，例如可以列举烯基琥珀酸二钾、烷基醚羧酸盐、烷酰基谷氨酸盐、N-十二烷基肌氨酸钠等。作为具有磷酸基的物质，例如可以列举聚氧乙烯烷基醚磷酸钾等。这些阴离子性表面活性剂可以单独使用1种或将2种以上组合使用。
阴离子性表面活性剂适合作为上述组合物中的成分的理由是，可以列举对病毒膜的乳液形成能力高，容易渗透病毒膜。而且，通过使用阴离子性表面活性剂，可期待其对寡核苷酸与病毒核酸的杂交反应有促进效果。
阴离子性表面活性剂的含量以与上述生物学样品混合后的浓度计，为2.5质量％～30质量％。如果阴离子性表面活性剂的含量在上述范围内，则会得到溶解作为目标的3种病毒(HBV、HCV、HIV)的膜、有助于病毒核酸游离的效果。如果阴离子性表面活性剂的含量低于上述范围，则存在无法将病毒膜乳液化、使其溶解的情况。如果阴离子性表面活性剂的含量超过上述范围，则用于使病毒核酸游离的组合物的粘性增高，难以准确地称量，因此在实用上不优选。
作为上述还原剂，列举2-巯基乙醇、硫甘油、二硫苏糖醇、2-巯基乙胺盐酸盐、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐、巯基乙酸和2-巯基丙酸，可以单独使用1种或将2种以上组合使用。如果添加上述例示的还原剂，则可以使病毒膜或病毒蛋白质中的-S-S-键解离，形成2个-SH键。由此，病毒蛋白质的超级结构被分解，通过上述组合物病毒蛋白质变得更容易变性。
还原剂的含量以与上述生物学样品混合后的浓度计，优选为0.05质量％～20质量％，更优选为0.01质量％～10质量％。如果还原剂的含量少于上述范围，则上述还原作用不足，不优选。另一方面，如果还原剂的含量超过上述范围，则实际效果不变，未发现更好的效果，因此不优选。
在上述组合物中，根据需要还可以添加乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂。有时在生物学样品中会混入有分解RNA的称为RNase的酶，通过溶解HCV或HIV的膜而得到的RNA会被该RNAase分解。此时，由于多种RNAase表现出镁依赖性，因此能够通过添加螯合剂来抑制RNA的分解。螯合剂的含量优选为0M～1M。如果超过1M，实际效果不变，未发现更好的效果，因此不优选。
上述组合物的pH优选为5.0～10.0，更优选为6.0～9.0。上述组合物的pH调节可以通过使用通常在生化领域使用的Good’s缓冲液而容易地实现。作为Good’s缓冲液，例如列举三羟甲基氨基甲烷缓冲液等。
以上说明的用于使病毒核酸游离的组合物不仅可以用于本工序，还可以用于其它用途，只要该用途的目的是从可能含有选自B型肝炎病毒、C型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒中的至少1种病毒的生物学样品中将上述病毒的膜溶解并使病毒核酸游离即可。
1.1.2.工序(b)
本工序为在上述工序(a)的混合物中，添加能够与所述病毒核酸的至少一部分序列杂交，且至少一方的末端被生物素化的寡核苷酸(以下，也简称为“寡核苷酸”)，将该混合物升降温的工序。
寡核苷酸的添加量优选为0.5pmol～400pmol，更优选为5pmol～100pmol。如果寡核苷酸的添加量少于上述范围，则杂交的量不足，不优选。另一方面，如果寡核苷酸的添加量超过上述范围，则存在无法用抗生物素蛋白粒子捕捉的情况。
将上述工序(a)的混合物与寡核苷酸混合后，将该混合物升温进行温育，由此病毒膜的溶解加速。温育的时间优选为5～60分钟，更优选为10～30分钟。温育的温度优选为30～85℃，更优选为50～80℃。另外，为了使加热均匀，根据需要也可以在加热时缓慢搅拌或振动。而且，在降温到室温时病毒核酸和寡核苷酸会杂交，将抗生物素蛋白导入核酸。
1.1.3.工序(c)
本工序为，在上述工序(b)的混合物中，添加与生物素特异性反应的表面固定有抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的固相载体并进行分散的工序。通过抗生物素蛋白-生物素反应，特异性地捕捉病毒核酸是本发明的特征之一。由此，在后续的核酸扩增法中不会被其它夹杂核酸影响，能够高效率地使目的病毒核酸扩增。
作为表面固定有抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的固相载体，列举以下示例的抗生物素蛋白磁性粒子。
可以在本工序使用的抗生物素蛋白磁性粒子的平均粒径优选为0.1μm～20μm，更优选为0.3～17μm，特别优选为0.5μm～10μm。如果抗生物素蛋白磁性粒子的平均粒径小于上述范围，则存在粒子的分离纯化需要长时间的情况。另一方面，如果超过上述范围，则表面积减小，病毒核酸的捕捉量不足，因此不优选。此外，在本发明中，平均粒径是指，使用以动态光散射法为测定原理的粒径分布测定装置进行测定的值。
抗生物素蛋白磁性粒子为应答外部磁场的粒子，该粒子的固液分离操作可以通过外部磁石进行。因此，固液分离操作不只可以使用离心分离或自然沉淀这样的手动方法，还可以用装备了磁石的市售自动仪器进行。
