CN101848992A - 相反细胞分化程序(ocdp）用于治疗处于病理状态的退化器官的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过使用细胞治疗退行性和/或处于病理状态的器官的方法，所述细胞就发育而言是处于表型稳定分化中或已分化的但不一定是根本上预决定的，其来自根据相反细胞分化程序(OCDP)的原则而选择的供体器官；本发明还涉及此类型细胞用于治疗的用途或者用于生产治疗同样疾病之药物的用途。此外，本发明还涉及包含合适的表型稳定细胞的药剂，由此使用第一器官的细胞，所述第一器官在器官类型方面不同于第二器官，在预定的表达基因和/或表型性能之组合方面处于正常生理状态的所述第一器官的细胞具有与正常生理状态下第二细胞相反的性能。

Description

相反细胞分化程序(OCDP)用于治疗处于病理状态的退化器官的用途

本发明涉及通过使用细胞来治疗退化和/或处于病理状态的器官的方法，所述细胞在发育方面是处于表型稳定分化中或已分化的但不一定是根本上预决定(predetermined)的，其来自根据相反细胞分化程序(OCDP)的原则选择的供体器官，本发明还涉及此类型细胞用于治疗的用途或者用于生产治疗同样疾病之药物的用途。此外，本发明还涉及包含合适表型稳定细胞的药剂。

目前，对于西方世界大多数广泛分布的退行性疾病来说，基于细胞的治疗是关注的焦点(Slack JMW.Metaplasia and transdifferentiation：frompure biology to the clinic.Nature Rev.2007；8：369-378)。这些疾病包括神经退行性疾病(阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病等)、慢性肝病(肝炎、纤维化和肝硬化)、糖尿病、心脏疾病、关节炎以及许多其它疾病。这些基于细胞的治疗的基本原理是替换受损和受限制或失去再生能力的细胞，或者通过营养因子协助其替换，所述营养因子由移植的天然或生物技术改造的细胞产生(Slack JMW.Metaplasia and transdifferentiation：frompure biology to the clinic，Nature Rev.2007；8：369-378)。

讨论了有可能获得治疗上成功的合适细胞：胚胎干细胞、成体干细胞、细胞的转分化(例如造血干细胞分化为相应器官细胞)，以及连续或瞬时使用通过产生细胞因子和生长因子促进受体器官中再生的细胞(SlackJMW.Metaplasia and transdifferentiation：from pure biology to the clinic，Nature Rev.2007；8：369-378)。

在这方面最早的实验也是临床试验得到了令人失望的结果(JeffreyDR Failure of allogeneic bone marrow transplantation to arrest diseaseactivity in multiple sclerosis.Mult.Scler.2007；July 10(Epub ahead ofprint))，并同时表明了该治疗方法的固有缺陷。

根据本发明的“相反细胞分化程序”(OCDP)的原理超越了前述为细胞替换而设计的治疗方法，并且采取了不同的策略。

基于细胞治疗患慢性病器官的现代方法基于以下应用：

1.具有分化成患病器官细胞之性能的不同来源的干细胞和/或

2.细胞，特别是遗传操作的细胞，其具有可对患病器官的再生起到积极影响的性能(例如产生营养因子)。

对于治疗患慢性病器官的可能性来说，这些方法中的每一个都获得了具有希望的根本性进展或者已经得到实现，但是同时，其伴有一系列重大且尚未解决的缺点。

就干细胞治疗来说，使用多能(pluripotent或multipotent)(未分化的)供体细胞(胚胎或成体干细胞(SC)、间充质(mesenchymal)或上皮造血SC、骨髓细胞、来自脂肪组织和皮肤或者发根及其它器官的干细胞)(Wobus AM，Boheler KR.Embryonic Stem Cells：prospects fordevelopmental biology and cell therapy.Physol.Rev.2005；85：635-678)。本申请是基于以下的发现：未分化的干细胞具有能够在有限次细胞分裂中转化为不同的器官特异性分化细胞的性能。其实例有干细胞转化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、抗原呈递树突细胞。但是，也讨论了通过合适的方法将已分化器官细胞转化为其它已分化器官细胞的可能性，例如通过转染转录因子的基因(转分化；Slack JMW.Metaplasia andtransdifferentiation：from pure biology to the clinic.Nature Rev.2007；8：369-378)。根据其表型可塑性(phenotypical flexibility)(多能性，pluripotency或multipotency)，认为干细胞可植入几乎所有器官中以替代有功能的器官细胞。然而，应用干细胞或转分化确实具有下列缺点：

·致肿瘤性(尤其是对于胚胎干细胞来说)

·去分化的可能性增加(使用成体干细胞，产生肿瘤干细胞)

