CN101868543A - 基因表达的靶向调节 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用设计成靶向特定核酸序列的snoRNA分子或snoRNA样分子或片段来调节基因表达的方法。
Description
发明领域
本发明涉及利用设计成靶向特定核酸序列的snoRNA分子或snoRNA样分子或片段来调节基因表达的方法。
本发明还涉及用于基因表达的靶向调节的修饰的snoRNA分子和修饰的snoRNA样分子和片段。
发明背景
小核仁RNAs(snoRNAs)包括存在于所有真核细胞中的核RNAs家族。snoRNAs集中在细胞核中,特别是集中在核仁中,在核仁中它们在核糖体亚基合成过程中作用于修饰核糖体RNA(rRNA)或另外参与rRNA的加工。存在两种主要种类的snoRNAs,即盒C/D snoRNAs和盒H/ACAsnoRNAs,其分别参与2′-O-核糖甲基化和假尿苷修饰(评论见Boisvert等人,2007,Kiss等人,2002和2006)。
SnoRNAs在体内作为RNA-蛋白复合体(snoRNPs)起作用,在该情形中RNA结构部分作用为使碱基与rRNA前体配对的指导RNA,或者将修饰位点定向于rRNA上的特定序列(在盒C/D与盒H/ACA snoRNAs的情形中)或作为分子伴侣来辅助新生rRNA前体的成熟(例如U3 snoRNA)。
盒C/D snoRNAs依据在作用为一组盒C/D蛋白的结合位点的这一亚家族中常见的RNA基序而命名,所述一组盒C/D蛋白包括NOP56,NOP58,TIP48,TIP49,15.5K和高度保守的蛋白纤维蛋白,所述纤维蛋白具有特异性2-O-甲基化酶活性。盒C/D snoRNA与干II和盒D区5′紧接的区域包含与rRNA上特定位点互补的‘指导’序列,其指导纤维蛋白2′-O-甲基酶在与指导RNA区互补的rRNA序列内所需要的核糖残基的2′-OH位置上添加甲基。已经表明类似的功能从酵母一直到哺乳动物细胞都起作用。由于保守的序列组件,所以可以利用基因组DNA序列信息来预测人盒C/D snoRNA家族的成员,并通过计算分析来预测其在rRNA上的推定2′-O-甲基化靶位点。然而,迄今为止,在人类的情形中,并不是所有这些种类都通过直接的实验鉴定或验证过。
除了rRNA的修饰之外,对于某些盒C/D snoRNAs已经提议了两种另外的功能。第一,据认为一些家族成员针对其它非核糖体RNAs上的2′-O-核糖基团的甲基化,所述其它非核糖体RNAs包括小核RNAs,其是核前mRNA剪接机制的亚基。这基本上是与对于rRNA所观察的相同的修饰反应,但是由于其所包含的指导RNA序列而针对不同的RNA底物。第二,据报道,盒C/D snoRNA家族的一个成员(HBII-52)(S.Kishore和S.Stamm,2006)作用为可变剪接因子,其可以对剪接位点的选择产生改变,影响编码5-羟色胺受体2C的6外显子神经元-特异性转录体中的外显子5。在这一情形中,所涉及的机制是未知的,且还不清楚HBII-52snoRNA是否也参与rRNA的修饰或者其是否定位于核仁。
对于能够控制基因表达已经研究了很多年,并且多种技术是已知的,均具有优点和缺点。例如,RNAi技术是本领域公知的。″RNAi″是指在动物和植物中由双链RNA起始的序列特异性转录后基因沉默的过程,所述双链RNA与靶RNA的区域相同且引起其降解(例如,参见WO9932619,WO0129058和Tuschl Chem Biochem.(化学和生物化学)2:239-245(2001))。然而,存在与RNAi技术相关的问题,不仅是人们必须利用化学手段合成所述分子的成本问题。此外,当利用遗传方法制备RNAi分子时,可能难以适当地产生该分子。此外,为了产生多于一种RNAi分子以靶向相同或不同的靶序列,仅仅增加了前述问题。在获得靶向基因的高效击倒中,特别是在不产生其它基因的不需要的“非靶向(off target)”击倒中,也产生使用RNAi的问题。
因此,基因沉默或表达调节的其它或备选方法将是需要的。本发明的目的是消除和/或减轻上述缺点中的至少一种。
发明概述
本发明部分基于本发明人对snoRNAs的研究和下述鉴定,即,snoRNA序列的一部分可以用靶特异性核酸序列取代,以形成修饰的snoRNA,当所述修饰的snoRNA加入细胞时,其或其片段能够调节包括所述靶特异性核酸序列的基因的表达。
在第一方面中,提供了调节靶核酸表达的方法,所述方法包括在使snoRNA和/或其片段能够与靶核酸的一部分杂交的条件下使所述核酸与snoRNA相接触;且其中所述snoRNA或其片段与所述核酸部分的杂交调节所述靶核酸的表达和/或功能或者对所述靶核酸的表达和/或功能产生调节。所述snoRNA可以是天然snoRNA分子,或者其可以是修饰的snoRNA分子,如下文进一步所述。
还提供了用于调节靶核酸表达的修饰的snoRNA序列,所述修饰的snoRNA序列包括基本上与靶核酸序列的一部分互补的核酸序列,其用于与所述靶核酸部分杂交且调节所述核酸的表达。应该理解,所述修饰的snoRNA分子与本领域已知的天然snoRNA分子如分子HBII-180C不同。一般说来,所述修饰的snoRNA分子基于天然snoRNA分子,如下文所讨论,但是包括特别选择和引入到所述snoRNA分子中的核酸部分,以与靶核酸部分杂交且调节其表达。
本发明人已经观察到本发明所述的snoRNA分子能够下调或者减少靶RNA或蛋白的表达/功能。不希望受到理论限制,可能的是,所述修饰的snoRNA可以在细胞内进行加工,以便包括能够特异性杂交所述靶序列的序列的所述snoRNA分子的片段,可以具有调节所述靶RNA的表达/功能的作用,尽管表达可以通过结合在特定基因座的DNA进行调节也是可能的。这样的序列可以准确地或者高度特异性地对应于在本文所述的天然和修饰的snoRNAs中存在的序列,其基本上与靶核酸序列如RNA或DNA序列的所述部分互补,或者取决于所述序列的碱基组成和G/C含量长度可以更短,如2-10个核苷酸长。原则上,所述互补区长度将足够长,且是这样的序列,即其足以提供通过已知的互补碱基配对原理特异性结合所述靶RNA。
本发明的snoRNA分子可以基于所谓的盒C/D-snoRNA或盒H/ACA-snoRNA。优选的snoRNAs基于盒C/D-snoRNA。
当用于本文时,短语″snoRNA″指通常在细胞的核浆中和/或核仁中合成和/或起作用的小RNA分子。按照优选实施方案,本发明的小核RNA分子是包含盒C/D的snoRNAs。
盒C/D snoRNAs的非限制性实例包括L.collosoma b2(GenBank登记号AF331656),L.collosoma B3(GenBank登记号AY046598),L.collosomaB4(GenBank登记号AY046598),L.collosoma B5(GenBank登记号AY046598),L.collosoma TS1(GenBank登记号AF331656),L.collosomaTS2(GenBank登记号AF331656),L.collosoma g2(GenBank登记号AF331656),L.collosoma snoRNA-2(GenBank登记号AF050095),T.bruceisnoRNA 92(GenBank登记号Z50171,L.tarentolae snoRNA 92(GenBank登记号AF016399),T.brucei TBC4 snoRNA(SEQ ID NO:35),T.brucei sno270(GenBank登记号Z50171)和人U14snoRNA(GenBank登记号NR_000022)。
本发明的修饰的snoRNAs可以包括通常在盒C/D snoRNAs中存在的一种或多种D/D′盒核酸序列。所述D和/或D′盒是保守核苷酸序列,并且可以由选自例如5′-CUGA-3′,5′-AUGA-3′,5′-CCGA-3′,5′-CAGA-3′,5′-CUUA-3′,5′-UUGG-3′和5′-CAGC-3′的序列组成。然而,可以考虑其它的修饰和/或衍生物。
本发明的修饰的snoRNAs还可以包括与28S rRNA互补的序列和/或盒C序列。所述与28S rRNA互补的序列长度可以为5-15个核苷酸,如8-12个核苷酸,特别是10个核苷酸,但是该rRNA互补区还可以在不妨碍活性的前提下突变且基本或完全去除与rRNA的互补性(complentarity)。典型地,与28S rRNA互补的序列可以与28S rRNA序列的碱基3680处或其附近的核苷酸(编号依据Lestrade,L.,和Weber,M.J.(2006).snoRNA-LBME-db,a comprehensive database of human H/ACA and C/Dbox snoRNAs(snoRNA-LBME-db,人H/ACA和C/D盒snoRNAs的完全数据库).Nucleic Acids Res(核酸研究)34,D158-162.)互补,如在3670-3690附近,例如,3677-3686。所述盒C序列长度典型地为5-9个核苷酸,如7个核苷酸,且可以包括序列AUGAUGU或其一部分。典型地,当存在时,盒C序列位于与rRNA互补或与snoRNA的其它生理学RNA靶互补的序列的5′处,所述序列位于盒D′序列的5′,所述盒D′序列位于基本上与所述靶核酸序列的所述部分互补的核酸序列的5′。优选地,在盒C序列,与rRNA互补的序列、盒D′序列和/或基本上与靶核酸序列的所述部分互补的核酸序列之间仅发现1-3个核苷酸碱基,如1个核苷酸碱基。与盒D′序列相同或不同的盒D序列可以位于基本与靶RNA序列的所述部分互补的核酸序列的3′处。所述盒D序列可以位于基本与靶核酸序列的所述部分互补的核酸序列的3′碱基的20-30个核苷酸3′,如24-28个核苷酸,特别是26个核苷酸的下游处。
本发明的修饰的snoRNA分子还包括至少一个能够靶向靶核酸序列并与其杂交的序列。基于本文所述的工作,本发明人鉴定了snoRNA分子HB II-180C,其包括紧接盒D′序列下游的序列,其与由人成纤维细胞生长因子3(FGFR3)转录的前mRNA的内含子17中存在的21个核苷酸的序列高度互补。通过将该序列改变为被设计成与特定靶基因序列互补的不同序列,所述特定靶基因可以是内含子或外显子序列,本发明人已经能够调节需要的靶基因的表达。
典型地,基本与靶核酸序列的所述部分互补的核酸序列长度为15-45个核苷酸,如17-30个核苷酸,但是取决于序列和碱基组成,所述长度可以更长。“基本”互补意指在靶核酸序列和设计为与所述靶核酸杂交的snoRNA分子序列之间不必存在精确的互补性。然而,应该理解,应该存在高度的同一性,所述同一性典型地大于90或95%,这足以确保依据已知的RNA或DNA/RNA碱基配对法则的特异性结合。因此,典型地,取决于互补区的长度和G/C含量,可以允许在两个序列之间存在至多仅1-3个错配。所述靶核酸序列可以是RNA序列,典型地为mRNA,tRNA,miRNA或rRNA序列,或RNA病毒基因组序列或源于其的转录体,特别是mRNA序列。在靶核酸序列内,所述互补区可以存在于内含子内、或外显子内、或特别存在于内含子-外显子连接处,但是也可以位于5′或3′非翻译区。
应该理解,多于一种设计为与靶核酸分子杂交的序列可以存在于本发明的修饰的snoRNA分子中。当存在多于一种所述序列时,可以设计不同的“靶向”序列以靶向同一靶核酸分子的不同部分、或不同的靶核酸分子。
在另一个方面中,还提供了能够表达本发明所述的至少一种snoRNA分子的核酸构建体。
典型地,所述核酸构建体包括至少两个侧连内含子核酸区的外显子核酸区,所述内含子核酸区能够编码本发明所述的snoRNA。最理想地,所述核酸构建体可以包括侧连两个以上内含子序列的多个外显子序列,所述内含子核酸区包括能够编码一个以上本发明所述的snoRNAs的序列。所述构建体可以作为单一构建体形成,其在靶细胞内转录时引起与所述外显子序列对应的且剪除所述内含子序列的mRNA的产生,且随后产生本发明所述的snoRNA(s)。
在使用多于一种内含子序列来产生多于一种本发明的snoRNA序列的情形中,可以设计每个snoRNA靶向相同或不同的靶RNA分子。
预计熟练的技术人员(addressee)非常熟悉内含子和外显子由什么组成,但是处于辅助目的提供下述:
内含子是插入在在最终mRNA产物中表达、通常编码蛋白的DNA区域的部分或“外显子”之间的真核DNA的部分。内含子和外显子转录为称为“一级转录体,mRNA前体”(或“前mRNA”)的RNA。内含子必须从前mRNA去除,以便可以产生由外显子编码的天然蛋白(术语″天然蛋白″用在本文中指天然存在的、野生型、突变的或功能蛋白)。内含子从前mRNA的去除以及随后的外显子的连接在剪接过程中进行。
剪接过程实际上是由剪接因子介导的一系列反应,其在转录之后但是在翻译之前在RNA上进行。因此,″前mRNA″是包含外显子和内含子二者的RNA,″mRNA″是这样的RNA,其中已经去除内含子且随后外显子连接在一起从而蛋白可以由该RNA通过核糖体进行翻译。
