CN101852707B - 一种以聚苯乙烯球为模板的石英晶体微天平信号扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以聚苯乙烯球为模板的石英晶体微天平信号扩增方法,包括如下步骤:(1)纳米金颗粒溶液的制备;(2)纳米金颗粒复合聚苯乙烯球溶液的制备;(3)纳米金颗粒复合聚苯乙烯球修饰的石英晶体微天平提高探针DNA吸附量和靶标DNA检测限。本发明的以聚苯乙烯球为模板的石英晶体微天平信号扩增方法能够增强石英晶体微天平表面不平整度和表面曲率,用于探针DNA的吸附以及对靶标DNA的检测,以聚苯乙烯球为模板利用表面活性剂的不同的静电作用制备的不同表面曲率的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球,从而实现表面曲率和活性位点的可控可调。
Description
技术领域
本发明涉及一种石英晶体微天平信号扩增方法,特别是一种以聚苯乙烯球为模板的石英晶体微天平信号扩增方法。
背景技术
石英晶体微天平是一种基于物质的质量导致电信号的变化而检测微量物质的传感器,具有检测灵敏度高、选择性易调变、成本低,特别是无须样品标记的适时检测等优点。最近几十年,石英晶体微天平-基于压电特性由于其高灵敏度、低花费、易使用和适时检测等特性在DNA的可逆杂交分析中的应用日益受到重视,尤其是微流技术和石英晶体微天平的联用为DNA检测提供了一个全新的检测平台。对于通用的检测技术来说,探针DNA和靶标DNA的杂交量至关重要,直接保证了仪器检测的精确度和敏感性。为了获得对低浓度的痕量物质的检测,研究人员探索了许多方法来提高检出限。前人通过实验证实低的表面覆盖率和高的探针-靶标比率可以导致最优化的杂交效果,提高探针的固定量和控制探针DNA的方向能提高DNA传感器的检出限。
在提高石英晶体微天平对痕量物质的检出限的探索过程中,研究人员通常认为两种因素能有效的提高压电DNA传感器的灵敏度。一种就是表面增强技术,其涉及电极表面的有效面积的提高或者通过一种较好的固定方法为DNA的吸附提供更多的活性位点;另外一种就是质量扩增技术,通过分析靶标物质与扩增质量物质的相互化学联接从而实现石英晶体微天平表面的更大的质量变化实现其更大的检测信号。探针DNA的固定不仅制备了功能化的敏感膜也决定了敏感度,一种最常用的方法就是通过化学键的形式以一种媒介层的形式组装到电极表面,如自组装单层、LB膜技术、聚合物覆盖,电镀高聚物和等离子聚合膜等。直接吸附探针到电极表面或媒介层已经被采用,包括特异性的含巯基的探针吸附、层-层组装的聚电解质膜和自组装纳米层。不同固定方法通过提高电极的表面积而提高了敏感度。但是,有非议的是这些方法导致固定的探针是杂乱无序的,暗示着大量探针不能被用于靶标物的检测。保持探针的有序固定可以通过在探针上接上刚性功能基团或者蛋白质A这类具有高的亲和性和选择性。另外一种增敏策略就是质量增强,就是在通过化学方法在检测靶标物上绑定标记物,标记物具有比检测靶标物大得多的质量,这就是所谓的“Sandwich”检测模式,其中一种就是利用抗体作为质量标记物,明显的质量信号在这种“Sandwich”检测方式中得到大大的增强,最近抗原-抗体的石英晶体微天平免疫质量检测也用这种质量增强的方式来检测。
对于最大化的修饰生物探针,许多研究组采用了金纳米颗粒来增强探针的固定量从而实现更多靶标的吸附,而对于纳米金颗粒提高探针吸附量来讲,除了纳米金颗粒提高了电极的表面积,探针的吸附还与电极的表面曲率有很大的关系,因此,进一步增强表面积和寻找最佳表面曲率而增强探针吸附量应受到关注。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:提供一种利用聚苯乙烯球为模板来增强石英晶体微天平对于生物分子的结合位点,从而实现石英晶体微天平对更低浓度生物分子检测的方法。