另外，优选抗生物素蛋白磁性粒子为不具有剩余磁化的超常磁性。对于超常磁性的抗生物素蛋白磁性粒子，如果施加外部磁场，则受磁场的影响而在磁场方向移动，但如果屏蔽外部磁场，则由于失去剩余磁化，因此能够不受抗生物素蛋白磁性粒子之间的影响，彼此不凝聚地独自运动。由此，超常磁性的抗生物素蛋白磁性粒子具有以下优点：磁性分离后的抗生物素蛋白磁性粒子的再分散容易实现。在本发明的捕捉病毒核酸的过程中，通过使用所述超常磁性的磁性粒子，容易洗落目的病毒核酸以外的不需要成分、夹杂物，以高效率进行后续的核酸扩增反应，可以捕捉数分子左右的极微量的病毒核酸并进行分离、检测。
在本工序中可使用的抗生物素蛋白磁性粒子对将捕捉病毒核酸的操作自动化或装置化是有用的，但也可以用手动法进行捕捉病毒核酸的操作。在手动法中，可以代替磁性分离而利用离心分离或自然沉淀进行分离，也可用非磁性粒子代替磁性粒子。
1.1.4.工序(d)
本工序为从上述工序(c)的混合物中将上述固相载体分离的工序。
首先，通过工序(c)将含有捕捉病毒核酸的固相载体的混合物分离为固相载体和其它液体，只回收捕捉病毒核酸的固相载体。由此，将混合物中的样品所含的血清、血浆中的蛋白质、糖、脂质等成分或夹杂物除去。固相载体和其它液体的分离可以通过将混合物在磁力架上静置，磁性吸引固相载体来进行固液分离，也可以用数千转/分钟左右的低速离心分离进行。
在如上所述得到的固相载体的表面，除了目的病毒核酸之外，还含有游离的金属离子和蛋白质，其它夹杂物。这些物质在核酸检测法中存在抑制核酸扩增的情况。因此，在本工序中，优选用不引起核酸解离的洗净缓冲液将固相载体洗净。
洗净缓冲液例如优选以0.5M～2.0M左右的浓度含有NaCl、KCl等盐。添加这种程度的盐具有将上述夹杂物中通过静电相互作用而在固相载体表面吸附的成分除去的效果。但盐浓度低于0.5M时，存在在固相载体表面配对并捕捉的病毒核酸会解离而失去，病毒核酸的分离效率降低的情况。核酸的Watson-Crick碱基配对为在2根单链核酸中起作用的碱基间的氢键产生的引力，与构成核酸骨架的磷酸二酯基的阴离子性磷酸基间起作用的静电斥力的平衡中，碱基间的氢键产生的引力占优势时形成的。溶液的盐浓度高时，溶液中的盐中和磷酸基间的静电排斥，由此碱基间的氢键产生的引力占优势，促进Watson-Crick碱基配对的形成。在本发明中，室温附近的温度条件的情况、盐浓度低于0.5M的情况使磷酸基间的静电排斥占优势，寡核苷酸和病毒核酸的配对进行解离，利用核酸配对的病毒核酸的捕捉效率降低，结果存在病毒核酸的分离效率降低的情况。另一方面，在盐浓度比2.0M高时，碱基间的氢键产生的引力占优势，寡核苷酸和病毒核酸的配对稳定，但在除去洗净缓冲液之后，未除尽而微量残留并进入随后工序的盐使作为随后工序(e)的任意工序的病毒核酸的溶出工序的效率降低，因而不优选。
另外，洗净缓冲液例如优选以0.01质量％～2.0质量％的浓度含有Triton X-100、Tween20等表面活性剂。添加这种程度的表面活性剂具有将上述夹杂物中通过疏水性相互作用在磁性粒子表面吸附的成分除去的效果。
洗净缓冲液的pH优选为5.0～10.0，更优选为6.0～9.0。
在本工序中还优选，在用洗净缓冲液洗净固相载体之后，用洗净缓冲液或后述的溶出液将上述分离的固相载体再次分散，制成上述固相载体的水分散液。
1.1.5.工序(e)
本工序为用核酸扩增法检测在工序(d)分离的病毒核酸的工序。在被捕捉于固相载体的病毒核酸可以就按被捕捉于固相载体表面的(即，固相载体的水分散液)状态进入PCR等核酸扩增反应体系，进行核酸扩增。
另一方面，也可以将被捕捉于上述磁性粒子表面的病毒核酸从磁性粒子中溶出，然后用核酸扩增法进行检测。经过溶出工序，可以将病毒核酸作为水溶液回收，因此可以应对使用病毒核酸之类的应用。
这些方法可以根据使用的核酸扩增装置的种类、使用目的进行适当区分使用。一般的，以就按被捕捉于磁性粒子表面的状态进入核酸扩增反应体系的方法更为简便。但是，在使用实时荧光检测装置时，存在一部分机型中荧光信号被固相载体遮蔽或吸收，病毒核酸的检测效率降低的可能。将病毒核酸由固相载体溶出进行核酸扩增的方法具有增加病毒核酸的溶出工序这一缺点，同时具有可靠消除PCR反应的阻碍因素这一优点。
以下，对由固相载体将病毒核酸溶出的方法进行说明。
作为使病毒核酸由固相载体溶出时的溶出液，可以使用蒸馏水或碱性水溶液等的能够将配对的病毒核酸解离的物质。此外，还可以使用DEPC水、超纯水等对后续的PCR酶反应不产生不良影响的物质代替蒸馏水。在本发明中，添加蒸馏水以使固相载体的水分散液的盐浓度降低，由此能够使与寡核苷酸配对的病毒核酸解离。此时，作为溶出液，优选蒸馏水，但作为不妨碍与寡核苷酸配对的病毒核酸的解离的范围，还可以添加0.2M以下浓度的NaCl、KCl等盐。另外，作为同样不妨碍解离的范围，还可以添加0.2M以下浓度的三羟甲基氨基甲烷等具有缓冲作用的盐。此时，溶出液的pH优选为5.0～9.0，更优选为6.0～8.5。另外，为使固相载体的凝聚或对试管等容器的附着为最小限度，还可以添加微量的表面活性剂。具体地，可以添加0.01～0.5质量％的Triton系、Briji系、Tween、NP40等的表面活性剂。