内含子定义为一组“剪接组件”,其是相对较短、保守的RNA区段,其结合进行剪接反应的多个剪接因子。因此,每个内含子定义为5′剪接位点、3′剪接位点、和位于之间的分支点(branch site)。
所述核酸构建体还可以包括通常存在于常规核酸载体中且对熟练的技术人员是公知的常见核酸特征。例如,所述核酸构建体可以包括用于促进对其中已经转化或转染了所述核酸构建体的细胞的鉴定的选择标记基因。优选地,所述核酸构建体包括用于促进编码所述snoRNA分子的核酸的表达的至少一个启动子,如本领域已知的组成型或可控型启动子。适当的启动子的实例包括CMV启动子,T3,T7,SP6,SV40,腺病毒主要晚期启动子和熟练的技术人员已知的其它启动子。
所述核酸构建体还可以包括采用天然的、突变或另外标记形式的基因/RNA拷贝,其设计成替代由所述snoRNA调节的基因/RNA拷贝。
可以使用一些方法来在细胞中产生本发明的snoRNA。
按照本发明的一个优选实施方案,可以通过向细胞中引入上述能够表达snoRNA分子的核酸构建体而产生本发明的snoRNA分子。
为了在细胞中表达本发明的snoRNA,将核酸序列连接至核酸构建体中,其包括在编码snoRNA的核酸序列上游的启动子。理想地,所述编码snoRNA的序列侧连在熟练的技术人员鉴定为外显子序列和剪接序列的核酸区的任一侧,所述剪接序列在转录时引起编码snoRNA的序列的剪接。适于指导所述核酸序列在例如真核细胞中的转录的启动子包括组成型或诱导型的启动子。
适用于本发明的组成型启动子是在大部分环境条件下和大部分细胞类型中有活性的启动子序列,如CMV启动子,SV40启动子,腺病毒主要晚期启动子和劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(RSV)启动子。适用于本发明的诱导型启动子包括,例如,低氧诱导因子1(HIF-1)启动子(Rapisarda,A.等人,2002.Cancer Res.(癌症研究)62:4316-24)和四环素诱导型启动子(Srour,M.A.,等人,2003.Thromb.Haemost.(凝血和止血)90:398-495)。
本发明的核酸构建体通常包括使得所述构建体适合在原核生物、真核生物、或优选在二者(例如,穿梭载体)中复制和/或整合的其它序列。典型的克隆载体包含转录和翻译起始序列(例如,启动子,增强子)与转录和翻译终止子(例如,多腺苷酸化信号)。
在核酸构建体的构建中,启动子优选位于距离异源转录起始位点与其距离其天然设置的转录起始位点大约相同距离处。然而,如本领域已知的,在不丢失启动子功能的条件下,可以适应该距离的一些变化。
除了已经描述的组件之外,本发明的核酸构建体可以典型地包含其它专门的组件,其目的是增加克隆核酸的表达水平或促进携带重组DNA的细胞的鉴定。例如,许多动物病毒包含促进病毒基因组在允许的细胞类型中的染色体外复制的DNA序列。携带这些病毒复制子的质粒进行游离型复制,只要由所述质粒携带的或宿主细胞基因组具有的基因提供适当的因子。
所述核酸构建体可以或可以不包括真核复制子。如果存在真核复制子,那么载体可以利用适当的选择标记在真核细胞中扩增。如果载体不包括真核复制子,则不可能进行游离型扩增。相反,重组DNA整合到加工细胞的基因组中,在其中启动子指导所需核酸的表达。所述构建体还可以包括位点特异性重组位点,其被设计为使所述核酸构建体靶向细胞基因组中的特定位点,且当在细胞中存在必需的酶时在该特定位点整合。对于本领域的技术人员,多种位点特异性重组系统是公知的,包括Cre/Lox,Att/λ整合酶,frt/Flp,γδ解离酶,Tn3解离酶和整合酶(参见Gover等人,2005,其指导熟练的读者)。
本发明的核酸构建体可以用来在哺乳动物细胞(例如,HeLa细胞,Cos细胞),酵母细胞(例如,AH109,HHY10,KDY80),昆虫细胞(例如,Sf9),锥虫细胞(例如,L.collosoma,L.major,T.brucei 29-13)或细菌细胞(例如,JM109,RP437,MM509,SW10)中表达本发明的多核苷酸。
优选地,通过将核酸序列连接至哺乳动物、酵母、锥虫或细菌表达载体中而合成本发明的多核苷酸。所述载体的实例包括,但不限于,适用于哺乳动物细胞中的pcDNA3.1、pBK-CMB和pCI载体,适用于酵母细胞中的pGBKT7、pLGADH2-lacZ和pBGM18载体,适用于锥虫细胞中的pX-neo游离型载体和适用于细菌细胞中的Pack02scKan、pMLBAD、pMLS7载体。
按照优选实施方案,优选地构建本发明的核酸构建体用于真核生物表达,最优选地,用于哺乳动物细胞表达。
哺乳动物表达载体的实例包括,但不限于,可从Invitrogen获得的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、Pgl3、PzEOsv2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81,可从Promega(普洛麦格)获得的pCI,可从Stratagene获得的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV,可从Clontech获得的pTRES,以及它们的衍生物。
也可以使用包含来自真核病毒如反转录病毒的调节元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。来源于牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA,和来源于埃巴病毒的载体包括pHEBO,和p205。其它示例性的载体包括pMSG,pAV009/A+,pMTO10/A+,pMAMneo-5,杆状病毒pDSVE,和在SV-40早期启动子,SV-40晚期启动子,金属硫蛋白启动子,鼠乳腺瘤病毒启动子,劳氏肉瘤病毒启动子,多角体启动子,或其它证明有效用于真核细胞中表达的启动子的指导下允许蛋白表达的任意其它载体。
可以使用多种方法将本发明的核酸构建体引入哺乳动物细胞中。所述方法通常记述在Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆:实验室手册),Cold Springs Harbor Laboratory(冷泉港实验室),纽约(1989,1992)中,在Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology(现代分子生物学方法),John Wiley和Sons,Baltimore,Md.(1989),Chang等人,Somatic Gene Therapy(体细胞基因治疗),CRC出版社,AnArbor,Mich.(1995),Vega等人,Gene Targeting(基因靶向),CRC出版社,Ann Arbor Mich.(1995),Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors andTheir Uses(载体:分子克隆载体及其应用的研究),Butterworths,BostonMass.(1988)和Gilboa等人.[Biotechniques(生物技术)4(6):504-512,1986]中,并且包括,例如,稳定或瞬时转染、脂质转染法、电穿孔、显微注射、脂质体、离子电渗疗法(iontophoresis)、受体介导的胞吞作用和用重组病毒载体感染。另外,参见美国专利号5,464,764和5,487,992的阳性-阴性选择方法。例如,对于在二氢叶酸还原酶缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO dhfr-)细胞中的稳定转染,本发明的表达载体还包括位于胸苷激酶启动子控制下的二氢叶酸还原酶表达盒。
还可以使用病毒载体,如本领域已知的慢病毒(lentivirus)、反转录病毒或腺病毒来源的载体,将本发明的核酸构建体递送至细胞中。
在本发明的另一个方面中,提供用于产生本发明所述的snoRNA分子的核酸载体构建体,所述构建体在5′至3′方向包括:
i)用于控制转录的启动子序列;
ii)第一外显子序列;
iii)第一内含子剪接序列;
iv)用于促进编码本发明的snoRNA的核酸序列的克隆的克隆位点或序列;
v)第二内含子剪接序列;和
vi)第二外显子序列。
所述snoRNA可以是天然或修饰的snoRNA分子,如本文所述。
应该理解,各种元件通过转录连接,这是熟练的技术人员所理解的。载体可以天然包括如上文所述的其它元件,且可以包括促进载体构建的其它克隆位点。
本发明的一个特别的优点是由单一转录体提供多个可以靶向相同或不同的靶核酸序列的snoRNAs的能力。
作为使用核酸构建体的备选方案,应该理解,可以使用例如固相合成化学合成作为RNA寡核苷酸的本发明的snoRNA分子。
在设计本发明的合成的snoRNA分子、snoRNA样分子或其片段时,必须考虑一些需要考虑的事项。为了有效地在体内抑制基因表达,所述分子可以理想地满足下述要求:(i)充分的与靶序列结合的特异性;(ii)在水中的溶解性;(iii)抗细胞内核酸酶和细胞外核酸酶的稳定性;(iv)透过细胞膜的能力;和(v)当用于治疗生物体时,是低毒性的。
未修饰的多核苷酸用于应用可能是不切实际的,原因在于其体内半衰期短,在该期间内其可以被核酸酶迅速降解。此外,其难以在多于毫克量级上制备。另外,所述多核苷酸是较差的细胞膜渗透剂。
为了提供半衰期以及膜渗透性,可以修饰本发明的多核苷酸的多核苷酸主链。
可以在碱基、糖或磷酸结构部分修饰多核苷酸。这些修饰包括,例如,使用甲基磷酸酯(methylphosphonates),一硫代磷酸(monothiophosphates),二硫代磷酸(dithiophosphates),氨基磷酸酯(phosphoramidates),磷酸酯(phosphate esters),桥连硫代磷酸酯
(bridged phosphorothioates),桥连氨基磷酸酯(bridged phosphoramidates),桥连亚甲基磷酸酯(bridged methylenephosphonates),具有硅氧烷桥接(siloxane bridges)、碳酸酯桥接(carbonate bridges)、羧甲基酯桥接(carboxymethyl ester bridges)、碳酸酯桥接(carbonate bridges)、羧甲基酯桥接(carboxymethyl ester bridges)、乙酰胺桥接(acetamide bridges)、氨基甲酸酯桥接(carbamate bridges)、硫醚桥接(thioether bridges)、sulfoxy桥接、sulfono桥、异头(anomeric)桥接和硼烷衍生物的脱磷酸核苷酸间类似物(dephospho internucleotide analogs)(Cook,1991,Medicinal chemistryof antisense oligonucleotides-future opportunities(反义寡核苷酸医学化学-未来机遇).Anti-Cancer Drug Design(抗癌药物设计)6:585)。优选地,为了使得本发明的合成多核苷酸具有体内稳定性,可以将在核糖环位置2处的氧分子甲基化,形成2′-O-甲基化RNA寡核苷酸。
国际专利申请WO 89/12060公开了用于合成多核苷酸类似物的多种结构单元,以及通过以限定顺序连接所述结构单元形成的多核苷酸类似物。所述结构单元可以是“刚性的”(即,包含环结构)或“柔性的”(即,缺少环结构)。在这两种情形中,所述结构单元包含羟基和巯基,据说结构单元通过它们连接形成多核苷酸类似物。在寡核苷酸类似物中的连接结构部分选自由硫化物(-S-),亚砜(-SO-),和砜(-SO2-)组成的组。
国际专利申请WO 92/20702描述了一种包括肽主链的无环寡核苷酸,在所述肽主链上任何选择的化学核碱基(nucleobase)或类似物排成一列且如同其在天然RNA中那样作为编码特征(coding characters)。这些称为肽核酸(PNAs)的新化合物不但在细胞中比其天然对应物更稳定,而且结合天然RNA比彼此附着的天然核酸更紧密50-100倍。可以通过Merrifield固相肽合成法,由包含尿苷、胞苷、腺苷和鸟苷的4种被保护的单体合成PNA低聚物。为了提高在水中的溶解性以防止聚集,赖氨酸酰胺基位于在C端区域。
还可以通过在合成过程中在snoRNAs中结合3′-脱氧胸苷或2′-取代的核苷酸(例如,用烷基取代的),通过提供作为苯基异脲(phenylisourea)衍生物的snoRNAs,或通过使其它分子如氨基吖啶(aminoacridine)或聚赖氨酸连接在snoRNAs的3′端,而提高snoRNA的稳定性(参见,例如,Anticancer Research(抗癌研究)10:1169-1182,1990)。本发明snoRNAs的RNA核苷酸的修饰可以在整个snoRNA中、或在选择的区域如5′和/或3′端存在。还可以通过将snoRNAs偶联至亲脂化合物上而修饰snoRNAs以提高其透过靶组织的能力。可以通过本领域已知的标准方法制备本发明的snoRNAs,所述标准方法包括标准化学合成法和编码其的DNA的转录。另外,可以通过将snoRNAs偶联至对靶细胞细胞表面上的受体特异性的配体而使snoRNAs靶向特定的细胞。还可以通过缀合到特异性结合细胞型特异性受体的单克隆抗体上,而使snoRNAs靶向特定的细胞类型。