·在细胞培养物中以及移植之后转化成器官以外的细胞

·在遗传操作基础上细胞退化或者细胞丧失不可或缺的能力和/或可被环境调控的能力

·所获得干细胞的数量有限

·成体或已差不多分化的干细胞的增殖速率低

·伦理上的顾忌(对于胚胎和胎儿干细胞来说)

之前基于细胞治疗(慢性)退行性疾病的策略是基于在疾病晚期机体、功能性细胞的自发或药物诱导性的固有保护和再生无效时使用干细胞或其它具有治疗潜力的细胞。因此，疾病的慢性特性是指在器官背景下(病理)调节系统占优势，其导致不可避免地迫使保持病理状态。神经和非神经组织连续暴露于致病因素引发器官特异性稳态并干扰在健康背景中实现或控制损伤补偿的代谢途径和信号转导途径。这些强迫不仅阻止(阻断)固有的机体再生，还迫使移植细胞向病理方向发展。此外，致病环境可促进分化，并因此促进老化和功能丧失，其源自于植入的干细胞。所使用干细胞的表型可塑性越大，它们就越容易屈服于病理压力，即错误分化、肿瘤形成紊乱或者这些细胞由于细胞死亡被除去的危险就越大。

目前还未实现利用干细胞实现供体细胞持久功能性表型的目标，所述供体细胞对退行性环境有抗性。因此，本发明的目的是克服在基于细胞的治疗情况下使用遗传修饰细胞所导致的以及不同来源干细胞所导致的已知缺点。根据本发明独立权利要求的方法和药剂实现了此目的。从属权利要求中显示了有利的实施方案。

针对此目的的解决方案在于应用相反细胞分化程序(OCDP)的原理。OCDP源自两个基本前提，它们是在所有其它基于细胞的治疗方法中未曾考虑过的。一个基本前提是在不同器官中存在细胞群体(细胞类型)，其在表达基因之特异性组合方面或表型性能之特异性组合方面潜在地具有相反(反向)或逆向的性能和/或控制机制-(例如，应提到对于组织稳态的维持、不同区室间的物质转移(例如：血液/组织；空气/组织)、解毒和再生来说实施不可或缺之功能的细胞群体-(缩写为“GPC”、GFAP产生细胞)(Danielyan L，Tolstonog G，Traub P，Salvetter J，Gleiter CH，Reisig D，Gebhardt R，Buniatian GH.4.6 Colocalization of glial fibrillary acidicprotein，metallothionein，and MHC II in human，rat NOD/SCID，and nudemouse skin keratinocytes and fibroblasts.J Invest Dermatol.2007 Mar.；127(3)：555-63)。第二个前提是以下认识：这些细胞存在于不同活化状态或调控状态的不同器官中，这些状态主导了各自的组织类型，其对于疾病来说尽管不一定但通常呈现出恰好相反的活化状态(或分化状态)或调控状态，特别是对于重要的功能性蛋白质和/或调控机制来说更是如此(Buniatian G.H.，H-J Hartmann，P.Traub，U.Weser，H.Wiesinger，R.Gebhardt(2001).Acquisition of blood-tissue barrier supporting features byhepatic stellate cells and astrocytes of myofibroblastic phenotype.Inversedynamics of metallothionein and glial fibrillary acidic protein expression.Neurochem.Int.38，373-383；Buniatian G.H.，Hartmann H.-J.，Traub P.，Wiesinger H.，Albinus M.，Nagel W.，Shoeman R.，Mecke D.，Weser U.(2002).Glial Fibrillary Acidic Protein-Positive Cells of the Kidney areCapable of Raising a Protective Biochemical Barrier Similar to Astrocytes：Expression of Metallothionein in Podocytes.Anat.Rec.267，296-306)。现在，OCDP的概念以新的且出人意料地方式来自于下列事实：当移植代表性细胞群时，定向于治疗患病组织的细胞移植是特别成功的，所述细胞群的天然活化状态或表型相对于供体器官中所述重要抗原(蛋白质)或调控机制来说是与受体器官中“相关”细胞的表型相反的。因此，所移植的天然细胞群是否具有干细胞性能，它是作为营养因子来源还是具有促进受体器官再生的其它性能，这些都是不相关的。相反细胞分化程序之下隐含的是许多(如果不是全部的话)器官中有“相关”细胞，其分化状态以具有成对器官丛的形式而不同，其中各相关细胞的分化状态可被称为相反或反向的。本文中的“相关”细胞不一定指相同来源意义上的相关，而是可以简单地表示这些细胞具有有限的相同表达基因A、B、C等的组合，使得一个器官中的这些细胞可以通过例如下述性能来表征：“基因A高表达，基因B低表达”以及在另一些“相反”性能的器官中：“基因A低表达，基因B高表达”。参照随后的两个实例，在不限制本发明的情况下再次对其进行阐明。