本发明是通过如下技术方案实现的:一种以聚苯乙烯球为模板的石英晶体微天平信号扩增方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)纳米金颗粒溶液的制备:配制2wt%的HAuCl4水溶液和2wt%的柠檬酸三钠水溶液备用,取0.15mL的HAuCl4水溶液,添加到30mL水中,然后将溶液加热至回流,在搅拌下加入0.08-0.45mL柠檬酸三钠水溶液,继续加热20min;
(2)纳米金颗粒复合聚苯乙烯球溶液的制备:(a2)将3毫摩表面活性剂溶解到1L浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液中,然后通过针头将溶液从孔径为0.2-0.8μm的尼龙膜中滤除,得到表面活性剂的PBS缓冲溶液;(b2)按照体积比1∶20将浓度为3.8wt%的聚苯乙烯球溶液加入到步骤(a2)中表面活性剂的PBS缓冲溶液中,聚苯乙烯球溶液中聚苯乙烯球的粒径为250-270nm,搅拌;(c2)将步骤(b2)中的溶液离心分层,去除上层溶液,未吸附到聚苯乙烯球表面的表面活性剂则去除,吸附有表面活性剂的聚苯乙烯球则沉淀,重复清洗离心以保证表面活性剂去除完全;(d2)将步骤(c2)中的沉淀重新分散在水中形成吸附好表面活性剂的聚苯乙烯球溶液,并取步骤(1)中制备的纳米金颗粒溶液加入到吸附好表面活性剂的聚苯乙烯球溶液中,搅拌;(e2)将步骤(d2)中的溶液离心分层,去除上层溶液,得到红色沉淀物即为纳米金颗粒复合聚苯乙烯球,重复清洗离心以保证纳米金颗粒去除完全;(f2)将步骤(e2)中获得的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球重新溶解到水中,加入浓度为0.375毫摩每升的氢氧化金溶液后搅拌均匀,离心去除上层溶液得到黑色沉淀,最后将黑色沉淀物重新溶解到水中得到纳米金颗粒复合聚苯乙烯球溶液;
(3)纳米金颗粒复合聚苯乙烯球修饰的石英晶体微天平提高探针DNA吸附量和靶标DNA检测限:(a3)首先将石英晶体微天平用piranha溶液清洗去除有机物和表面的杂质,所述piranha溶液是用质量浓度为98%的H2SO4与质量浓度为30%的H2O2按照体积比为3∶1混合制成,然后用去离子水清洗石英晶体微天平,N2吹干;(b3)将步骤(a3)中清洗好的石英晶体微天平浸泡于0.5mL1,6-己硫醇溶液,1,6-己硫醇溶液用体积比为1∶200的HS(CH2)6SH和乙醇配制而成,1,6-己硫醇通过Au-S化学键固定在石英晶体微天平表面,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水清洗去未吸附的1,6-己硫醇,N2吹干;(c3)将步骤(b3)石英晶体微天平浸入纳米金颗粒复合聚苯乙烯球颗粒溶液,纳米金颗粒复合聚苯乙烯球与己硫醇通过Au-S化学键固定到石英晶体微天平表面,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水清洗洗掉多余的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球颗粒,N2吹干;(d3)将步骤(c3)中修饰有纳米金颗粒复合聚苯乙烯球颗粒的石英晶体微天平暴露于探针DNA溶液中,探针DNA通过化学键力固定到纳米金颗粒复合聚苯乙烯球表面,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水清洗未修饰到石英晶体微天平表面的探针DNA,N2吹干;(e3)将步骤(d3)中获得的修饰有探针DNA的石英晶体微天平暴露于靶标DNA溶液中,靶标DNA通过与探针DNA的杂交固定于石英晶体微天平敏感膜上,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水清洗未杂交的靶标DNA,N2吹干。
上述以聚苯乙烯球为模板的石英晶体微天平信号扩增方法,其特征在于,包括如下步骤:
(11)纳米金颗粒溶液的制备:配制2wt%的HAuCl4水溶液和2wt%的柠檬酸三钠水溶液备用,取0.15mL的HAuCl4水溶液,添加到30mL水中,然后将溶液加热至回流,在搅拌下加入0.08-0.45mL柠檬酸三钠水溶液,继续加热20min;