作为溶出液还可以使用碱性水溶液。碱性水溶液具有双链核酸的变性作用，能够使核酸解离为单链。作为这样的碱性水溶液，可以使用氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液等。作为氢氧化钠或氢氧化钾的浓度，优选为30mM以下。在使用比30mM更浓的碱时，会导致核酸、特别是病毒RNA的水解，病毒核酸的分离效率降低。将碱性水溶液用作溶出液时，与将蒸馏水用作溶出液同样，作为不妨碍核酸解离的范围，也可以预先加入0.2M以下浓度的NaCl、KCl等盐。
为了将病毒核酸溶出，优选在磁性粒子中加入溶出液然后温育1分钟～20分钟左右，在温育中还可以搅拌样品。作为溶出液，在使用蒸馏水时，作为促进病毒核酸溶出的方法，进行加热也是有效的。作为加热方法，可以采用以下任意的方法：使用预先加热过(例如70℃)的溶出液的方法、或在与固相载体混合后进行加热的方法。将碱性水溶液用作溶出液时，存在加热导致病毒核酸水解而丧失的可能性，必须注意加热。
另外，为了可靠地将病毒核酸溶出，将该溶出工序重复进行2～3次也是有效的。
在将碱性水溶液用作溶出液时，根据需要，还可以增加在核酸溶液回收后添加酸性水溶液或具有缓冲作用的水溶液、中和pH的工序。
通过以上得到的病毒核酸溶液可以用于核酸扩增反应。作为核酸扩增法，没有特别限定，但例如可以使用罗氏公司的PCR(Polymerase chainreaction)法、Gen-Probe公司的TMA(Transcription mediatedamplification-hybridization protection assay)法、雅培公司的LCR(Ligase chain reaction)法、荣研化学社的LAMP(Loop-mediatedisothermal amplification of DNA)法、宝酒造社的ICAN(Isothermal andchimeric primer-initiated amplification of nucleic acid)法等。
本发明的病毒检测方法主要可以用于输血血液或血液制剂的病毒筛选。本发明的病毒检测方法可以在人工操作中进行，但多数是在用于集中处理大量的样品的专用装置中使用。本发明的病毒检测方法和用于使病毒核酸游离的组合物也可以适用于人工操作及自动仪器操作的任意的方法。
1.2.第二实施方式
本发明的第2实施方式的病毒检测方法为，在同一溶液中从可能含有选自B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)中的至少1种病毒的生物学样品中特异性地分离病毒核酸，然后进行检测的方法，其包含以下工序：
(f)将所述生物学样品和用于使病毒核酸游离的组合物混合，制备混合物的工序，
(g)在所述工序(f)的混合物中，添加固相载体并进行分散的工序，所述固相载体使与所述病毒核酸的至少一部分序列杂交的寡核苷酸结合于表面，
(h)由所述工序(g)的混合物将所述固相载体分离，用洗净缓冲液使所述固相载体再分散，得到所述固相载体的水分散液的工序，和
(i)使用所述固相载体的水分散液，用核酸扩增法检测所述病毒核酸的工序；
所述组合物含有：选自硫氰酸胍、盐酸胍和碘化钠中的至少一种的离液剂，阴离子性表面活性剂和还原剂。
以下，对各工序进行详细说明。
1.2.1.工序(f)
本工序为将上述生物学样品和用于使病毒核酸游离的组合物混合，制备混合物的工序，与第1实施方式中的工序(a)相同。
1.2.2.工序(g)
本工序为在所述工序(f)的混合物中，添加固相载体并进行分散的工序，所述固相载体使与上述病毒核酸的至少一部分序列杂交的寡核苷酸结合于表面。特异性地捕捉病毒核酸是本发明的特征之一。由此，在后续的核酸扩增法中不被其它夹杂核酸影响，能够高效率地使目的病毒核酸扩增。
作为在本工序中可使用的固相载体，列举以下示例的探针结合磁性粒子。
作为在本工序中可使用的探针结合前的磁性粒子的平均粒径，优选为0.1μm～20μm，更优选为0.3μm～17μm，特别优选为0.5μm～10μm。如果磁性粒子的平均粒径低于上述范围，则存在粒子的分离纯化需要长时间的情况。另一方面，如果超过上述范围，则表面积减小，病毒核酸的捕捉量不足，因此不优选。此外，在本发明中，平均粒径是指，使用以动态光散射为测定原理的粒径分布测定装置进行测定的值。
在本工序中可使用的磁性粒子为应答外部磁场的粒子，该粒子的固液分离操作可以通过外部磁石进行。因此，固液分离操作不只可以使用离心分离或自然沉淀这样的手动方法，还可以用装备了磁石的市售自动仪器进行。