A)在每个器官中都有一群对于组织稳态的维持、不同区室(例如：血液/组织；空气/组织)间物质转移、解毒和再生来说发挥不可或缺的功能的细胞群体(例如产生GFAP的细胞)。除了中间丝蛋白GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白)以外，这些细胞还可同时产生其它细胞骨架蛋白，例如SMAA(平滑肌α-肌动蛋白)(一种微丝蛋白)。近几年来的认识表明，这些细胞存在于处于不同活化状态的多种器官中，其在各个类型的组织中占优势。因此，例如正常脑中的星形细胞特征是高SMAA表达和低GFAP表达，而肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的特征是GFAP高表达和SMAA低表达。这种不同类型的基因表达是与正常星形细胞(astrocyte)参与高度不通透性血脑屏障构建的情况相关联的，而HSC在肝脏中参与或者决定高度通透性血液肝脏组织界面的构建。在疾病的情况下，此表达状态分别被逆转，并由此也逆转了受影响的血脑组织屏障的通透性，以及与维持组织稳态、解毒和再生有关的其它性能。这意味着，在退化的脑区域中，星形细胞减少了SMAA的高表达并增加了GFAP的表达，而肝脏中的HSC降低了GFAP的表达并增加了SMAA的表达。因此，具有与正常状态相反之表型的细胞的特征不限于蛋白质GFAP和SMAA的实例。GPC的治疗性能也可以由其它表达模式来表明，例如由谷氨酰胺合成酶、金属硫蛋白或MHC II类分子的表达来表明，并决定相反表型。在这种情况下，解毒反应处于所述组织功能的最前列。

B)第二个例子将调控方面放在更前列。在许多(如果不是全部的话)成体组织中，hedgehog-和Wnt/β-连环蛋白(catenin)信号转导的双重性在组织的亚结构中特别重要，一部分细胞更多地受到hedgehog的影响，另一部分细胞更多地受到Wnt/β-连环蛋白的影响。这方面的一个实例可以是肠，在其隐窝中Wnt/β-连环蛋白的影响占优势，而在绒毛顶端则是hedgehog的影响占优势。甚至在肝脏也有这样的双重性。在没有这些相反信号通路的恒定拮抗作用以及在提供某些组织特异性代谢平衡的情况下，所述组织会逐渐产生多种类型的病态，包括肿瘤形成。相反，在病态情况下，这些信号通路之一的影响以另外一个为代价进行扩展，因此，非常类似于上文所述的GPC实例，诱导细胞的相反或逆向表型，但其实质上比各自的天然表型更加不稳定。

因此，OCDP使得可以鉴定适合的细胞和/或以鉴定合适的细胞为前提，所述合适的细胞尤其符合移植的标准：首先确定患病器官中主要损伤或变化的细胞类型或者最初对病理状况来说起更重要作用的细胞类型。假定在关键性能方面病态表型与正常表型具有相反的表现。当然，这在这些细胞的整个蛋白质组方面并不是普遍适用的，而是仅适用于上述含义的关键性能方面。第二步，鉴定含有所述“相关”细胞类型的器官，所述细胞类型对应于在关键性能方面的病理表型，如果必要则显示与病理器官的正常细胞类型相反的分化模式。分化中或已分化的供体细胞(具有相反的分化特征)应来源于具有相反生理功能以及血液-组织(例如肝脏和脑)界面特征的健康供体器官。移植此细胞类型之后，由于供体细胞在供体器官的生命过程中获得的经验和记忆(Ghazarian A，Garner WL，EhrlichHP.Memory of past exposure to the chemokine IL-8 inhibits thecontraction of fibroblast-populated collagen lattices.Exp Mol Pathol.2000Dec；69(3)：242-7；Huang C，Kim Y，Caramori ML，Moore JH，Rich SS，Mychaleckyj JC，Walker PC，Mauer M.Diabetic nephropathy is associatedwith gene expression levels of oxidative phosphorylation and relatedpathways.Diabetes.2006 Jun；55(6)：1826-31.)，其可更好地适合病理环境并更好地抵抗其致病压力。所以，可以通过该细胞类型更有效地引入再生。因此，该细胞类型是具有多能干细胞的特定性能(例如转变为受体器官相关细胞类型的性能)还是仅具有促进再生的性能和作用(例如表达营养因子)并不重要。

就GPC来说，发生例如下列情况：在退化的脑中以及在细胞结构惯常老化的情况下，在脑中对最多变化类型的有毒物质发挥强保护作用的星形细胞失去其活化的可收缩表型并逐渐获得功能性降低的扩张表型。脑中的此病理状况通过提供表型稳定分化中或已分化的来自肝脏的活化肝星状细胞(HSC)或来自肾脏的系膜细胞(MC)而得到改善。