本发明核酸的构建体和/或载体可以包括多于一种被设计为产生本发明所述的修饰的snoRNA的序列。当存在多于一种序列时,所述序列可以被设计为靶向相同的靶核酸,或不同的靶核酸。
所述核酸构建体,载体或实际上编码修饰的snoRNA的核酸本身可以被设计成表达与本发明的snoRNA分子联合使用的其他分子,如RNAi分子,以调节基因表达。
还可能利用本发明的技术产生疾病模型,而不必产生常规转基因动物。因此,本发明的核酸,核酸构建体或载体可以被设计成表达snoRNA,以在宿主细胞/动物中防止或最小化正常野生型基因/蛋白的表达,且还表达与特定疾病/病况相关的基因/蛋白的突变形式。然后,可以向所述细胞/动物增加/实施可能的治疗,以观察所述治疗能否治疗或改善突变基因/蛋白的作用。
本发明的snoRNAs,核酸,核酸构建体和/或载体可以用来确定基因在细胞或生物体中的功能,或者甚至用于调节基因在细胞或生物体中的功能。所述细胞优选地是真核细胞或细胞系,例如,植物细胞或动物细胞,如哺乳动物细胞,例如,胚胎细胞,多能干细胞,肿瘤细胞,例如畸胎瘤细胞,或病毒感染的细胞。所述生物体优选地是真核生物体,例如,植物或动物,如哺乳动物,特别是人。
本发明的snoRNA分子针对的靶基因可以与病理状况相关。例如,所述基因可以是病原体相关基因,例如,病毒基因,肿瘤相关基因或自体免疫疾病相关基因。所述靶基因还可以是在重组细胞或遗传改变的生物体中表达的异源基因。通过确定或调节、特别是抑制所述基因的功能,可以获得农业领域或医学或兽医用医学领域中的有价值的信息和治疗益处。本发明允许提供被设计为用备选形式、典型地使用单一载体来置换细胞(或病毒)蛋白(或功能RNA)的一种形式的核酸构建体和snoRNAs。例如,这可以用来纠正在生物体或细胞中存在的缺陷,如已知可能为疾病的致病因子的突变基因(例如在CFTR基因中的基因突变导致发展囊性纤维化病)。相同的载体可以被设计成在同一构建体内编码靶向以减少突变基因表达的snoRNA(s),并且还编码该基因的正确拷贝以表达正确的蛋白。所述正确的拷贝可以由cDNA序列提供,或者备选地由侧连内含子的外显子编码,所述内含子编码本发明的修饰的snoRNAs。其他实例包括置换与癌症进展相关的突变的p53基因、BRCA基因等。
有利地,snoRNA和置换核酸可以位于同一转录体内,且由与击倒(knock down)表达的snoRNAs相同的启动子表达。这具有允许使全部作为单一转录体表达的优点。此外,这还具有使snoRNAs的表达水平和所表达的置换核酸平衡且共同调节(即,由相同的启动子调节)的优点。
可以利用相似的方法来用相同RNA的修饰形式置换不编码蛋白的被靶向的RNA(例如,snRNA或miRNA或其他功能RNA)。
这种策略不限于校正缺陷。可以利用相似的策略来置换由细胞或病毒编码的任何蛋白(或RNA),包括用相同基因产物的缺陷的、突变的或修饰形式置换的该蛋白(或RNA)的野生型和/或功能形式,这对于某些应用可能是理想的,例如,评价突变体表型,或辅助药物筛选策略,或用于靶标验证,或在不与已有的未标记的细胞形式竞争的条件下分析蛋白的标记形式,或用于其它实施的应用或研究应用。还可以利用所述策略使用单一载体来用完全或基本不同的蛋白(或RNA)置换一种类型的蛋白(或RNA)。
图1-3示意性显示可以用于本发明的载体的实例。在图1中,载体显示为表达多个snoRNAs,其可以被靶向以调节单一基因序列或多个基因序列的表达。图2示意性显示蛋白置换载体,对其进行设计从而提供抑制靶基因X表达的snoRNA(s),所述靶基因X可以由在所述载体中存在的cDNA所编码的新蛋白所置换。图3示意性显示与蛋白置换载体相似的载体,但是其用于抑制RNA,如突变RNA,且其可以用新形式/与所述载体中存在的序列不同的形式来置换。
本发明用于细胞或生物体的其他应用是分析基因表达模式和/或蛋白质组。在一个实施方案中,可以进行关于一个或数个靶蛋白的变体或突变形式的分析,其中通过上述外源靶核酸将所述变体或突变形式重新引入到细胞或生物体中。与使用敲除细胞相比较,组合外源基因的敲除和通过使用突变的例如是部分缺失的外源靶标的挽救具有优点。此外,该方法特别适用于鉴定靶蛋白的功能结构域。在另一个优选的实施方案中,例如,进行对至少两种细胞或生物体的基因表达模式和/或蛋白质组和/或表型特征的比较。
本发明还可以用于鉴定和/或表征药剂、例如,由测试物质的集合鉴定新药剂的方法中,和/或用于表征已知药剂的作用机制和/或副作用的方法中。
因此,在另一个方面中,提供本发明所述的snoRNA,核酸,核酸构建体或载体,其用于治疗受试者中的疾病或病症,在所述受试者中需要调节特别是下调一种或多种靶基因的表达。
在另一个方面中,提供本发明所述的snoRNA,核酸,核酸构建体或载体,其用于制备用于治疗受试者中的疾病或病症的药物,在所述受试者中需要调节特别是下调一种或多种靶基因的表达。
在另一个方面中,提供治疗受试者中的疾病或病症的方法,在所述受试者中需要调节特别是下调一种或多种靶基因的表达,所述方法包括对需要其的受试者施用治疗有效量的本发明所述的snoRNA、核酸、核酸构建体或载体的步骤。
当用于本文时,词语“治疗”指抑制或阻止疾病、病症或病况的发展和/或在患有、或诊断患有所述疾病、病症或病况的个体中引起疾病、病症或病况的减轻、消除、或恢复。本领域技术人员将知晓可以用于评估疾病、病症或病况的发展的各种方法和测定法,以及类似地,可以用于评估疾病、病症或病况的减轻、消除或恢复的各种方法和测定法。
通过向个体的细胞提供本发明的分离的多核苷酸,由此下调所述个体的细胞中靶RNA的水平,而实施本发明该方面所述的方法。
提供可以通过将本发明的多核苷酸直接施用至细胞中或通过如上文所述在细胞中表达所述多核苷酸而实施。表达可以通过用能够表达本发明的多核苷酸的核酸构建体直接转染个体的细胞(即,体内转染)、或通过用所述核酸构建体转染由个体分离的细胞并将所转染的细胞施用至所述个体(即,离体转染)而实施。
因此,在另一个方面中,提供一种药物组合物,其包括本发明所述的snoRNA,或能够表达本发明所述的snoRNA分子的核酸构建体,以及其药用载体。
药物制剂包括适于口服、局部(包括皮肤、口腔和舌下)、直肠或肠胃外(包括皮下、皮内、肌内和静脉内)、鼻和肺部施用如通过吸入的那些制剂。在适当时,所述制剂可以方便地以离散的剂型(discrete dosage unit)存在,并且可以通过制药领域中公知的任何方法制备。所有方法均包括这样的步骤:使活性化合物与液体载体或细分的固体载体或二者缔合,然后如果需要,将产品定型为需要的制剂。
其中载体是固体的适于口服施用的药物制剂最优选地作为单位剂量制剂存在,如大丸剂(boluses),胶囊或片剂,每种包含预先确定量的活性化合物。片剂可以通过压制或模塑制备,任选地具有一种或多种辅助成分。压制的片剂可以通过在适当的机器中挤压采用自由流动形式的活性化合物,如粉末或颗粒而制备,所述粉末或颗粒任选地与结合剂、润滑剂、惰性稀释剂、滑润剂、表面活性剂或分散剂混合。模塑的片剂可以通过用惰性液相稀释剂模塑活性化合物而制备。片剂可以任选地包被,并且如果未包被,可以任选地是有划痕的(scored)。胶囊可以通过将单独的或与一种或多种辅助成分混合的活性化合物填充至胶囊壳中然后以常用方式将其密封而制备。扁囊剂与胶囊类似,其中活性化合物与任意辅助成分一起被密封在米纸封中。活性化合物还可以被配制为可分散的颗粒,其可以例如在施用前混悬在水中,或撒在食物上。颗粒可以进行包装,例如,包装在小药囊中。其中载体是液体的适于口服施用的制剂可以作为在水性或非水性液体中的溶液或混悬液、或作为水包油液体乳剂存在。
用于口服施用的制剂包括控释的剂型,例如,片剂,其中将活性化合物配制在适当的控释基质中,或者用适当的控制释放的薄膜包被。所述制剂可以特别方便的用于预防应用。
其中载体是固体的适于直肠施用的药物制剂,最优选地作为单位剂量的栓剂存在。适当的载体包括可可脂和本领域常用的其它物质。所述栓剂可以通过用软化的或熔融的载体混合活性化合物然后在模具中冷却并塑形而方便地形成。
适于肠胃外施用的药物制剂包括活性化合物在水性或油质赋形剂中的无菌溶液或混悬液。
可注射的制剂可以适用于推注注射(bolus injection)或连续输注。所述制剂方便地以单位剂量存在或者存在于多剂量容器中,所述多剂量容器在引入所述制剂后密封直至需要使用时。备选地,活性化合物可以采用粉末形式,其在使用前用适当的赋形剂如无菌、无致热原的水构成。
活性化合物还可以配制为长久作用的长效制剂,其可以通过肌内注射或通过植入如皮下或肌内植入而施用。长效制剂可以包括,例如,适当的聚合物或疏水物质,或离子交换树脂。所述长久作用的制剂特别方便地用于预防应用。
存在适于通过口腔进行肺部施用的制剂,以便在接受者的支气管树中递送包含活性化合物且理想地直径在0.5-7微米范围内的颗粒。
作为一种可能性,所述制剂可以采用精细粉碎的粉末形式,其可以方便地存在于可穿透的胶囊中,例如,适当的明胶胶囊中,适于用在吸入装置中,或者备选地作为自推进式制剂,其包括活性化合物,合适的液体或气体推进剂和任选地其它成分如表面活性剂和/或固体稀释剂。适当的液体推进剂包括丙烷和含氯氟烃,并且合适的气体推进剂包括二氧化碳。还可以使用这样的自推进式制剂,其中活性化合物以溶液小滴或混悬液小滴的形式分散在其中。
所述自推进式制剂与本领域已知的那些类似,且可以通过建立的方法制备。适当地,其存在于装备有手动操作阀或自动运行阀的容器中,所述阀具有理想的喷雾特征;有利地,所述阀是其每次操作递送固定体积如25-100微升的计量形式。
作为另外一种可能性,活性化合物可以采用用在喷雾器(atomizer)或雾化器(nebuliser)中的溶液或混悬液的形式,由此利用加速气流或超声波搅动来产生细小的小雾滴以用于吸入。
适于鼻施用的制剂包括通常与上述用于肺施用的那些类似的制剂。当分散时,所述制剂应该理想地具有10-200微米范围内的颗粒直径,以保证在鼻腔内的保留;这可以适当地通过使用适当的粒度的粉末或选择适当的阀实现。其它适当的制剂包括颗粒直径在20-500微米范围内的粗磨粉末,用于通过由紧贴鼻部放置的容器经由鼻通路快速吸入而施用,和滴鼻剂,其含有在水性或油性溶液或混悬液中的0.2-5%w/v活性化合物。
应该理解,除了上述载体成分之外,上述药物制剂可以包括适当的一种或多种另外的载体成分,如稀释剂,缓冲剂,增香剂,结合剂,表面活性剂,增稠剂,润滑剂,防腐剂(包括抗氧化剂)等,以及所包含的用于使所述制剂与目的接受者的血液等渗的物质。
对于本领域的技术人员,药用载体是公知的,且包括,但不限于,0.1M且优选为0.05M的磷酸缓冲液或0.8%的盐水。另外,所述药用载体可以是水性或非水性溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水,醇/水溶液,乳液或混悬液,其包括盐水和缓冲介质。肠胃外赋形剂包括氯化钠溶液、复方氯化钠葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏(Ringer′s)或不挥发性油。还可以存在防腐剂和其他添加剂,如例如,抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。
例如,适于局部制剂的制剂可以作为凝胶、霜剂或药膏提供。例如,所述制剂可以涂在伤口或溃疡处,直接涂敷在伤口或溃疡的表面,或者负载在适当的支持物如绷带、纱布、网眼等上,所述支持物可以应用于待治疗的区域且覆盖在其上。
还可以提供液体或粉末制剂,其可以直接喷雾或撒在待治疗部位上,例如,伤口或溃疡上。备选地,可以用所述制剂喷雾或撒在载体如绷带、纱布、网眼等上,然后施用于待治疗部位。
用于兽医用的治疗制剂可以方便地采用粉末或液体浓缩液形式。按照标准的兽医用制剂实践,可以在粉末中结合常规水溶性赋形剂,如乳糖或蔗糖,以提高其物理特性。因此,本发明特别适合的粉末包括50-100%w/w且优选地60-80%w/w的活性成分和0-50%w/w且优选地20-40%w/w的常规兽医用赋形剂。这些粉末可以添加到动物饲料中,例如,通过中间预混合来添加,或稀释在动物饮用水中。
本发明的液体浓缩液适当地包含所述化合物或其衍生物或其盐,且可以任选地包括兽医用水混溶性溶剂,例如,聚乙二醇、丙二醇、甘油、缩甲醛甘油(glycerol formal)或与多至30%v/v乙醇混合的溶剂。所述液体浓缩液可以施用在动物的饮用水中。
详述
现在将参考下述非限制性实施例和附图描述本发明,所述附图显示:
图1:本发明所述的被设计为表达多个snoRNAs的snoRNA表达载体的示意图;
图2:被设计为用载体编码的蛋白替代宿主细胞蛋白的snoRNA表达载体的示意图;