(21)纳米金颗粒复合聚苯乙烯球溶液的制备:(a21)将3毫摩表面活性剂溶解到1L浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液中,然后通过针头将溶液从孔径为0.2-0.8μm的尼龙膜中滤除,得到表面活性剂的PBS缓冲溶液;(b21)按照体积比1∶20将100μL浓度为3.8wt%的聚苯乙烯球溶液加入到步骤(a21)中表面活性剂的PBS缓冲溶液中,聚苯乙烯球溶液中聚苯乙烯球的粒径为250-270nm,搅拌;(c21)将步骤(b21)中的溶液离心分层,去除上层溶液,未吸附到聚苯乙烯球表面的表面活性剂则去除,吸附有表面活性剂的聚苯乙烯球则沉淀,重复清洗离心以保证表面活性剂去除完全;(d21)将步骤(c21)中的沉淀重新分散在2mL水中形成吸附好表面活性剂的聚苯乙烯球溶液,并取1mL-5mL步骤(11)中制备的纳米金颗粒溶液加入到吸附好表面活性剂的聚苯乙烯球溶液中,搅拌;(e21)将步骤(d21)中的溶液离心分层,去除上层溶液,得到红色沉淀物即为纳米金颗粒复合聚苯乙烯球,重复清洗离心以保证纳米金颗粒去除完全;(f21)将步骤(e21)中获得的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球重新溶解到水中,加入10μL-1mL、浓度为0.375毫摩每升的氢氧化金溶液后搅拌均匀,离心去除上层溶液得到黑色沉淀,最后将黑色沉淀物重新溶解到2mL水中得到纳米金颗粒复合聚苯乙烯球溶液;
(31)纳米金颗粒复合聚苯乙烯球修饰的石英晶体微天平提高探针DNA吸附量和靶标DNA检测限:(a31)首先将石英晶体微天平用piranha溶液清洗去除有机物和表面的杂质,然后用去离子水清洗石英晶体微天平,N2吹干;(b31)将步骤(a31)中清洗好的石英晶体微天平浸泡于0.5mL1,6-己硫醇溶液,1,6-己硫醇溶液用体积比为1∶200的HS(CH2)6SH和乙醇配制而成,1,6-己硫醇通过Au-S化学键固定在石英晶体微天平表面,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水清洗去未吸附的1,6-己硫醇,N2吹干;(c31)将步骤(b31)石英晶体微天平浸入纳米金颗粒复合聚苯乙烯球颗粒溶液,纳米金颗粒复合聚苯乙烯球与己硫醇通过Au-S化学键固定到石英晶体微天平表面,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水清洗洗掉多余的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球颗粒,N2吹干;(d31)将步骤(c31)中修饰有纳米金颗粒复合聚苯乙烯球颗粒的石英晶体微天平暴露于探针DNA溶液中,探针DNA通过化学键力固定到纳米金颗粒复合聚苯乙烯球表面,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水清洗未修饰到石英晶体微天平表面的探针DNA,N2吹干;(e31)将步骤(d31)中获得的修饰有探针DNA的石英晶体微天平暴露于靶标DNA溶液中,靶标DNA通过与探针DNA的杂交固定于石英晶体微天平敏感膜上,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水清洗未杂交的靶标DNA,N2吹干。
所述表面活性剂为:bis(amidoethyl-carbamoylethyl)octadecylamine,其制备方法参考文献:Wang W,Lu W and Jiang L2008The Journal of Physical Chemistry B112 1409。
本发明的以聚苯乙烯球为模板的石英晶体微天平信号扩增方法具有以下有益的技术效果:纳米金颗粒通过表面活性剂作为交联剂覆盖到聚苯乙烯球表面后形成具有特定生物分子最佳吸附曲率的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球修饰到石英晶体微天平表面上,实现对最大化吸附探针DNA,从而实现痕量靶标DNA检测。