在本工序中可使用的磁性粒子优选为不具有剩余磁化的超常磁性。对于超常磁性的磁性粒子，如果施加外部磁场，则受磁场的影响而在磁场方向移动，但如果屏蔽外部磁场，则失去剩余磁化，因此能够不受磁性粒子之间的影响，彼此不凝聚地独自运动。由此，超常磁性的磁性粒子具有以下优点：磁性分离后的磁性粒子的再分散容易实现。在本发明的捕捉病毒核酸的过程中，通过使用所述超常磁性的磁性粒子，容易洗落目的病毒核酸以外的不需要成分或夹杂物，以高效率进行后续的核酸扩增反应，可以捕捉数分子左右的极微量的病毒核酸而进行分离、检测。
在本工序中可使用的磁性粒子的含有率由用装备磁石的自动装置进行操作的观点来看，优选为20质量％～70质量％，更优选为30质量％～60质量％。如果磁性粒子的含有率不足上述范围，则通常对于外部磁场的磁性应答性减弱，难于使用，因此不优选。另一方面，如果磁性粒子的含有率超过上述范围，则磁性粒子的比重过大，在反应途中产生自然沉淀，因此不优选。
作为在本工序中可使用的磁性粒子的材质，优选选自Fe2O3和Fe3O4中的至少一种。这些材质不仅对外部磁场的磁性应答性强，还可以抑制剩余磁化。
可在本工序中使用的磁性粒子由用核酸扩增法检测捕捉的病毒核酸的观点来看，优选不阻碍核酸扩增酶的作用。因此，能够在磁性粒子的表面形成聚合物覆层而不使磁性粒子表面露出。作为构成该聚合物覆层的聚合物，例如列举乙烯基类聚合物。另外，通过适当调节上述磁性粒子和上述聚合物成分的配合比例，可以控制磁性粒子的比重。
此外，对于磁性体和聚合物在粒子内部的分布，没有特别限定，两者可以均匀分布，也可以是在聚合物核上形成磁性体壳的形状。
在可在本工序中使用的磁性粒子中，为了捕捉病毒核酸，必须使寡核苷酸结合于该粒子的表面。因此，优选在该粒子表面导入可与寡核苷酸反应的官能团。作为这样的官能团，例如列举羧基、氨基、对甲苯磺酰基、环氧基等。这些官能团可以在上述聚合物覆层的聚合阶段导入，或者也可以在上述聚合物覆层的聚合反应完成后再次用聚合物将该粒子表面包覆时导入。在上述聚合物覆层的聚合阶段进行导入时，例如可以使用丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺、N-羟甲基甲基丙烯酰胺、邻苯二甲酸二烯丙酯、丙烯酸烯丙酯、甲基丙烯酸烯丙酯等构成乙烯基类聚合物的乙烯基单体与可共聚单体的共聚物。作为形成聚合物覆层时的导入方法，可以使用通常的有机化学合成法来导入。
可在本工序中使用的磁性粒子对将捕捉病毒核酸的操作自动化或装置化是有用的，但也可以用手动法进行捕捉病毒核酸的操作。在手动法中，可以代替磁性分离而利用离心分离或自然沉淀进行分离，也可用非磁性粒子代替磁性粒子。
在本工序中可使用的探针结合磁性粒子是指，将用于捕捉病毒核酸的探针结合于上述磁性粒子的表面而得到的产物。
“探针”是指，含有与由病毒游离的目的核酸的核酸序列互补的核酸序列的寡核苷酸。
“杂交”是指，通过Watson-Crick碱基配对，目的核酸与寡核苷酸互补地形成复合体。杂交的序列并非必须具有完全互补的关系。例如，即使在碱基序列中小于约10％的序列不一致的情况下，也可以形成稳定的复合体。
“特异性地捕捉病毒核酸”并不表示使寡核苷酸100％一致，而是表示在捕捉条件中能够与磁性粒子探针形成稳定的复合体的程度。
作为使寡核苷酸结合于上述磁性粒子的表面的方法，列举使导入至磁性粒子表面的官能团与寡核苷酸的官能团发生化学反应而固定的方法。例如有以下方法：使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐)等偶联剂，使以氨基修饰过单侧末端(例如3’末端)的寡核苷酸探针与表面具有羧基的磁性粒子反应的方法。
另外，还有以下方法：首先使抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素在磁性粒子上固定然后使其与生物素化的探针结合。所述方法具有以下优点：在一次化学反应中能够使抗生物素蛋白在磁性粒子上固定，然后不影响探针序列地将探针小心地固定。作为使生物素化的探针与抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素化的磁性粒子结合的方法，有以下方法：在水溶液中，使以抗生物素蛋白基团修饰单侧末端(例如3’末端)的寡核苷酸探针与将抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素分子在表面固定化的磁性粒子反应。
根据现有的方法，为了使病毒核酸与结合至磁性粒子的表面的寡核苷酸杂交，在工序(g)中，必须进一步添加杂交用的结合液。根据本发明，在工序(f)中使用的用于使病毒核酸游离的组合物即使在工序(g)中也能直接用于与病毒核酸的杂交反应。即，上述组合物不仅具有使核酸由病毒游离的作用，而且同时具备促进病毒核酸与结合至磁性粒子的表面的寡核苷酸的杂交的作用。