例如，HSC和MC被编程以呈现活化的可收缩表型，并且在其分化过程中逐渐增强此表型(即功能性星形细胞的性能)。结果是，由表型稳定分化中或已分化的活化HSC或MC所产生的多种保护性因子(促红细胞生成素和/或BDNF(脑来源的神经营养性因子)和/或金属硫蛋白和/或谷氨酰胺合成酶和/或NGF(神经生长因子)和/或I型胶原和/或GPR 49(G-蛋白偶联受体49)和/或其它)的这些细胞可改善受损的稳态以及受体器官细胞的存活和功能(就脑来说)。此外，类似于在培养条件下的干细胞，HSC/MC可获得神经元的性能(形成突触、产生神经元特异性标志物、神经递质和参与形成神经递质的酶)。为此，在植入退化脑中的情况下，HSC/MC(除了其稳态改善功能和对于神经元和星形细胞的保护功能之外)可代替损失的和退化的神经元的功能。表1显示了(仅作为举例)作为各细胞类型分化状态之函数的所选因子的表达量。

由于属于脑、肝脏和肾脏中GFAP阳性的血管周围细胞的星形细胞、肝星状细胞(HSC)与系膜细胞(MC)的解剖学和功能相关性(“亲和性”)，后者具有针对血源信号的类似保护机制。脑退行性疾病的主要标志是神经元的损失和脑特异性稳态的重大变化，后者受星形细胞调控。用于神经退行性疾病的基于细胞治疗的HSC和MC的特征在于这些非神经GFAP-PC是天然编程的，在其分化(活化)过程中获得并提高年轻星形细胞(抗细胞毒性功能)、神经SC(巢蛋白产生)和神经元(β-III微管蛋白、神经介质(neuromediator)、神经营养性因子)特征性性能。它们在体外和体内快速增殖，因为它们表型已分化，所以在受体器官的患病组织中保持稳定的形式。星形细胞与HSC/MC恰好相反地进行分化程序使得能够使用表型稳定分化中或已分化的HSC/MC治疗神经退行性疾病。

用于基于细胞治疗神经退行性疾病的稳定分化中的或已分化的HSC产生EPO(促红细胞生成素)、GS(谷氨酰胺合成酶)和MT(金属硫蛋白)。它们的细胞骨架由巢蛋白、β-微管蛋白、结蛋白和SMAA支持。就这些细胞来说，可以少量存在核周围或者核(但不是在突起(protrusion)中)表达的GFAP。

因此，HSC和/或MC可用于一系列神经退行性疾病的基于细胞的治疗，例如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、中风及特征在于神经元数量和功能损失以及脑特异性稳态反常的其他疾病。

就HSC/MC(或者具有类似分化程序的另一种细胞类型)来说，通过植入、静脉内施用或者其它类型的施用将所述细胞提供给患病脑。因此，可以对患有上述疾病晚期的患者进行HSC植入。HSC和/或MC的输注旨在：

1)通过其显著的解毒功能永久改善受损组织中的脑特异性稳态(产生谷氨酰胺合成酶、促红细胞生成素、金属硫蛋白)

2)增加受体固有神经元的存活率以及其再生(例如轴突再生)。

3)通过将HSC/MC转变为可产生功能蛋白(例如乙酰胆碱、酪氨酸羟化酶)的神经元类型细胞改善神经传导

4)改善受体器官中细胞的功能(HSC/MC的存在诱导星形细胞/神经元中乙酰胆碱、酪氨酸羟化酶的产生)。

5)增加根据2)、3)、4)的神经元的数目。

在分化和活化的状态下，HSC不表达II类MHC蛋白，因此它们很弱几乎不表现出抗原呈递功能。因此，就HSC植入来说，消除或者减少了干细胞出现排斥反应以及植入物存活率低的问题。肝脏退化的特征在于肝细胞损失，因此降低了由肝细胞进行的解毒功能，以及由静息HSC控制的肝脏特异性稳态的重大变化，和活化HSC进行的肝窦状隙的结构性修饰。静息HSC强烈表达GFAP(一种促进细胞外基质降解酶产生的中间纤维蛋白)，所述降解酶促进通过肝脏毛细血管中经开孔进行的血液-肝脏交换。储存维生素A的静息HSC产生抗原的II类MHC复合物，其对于抗原呈递到归巢淋巴细胞来说非常重要。此功能也通过静息HSC控制的肝脏开孔大小来实现。肝脏纤维化的特征在于由GFAP损失所表现的HSC活化、ECM蛋白消化减少以及适于脑毛细血管的血管类型的连续发育。