本发明采用聚苯乙烯球作为模板,可控修饰不同粒径的纳米金颗粒,用于进行石英晶体微天平表面不平整度的调控;并可以实现纳米金颗粒复合聚苯乙烯球的表面曲率的自由调控以及在石英晶体微天平表面修饰上更多的纳米金颗粒,在对探针DNA的吸附过程中,大量纳米金颗粒扩增表面和可控曲率对于探针DNA吸附的促进作用,可容易地实现大量探针DNA的吸附,且在对靶标DNA的检测过程中,由探针DNA良好的空间排列和由于表面曲率所导致的发射状的探针吸附,实现对更低浓度靶标DNA的检测,从而为新型传感器的设计和开发提供了一个很好的思路和平台。
本发明的方法增强石英晶体微天平表面不平整度和表面曲率,用于探针DNA的吸附以及对靶标DNA的检测,以聚苯乙烯球为模板利用表面活性剂的不同的静电作用制备的不同表面曲率的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球,从而实现表面曲率和活性位点的可控可调。
在石英晶体微天平传感器上放置探针DNA作为识别物,将靶标DNA同探针DNA进行杂交反应,根据不同浓度靶标DNA加入不同物质的量所引起的重量变化,定量地判断靶标DNA的最低检出限。
纳米金颗粒的粒径可控,通过不同粒径的纳米金颗粒的吸附精确的调控纳米金颗粒复合聚苯乙烯球的表面曲率,从而实现探针DNA的最佳吸附。不同粒径的纳米金所引起的探针DNA有着不同的空间朝向,从而实现对靶标DNA的检出限的降低。
在本发明的以聚苯乙烯球为模板的石英晶体微天平信号扩增方法中,不同粒径的金纳米颗粒的粒径可以通过控制柠檬酸三钠的体积用量来获得;囊泡的均一度和大小可通过选择不同孔径的尼龙膜实现;金生长液用于封闭吸附到聚苯乙烯球上的纳米金颗粒之间的空白,从而提供更多的生物分子吸附活性位点。
附图说明
图1.12nm纳米金颗粒的TEM图;
图2.聚苯乙烯球的TEM图;
图3.纳米金颗粒交联到聚苯乙烯球后的TEM图;
图4.纳米金颗粒复合聚苯乙烯球修饰石英晶体微天平表面后的SEM图;
图5.利用石英晶体微天平检测DNA步骤示意图;
图6.不同表面修饰的石英晶体微天平对探针DNA的吸附图;
图7.不同表面修饰后探针DNA后对靶标DNA的检测图;
图8.不同表面曲率的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球对探针DNA的吸附时间图;
图9.不同表面曲率的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球对靶标DNA的检测图。
其中:图5:step1:表面吸附有HS-(CH2)6-SH的石英晶体微天平用于纳米金颗粒复合聚苯乙烯球的固定;step2:固定好纳米金颗粒复合聚苯乙烯球的石英晶体微天平用于探针DNA的吸附;step3:修饰有探针分子的石英晶体微天平用于靶标DNA的检测;
图6:▲纳米金颗粒复合聚苯乙烯球修饰的石英晶体微天平对探针DNA的吸附;●纳米金颗粒修饰的石英晶体微天平对探针DNA的吸附;■平坦的石英晶体微天平对探针DNA的吸附;
图8:■修饰纳米金颗粒复合聚苯乙烯球、金颗粒的粒径为12nm的石英晶体微天平对于探针oligo-1的吸附量;●修饰纳米金颗粒复合聚苯乙烯球、金颗粒的粒径为24nm的石英晶体微天平对于探针oligo-1的吸附量。
实施方式
实施例一:配制2wt%的HAuCl4水溶液和2wt%的柠檬酸三钠水溶液。取0.15mL的HAuCl4溶液,添加到30mL水中;将得到的溶液加热至回流,在搅拌下迅速将0.45mL的柠檬酸三钠水溶液加入到此溶液中,继续加热20min;所得溶液呈亮红色,通过TEM进行金颗粒粒径确认约为12nm(如图1所示)。