图3:被设计为用载体编码的RNA替代宿主细胞RNA的snoRNA表达载体的示意图;
图4:Hela细胞核仁RNA文库。
(A)来自HeLa细胞核仁级分的核仁RNA的分离和克隆。左版显示分级分离之前的完整的HeLa细胞图像,右版显示分离的核仁。HeLa细胞核仁利用先前所述的蔗糖梯度方法(Andersen等人.,2005)分级,然后由核仁沉淀分离总核仁RNA。通过使用多腺苷酸化聚合酶在3′端添加多腺苷酸而对总核仁RNA进行修饰。
(B)显示cDNA合成策略的示意图,其利用扩增(显示在右)和不用扩增(显示在左)进行。通过使用有聚腺苷酸尾的核仁RNA作为模板进行反转录合成核仁cDNAs。不用扩增制备的文库(左)主要用来检测丰度核仁RNA种类,而我们利用扩增技术(右)制备包括较低丰度核仁RNA种类的文库。将这两种文库独立地克隆至通用质粒载体中,并且通过DNA测序进行分析。
(C)在核仁cDNA文库中检测到的RNA种类的总结。我们分别分析了所述扩增的文库和未扩增的文库,但是圆形分格统计图表显示两种文库的合并结果。
图5:HBII-180C snoRNA和宿主基因C19orf48的保守性。
(A)HBII-180C snoRNA的结构。盒C(A/G)UGAUGA)与盒D或D′(CUGA)分别表示在盒内。用于指定核糖2′-O-甲基化位点的预测的rRNA互补序列用下划线表示。
(B)预测的HB II-180C snoRNA的二级结构,显示与FGFR3前mRNA互补的区域。HBII-180C snoRNA 的二级结构由mfold(http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/rna-forml.cgi)(M.Zuker Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction(用于核酸折叠和杂交预测的M.Zuker Mfold网络服务器).Nucleic AcidsRes.(核酸研究)31(13),3406-15,(2003)和D.H.Mathews,J.Sabina,M.Zuker与D.H.Turner Expanded Sequence Dependence of ThermodynamicParameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure(Turner扩大的热动力学参数的序列依赖性提高RNA二级结构的预测)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)288,911-940(1999)(左)计算。盒C与盒D与D′分别显示在盒内。rRNA互补序列(虚线)和FGFR3互补序列(实线)用条线表示。FGFR3前mRNA的互补区显示在右侧,其显示潜在的碱基配对相对作用。
(C)人C19orf48基因的结构。外显子显示为具有罗马数字的条纹盒。预测的蛋白编码区用黑色显示。内含子-编码的snoRNAs HBII-180A,HBII-180B和HBII-180C以实心灰色盒显示。
(D)C19orf48基因的保守区。该图来源于UCSC人类基因组浏览程序的C19orf48染色体位置(http://genome ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway KentWJ,Sugnet CW,Furey TS,Roskin KM,Pringle TH,Zahler AM,Haussler D:The human genome browser at UCSC(UCSC的人类基因组浏览程序).Genome Res(基因组研究)2002,12(6):996-1006)。脊椎动物Multiz比对和保守性结果以黑色盒和线条表示。17种脊椎动物物种之间的保守区以条形显示(保守性)。三个最保守的区域准确对应三种检测的HBIIsnoRNAs。
图6:HBII-180C的FGFR3互补区的序列特异性作用。
(A)通过RNA印迹(左版)和通过半定量RT-PCR(右版)分析的HBII-180C表达水平。左版显示使用HBII-180C特异性探针进行的RNA印迹分析的结果。印迹分析了相同量的来自人原代细胞系WI38(WI38)和HeLa细胞(HeLa)的总核仁RNA(核仁),或总细胞RNA(细胞)。右版显示使用HBII-180C特异性引物组进行的半定量RT-PCR的结果。使用相同量的来自WI38和HeLa细胞的总核仁RNA或总细胞RNA作为模板。
(B)用于野生型和突变HBII-180C snoRNAs的HBII-180C表达质粒。HBII-180C中与FGFR3前mRNA互补的序列由GAGG改变为ATAA(蓝色,mut1)。
(C)WI38细胞中表达野生型或mut1 HBII-180C snoRNAs的效果比较。图像显示在用空质粒pcDNA3(pcDNA3),HBII-180C野生型表达质粒(WT)或HBII-180C突变体表达质粒(mut1)转染WI38细胞后三天的细胞的代表性实例。红色箭头指示将死细胞块或死亡细胞块。
(D)显示在用上述质粒表达后三天的死亡细胞的百分数的图表。与野生型相比较,FGFR3前mRNA互补区的突变清楚地降低细胞死亡水平。
图7:HBII-180C snoRNA的FGFR3-互补区与可变的FGFR3剪接同
种型模式相关。
(A)用于野生型和突变体的FGFR3内含子17表达质粒,其被设计为抑制内源HBII180-C snoRNA的表达/活性。对于突变体构建体,FGFR3的互补区由CCTC改变为TTAT(蓝色,FRm)。
(B)FGFR3剪接的mRNA同种型在WI38和HeLa细胞两种细胞中的内源性表达模式。凝胶(左图)显示RT-PCR分析结果,以检测可变剪接的FGFR3mRNA同种型。右图显示FGFR3mRNA特异性引物组的位置。外显子显示为具有罗马数字的盒。用于PCR的引物以箭头显示。
(C)通过过量表达FGFR3小基因而改变FGFR3可变剪接的mRNA同种型模式。凝胶图像显示没有进行转染的(No,泳道1),转染了空质粒pcDNA3.1(pC,泳道2),转染了FGFR3内含子17的野生型小基因(FR3W,泳道3)和突变体小基因(FRm,泳道4)的RT-PCR结果。
图8:使用修饰的snoRNA表达载体对GFP和YFP的靶向抑制。
(A)GFP和YFP共有的嵌合体表达质粒靶向序列。WT HB II-180CsnoRNA中与FGFR3前mRNA互补的序列由5′-CACCCCAGAGGACACAGTGCA-3′改变为5′-GACTTGAAGAAGTCGTGCTGC-3′(蓝色,嵌合体1)或改变为5′-ACCTTGATGCCGTTCTTCTGC-3′(蓝色,嵌合体2)。将所得到的嵌合体1和2snoRNAs亚克隆到表达mCherry荧光蛋白cDNA的载体的3′区。
(B)该图显示靶向GFP的两个单独区域的嵌合体1和嵌合体2的互补区,所述两个单独区域也存在于相关的YFP基因中。
(C)在仅表达未融合的GFP的HeLaGFP稳定细胞系中,嵌合体构建体对GFP表达的作用。该图显示在HeLaGFP稳定细胞系中转染空的mCherry表达质粒mCherry-C1(mCherry-C1),表达质粒HBII-180C嵌合体1或表达质粒HBII-180C嵌合体2的作用。左版显示未转染的HeLaGFP稳定细胞系的活细胞图像(DIC图像)。上版显示由固定的细胞记录的图像的GFP荧光信号(绿色)。下版显示组合GFP(绿色)和mCherry(红色)信号的合并图像。箭头指示转染细胞,箭头状物指示未转染的细胞。注意到特别是在用编码HBII-180C嵌合体1或2的表达质粒转染的细胞中GFP表达的清楚的减少。
(D)在表达融合在纤维蛋白的氨基端的YFP的HeLaYFP-纤维蛋白稳定细胞系中嵌合体构建体对YFP表达的作用(Leung等人.,2004)。该附图显示在HeLaYFP-纤维蛋白稳定细胞系中使用空的mCherry表达质粒mCherry-C1(mCherry-C1),表达质粒HBII-180C嵌合体1或表达质粒HBII-180C嵌合体2对转染的作用。左版显示未转染的HeLaYFP-纤维蛋白稳定细胞系的活细胞图像(DIC图像)。上版显示由固定的细胞记录的图像的YFP荧光信号(绿色)。下版是组合YFP(绿色),mCherry(红色)和DAPI信号(蓝色)的合并图像。箭头指示转染的细胞,而箭头状物指示未转染的细胞。注意到特别在用编码HBII-180C嵌合体1或2的表达质粒转染的细胞中YFP-纤维蛋白表达的清楚减少。在一些细胞中,YFP信号几乎被完全消除,这表明所述嵌合的snoRNA构建体对YFP-纤维蛋白的有效抑制。
图9:由蛋白质印迹和RNA印迹检测的靶向的snoRNA对GFP和
YFP的抑制。
(A)在用空的mCherry表达质粒mCherry-C1(对照:泳道1),表达质粒HBII-180C嵌合体1(泳道2)或表达质粒HBII-180C嵌合体2(泳道3)转染HeLaGFP和HeLaYFP纤维蛋白稳定细胞系后,检测GFP(上图)和YFP-纤维蛋白(下图)的蛋白水平。每一泳道加载等量的HeLa提取物,且蛋白通过SDS PAGE分离,电印迹且用单克隆抗-GFP抗体和用作为加载对照的抗-微管蛋白探测。注意到,特别是使用编码HB II-180C嵌合体1或2的表达质粒,GFP和YFP-纤维蛋白水平而不是微管蛋白水平的减少。
(B)该图显示三次独立的实验的平均信号强度和标准差。GFP信号比率根据微管蛋白信号标准化。注意到,特别是使用编码HB II-180C嵌合体1或2的表达质粒,GFP和YFP-纤维蛋白水平而不是微管蛋白水平的减少。
(C)在用空mCherry表达质粒mCherry-C1(对照:泳道1),表达质粒HBII-180C嵌合体1(泳道2)或表达质粒HB II-180C嵌合体2(泳道3)转染HeLaYFP-纤维蛋白稳定细胞系后检测YFP-纤维蛋白的RNA水平。每一泳道加载等量的HeLa细胞总RNA,且RNA通过6.5%甲醛-0.8%琼脂糖凝胶分离,电印迹,且用放射标记的抗-YFP低聚物和用作为加载对照的抗-18S rRNA进行探测。该图显示三次独立实验的平均信号强度和标准差。YFP-纤维蛋白信号比率针对18S rRNA信号进行标准化。
(D)嵌合体snoRNA质粒的转染效率。通过RT-PCR定量mcherrymRNA。HeLa细胞总RNA分离自瞬时转染的mCherry质粒(对照)和嵌合体snoRNAs。该图显示三次独立实验的平均信号强度。mCherry细胞比率针对GAPDH信号标准化。
图10:使用嵌合体1和2进行的基因击倒的另一个实例。
其实验设计与图8C和D所示的实验设计相同,不同在于此处用稳定细胞系HeLaGFP-SMN。mCherry-HBII-180C为另一种阴性对照,其在mCherry cDNA的3′区具有野生型HBII-180C snoRNA序列。箭头指示转染的细胞,而箭头状物指示未转染的细胞。注意到,特别在用编码HBII-180C嵌合体1或2的表达质粒转染的细胞中,GFP表达的清楚减少。
图11:使用三联嵌合体(triplet chimera)snoRNA质粒的靶向基因击
倒。
(A)三联嵌合体snoRNA构建体的结构和靶向GFP/YFP击倒的示意图。
(B)(C)实验设计与图8C和D所用的实验设计相同,但是此处使用嵌合体三联质粒进行转染。Mcherry-triple-HBII-180C是另一种阴性对照,其在mCherry cDNA的3′区具有3个野生型HB II-180C snoRNA序列的重复。箭头:转染的,箭头状物:未转染的。
(D)通过蛋白质印迹(泳道1-5)检测靶向GFP/YFP的每种嵌合体质粒的击倒效率。用mCherry和野生型HBII-180C表达质粒mCherry-HBII-180C(对照:泳道1),表达质粒嵌合体1(泳道2),嵌合体2(泳道3),嵌合体3(泳道4),HBII-180C三联嵌合体(泳道5)转染HeLaYFP- 纤维蛋白稳定细胞系后,检测YFP-纤维蛋白的蛋白水平。每一泳道加载等量的HeLa提取物,且通过SDS PAGE分离蛋白,进行电印迹,且用单克隆抗-GFP抗体和作为加载对照的抗-B23进行探测。该图显示由B23信号标准化的YFP-纤维蛋白信号强度。注意到,特别是用编码嵌合体1,2和3的表达质粒时,YFP-纤维蛋白水平而不是B23水平的降低。使用三联嵌合体质粒已经增加了降低YFP-纤维蛋白表达水平的效率。
(E)实验设计与图11B和C的实验设计相同,但是此处使用嵌合体稳定细胞系HeLaGFP-SMN。还使用GFP-SMN融合蛋白的另一种稳定细胞系检测由所述三联嵌合体质粒介导的靶向基因表达的减少。箭头:转染的,箭头状物:未转染的。
图12:鉴定来自嵌合体三联质粒的嵌合体snoRNAs。
(A)原位杂交的荧光显示野生型HBII-180C和嵌合体snoRNAs(Cy3)的核仁定位。用DAPI染色DNA。线条是10μM。三联嵌合体snoRNA构建体的结构显示在上版中。箭头指示核仁。