相反地，星形细胞的成熟和分化导致大量GFAP、MHC-II和金属蛋白酶的积累，换言之，获得了健康肝脏和肾脏中未分化HSC以及其它非神经器官中类似细胞的特征。在神经退行性疾病过程中已经显示出此抗原组合(Markowitz CE.Interferon-beta：mechanism of action and dosingissues.Neurology.2007 Jun 12；68(24Suppl 4)：S8-11.)，阿尔茨海默病的血管壁中频繁出现凹点和空隙(Scheibel AB，Duong T.On the possiblerelationship of cortical microvascular pathology to blood brain barrierchanges in Alzheimer′s disease.Neurobiol Aging.1988 Jan-Feb；9(l)：41-2.)证明提供以下情形之机制的普遍性：受促进的血液-组织相互作用和富含GFAP的血管周围细胞支持细胞旁通路开放的能力。星形细胞的分化在成体脑中终止，或者它可以在神经细胞培养中实现。

根据本发明，分化中的和表型稳定分化的星形细胞可用于治疗患有纤维化或基本上由紊乱造成的其它疾病的非神经器官。这方面的实例有肝硬化和肾纤维化。

将分化的星形细胞(或具有类似分化程序的另一种细胞类型)提供给非神经器官(例如提供给在肝纤维化、肝硬化情况下的肝脏)。还可以使用表型稳定分化中的星形细胞。

与干细胞和基因治疗相比，基于HSC/MC治疗神经退行性疾病和基于神经胶质细胞治疗非神经器官(肝脏、肾脏)的纤维化疾病提供了一系列的优点。

1)移植细胞的表型稳定性和它们对受体器官中占优势的病理条件的抗性。在移植到脑中之后，已分化的HSC/MC可优选地转分化为神经样和神经胶质样细胞类型，因此与干细胞相反其保持表型稳定。这为在患病环境中的植入提供了关键性优势：移植的细胞a)不会采取退化细胞的表型；以及b)作为其天然编程和高度解毒功能的结果，不仅在有毒条件下存活，而且还会改善稳态。

2)无需伦理上的顾忌(与胚胎干细胞不同)以及分离方法的低复杂性。例如HSC/MC可以大于成体干细胞的量自受体固有(自体)的肝脏或肾脏获得，并且可以通过诱导增殖在细胞培养中扩增。其它可能性是由血液来源的间充质干细胞制备它们，即诱导间充质干细胞转化为HSC和MC。

3)待移植的细胞量不受限制(因为它们的高增殖能力和由供体器官获得这些细胞的可能性)。

4)由于其免疫原性低，受体组织中植入的HSC/MC细胞的存活率高。它们仅有微弱显示的(至少在细胞培养条件下)抗原呈递功能，因为它们几乎不表达任何MHC II类蛋白。

总之，稳定分化中或已分化的血管周围GFAP阳性细胞(HSC、MC和星形细胞)可分别提供在受体器官中更高的植入存活率，改善稳态，受体器官中的表型稳定性以及获取和植入前处理这些细胞的简便性。

另外，作为OCDP应用的另一个实例，可提到的是肾小球足细胞和皮肤角化细胞的相互替换。

表型稳定分化中或已分化的细胞的施用以已知方式进行。例如，它们可通过静脉内、鞘内(沿脊椎骨)、颅内、脑室内、腹膜内、肌内和/或皮下施用或植入。

施用量有利地为5×10³至1×10¹⁰个细胞。因此，所述量可取决于：1)疾病的阶段；2)患者年龄；3)疾病类型；3)施用途径(静脉内、腹膜内等)；4)施用时间(长期、一次或数次)；5)之前所患疾病和/或伴随疾病。

施用频率有利地为单次施用、具有不同输注频率和持续时间的输注、多次或长期施用。

下述实施例解释本发明，并且不对其构成限制。

1.体外试验

随后使用以下缩写：HSC-肝星状细胞；MC-系膜细胞；GFAP-PC-神经胶质纤维酸性蛋白阳性的血管周围细胞；AP-星形神经胶质细胞原代培养物；P-传代；EPO-促红细胞生成素；GS-谷氨酰胺合成酶；MT-金属硫蛋白；PCNA-增殖细胞核抗原；OCDP-相反细胞分化程序。

在单个单培养物以及与来自大鼠的星形神经胶质细胞原代培养物的共培养物中，通过不同功能特异性和细胞类型特异性的标志物蛋白的免疫细胞化学分析表征了HSC、HSC-T6细胞系和MC的保护性能。在体外模型中评价了OCDP治疗的效率，所述体外模型来自分化程度很大的来源于脑的原代培养物与非神经GFAP-PC的共培养物。下列细胞中包含非神经GFAP-PC：

1.来自成体肾脏和新生大鼠肾脏的系膜细胞

2.成体活化HSC(原代培养物)

3.HSC-T6细胞系(活化的HSC细胞系)