将3毫摩表面活性剂溶解到1L浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液中,然后通过针头将溶液从孔径250nm的尼龙膜中滤除,得到表面活性剂的PBS缓冲溶液;按照体积比1∶20将100μL聚苯乙烯球(聚苯乙烯球的浓度为3.8wt%,聚苯乙烯球的粒径为260nm)(如图2所示)的溶液加入到表面活性剂的PBS缓冲溶液中,然后搅拌2小时,表面活性剂可通过静电作用在聚苯乙烯球表面形成双层;离心去除未吸附到聚苯乙烯球表面的表面活性剂,得到乳白色的沉淀(清洗重复5次),将得到的乳白色的沉淀溶解到2mL水中得到吸附好表面活性剂的聚苯乙烯球溶液;将5mL上述制备的纳米金颗粒溶液加入到吸附好表面活性剂的聚苯乙烯球溶液中,充分搅拌40min后静止2小时;离心去除多余的纳米金颗粒得到红色沉淀物即为纳米金颗粒复合聚苯乙烯球,然后把红色沉淀重新溶解到2mL水中,并加入10μL、浓度为0.375毫摩每升的氢氧化金溶液后搅拌;离心去除上层溶液得到黑色沉淀,最后重新将黑色沉淀溶解到2mL水中得到纳米金颗粒复合聚苯乙烯球溶液(如图3所示)。
将石英晶体微天平芯片用piranha溶液清洗去除有机物和表面的杂质,然后用去离子水清洗石英晶体微天平,N2吹干,这个过程重复两次;清洗好的石英晶体微天平浸泡于0.5mL1,6-己硫醇溶液中30min,1,6-己硫醇溶液用体积比为1∶200的HS(CH2)6SH和乙醇配制而成,1,6-己硫醇通过Au-S化学键固定在石英晶体微天平表面,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水洗去未吸附1,6-己硫醇,N2吹干;将石英晶体微天平浸入纳米金颗粒复合聚苯乙烯球溶液中1小时,将纳米金颗粒复合聚苯乙烯球修饰到石英晶体微天平表面(如图4所示),用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水冲洗掉多余的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球颗粒,N2吹干;室温下将浓度为1×10-6mol/L探针DNA溶液(10mM PBS,0.1M NaCl,pH7.4)滴到石英晶体微天平表面,不同的时间用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液清洗未修饰到石英晶体微天平表面的探针DNA两次,后用去离子水清洗,N2吹干,其修饰步骤如图5所示。与之相对于的,未修饰的石英晶体微天平用于探针DNA的直接固定以及修饰有与固定到聚苯乙烯球表面粒径相同的纳米金颗粒的石英晶体微天平,其对于探针DNA吸附量的比较图形见图6。
将本实施例中固定好探针DNA的石英晶体微天平用于靶标DNA的检测。将不同浓度的靶标DNA溶液(使用浓度为10毫摩每升、pH为7.4、NaCl浓度为0.1摩每升的PBS缓冲溶液配制)滴到石英晶体微天平表面,在40℃下保持3h,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水清洗掉多余的靶标DNA,N2吹干,其中靶标DNA的浓度分别为10-6摩每升,10-7摩每升,10-8摩每升,10-9摩每升,10-11摩每升和10-13摩每升,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水清洗掉未杂交上的靶标DNA,N2吹干,其检测步骤如图5所示,其对于不同浓度靶标DNA检测量见图7。
实施例二:
采用和实施例二相同的制备纳米金颗粒溶液的步骤,不同的是加入的柠檬酸三钠的体积为0.375mL,所制得的纳米金颗粒的粒径约为24nm。其制备纳米金颗粒复合聚苯乙烯球的步骤和对探针DNA的吸附过程类似于实施例一,其对靶标DNA的检测步骤类似于实施例一。修饰纳米金颗粒复合聚苯乙烯球、金颗粒的粒径为24nm的石英晶体微天平对于探针DNA的吸附量和修饰纳米金颗粒复合聚苯乙烯球、金颗粒的粒径为12nm的石英晶体微天平对于探针DNA的吸附量的比较见图8;修饰纳米金颗粒复合聚苯乙烯球、金颗粒的粒径为24nm的石英晶体微天平修饰探针DNA后对靶标DNA的检测,以及修饰纳米金颗粒复合聚苯乙烯球、金颗粒的粒径为12nm的石英晶体微天平修饰探针DNA后对靶标DNA的检测见图9。