在磁性粒子上被固定的探针量相对于1mg磁性粒子，优选为1pmol～500pmol，更优选为5pmol～200pmol。如果不足上述范围，则目的病毒核酸的捕捉率降低因此不优选。如果超过上述范围，则目的病毒核酸的捕捉率不变，不能期望更好的效果，因此不优选。磁性粒子上的探针固定量可以这样得到：用吸光光度计测定与磁性粒子反应后的探针残留量，由探针添加量和探针残留量的差求出。另外，探针量还可以通过以下求出：测定与用荧光、放射性同位素等标记的互补链寡核苷酸杂交而捕捉的物质。此外，在本发明中，可以将这些HBV、HCV、HIV捕捉用探针粒子事先以一定比例混合然后进行使用。当然，根据目的，例如在只检测HBV时，可以只使用将捕捉HBV的探针固定化的磁性粒子。
1.2.3.工序(h)
本工序为由上述工序(g)的混合物将固相载体分离的工序，与第1实施方式中的工序(d)相同。
1.2.4.工序(i)
本工序为使用上述固相载体的水分散液，用核酸扩增法检测上述病毒核酸的工序，与第1实施方式中的工序(e)相同。
以上，以B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)为例对病毒检测方法进行详细说明，但也可以用于流感病毒、肺炎病毒、风疹病毒、麻疹病毒等其它病毒。
2.实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明不受这些实施例的限定。
2.1.HBV、HCV、HIV探针结合磁性粒子的制备
取结合了抗生蛋白链菌素的磁性粒子MagnosphereTMM300/Streptavidin(JSR株式会社制)的1质量％分散液500μL于试管中，于磁力架上进行磁性分离，除去上清液。以含有0.5mM EDTA和1.0M NaCl的5mM的Tris-HCl(pH7.4)洗净3次后，在500μL的含有0.5mM EDTA和1.0M NaCl的5mM的Tris-HCl(pH7.4)缓冲液中分散，分别加入5μL下述HBV、HCV、HIV病毒核酸捕捉DNA探针的100μM溶液，在室温下搅拌30分钟。各病毒捕捉用探针DNA使用将向Operon Biotechnologies公司特别订购的定制DNA进行HPLC纯化后得到的探针DNA。
之后，以磁力架进行磁性分离，除去上清液。以含有0.5mM EDTA和1.0M NaCl的5mM的Tris-HCl(pH7.4)洗净5次后，在50μL的5mM Tris-HCl缓冲液中分散，得到捕捉各病毒的磁性粒子(以下，分别简称为HBV-粒子、HCV-粒子、HIV-粒子)分散液(10质量％)。由添加前的寡核苷酸探针溶液的吸光度A260与反应后磁性粒子上清液的吸光度A260，测得相对于每1mg磁性粒子，HBV探针为50pmol、HCV探针为60pmol、HIV探针为40pmol。
[HBV捕捉探针序列]：
5’-T C C T A G G A C C C C T G C T C G T G T T A C A G GC G G G G T T T T T C T-生物素3’(以下，称为“序列1”)
[HCV捕捉探针序列]
5’-G T G A A G A C A G T A G T T C C T C A C A G G G G AG T G A T C T A-生物素3’(以下，称为“序列2”)
[HIV捕捉探针序列]
5’-T T A T G T C C A G A A T G C T G G T A G G G C T A TA C A T T C T T A C-生物素3’(以下，称为“序列3”)
上述HCV探针序列使用了对现有专利文献日本特开平10-1493号公报中记载的序列作了部分修改的序列。
上述HIV探针序列为现有技术文献“Tano，H.et.al.Journal ofClinical Microbiology，Sept.1995，p.2489-2491”中记载的序列。
2.2.用于使病毒核酸游离的组合物的制备
作为用于使病毒核酸游离的组合物，将各试剂混合，使其浓度为下表1～表2记载的浓度，用蒸馏水溶解。用注射管式过滤器(0.45μm)将该组合物过滤，遮光保存直至使用时为止。此外，各试剂的添加顺序没有特别限定。另外，对于难溶于蒸馏水的成分，升温到50℃缓慢地进行溶解。
[表1]
[表2]
2.3.实施例和比较例
2.3.1.实施例1
由含有HBV(亚型C)、HCV(亚型Ib)和HIV(亚型B)的血浆分别混合特定量，用病毒阴性血浆进行稀释，由此制备分别以103IU/mL含有各病毒的样品、以102IU/mL含有各病毒的样品、以10IU/mL含有各病毒的样品。此外，为了确认配制的各病毒浓度，与由NIBSC公司购入的WHO标准品同时并列进行实验，使用修正过浓度偏差的样品。分别取这些样品和病毒阴性血浆各250μL至试管中，等容量加入上述“2.2.用于使病毒核酸游离的组合物的制备”中制备的“组合物A”250μL(以上为工序(a))。
接着，加入上述序列1、上述序列2、上述序列3的寡核苷酸的各自配制为10pmol/μL的溶液5μL，在75℃加热12分钟后，冷却至25℃(以上为工序(b))。
接着，在各试管中加入MagnosphereTM M300/Streptavidin(JSR株式会社制)4质量％的粒子分散液50μL，在25℃温育10分钟，由此通过抗生物素蛋白-生物素反应将由样品游离的源自病毒的核酸捕捉到粒子上(以上为工序(c))。