在不同培养年龄(培养物中最多150天)和彼此间不同定量条件下以及在不同细胞密度下，单独以及在与星形神经胶质细胞的共培养物中分析了所有这些细胞类型。

下面显示通过分化获得的非神经已分化GFAP-PC(即活化的HSC和MC)的神经元特异性、形态学和抗原性性能。

GFAP-PC细胞(HSC和MC)的神经元和干细胞特异性性能

对不同年龄培养物(第7天；第14天和第21天)中来自新生大鼠的MC以及不同传代的成体HSC和MC来说，可以在MC中观察到GFAP的逐渐减少和神经元标志物β-III微管蛋白高度调节表达的增加。另外，干细胞标志物巢蛋白也高度表达。成体MC和HSC也表达高水平的巢蛋白和-III微管蛋白。在MC中，可观察到在细胞培养物中3次传代之后β-III微管蛋白的表达受到极高程度的调节。

具有解毒和保护功能的蛋白质(GS、MT、EPO)以及参与神经传导的蛋白质(突触蛋白和突触素)以及GFAP-PC中乙酰胆碱的表达

MC和来自大鼠的成体活化的HSC表达高水平的GS，其为将过量的谷氨酸盐和NH₃转化为谷氨酰胺的酶。在GS阳性的MC中观察到由于其与自由基有关的“清除剂”功能而公知的金属硫蛋白(MT)。另外，成体已分化的HSC共表达GS和EPO。GS和EPO也在活化的MC中表达。成体活化的MC甚至在9次传代之后仍显示出高增殖能力。这由PCNA的表达而表明。活化的MC还表达功能性活化神经元的标志物：乙酰胆碱、突触蛋白和突触素。

HSC和MC的神经元样形态

还在MC和HSC中发现了对于神经元来说典型的突触终球。同样对于神经元来说典型的长轴突样突起也由MC和HSC形成。此外，对EPO和GS的复染显示HSC中树突状棘(spike)的形成。

HSC-T6(HSC细胞系)与来自大鼠的星形神经胶质细胞原代培养物的共培养物中神经元标志物(β-III微管蛋白)和GFAP的表达

为了表明退化的CNS组织中ODCP治疗的效力，将星形神经胶质细胞原代培养物用作神经退化体外模型，其中大的部分包括星形细胞，并且具有非常小数量的神经元。该模型反映了患病脑中的情况，其中神经元的数目显著减少，而星形细胞的数目增加。因为特定脑区域中的星形细胞具有前体细胞的性能并可用作新细胞群体(包括神经元)的来源，所以使用了不同年龄的细胞培养物。除了年轻的七天龄细胞和中年星形细胞(培养14天)之外，还使用了老年星形细胞(培养30、48、90天)，其失去了其原始的性能。

图1显示了与HSC-T6细胞系或原代MC共培养之后，14天星形神经胶质细胞培养物中β-III微管蛋白阳性细胞数目的变化。从图中明显得知，14天时星形神经胶质细胞(Ao)与HSC-T6的共培养物(Ao+T6)或者与MC的共培养物(Ao+MC)导致β-III微管蛋白阳性细胞相比于星形神经胶质细胞对照培养物(Ao14天)增加几乎三倍。在第28天，星形神经胶质细胞培养物仅含有很少的β-III微管蛋白阳性细胞。将5×10⁴HSC-T6细胞施用给14天的星形神经胶质细胞培养物导致共培养7天后β-III微管蛋白阳性细胞群的大量扩增。共培养14天后，观察到β-III微管蛋白阳性细胞数量显著增加。在这些β-III微管蛋白阳性细胞中，大量显示神经元形态，即个体延伸出轴突样突起以及环绕细胞体的许多短的树突。在使用低5倍细胞密度的培养物中观察到了此效果。β-III微管蛋白阳性细胞组织成网络。这些细胞高水平地表达β-III微管蛋白，但非常低水平地表达GFAP。来自新生大鼠的MC与星形神经胶质细胞原代培养物的共培养中神经元标志物(β-III微管蛋白)和GFAP的表达

将来自新生大鼠的星形神经胶质细胞与MC共培养：

1.从新生大鼠新分离出MC细胞，随后与14天星形神经胶质细胞共培养14天。

2.从新生大鼠新分离出星形神经胶质细胞，随后与14天MC细胞共培养14天。

3.将来自新生大鼠的14天星形神经胶质细胞培养物与14天MC在培养基中传代，随后共培养14天。

4.将来自新生大鼠的21天MC与21天星形神经胶质细胞培养物在培养基中传代，随后共培养14天。

5.随后将传代1中的31天的MC细胞与46天的星形神经胶质细胞共培养14天。

在所有上述列出的5种共培养条件中，β-III微管蛋白阳性细胞的数目均大大增加。此外，在60天星形神经胶质细胞培养物中的对照条件下，仅可通过核染色而检测到的沉默细胞的数目显著高于共培养物中的沉默细胞的数目。因为共培养物中β-III微管蛋白阳性细胞的数目大大增加，所以可认为这些沉默细胞转变为神经元。