实施例一和实施例二中所用的探针DNA和靶标DNA系列如下:
探针DNA:9-mer,oligo-1∶5’-CAG GTT CAT-(CH2)6-SH-3’;
靶标DNA:17-mer,oligo-2∶5’-ATG AAC CTG AGG CCCAT-3’。
本实施例的以聚苯乙烯球为模板的石英晶体微天平信号扩增方法具有以下有益的技术效果:
纳米金颗粒通过表面活性剂作为交联剂覆盖到聚苯乙烯球表面后形成具有特定生物分子最佳吸附曲率的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球修饰到石英晶体微天平表面上,实现对最大化吸附探针DNA,从而实现痕量靶标DNA检测。
本实施例采用聚苯乙烯球作为模板,可控修饰不同粒径的纳米金颗粒,用于进行石英晶体微天平表面不平整度的调控;并可以实现纳米金颗粒复合聚苯乙烯球的表面曲率的自由调控以及在石英晶体微天平表面修饰上更多的纳米金颗粒,在对探针DNA的吸附过程中,大量纳米金颗粒扩增表面和可控曲率对于探针DNA吸附的促进作用,可容易地实现大量探针DNA的吸附,且在对靶标DNA的检测过程中,由探针DNA良好的空间排列和由于表面曲率所导致的发射状的探针吸附,实现对更低浓度靶标DNA的检测,从而为新型传感器的设计和开发提供了一个很好的思路和平台。
本实施例的方法增强石英晶体微天平表面不平整度和表面曲率,用于探针DNA的吸附以及对靶标DNA的检测,以聚苯乙烯球为模板利用表面活性剂的不同的静电作用制备的不同表面曲率的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球,从而实现表面曲率和活性位点的可控可调。
在石英晶体微天平传感器上放置探针DNA作为识别物,将靶标DNA同探针DNA进行杂交反应,根据不同浓度靶标DNA加入不同物质的量所引起的重量变化,定量地判断靶标DNA的最低检出限。
纳米金颗粒的粒径可控,通过不同粒径的纳米金颗粒的吸附精确的调控纳米金颗粒复合聚苯乙烯球的表面曲率,从而实现探针DNA的最佳吸附。不同粒径的纳米金所引起的探针DNA有着不同的空间朝向,从而实现对靶标DNA的检出限的降低。
在本实施例的以聚苯乙烯球为模板的石英晶体微天平信号扩增方法中,不同粒径的金纳米颗粒的粒径可以通过控制柠檬酸三钠的体积用量来获得;囊泡的均一度和大小可通过选择不同孔径的尼龙膜实现;金生长液用于封闭吸附到聚苯乙烯球上的纳米金颗粒之间的空白,从而提供更多的生物分子吸附活性位点。
Claims (2)
1.一种以聚苯乙烯球为模板的石英晶体微天平信号扩增方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)纳米金颗粒溶液的制备:配制2wt%的HAuCl4水溶液和2wt%的柠檬酸三钠水溶液备用,取0.15mL的HAuCl4水溶液,添加到30mL水中,然后将溶液加热至回流,在搅拌下加入0.08-0.45mL柠檬酸三钠水溶液,继续加热20min;
(2)纳米金颗粒复合聚苯乙烯球溶液的制备:(a2)将3毫摩表面活性剂溶解到1L浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液中,然后通过针头将溶液从孔径为0.2-0.8μm的尼龙膜中滤除,得到表面活性剂的PBS缓冲溶液;(b2)按照体积比1∶20将浓度为3.8wt%的聚苯乙烯球溶液加入到步骤(a2)中表面活性剂的PBS缓冲溶液中,聚苯乙烯球溶液中聚苯乙烯球的粒径为250-270nm,搅拌;(c2)将步骤(b2)中的溶液离心分层,去除上层溶液,未吸附到聚苯乙烯球表面的表面活性剂则去除,吸附有表面活性剂的聚苯乙烯球则沉淀,重复清洗离心以保证表面活性剂去除完全;(d2)将步骤(c2)中的沉淀重新分散在水中形成吸附好表面活性剂的聚苯乙烯球溶液,并取步骤(1)中制备的纳米金颗粒溶液加入到吸附好表面活性剂的聚苯乙烯球溶液中,搅拌;(e2)将步骤(d2)中的溶液离心分层,去除上层溶液,得到红色沉淀物即为纳米金颗粒复合聚苯乙烯球,重复清洗离心以保证纳米金颗粒去除完全;(f2)将步骤(e2)中获得的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球重新溶解到水中,加入浓度为0.375毫摩每升的氢氧化金溶液后搅拌均匀,离心去除上层溶液得到黑色沉淀,最后将黑色沉淀物重新溶解到水中得到纳米金颗粒复合聚苯乙烯球溶液;