接着，在磁力架上设置试管，将样品中的粒子进行磁性分离，除去液体。之后，以250μL的10mM Tris-HCl(pH7)/0.7M NaCl洗净液将粒子洗净1次，再次利用磁性将粒子分离，之后除去上述洗净液(以上为工序(d))。
在该磁性粒子中，加入80μL的蒸馏水作为溶出液并进行分散，在75℃加热2分钟然后恢复至室温，使杂交至磁性粒子的核酸在分散液中溶出。从该分散液中将磁性粒子固液分离，各取20μL加入3个试管中，分别实施HBV、HCV和HIV检测用实时PCR，验证是否回收到各病毒核酸(以上为工序(e))。
此外，在HBV、HCV、HIV病毒的检测中，分别使用ROCHE-DIAGNOSTICS公司制COBAS TaqmanHBV“自动”、COBAS TaqmanHCV“自动”、COBASTaqmanHIV-1“自动”试剂，进行检测和判定。实时PCR的试剂配制、PCR扩增条件、PCR装置条件设定、分析方法、判断标准依照产品手册。
[表3]
如表3所示，通过使用实施例1的病毒检测方法，能够在同一溶液中分离出HBV、HCV、HIV病毒核酸，通过实时PCR检测法可以对它们进行检测。HBV、HCV和HIV的检测灵敏度非常高，即使在分别以102IU/mL的非常低的浓度含有各病毒的样品中，也能以100％的准确率检测出3种病毒。
另外，使用全血样品取代血浆样品，用与上述相同的方法进行病毒溶解、核酸捕捉和检测。其结果如表4所示。在使用全血样品时，与使用血浆样品的情况相比检测灵敏度稍稍降低。在全血样品的情况下，考虑到血球容量占到全血的大约一半，实质上可用于检查的样品与血浆样品相比约为一半。即确认，即使在全血样品的情况下，也可以无障碍地同时检测出低至103IU/mL的3种病毒。
[表4]
此外，使用血清样品时的结果由于与血浆样品相同，因此省略数据。
2.3.2.实施例2
由含有HBV(样品C)、HCV(样品Ib)和HIV(样品B)的血浆分别混合特定量，用病毒阴性血浆进行稀释，由此制备分别以103IU/mL含有各病毒的样品、以102IU/mL含有各病毒的样品、以10IU/mL含有各病毒的样品。此外，为了确认配制的各病毒浓度，与由NIBSC公司购入的WHO标准品同时并列进行实验，使用修正过浓度偏差的样品。分别取这些样品和病毒阴性血浆各250μL至试管中，等容量加入上述“2.2.用于使病毒核酸游离的组合物的制备”中制备的“组合物A”250μL，在75℃加热12分钟(以上为工序(f))。
各取上述“2.1.HBV、HCV、HIV探针结合磁性粒子的制备”中制备的10质量％的HBV-粒子分散液、HCV-粒子分散液、HIV-粒子分散液5μL，将合计15μL加入各试管中，在25℃下温育10分钟，由此将由样品游离的源自病毒的核酸捕捉到粒子上(以上为工序(g))。
接着，在磁力架上设置试管，将样品中的粒子进行磁性分离，除去液体。之后，以250μL的10mM Tris-HCl(pH7)/0.7M NaCl洗净液将粒子洗净1次，再次利用磁性将粒子分离，之后除去上述洗净液(以上为工序(h))。
在该磁性粒子中，加入80μL的蒸馏水作为溶出液并进行分散，在75℃加热2分钟，然后恢复至室温，使杂交至磁性粒子的核酸在分散液中溶出。从该分散液中将磁性粒子固液分离，各取20μL加入到3个试管中，分别实施HBV、HCV和HIV检测用实时PCR，验证是否回收到各病毒核酸(以上为工序(i))。
此外，在HBV、HCV、HIV病毒的检测中，分别使用ROCHE-DIAGNOSTICS公司制COBAS TaqmanHBV“自动”、COBAS TaqmanHCV“自动”、COBASTaqmanHIV-1“自动”试剂，进行检测和判定。PCR试剂配制、PCR扩增条件、PCR装置条件设定、分析方法、判断标准依照产品手册。
对各个样品进行5次测定，判定为阳性的次数归纳在表3中。
[表5]
如表3所示，通过使用实施例2的病毒检测方法，能够在同一溶液中分离出HBV、HCV、HIV病毒核酸，通过实时PCR检测法可以对它们进行检测。HBV、HCV和HIV的检测灵敏度非常高，即使在分别以102IU/mL的非常低的浓度含有各病毒的样品中，也能以100％的准确率检测出3种病毒。
另外，使用全血样品取代血浆样品，用与上述相同的方法进行病毒溶解、核酸捕获和检测。其结果如表6所示。在使用全血样品时，与使用血浆样品的情况相比检测灵敏度稍稍降低。在全血样品的情况下，考虑到血球容量占到全血的大约一半，实质上可用于检查的样品与血浆样品相比约为一半。即确认，即使在全血样品的情况下，也可以无障碍地同时检测出低至103IU/mL的3种病毒。
[表6]
此外，使用血清样品时的结果由于与血浆样品相同，因此省略数据。
2.3.3.实施例3～实施例8
除了在上述“2.3.1.实施例1”的工序(a)中，用表1所述的组合物B～G代替“组合物A”以外，实施与使用上述“2.3.1.实施例1”的血浆样品的情况相同的工序。对各个样品进行5次测定，判定为阳性的次数归纳在表7～表12中。