140天的星形神经胶质细胞培养物与来自大鼠的成体HSC或MC的共培养物中β-III微管蛋白的表达

在此系列实验中，观察超过140天星形神经胶质细胞培养物作为对照。相比于对照培养物，149天星形神经胶质细胞(PI)与来自8次传代的成体MC或来自7次传代的成体活化HSC的28天共培养物导致β-III微管蛋白阳性细胞显著增加。共培养API-和HSC-T6细胞系导致细胞从培养皿底部显著脱离。但是，剩余的贴壁细胞群显示出比对照培养物更高的β-III微管蛋白阳性细胞数目。

HSC-T6的抗细胞毒性性能

图2显示与56天星形神经胶质细胞单培养物(AP2)相比，传代后星形神经胶质细胞(P2)与传代后MC(P1)的共培养物(AP2+MC P1)中GS阳性细胞的数目增加600％。此外，在该图中，显示了来自加入或未加入HSC-T6(活化的HSC细胞系)的星形神经胶质细胞培养物中GS和MT表达的比较研究的结果。将HSC-T6加入到52天星形神经胶质细胞培养物中导致GS、MT和结蛋白的显著增加。所述细胞形成了神经元样网络，其具有大量设置的突起，其中GS、MT和结蛋白强烈表达。

MC的抗细胞毒性性能

将来自新生大鼠的MC加入到14天共培养物中使得在58天星形神经胶质细胞培养物中GS的表达和相应活性显著增加。

星形神经胶质细胞与HSC或MC的共培养物中神经元特异性功能的产生酪氨酸羟化酶(TH)的表达

在第28天，均质培养物中大量星形细胞表达TH。在与来自大鼠的原代培养物的成体分化的(活化的)MC或者与7-8次传代的成体分化的HSC和MC共培养14天之后，TH阳性细胞的数目保持约与星形神经胶质细胞对照培养物的相同。

相当长培养时间后TH的表达

在星形神经胶质细胞原代培养物中，第40天与第28天相比，TH阳性细胞的数目略微降低。TH染色的强度和表达TH的细胞的数目在第40和第52天之间甚至减少得更多。与52天星形神经胶质细胞对照培养物相比，40天星形神经胶质细胞培养物与来自大鼠的成体活化的MC或成体活化的大鼠-HSC或者活化的HSC-T6细胞系的共培养导致TH表达显著增加。

神经丝蛋白(NF)的表达

相比于星形神经胶质细胞对照培养物，将20000个HSC-T6细胞加入到14天星形神经胶质细胞培养物中导致N F表达细胞的数目略微增加。HSC-T6细胞的数目增加10倍，导致来自AP(星形细胞原代培养物)和HSC-T6的14天共培养物中NF阳性细胞的数目和强度大大增加。星形神经胶质细胞(传代2，AP2)和HSC-T6细胞系的共培养物中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达

图3显示星形神经胶质细胞与52天星形神经胶质细胞培养物的共培养物中PCNA阳性细胞增加370％。

与未传代的原代培养物相比，传代2的31天星形神经胶质细胞(AP2)的增殖活性略微下降(通过PCNA的表达表明)。在AP2中加入HSC-T6细胞并另外共培养14天使得增殖大大增加。如果将后者与AP2的细胞悬液混合并同时培养于培养皿中，则HSC-T6的作用甚至更大。混合培养物中的高度增殖产生大量从培养皿底部脱离的细胞(可通过邻近非常致密或非常稀疏细胞分布之区域的大面积致密生长细胞来检测)。尽管如此，在共培养物中，即使在稀疏细胞分布的区域，PCNA阳性细胞的数目仍大于不含HSC的星形神经胶质细胞培养物中的数目。

HSC-T6对星形神经胶质细胞老化过程的作用

为了研究此作用，通过Western印迹分析了单独的星形神经胶质细胞培养物中以及与HSC-T6的共培养物中的GFAP表达。图4表明，相比于GFAP在HSC-T6(第2列)或星形神经胶质细胞原代培养物(第3列和第4列)单独培养物中的表达，星形神经胶质细胞与HSC-T6的共培养物中几乎不存在GFAP的表达(图4第1列)。这表明了非常强的分化，因此HSC对星形神经胶质细胞有延缓老化的作用。

在共培养物中星形神经胶质和HSC-T6细胞对缺氧的抗性

在此系列实验中，使星形神经胶质细胞经受下列条件：

1.将来自初次传代(P1)的43天培养物在含氧量正常条件下(NC)单独培养。含氧量正常对照

2.将来自初次传代(P1)的43天星形神经胶质细胞培养物在NC下再培养10天，然后转移到低含氧条件下(HC)再培养48小时(1％O₂、10％CO₂、89％N₂)。低含氧对照。