(3)纳米金颗粒复合聚苯乙烯球修饰的石英晶体微天平提高探针DNA吸附量和靶标DNA检测限:(a3)首先将石英晶体微天平用piranha溶液清洗去除有机物和表面的杂质,所述piranha溶液是用质量浓度为98%的H2SO4与质量浓度为30%的H2O2按照体积比为3∶1混合制成,然后用去离子水清洗石英晶体微天平,N2吹干;(b3)将步骤(a3)中清洗好的石英晶体微天平浸泡于0.5mL 1,6-己硫醇溶液,1,6-己硫醇溶液用体积比为1∶200的HS(CH2)6SH和乙醇配制而成,1,6-己硫醇通过Au-S化学键固定在石英晶体微天平表面,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水清洗去未吸附的1,6-己硫醇,N2吹干;(c3)将步骤(b3)石英晶体微天平浸入纳米金颗粒复合聚苯乙烯球颗粒溶液,纳米金 颗粒复合聚苯乙烯球与己硫醇通过Au-S化学键固定到石英晶体微天平表面,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水清洗洗掉多余的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球颗粒,N2吹干;(d3)将步骤(c3)中修饰有纳米金颗粒复合聚苯乙烯球颗粒的石英晶体微天平暴露于探针DNA溶液中,探针DNA通过化学键力固定到纳米金颗粒复合聚苯乙烯球表面,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水清洗未修饰到石英晶体微天平表面的探针DNA,N2吹干;(e3)将步骤(d3)中获得的修饰有探针DNA的石英晶体微天平暴露于靶标DNA溶液中,靶标DNA通过与探针DNA的杂交固定于石英晶体微天平敏感膜上,用浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液和去离子水清洗未杂交的靶标DNA,N2吹干。
2.根据权利要求1所述的以聚苯乙烯球为模板的石英晶体微天平信号扩增方法,其特征在于,包括如下步骤:
(21)纳米金颗粒复合聚苯乙烯球溶液的制备:(a21)将3毫摩表面活性剂溶解到1L浓度为10毫摩每升、pH为6.8的PBS缓冲溶液中,然后通过针头将溶液从孔径为0.2-0.8μm的尼龙膜中滤除,得到表面活性剂的PBS缓冲溶液;(b21)按照体积比1∶20将100μL浓度为3.8wt%的聚苯乙烯球溶液加入到步骤(a21)中表面活性剂的PBS缓冲溶液中,聚苯乙烯球溶液中聚苯乙烯球的粒径为250-270nm,搅拌;(c21)将步骤(b21)中的溶液离心分层,去除上层溶液,未吸附到聚苯乙烯球表面的表面活性剂则去除,吸附有表面活性剂的聚苯乙烯球则沉淀,重复清洗离心以保证表面活性剂去除完全;(d21)将步骤(c21)中的沉淀重新分散在2mL水中形成吸附好表面活性剂的聚苯乙烯球溶液,并取1mL-5mL步骤(1)中制备的纳米金颗粒溶液加入到吸附好表面活性剂的聚苯乙烯球溶液中,搅拌;(e21)将步骤(d21)中的溶液离心分层,去除上层溶液,得到红色沉淀物即为纳米金颗粒复合聚苯乙烯球,重复清洗离心以保证纳米金颗粒去除完全;(f21)将步骤(e21)中获得的纳米金颗粒复合聚苯乙烯球重新溶解到2mL水中,加入10μL-1mL、浓度为0.375毫摩每升的氢氧化金溶液后搅拌,离心去除上层溶液得到黑色沉淀,最后将黑色沉淀物重新溶解到2mL水中得到纳米金颗粒复合聚苯乙烯球溶液。
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