[表7]
[表8]
[表9]
[表10]
[表11]
[表12]
如表7～表12所示，通过使用实施例3～实施例8的病毒检测方法，能够在同一溶液中分离出HBV、HCV、HIV病毒核酸，通过实时PCR检测法可以对它们进行检测。HBV、HCV和HIV的检测灵敏度非常高，即使在分别以102IU/mL的非常低的浓度含有各病毒的样品中，也能以100％的准确率检测出3种病毒。
2.3.4.实施例9～实施例14
除了在上述“2.3.2.实施例2”的工序(f)中，用表1所述的组合物B～G代替“组合物A”以外，实施与使用上述“2.3.2.实施例2”的血浆样品的情况相同的工序。对各个样品进行5次测定，判定为阳性的次数归纳在表13～表18中。
[表13]
[表14]
[表15]
[表16]
[表17]
[表18]
如表13～表18所示，通过使用实施例9～实施例14的病毒检测方法，能够在同一溶液中分离出HBV、HCV、HIV病毒核酸，通过实时PCR检测法可以对它们进行检测。HBV、HCV和HIV的检测灵敏度非常高，即使在分别以102IU/mL的非常低的浓度含有各病毒的样品中，也能以100％的准确率检测出3种病毒。
2.3.4.比较例1～比较例5
除了在上述“2.3.1.实施例1”的工序(a)中，用表2所述的组合物H～L代替“组合物A”以外，实施与使用上述“2.3.1.实施例1”的血浆样品的情况相同的工序。对各个样品进行5次测定，判定为阳性的次数归纳在表19～表23中。
[表19]
[表20]
[表21]
[表22]
[表23]
如表19～表23所示，在比较例1～比较例5的病毒检测方法中，在任一个浓度中也无法检测出HBV、HCV和HIV。
2.3.5.比较例6～比较例10
除了在上述“2.3.2.实施例2”的工序(f)中，用表2所述的组合物H～L代替“组合物A”以外，实施与使用上述“2.3.2.实施例2”的血浆样品的情况相同的工序。对各个样品进行5次测定，判定为阳性的次数归纳在表24～表28中。
[表24]
[表25]
[表26]
[表27]
[表28]
如表24～表28所示，在比较例6～比较例10的病毒检测方法中，在任一个浓度中也无法检测出HBV、HCV和HIV。
2.3.5.实施例15
对上述“2.3.3.实施例10”的工序(h)和工序(i)进行如下改变。
在磁力架上设置试管，将样品中的粒子进行磁性分离，除去液体。之后，以250μL的10mM Tris-HCl(pH7)/0.7M NaCl洗净液将粒子洗净1次(以上为工序(h))。
省略从由工序(h)得到的磁性粒子中使核酸溶出的工序，将工序(h)得到的磁性粒子直接分散在50μL PCR反应的混合物中，进行实时PCR反应(以上为工序(i))。
对各个样品进行5次测定，判定为阳性的次数归纳在表29中。
[表29]
如表29所示，即使在将工序(h)回收的磁性粒子直接分散在50μL的PCR反应混合物中进行实时PCR反应时，也可以以高灵敏度检测HBV、HCV和HIV。即使在分别以10IU/mL的非常低的浓度含有各病毒的样品中，也能以80～100％的准确率检测出3种病毒。
2.3.6.实施例16
对上述“2.3.3.实施例10”的工序(i)进行如下改变。
在工序(h)得到的磁性粒子中，加入40μL的20mM的氢氧化钠水溶液作为溶出液并进行分散，在75℃加热2分钟，然后恢复至室温，使杂交至磁性粒子的核酸在分散液中溶出。从该分散液中将磁性粒子固液分离，回收溶出液。用40μL的20mM盐酸水溶液将回收的溶出液中和后，各取20μL，加入到3个试管，分别用于HBV、HCV和HIV检测用实时PCR，验证是否回收到各病毒核酸(以上为工序(i))。
对各个样品进行5次测定，判定为阳性的次数归纳在表30中。
[表30]
2.3.7.实施例17
使用“30mM氢氧化钠水溶液”代替在上述“2.3.6.实施例16”中用作溶出液的“20mM氢氧化钠水溶液”。回收的溶出液用40μL的30mM盐酸水溶液中和。
对各个样品进行5次测定，判定为阳性的次数归纳在表31中。
[表31]
2.3.8.参考例1
使用“40mM氢氧化钠水溶液”代替在上述“2.3.6.实施例16”中用作溶出液的“20mM氢氧化钠水溶液”。回收的溶出液用40μL的40mM盐酸水溶液中和。
对各个样品进行5次测定，判定为阳性的次数归纳在表32中。
[表32]
2.3.9.参考例2
使用“50mM氢氧化钠水溶液”代替在上述“2.3.6.实施例16”中用作溶出液的“20mM氢氧化钠水溶液”。回收的溶出液用40μL的50mM盐酸水溶液中和。
对各个样品进行5次测定，判定为阳性的次数归纳在表33中。
[表33]
如表30～表31所示，使用20mM或30mM氢氧化钠水溶液作为溶出液时，能够高灵敏度地检测HBV、HCV和HIV。即使在分别以10IU/mL的非常低的浓度含有各病毒的样品中，也能以80～100％的准确率检测出3种病毒。
另一方面，如表32～表33所示，可知在使用40mM或50mM氢氧化钠水溶液时，虽然能够高灵敏度地检测HBV，但HCV和HIV的检测率显著降低。