(B)HB II-180C和嵌合体snoRNAs的表征。RNA印迹显示HB II-180C和嵌合体snoRNAs的亚细胞分布。通过使用特异性探针的northern RNA印迹分析,用瞬时转染的野生型或嵌合体snoRNA表达小基因比较等量的HeLa细胞总RNA(泳道1),细胞质RNA(泳道2),核浆RNA(泳道3)和核仁RNA(泳道4)。使用tRNA-IIe特异性探针(下版)检测级分质量。
图13:分析HBII-180C和嵌合体snoRNA突变。
(A)显示snoRNAHBII-180C的序列,其中8个分开的三核苷酸AAA突变的位置显示为m1-m8(在所述序列上显示)。盒C,D和D′用盒显示。与28S rRNA互补的预测的指导序列用下划线表示,如在snoRNABase(L.Lestrade等人,2006)中所示。M盒区由粗体下划线表示。HeLa细胞瞬时转染了空质粒载体(泳道2),或表达野生型HB II-180C的质粒载体(泳道3)或HB II-180C snoRNA突变体m1-8(泳道4-11)。每个泳道加载等量的总HeLa细胞RNA(Ctrl:未转染)。条带显示高灵敏性RNA印迹的结果,其使用放射标记的寡核苷酸探针来分别检测HBII-180C snoRNA,和tRNA。通过半定量RT-PCR使用C19 orf48和GAPDH特异性引物组(C19orf48和GAPDH)验证转染效率。*C19orf48引物检测内源性C19orf48转录体和HBII-180C小基因之间共有的区域。
(B)将野生型质粒(CM2WT)和突变质粒(CM2m1&m7)瞬时转染至单独的GFp的稳定细胞(HeLaGFP)或GFP-SMN融合蛋白稳定细胞系(HeLaGFP-SMN)中。箭头:转染的,箭头状物:未转染的。注意,对于在嵌合体2质粒上作为HBII-180C snoRNA(图13A)的盒C(CM2m1)和盒D(CM2m7)的核心区域的突变对GFP和GFP-SMN表达水平没有表现出击倒作用。
(C)将突变质粒(CM2m2-1,m2-2和m3)瞬时转染至GFP-SMN融合蛋白稳定细胞系(HeLaGFP-SMN)中。箭头:转染的,箭头状物:未转染的。注意破坏28S rRNA互补序列的突变质粒(CMm2-1和m2-2)存在明显的击倒作用。
(D)将在M盒具有增加与GFP的互补性的插入的突变体质粒(CM2In-1至-3)和在M盒中具有缺失的突变体质粒(CM2Del-1至-3)瞬时转染至GFP-SMN融合蛋白稳定细胞系(HeLaGFP-SMN)中。箭头:转染的,箭头状物:未转染的。
(E)将在M盒中具有点突变的突变体质粒(CM2X-1至-6)瞬时转染至GFP-SMN融合蛋白稳定细胞系(HeLaGFP-SMN)中。箭头:转染的,箭头状物:未转染的。
(F)嵌合体2诱变结果总结。左版显示HBII-180C snoRNA的基序和每种质粒的突变区(质粒名称和突变位置在表格中)。表格显示显微镜分析(图13B-E)的结果。击倒效率显示当通过计数30个随机选择的转染细胞判断时,表现出对GFP-SMN水平的抑制的细胞数目(+++:多于16,++:13-16,+:9-12,-:5-8,--:少于5)。
图14:结合组合的snoRNA主链突变的嵌合体三联质粒(triple
plasmid)能够介导靶向基因的表达的击倒。
(A)突变体m2,m4和m5序列均组合且结合在嵌合体三联snoRNA(snoMENv1)中。使用Cy3标记的嵌合体snoRNAs特异性探针(Cy3)的原位杂交荧光显示核仁定位。用DAPI染色DNA。线条是15μm。箭头指示核仁。
(B)这是与图11E所示的实验设计相同的实验设计,不同的是转染三联嵌合体snoMENv1质粒。注意到snoMENv1质粒表现出与野生型嵌合体三联质粒相似的靶基因的减少水平。
图15:内源性SMN1蛋白的靶蛋白置换。
(A)被靶向的内源性SMN1基因击倒质粒(SMN1s noMENv1)和SMN1蛋白置换质粒(GFP-SMN1 snoMENv1-PR)的结构。这些构建体具有与三联嵌合体snoMENv1(图14A)相似的三联snoMEN序列,不同的是M盒序列具有针对内源性SMN1前mRNA特异性序列的互补序列(见材料和方法)。
(B)将被靶向的内源性SMN1质粒(SMN1 snoMENv1)和蛋白置换质粒(GFP-SMN1 snoMENv1-PR)转染至HeLa细胞中。还将表达GFP cDNA和mcherry-三联嵌合体质粒的EGFP-C1(图14A)瞬时转染到HeLa细胞中作为对照(GFP和三联嵌合体)。注意,SMN1 snoMENv1表现出对照没有表现出的细胞毒性表型。该细胞毒性作用通过使用GFP-SMN1snoMENv1-PR质粒进行GFP-SMN1融合蛋白的表达而得以挽救。箭头:转染的细胞,箭头状物:细胞毒性表型细胞。
(C)在用mCherry三联嵌合体(对照:泳道1)和SMN1 snoMENv1(泳道2)转染HeLa细胞后检测内源性SMN1的蛋白水平。每个泳道加载等量的HeLa提取物,且通过SDS PAGE分离蛋白,进行电印迹并用单克隆抗-SMN1抗体和作为加载对照的抗-B23探测。该图显示具有针对B23信号标准化的SMN1信号强度。
图16:具有本发明的snoRNA分子的慢病毒(Lentiviral)系统。
这是与图11B中所进行和所述相同的实验设计,不同的是在该情形中,表达载体用慢病毒载体系统(Lenti-XTM Clontech)转染。mCherry-三联-HBII-180C是阴性对照,其在mCherry cDNA的3′区具有3个野生型HBII-180C snoRNA序列的重复。箭头:转染的细胞,箭头状物:未转染的细胞。
缩写:
snoRNA:小核仁RNA
snRNA:小核RNA
rRNA:核糖体RNA
tRNA:转运RNA
FGFR3:成纤维细胞生长因子受体3
mRNA:信使RNA
前-mRNA:前体信使RNA
GAPDH:磷酸甘油醛脱氢酶
HBII-180C:人脑snoRNA II-180C
CIP:牛小肠磷酸酶
PCR:聚合酶链式反应
CMV:巨细胞病毒
材料和方法
构建核仁cDNA文库。如先前所述(Andersen等人.,2005),使用蔗糖梯度纯化HeLa细胞核仁。通过具有DNA酶I处理的TRIzol法按照供应商(Invitrogen)的使用说明,由纯化的核仁分离核仁RNA。使用多腺苷酸化聚合酶(Invitrogen),在3′末端加入20-30mer聚腺嘌呤序列(poly adeninesequence)来修饰核仁RNA。在未扩增的文库的情形中(图4B左图),通过使用寡dT引物进行反转录,由10μg加多腺苷酸尾的核仁RNA合成cDNA。通过使用Super Script质粒合成试剂盒按照供应商(Invitrogen)所述进行的切口平移置换技术合成第二链cDNA。在用T4 DNA聚合酶产生平端后,将双链cDNA克隆至pBluescript载体中。在扩增的文库的情形中(图4B右图),使用GeneRacer试剂盒不经CIP步骤(Invitrogen)制备核仁cDNA。通过使用衔接体特异性引物按照供应商(Invitrogen)所述进行的短时PCR扩增(例如,5秒的聚合酶反应),扩增小尺寸的双链cDNA。按照供应商的使用说明,将扩增的cDNA克隆至TOPO TA克隆载体中。
RNA印迹分析和RT-PCR。通过具有DNA酶I处理的TRIzol法按照供应商(Invitrogen)的使用说明,由HeLa细胞核仁和HeLa细胞或人成纤维原代细胞系WI38细胞分离核仁RNA和总细胞RNA。通过在TBE缓冲液中的8M尿素聚丙烯酰胺变性凝胶分离等量的RNA。通过电印迹将RNA转移至尼龙膜(Hybond-N;Amersham)上。在UV交联后,使用标准方法,将印迹的膜用32P标记的特异性探针(U3:
5′-CACTCAGACCGCGTTCTCTCCCTCTCACTCCCCAATACGG-3′,HBII-180C:
5′-AAAGGTCCTGGGGTGCACTGTGTCCTCAGGGGTGATCAGA-3′.HBII-85:
5′-ACGACGGTATGAGTTCTCACTCATTTTGTTCAGCTTTTCC-3′)杂交。还进行RT-PCR来验证每种snoRNA的表达水平。使用Superscript一步RT-PCR试剂盒(Invitrogen),使用基因特异性引物(U3:5′-AGAGGTAGCGTTTTCTCCTGAGCG-3′和5′-ACCACTCAGACCGCGTTCTC-3′,HBII-180C:5′-CTCCCATGATGTCCAGCACT-3′和5′-CTCAGACCCCCAGGTGTCAA-3′,HBII-85:5′-GATCGATGATGAGTCCCCCATAAAAAC-3′和5′-GACCTCAGTTCTGATGAGAACGACGG-3′)进行反转录和PCR。为了决定线性循环,我们使用Superscript III Platinum SYBR Green一步qRT-PCR试剂盒(Invitrogen)和Rotor-Gene RG-3000系统(CorbettResearch)进行实时PCR。将等量的RNA作为模板用于RT-PCR反应。每一实验分别重复三次。
质粒构建和转染。将来自C19orf48基因外显子2至3的序列插入到pcDNA3.1哺乳动物表达质粒的CMV启动子的3′区,产生HBII-180C表达载体。通过位点定向诱变由野生型构建体建立突变体构建体(mut1,图6B)。建立FGFR3内含子17表达小基因以抑制内源的HBII-180C功能。将FGFR3序列的外显子17-18插入到pcDNA3.1哺乳动物表达质粒(图7A)的CMV启动子的3′区。通过位点定向诱变由野生型构建体建立突变体构建体(Frm,图4A)。通过位点定向诱变由野生型HBII-180C表达构建体建立抗-GFP/YFP HB II-180C构建体(嵌合体1和2,图8A)。如图8A所示,将突变的插入物亚克隆至哺乳动物表达质粒mCherry-C1的mCherry cDNA的3′区中。使用磷酸钙法将所述质粒转染WI38细胞,且对于HeLa细胞及其他HeLa稳定细胞系使用″effectine″转染试剂(QIAGEN)。磷酸钙法如下文所述进行。
死细胞计数。将WI38细胞涂布在10cm的培养皿上。在附着细胞的同时转染所述质粒。在3天后计数死细胞百分数5次,每次随机选择100个细胞进行计数。然后以5次独立计数的平均数计算平均死细胞百分数。每次实验独立地重复3次(图8D)。
FGFR3剪接的mRNA变体检测。使用基因特异性引物组(FGFR3:5′-TGGACGTGCTGGAGCGCTCCCCGC-3′和5′-CCCAGGGTCAGCCGGGCCCGAGACAG-3′,GAPDH:5′-CGCATCTTCTTTTGCGTCGCCAG-3′和5′-GGTCAATGAAGGGGTCATTGATGGC-3′)(图7B和C)通过一步RT-PCR检测FGFR3 mRNA的剪接变体。将FGFR3内含子17表达质粒转染至HeLa细胞中。48小时后,通过具有DNA酶I处理的TRIzol方法中供应商的使用说明(Invitrogen),由HeLa细胞、转染的HeLa细胞和WI38细胞分离总RNA。将等量RNA用作上述每次RT-PCR(RNA印迹分析和RT-PCR)的模板。
细胞成像。使用Deltavision Spectris荧光显微镜(Deltavision Spectrisfluorescence microscope)(Applied Precision)记录所有的细胞图像。按先前所示(Andersen等人,2005,Trinkle-Mulcahy等人,2006,http://www.lamondlab.com/f7protocols.htm)准备WI38,HeLa YFP-FIB细胞和HeLa GFP细胞的活细胞图像。细胞使用60X(NA 1.4)平面高度消色透镜物镜(Plan Apochromat objective)成像。每个视野和每次曝光记录间隔0.5μm的12个光切面(SoftWoRx图像处理软件,Aplied Precision)(图4A,图6C,图8C和D)。使用下述先前所述的方法准备WI38,HeLaYFP-FIB细胞和HeLa GFP细胞的固定的细胞图像。
将细胞用3.8%低聚甲醛固定。在通过1%tritonX-100渗透后,用DAPI染色细胞。
结果部分
本发明人已经进行了关于由哺乳动物细胞系分离的核仁的大规模的纯化和蛋白质组研究(Andersen等人.,2002,2005,Lam等人,2007)。他们已经详细地表征了人核仁蛋白质组(Leung等人,2003,还参见:http://www.lamondlab.com/NOPdb/)。他们还分析了由HeLa细胞分离的核仁的RNA组成。由高度富集的分离自HeLa细胞的核仁制备物纯化RNAs,在短时扩增反应后进行大小分级分离,亚克隆(见图4中的方法)并且测序。该分析鉴定了589个snoRNA克隆,包括562个先前已知的soRNAs和7个新的snoRNAs。