Claims (13)
1.一种病毒检测方法，是在同一溶液中从可能含有至少1种病毒的生物学样品中特异性地分离病毒核酸后进行检测的方法，其中，包含以下工序：
(a)将所述生物学样品和用于使病毒核酸游离的组合物混合的工序，
(b)在所述工序(a)的混合物中，添加能够与所述病毒核酸的至少一部分序列杂交、且至少一方的末端被生物素化的寡核苷酸的工序，
(c)在所述工序(b)的混合物中，添加固相载体的工序，所述固相载体表面固定有抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，
(d)从所述工序(c)的混合物中将所述固相载体分离的工序，和
(e)使用所述固相载体、用核酸扩增法检测所述病毒核酸的工序；
所述组合物含有：选自硫氰酸胍、盐酸胍和碘化钠中的至少一种离液剂，阴离子性表面活性剂和还原剂，
所述工序(a)的混合物中的所述阴离子性表面活性剂的浓度为2.5质量％～30质量％。
2.根据权利要求1所述的病毒检测方法，其中，检测对象病毒为选自B型肝炎病毒HBV、C型肝炎病毒HCV和人类免疫缺陷病毒HIV中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的病毒检测方法，其中，所述工序(e)进一步包含向所述工序(d)得到的固相载体添加溶出液，将所述病毒核酸溶出的工序。
4.根据权利要求1所述的病毒检测方法，其中，所述工序(e)包含使用所述工序(d)得到的固相载体，不分离病毒核酸，而用核酸扩增法检测每个固相载体的工序。
5.一种病毒检测方法，是在同一溶液中从可能含有至少1种病毒的生物学样品中特异性地分离病毒核酸后进行检测的方法，其中，包含以下工序：
(f)将所述生物学样品和用于使病毒核酸游离的组合物混合的工序，
(g)在所述工序(f)的混合物中，添加固相载体的工序，所述固相载体表面结合有与所述病毒核酸的至少一部分序列杂交的寡核苷酸，
(h)由所述工序(g)的混合物将所述固相载体分离的工序，和
(i)使用所述固相载体、用核酸扩增法检测所述病毒核酸的工序；
所述组合物含有：选自硫氰酸胍、盐酸胍和碘化钠中的至少一种离液剂、阴离子性表面活性剂和还原剂，
所述工序(f)的混合物中的所述阴离子性表面活性剂的浓度为2.5质量％～30质量％。
6.根据权利要求5所述的病毒检测方法，其中，检测对象病毒为选自B型肝炎病毒HBV、C型肝炎病毒HCV和人类免疫缺陷病毒HIV中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的病毒检测方法，其中，所述工序(i)进一步包含在所述工序(h)得到的固相载体的水分散液中添加溶出液，将所述病毒核酸溶出的工序。
8.根据权利要求5所述的病毒检测方法，其中，所述工序(i)包含使用所述工序(h)得到的固相载体，不分离病毒核酸，而用核酸扩增法检测每个固相载体的工序。
9.根据权利要求1或5所述的病毒检测方法，其中，所述固相载体为具有0.5μm～15μm的平均粒径、且能够用重力或离心力进行固液分离的粒子。
10.根据权利要求1或5所述的病毒检测方法，其中，所述固相载体为具有0.5μm～15μm的平均粒径、且能够用电磁力进行固液分离的粒子。
11.一种用于使病毒核酸游离的组合物，含有：选自硫氰酸胍、盐酸胍和碘化钠的至少一种离液剂，阴离子性表面活性剂，和还原剂，
所述阴离子性表面活性剂的浓度为2.5～30重量％。
12.根据权利要求11所述的用于使病毒核酸游离的组合物，其中，所述阴离子性表面活性剂包含选自烯基琥珀酸二钾、N-十二烷基肌氨酸钠、烷基醚羧酸盐、烷酰基谷氨酸盐和聚氧乙烯烷基醚磷酸钾中的至少1种。
13.根据权利要求11所述的用于使病毒核酸游离的组合物，其中，所述还原剂包含选自2-巯基乙醇、硫甘油、二硫苏糖醇、2-巯基乙胺盐酸盐、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐、巯基乙酸和2-巯基丙酸中的至少1种。
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|---|---|---|---|---|
| CN111621481A (zh) * | 2020-05-06 | 2020-09-04 | 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） | 呼吸道病毒处理试剂及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN1940087A (zh) * | 2006-08-18 | 2007-04-04 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 一种同步扩增检测肝炎及艾滋病毒核酸的方法及试剂盒 |
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