将3个检测到的已知的称为HBII-180A,HBII-180B和HBII-180C的盒C/D snoRNAs分别在称为C19orf48的转录体的独立的内含子内编码(图5C和D),C19orf48先前据报道在多重耐药性癌细胞中扩增(Zhou等人,2002)。三个HBII-180snoRNAs中的每一个靶向28S rRNA核苷酸位置3680处的同一2′-O-核糖甲基化位点(图5A和B)。编码这些snoRNAs的基因位于染色体19上的位置q13.33。C19orf48基因序列的进化比较表明主要保守性对应于内含子编码的snoRNAs而不是各自的外显子序列。这表明C19orf48基因的主要功能可能是编码snoRNAs而不是蛋白(图5)。
出乎意料地,HB II-180C snoRNA的序列分析揭示其具有21个核苷酸区,位于28S rRNA甲基化指导序列的3′,其中21个核苷酸中有19个与由人成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因转录的前mRNA的内含子17内的区域互补(图5A和B)。HBII-180C snoRNA表达水平的比较表明其在HeLa细胞中高度表达,而在原代成纤维细胞(WI38细胞)中仅以低水平存在(图6A)。
本发明人利用CMV启动子驱动转录,通过用HBII-180C小基因瞬时转染质粒载体,而在WI38细胞中外源性过量表达HBII-180C snoRNA(图6B)。这导致所转染的WI38细胞的细胞程序性死亡。然而,当本发明人瞬时表达HB II-180C的突变体时,其在与FGFR3的内含子17互补的区域内具有3个核苷酸的序列改变(即,减少与FGFR3前-mRNA的互补性),这不再在WI38细胞中引起细胞程序性死亡(图6,B-D)。在HeLa细胞中,由质粒载体过量表达与内源性HB II-180C snoRNA互补的靶FGFR3内含子17序列,导致所表达的FGFR3 mRNA同种型的比率的明显变化(图7A和B)。这在HeLa细胞中引起FGFR3 mRNA的短同种型的增加,导致与通常在WI38细胞中表达的相似的FGFR3mRNA同种型模式(图7C)。
这些数据表明HBII-180C snoRNA的表达水平可以影响FGFR3mRNA的表达水平。此外,该数据表明这一作用取决于在HBII-180CsnoRNA中存在与FGFR3前mRNA内含子17中的区域互补的序列。
本发明人接着通过修饰HBII-180C的结构以用与一个或多个靶RNAs互补的序列置换FGFR3互补序列区来检测snoRNA HB II-180C调节FGFR3RNA表达的能力是否可以适于调节特定靶RNAs的表达。因此,构建如图5A和B所示的载体,称为嵌合体1和2,其具有包含HBII-180C内含子的小基因,其包括由CMV启动子表达的HBII-180C snoRNA主链。所述载体还编码由CMV启动子表达的mCherry荧光蛋白,以允许包含所述载体的转染细胞的即时检测。HBII-180C中的FGFR3互补区用与GFP RNA互补的序列置换(见图8,A和B)。插入的序列为5′-GACTTGAAGAAGTCGTGCTGC-3′(嵌合体1)和5′-ACCTTGATGCCGTTCTTCTGC-3′(嵌合体2),其置换Wt HBII-180C中的序列5′-CACCCCTGAGGACACAGTGCA3′。
嵌合体表达载体和仅表达mCherry的等价载体(mCherry-C1),分别瞬时转染至a/仅稳定表达不融合的GFP的HeLa细胞系,或b/稳定表达与纤维蛋白融合的YFP的HeLa细胞系中(图8,C和D)。细胞在转染后48小时固定,并且通过荧光显微镜分析GFP/YFP的水平和mCherry表达。这表明,在转染了被改造从而在HBII-180C snoRNA主链内包含与GFP互补的序列的载体的那些细胞中,在各自的HeLa稳定细胞系中的GFP荧光的水平特异性减少。这一减少仅在表达mCherry的细胞中观察到,验证了其特异性发生在转染的细胞中。相反,转染了缺少snoRNA的mCherry载体的细胞不表现出GFP荧光的显著减少,或在表达mCherry的细胞和不表达mCherry的那些细胞之间的GFP水平的变化(图8C&D)。所述数据表明,单独的GFP的表达,或由紧密相关的YFP和细胞蛋白(纤维蛋白)形成的融合蛋白的表达,均可以通过特异性靶向的、改造的snoRNA表达载体的表达而进行调节。
这些数据表明本发明人已经产生的snoRNA表达载体的序列和结构可以进行改造以靶向选择的特定RNA靶标且由此调节其表达。
其他材料和方法
RNA和高灵敏性RNA印迹分析。按前述,使用蔗糖梯度分级分离HeLa细胞提取物。使用具有DNA酶I处理的TRIzol法,按照供应商的使用说明(Invitrogen),分离总HeLa细胞RNA和来自分离的细胞质、核浆和核仁级分的RNA。将来自每种样品的等量RNA通过在1xTBE缓冲液中的8M尿素聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离,且通过电印迹将RNA转移至尼龙膜(Hybond-N;Amersham)上。在UV交联后,所述膜用对下述RNA种类(HBII-180A,HBII-180B,HBII-180C和tRNA)特异的32P 5′末端标记的寡核糖核苷酸探针杂交。按先前所述制备高灵敏性RNA印迹(G.S.Pall等人,2007)。
二级结构
所有RNA的二级结构通过RNA结构4.5(RNAstructure 4.5)(D.H.Mathews等人,2004)预测,且用RnaViz 2.0(P.De Rijk等人,2003)进行注解。
质粒构建和转染
将来自C19 orf48基因外显子2-3的序列插入到pcDNA3.1哺乳动物表达质粒(Invitrogen)的CMV启动子的3′,产生HBII-180C表达载体。通过位点定向诱变,由野生型HBII-180C表达小基因构建体建立HBII-180A,B和HBII-180C的突变体构建体。使用″effectine″转染试剂(QIAGEN)将所述质粒转染至HeLa细胞中。
细胞成像
所有细胞图像使用Deltavision Spectris荧光显微镜(Applied Precision)记录。按先前所示(L.Trinkle-Mulcahy等人,2006和K.L.Leung等人.,2004).(http://www.lamondlab.com/f7protocols.htm)准备HeLaYFP-纤维蛋白细胞和HeLaGFP细胞的活细胞图像。细胞使用60X(NA 1.4)平面高度消色透镜物镜成像。对于每个视野和每次曝光记录间隔0.5μm的12个光切面(SoftWoRx图像处理软件,Applied Precision)。
结果部分
修饰的snoRNA对被靶向的蛋白和/或mRNA表达水平的作用
RNA印迹分析表明瞬时转染靶向G/YFP mRNA序列的嵌合体snoRNA抑制G/YFP mRNA水平(图9C和D)。这一结果表明嵌合体snoRNA可以影响靶mRNA表达水平,如前所述(图1和2)。多个修饰的snoRNAs可以在一个转录体中表达以增加其效率。
如在图11A中建立三联嵌合体snoRNA构建体。该质粒(三联嵌合体)编码三个位于在本文用作转染标记的mCherry荧光蛋白cDNA的3′的修饰的snoRNAs,其靶向G/YFP mRNA序列中的不同位置(图11A)。使用该三联嵌合体质粒的瞬时转染实验表明与用单嵌合体质粒相似的对G/YFP和G/YFP-融合蛋白的抑制作用,这通过荧光显微镜判断(图11B,C,E)。蛋白质印迹分析表明三联嵌合体构建体的抑制效率强于单嵌合体snoRNAs(图11D)。FISH分析和对每种嵌合体snoRNA使用特异性探针的分级的RNA印迹分析表明所述三联嵌合体质粒产生与用野生型HBII-180C观察到的每个修饰的嵌合体1-3 snoRNAs(图12A和B)。这些结果表明所修饰的snoRNA可以通过在一个转录体中表达多个snoRNAs(多重(multiplexing))增加靶向的击倒的效率。此外,所述三联嵌合体质粒表达mCherry红色荧光蛋白而不是G/YFP和G/YFP融合蛋白(图11B,C,E)。这些结果还表明我们可以通过使用修饰的snoRNA用mCherry置换G/YFP和G/YFP融合蛋白,由此证明“蛋白置换”或“蛋白敲入”作用。对于修饰的snoRNA及其击倒能力的详细结构分析。
修饰的snoRNA的击倒能力可能由加工的snoRNA产生,或者备选地可能不依赖于snoRNA加工而直接由C19orf48前mRNA形成(图5C)。后一种可能性由最近的不依赖于Drosha加工的内含子-编码的微RNAs的报道所提议。为了区分这些可能性,将一系列三碱基突变引入到HBII-180C小基因的8个独立区域中,且在野生型和突变形式的HB II-180C之间比较全长snoRNA的表达(图13A)。WT HBII-180C小基因载体的表达升高全长HB II-180C snoRNA的水平高于内源水平,但是空载体没有升高全长HB II-180C snoRNA的水平(图13A,比较泳道1与泳道2&3)。包括在保守的C或D盒的任一个内的序列改变的多个突变,减少或者消除外源性全长HBII-180C snoRNA的表达,仅有内源性snoRNA水平存在(图13A,泳道4-11)。在HB II-180C表达水平减少的每种情形中,存在修饰的snoRNA嵌合体-2的击倒能力水平的相应减少(图13A,比较泳道3与泳道4和10,和图13B m1和m7,图13F)。这表明修饰的snoRNA的击倒能力取决于在前的snoRNA加工,且证明对于直接来自C19orf48前mRNA转录体的击倒能力不可能存在不依赖snoRNA的途径。HBII-180C中的m2突变,其破坏在snoRNA指导序列中针对28S rRNA的互补性,不阻止snoRNA形成和修饰的snoRNA的击倒效率(图13A,泳道5,图13C和F m2-1,m2-2)。因此,修饰snoRNA击倒靶基因表达的能力不依赖于snoRNA结合rRNA和使rRNA甲基化的能力。HBII-180C中的m3突变,其破坏盒D′,略微减少防止snoRNA形成和击倒效率(图13A,C,F)。这表明我们可能通过突变在M盒外部的区域而改变修饰的snoRNA的击倒能力。
建立在修饰的snoRNA嵌合体-2中的M盒序列的插入和缺失突变体,以检测击倒能力和M盒序列长度之间的相关性(图13D & F)。所有三种提高与G/YFP mRNA的序列互补性的插入突变体表现出与野生型嵌合体-2质粒相似的击倒活性(图13D&F In1-3)。显著地,具有针对G/YFPmRNA的另外的8碱基互补序列的插入突变体CM2In-3表现出提高的击倒效率(图13F)。M盒中2和3个碱基的缺失突变体(CM2Del-1 &-2)也表现出击倒能力,但是其不如野生型嵌合体-2有效(图13F)。与野生型嵌合体-2相比较,7碱基缺失突变体CM2Del-3不表现出显著的击倒活性(图13F)。还建立M盒中的6点突变体,来检测击倒能力和M盒中碱基对错配之间的相关性(图13E&F)。M盒中的1-3碱基错配突变体(CM2X-1至-3)也表现出击倒能力,但是其不如野生型嵌合体-2有效(图13F)。与野生型嵌合体-2相比较,M盒中的4-6碱基错配突变体(CM2X-4至-6)不表现出有效的击倒活性(图13F)。这些结果表明修饰的snoRNA调节基因击倒的能力与M盒互补性和靶mRNA序列之间的杂交亲和性相关。
结合预计不影响修饰的snoRNA击倒能力的m2(28S rRNA互补区),m4和m5的每个突变体的组合snoRNA(图13A&C,图14A)表现出与野生型三联嵌合体质粒相似的击倒能力,这通过荧光显微镜判断(图14B)。使用嵌合体-1,-2,-3特异性探针的FISH分析表现出该组合突变体质粒(三联嵌合体snoMENv1)如也用野生型三联嵌合体质粒观察到的那样表达每一个所编码的嵌合体修饰的snoRNAs(图12A&14A)。这些突变体分析表明所修饰的snoRNAs的击倒能力可以通过位于与snoRNA结合靶RNA相关的序列外部的突变和位于snoRNA与靶序列之间结合所需要的互补序列(即,M盒)内部的突变进行调节。
修饰的snoRNA载体可以通过蛋白置换而挽救致死性基因表达击倒作用。
由三联嵌合体snoMENv1建立两种靶向内源性SMN1(运动神经元存活)前mRNA的修饰的snoRNA质粒(图15A)。质粒SMN1 snoMENv1编码GFP cDNA和3个分别靶向内源性SMN1前mRNA内不同位置的修饰的snoRNAs(图15A)。另一种质粒GFP-SMN1 snoMENv1-PR编码GFP-SMN1融合蛋白cDNA和3个相同的具有分别靶向内源性SMN1前mRNA内部不同位置的SMN1 snoMENv1的修饰的snoRNAs(图15A)。瞬时转染分析表明单独的GFP和mCherry三联嵌合体质粒对HeLa细胞没有有害作用。然而,SMN1 snoMENv1质粒在转染至细胞内时表现出细胞毒性作用(图15B,箭头)。蛋白质印迹分析表明内源性SMN1水平通过转染SMN1 snoMENv1被抑制(图15C)。预测这一结果是因为已知SMN1敲除小鼠的表型是胚胎致死性的(Hsieh等人,Nature Genetics(自然遗传学)2000)。另一方面,瞬时转染GFP-SMN1 snoMENv1-PR质粒表现出如在HeLaGFP-SMN1稳定细胞系中观察到的正确的定位模式(图10),且重要地,不表现出如使用SMN1 snoMENv1所观察到的细胞毒性作用(图15B)。这些结果表明,内源性SMN1被靶向SMN1前mRNA的修饰的snoRNAs抑制,且其细胞毒性作用通过表达GFP-SMN1融合蛋白得到挽救。当由病毒载体系统表达时的修饰的snoRNA功能。
将三联嵌合体修饰的snoRNA(lenti-三联嵌合体)和野生型三联HBII-180C snoRNA(lenti-三联HBII-180C)分别亚克隆至lenti-X病毒载体(Clontech)中。lenti-三联嵌合体表现出与使用相对应的质粒载体三联嵌合体观察到的相同的击倒作用(比较图11B和图16)。这一结果表明,修饰的snoRNA击倒靶向的基因的能力不依赖于单一转染系统,且可以使用质粒和病毒载体系统递送。
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序列表
<110>敦提大学校董事会
安格斯·莱蒙德I
小野基晴I
<120>基因表达的靶向调节
<130>PC/P15434PC
<160>46
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>1
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugaucacc ccugaggaca cagugcaccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>2
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>2
cuggggcucc caugaaaacc agcacugggc ucugaucacc ccugaggaca cagugcaccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>3
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>3
cuggggcucc caugaugucc agcaaaaggc ucugaucacc ccugaggaca cagugcaccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>4
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>4
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc uaaaaucacc ccugaggaca cagugcaccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>5
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>5
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugaucacc ccugaggaca cagugcaaaa 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>6
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>6
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugaucacc ccugaggaca cagugcaccc 60
caggaaaauu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>7
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>7
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugaucacc ccugaggaca cagugcaccc 60
caggaccuuu gacaccuaaa ggucugaggg gccccag 97
<210>8
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>8
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugaucacc ccugaggaca cagugcaccc 60
caggaccuuu gacaccuggg gguaaaaggg gccccag 97
<210>9
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>9
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugaucacc ccugaggaca cagugcaccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugagaa accccag 97
<210>10
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>10
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugauaccu ugaugccguu cuucugcccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>11
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>11
cuggggcucc caugaaaacc agcacugggc ucugauaccu ugaugccguu cuucugcccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>12
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>12
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugauaccu ugaugccguu cuucugcccc 60
caggaccuuu gacaccuggg gguaaaaggg gccccag 97
<210>13
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>13
cuggggcucc caugaugucc agcaaaaggc ucugauaccu ugaugccguu cuucugcccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>14
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>14
cuggggcucc caugaugucc uuuuaaauuu ucugauaccu ugaugccguu cuucugcccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>15
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>15
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc uaaaauaccu ugaugccguu cuucugcccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>16
<211>99
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>16
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugauucac cuugaugccg uucuucugcc 60
cccaggaccu uugacaccug ggggucugag gggccccag 99
<210>17
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>17
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugauucac cuugaugccg uucuucuguu 60
cccccaggac cuuugacacc ugggggucug aggggcccca g 101
<210>18
<211>105
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>18
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugauguuc accuugaugc cguucuucug 60
uugtccccca ggaccuuuga caccuggggg ucugaggggc cccag 105
<210>19
<211>95
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>19
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugaucuug augccguucu ucugccccca 60
ggaccuuuga caccuggggg ucugaggggc cccag 95
<210>20
<211>94
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>20
cugggccucc caugaugucc agcacugggc ucugaucuug augccguucu ucucccccag 60
gaccuuugac accugggggu cugaggggcc ccag 94
<210>21
<211>90
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>21
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugauugau gccguucuuc ccccaggacc 60
uuugacaccu gggggucuga ggggccccag 90
<210>22
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>22
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugauaccu ugauaccguu cuucugcccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>23
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>23
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugauaccu ugauacaguu cuucugcccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>24
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>24
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugauaccu ugauacaguu auucugcccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>25
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>25
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugauaccu uaauacaguu auucugcccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>26
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>26
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugauaccu uaauacaguu auuaugcccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>27
<211>97
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>27
cuggggcucc caugaugucc agcacugggc ucugauacau uaauacaguu auuaugcccc 60
caggaccuuu gacaccuggg ggucugaggg gccccag 97
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>28
caccccagag gacacagtgc a 21
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>29
gacttgaaga agtcgtgctg c 21
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>30
accttgatgc cgttcttctg c 21
<210>31
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>31
cactcagacc gcgttctctc cctctcactc cccaatacgg 40
<210>32
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>32
aaaggtcctg gggtgcactg tgtcctcagg ggtgatcaga 40
<210>33
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>探针
<400>33
acgacggtat gagttctcac tcattttgtt cagcttttcc 40
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>34
agaggtagcg ttttctcctg agcg 24
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>35
accactcaga ccgcgttctc 20
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>36
ctcccatgat gtccagcact 20
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>37
ctcagacccc caggtgtcaa 20
<210>38
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>38
gatcgatgat gagtccccca taaaaac 27
<210>39
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>39
gacctcagtt ctgatgagaa cgacgg 26
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>40
tggacgtgct ggagcgctcc ccgc 24
<210>41
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>41
cccagggtca gccgggcccg agacag 26
<210>42
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>42
cgcatcttct tttgcgtcgc cag 23
<210>43
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>43
ggtcaatgaa ggggtcattg atggc 25
<210>44
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>44
gacttgaaga agtcgtgctg c 21
<210>45
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>45
accttgatgc cgttcttctg c 21
<210>46
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>质粒序列
<400>46
cacccctgag gacacagtgc a 21
Claims (33)
1.调节靶核酸表达的方法,所述方法包括在使snoRNA或修饰的snoRNA和/或其片段能够与所述靶核酸的一部分杂交的条件下,使所述核酸与snoRNA或修饰的snoRNA相接触;并且其中所述snoRNA或其片段与所述核酸部分的杂交调节所述靶核酸的表达和/或功能。
2.用于调节靶核酸的表达的修饰的snoRNA序列,所述修饰的snoRNA序列包括基本与所述靶序列的一部分互补的核酸序列,所述核酸序列用于与所述靶核酸的部分杂交且调节所述靶核酸的表达。
3.根据权利要求1或2所述的方法或修饰的snoRNA序列,其中所述靶核酸序列是RNA序列。
4.根据前述权利要求任一项所述的方法或修饰的snoRNA序列,其中所述snoRNA分子基于细胞snoRNAs,包括所谓的盒C/D-snoRNA或盒H/ACA-snoRNA。
5.根据权利要求3所述的方法或修饰的snoRNA,其中所述盒C/DsnoRNAs包括L.collosoma b2(GenBank登记号AF331656),L.collosoma B3(GenBank登记号AY046598),L.collosoma B4(GenBank登记号AY046598),L.collosoma B5(GenBank登记号AY046598),L.collosomaTS1(GenBank登记号AF331656),L.collosoma TS2(GenBank登记号AF331656),L.collosoma g2(GenBank登记号AF331656),L.collosomasnoRNA-2(GenBank登记号AF050095),T.brucei snoRNA 92(GenBank登记号Z50171,L.tarentolae snoRNA 92(GenBank登记号AF016399),T.brucei TBC4 snoRNA(SEQ ID NO:35),T.brucei sno 270(GenBank登记号Z50171)和人U14snoRNA(GenBank登记号NR_000022)。
6.根据前述权利要求任一项所述的方法或修饰的snoRNA,其包括通常存在于所述盒C/D snoRNAs中的一种或多种D/D′盒核酸序列。
7.根据权利要求5所述的方法或修饰的snoRNA,其中所述至少一种或多种D和/或D′盒包含选自下列各项的序列,例如,5′-CUGA-3′,5′-AUGA-3′,5′-CCGA-3′,5′-CAGA-3′,5′-CUUA-3′,5′-UUGG-3′和5′-CAGC-3′。
8.根据前述权利要求任一项所述的方法或修饰的snoRNA,其中所述修饰的snoRNA分子还包括盒C序列和/或任选地与28S rRNA互补的另一个区域或与snoRNA修饰的其它生理学靶标互补的另一个区域。
9.根据权利要求4所述的方法或修饰的snoRNA,其中编码所述snoRNA的序列包括提供按照建立的snoRNA加工途径由内含子进行加工所必需的结构元件。
10.根据权利要求7所述的方法或修饰的snoRNA,其中所述盒C序列长度为5-9个核苷酸。
11.根据前述权利要求任一项所述的方法或修饰的snoRNA,其中所述基本与靶RNA序列的部分互补的序列基本上与内含子或外显子序列互补,或与内含子-外显子连接序列互补,或与在所述靶核酸5′或3′非翻译区内部的区域或在所述靶核酸5′或3′非翻译区连接处的区域互补。
12.根据前述权利要求任一项所述的方法或修饰的snoRNA,其中基本上与所述靶RNA序列的部分互补的所述核酸序列长度典型地为15-45个核苷酸。
13.根据权利要求3所述的方法或修饰的snoRNA,其中所述靶RNA序列是mRNA,tRNA,miRNA或rRNA序列或RNA病毒基因组序列或来源于其的转录体。
14.根据前述权利要求任一项所述的方法或修饰的snoRNA,其中所述修饰的snoRNA分子包括多于一种设计为与靶核酸分子杂交的序列。
15.根据权利要求13所述的方法或修饰的snoRNA,其中所述多于一种设计为与靶核酸分子杂交的序列可以靶向同一靶核酸分子的不同部分、或靶向不同的靶核酸分子。
16.核酸构建体,其包括质粒和病毒载体,其能够表达权利要求2-15中任一项所述的至少一种修饰的snoRNA分子。
17.根据权利要求16所述的核酸构建体,其包括与内含子核酸区域侧连的至少两个外显子核酸区域,所述内含子核酸区域能够编码所述修饰的snoRNA。
18.根据权利要求16或17所述的核酸构建体,其中所述核酸构建体包括与两个或多个内含子序列侧连的多个外显子序列,所述内含子序列包括能够编码一种以上snoRNAs的序列。
19.根据权利要求18所述的核酸构建体,其中所述构建体作为单一构建体形成,其当在靶细胞内转录时,引起与所述外显子序列对应的且剪除所述内含子序列的mRNA的产生,且随后产生所述修饰的snoRNA(s)。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的核酸构建体,其中多于一种内含子序列被用来产生多于一个snoRNA序列,每个snoRNA设计为靶向相同或不同的靶RNA分子。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的核酸构建体,其还包括促进对其中已经转化或转染了所述核酸构建体的细胞的鉴定的选择标记基因。
22.根据权利要求16-21中任一项所述的核酸构建体,其包括至少一个启动子,如组成型或可控型启动子。
23.根据权利要求16-22中任一项所述的核酸构建体,其还包括位点特异性重组位点,其设计为促进位点特异性整合到宿主细胞基因组中。
24.用权利要求15-23中任一项所述的核酸构建体转化或转染的宿主细胞。
25.根据权利要求24所述的宿主细胞,其中所述细胞选自真核细胞,特别是哺乳动物细胞(例如,HeLa细胞,Cos细胞),酵母细胞,(例如,AH109,HHY10,KDY80)和昆虫细胞(例如,Sf9),锥虫细胞(例如,L.collosoma,L.major,T.brucei 29-13),细菌细胞(例如,JM109,RP437,MM509,SW10)或植物细胞。
26.用于产生修饰的snoRNA分子的核酸载体构建体,所述构建体在5′至3′方向包括:
i)用于控制转录的启动子序列;
ii)第一外显子序列;
iii)第一内含子剪接序列;
iv)克隆位点或序列,其用于促进编码权利要求2-15中任一项所述的修饰的snoRNA的核酸序列的克隆;
v)第二内含子剪接序列;和
vi)第二外显子序列。
27.根据权利要求26所述的核酸载体构建体,其在5′至3′方向还包括:
vii)第三或其它内含子剪接序列;
vii)第二或其它克隆位点或序列,其用于促进编码权利要求2-15中任一项所述的修饰的snoRNA的核酸序列的克隆;
viii)第四或其它内含子剪接序列;和
ix)第三或其它外显子序列。
28.根据权利要求26或27所述的核酸载体构建体,其还包括编码蛋白、RNA、标记的蛋白、突变蛋白等的可表达的编码序列,以功能性置换所述靶RNA、或要被所述一种或多种snoRNAs调节的蛋白。
29.根据权利要求28所述的核酸载体构建体,其中所述snoRNA核酸和所述编码蛋白、RNA、标记的蛋白、突变蛋白等的可表达的编码序列受到相同启动子的控制,且作为单一转录体表达,其中编码蛋白、RNA、标记的蛋白、突变蛋白等的所述可表达的编码序列功能性置换所述靶RNA、或要被所述一种或多种snoRNAs调节的蛋白。
30.snoRNA,修饰的snoRNA,编码snoRNA或修饰的snoRNA的核酸构建体,或能够表达snoRNA或修饰的snoRNA的细胞,其用于治疗受试者中的疾病或病症,在所述受试者中,需要调节特别是下调靶核酸的表达。
31.药物组合物,其包括snoRNA,修饰的snoRNA,编码snoRNA或修饰的snoRNA的核酸构建体,或能够表达snoRNA或修饰的snoRNA修饰的snoRNA的细胞,和用于其的药用载体。
32.根据权利要求30或31所述的产品或组合物,其包括权利要求2-29中任一项所述的修饰的snoRNA,编码snoRNA或修饰的snoRNA的核酸构建体,或能够表达snoRNA或修饰的snoRNA修饰的snoRNA的细胞。
33.根据权利要求28或29所述的载体的应用,其用于评估突变体表型,或辅助药物筛选策略,或用于靶标验证,或在不与已有的未标记的细胞形式竞争的条件下分析蛋白的标记形式,或用于其它实施的应用或研究应用。
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