3.向P1的31天星形神经胶质细胞培养物中添加150000 HSC-T6细胞，并在NC下另外共培养12天。

4.向P1的31天星形神经胶质细胞培养物中添加150000 HSC-T6细胞，并在NC下另外共培养10天。然后，使共培养物另外经受HC 48小时。

巢蛋白表达

在含氧量正常条件下的初次传代(AP1)中观察到了巢蛋白在GFAP阳性的星形神经胶质细胞中的中等表达。在这些培养物中，低含氧条件下巢蛋白表达过度降低。在NC下与HSC-T6共培养12天后，巢蛋白的表达速率大大增加。在50％的总细胞群中，巢蛋白表达的强度大于GFAP表达。在HC下，巢蛋白染色的强度甚至高于NC下不含HSC的星形神经胶质细胞的对照培养物。在AP1和HSC-T6细胞的共培养物中，保持了表达乙酰胆碱的能力，甚至在低含氧条件下亦如此。

β-III微管蛋白的表达

β-III微管蛋白和GFAP同时染色以及用抗β-III微管蛋白的单克隆抗体单独染色仅显示含氧量正常和低含氧条件下AP1中单独的β-III微管蛋白阳性细胞。在与HSC-T6共培养12天之后，在NC和HC条件下β-III微管蛋白阳性细胞的数目都显著增加。这些细胞中的一些显示典型的神经元表型(通过β-III微管蛋白的存在和GFAP的不存在而表明)。在HC中，β-III微管蛋白染色的强度和β-III微管蛋白阳性细胞的数目在NC和HC条件下均相同，但是比NC下AP1单独培养物中的高得多。

谷氨酰胺合成酶(GS)和金属硫蛋白(MT)的共表达

在NC和HC 7下，AP1单培养物中NC下的细胞都轻微表达GS，但几乎不表达任何MT。在NC下与HSC-T6共培养12天后，GS和MT被高度调控。大多数细胞共表达GS和MT。在许多细胞中，GS或MT的表达占优势。在HC下，共培养物中MT染色的强度略微小于在NC下共培养物中的强度。尽管如此，在HC下GS和MT在共培养物中的表达基本上大于在含氧量正常条件下在星形神经胶质细胞单培养物中的表达。PCNA和半胱天冬蛋白酶3的共表达

在含氧量正常条件下(NC)，初次传代(AP1)的43天星形神经胶质细胞培养物中仅少量细胞表达PCNA。大多数细胞也不包含半胱天冬蛋白酶3。在低含氧条件下AP1培养物的细胞数目和PCNA强度进一步降低。与NC和HC下的AP1培养物相比，在含氧量正常和低含氧量条件下AP1与HSC-T6共培养导致PCNA阳性细胞大量增加。共培养物中增殖增加产生了大量从培养皿底部脱离的细胞，其通过大的PCNA阳性细胞集聚体(conglomerate)以及相邻的稀疏且单独生长的细胞而变得明显。在一些集聚体中，几乎完全缺乏半胱天冬蛋白酶3的表达。另一方面，在另一些中，显示强半胱天冬蛋白酶和PCNA表达。这表明新的有增殖能力的细胞群的产生，其通过凋亡而被抵消。

这些结果验证了HSC、HSC-T6细胞系和MC对星形神经胶质细胞原代培养物的保护性能。这些性能通过下列参数进行评价：

1.共培养物中神经元数量增加(β-III微管蛋白阳性神经元增加250-300％)；

2.沉默细胞的活化；

3.酪氨酸羟化酶表达增加；

4.GS和MT表达增加，即抗细胞毒性功能；

5.细胞增殖增加；

6.星形细胞群体的再生(通过巢蛋白染色强度增加和巢蛋白阳性细胞增加300％而表明)；

7.共培养物中神经元网络的扩增；

8.由于下列作用产生的对低含氧量条件的抗性增加：

a)低含氧条件下细胞增殖增加；

b)星形神经胶质细胞培养物再生(在氧正常和缺氧下与单培养物相比巢蛋白阳性细胞增加超过300％)；

c)GS和MT表达增加；

d)神经元的数目增加(通过β-III微管蛋白阳性细胞增加300％而表明)。

非神经GFAP阳性细胞的这些保护性能是基于它们对CNS细胞的持久作用，其通过：

1.产生对神经元的分化和产生来说必需的物质；

2.由于它们具有分化的星形细胞的功能而产生的对星形细胞的分化阻滞作用；

3.通过增殖导致的神经细胞群再生；

4.转化为神经元样细胞的固有能力。

2.体内试验

用于治疗多发性硬化的HSC-T6细胞系的保护作用

试验设计：

将人MOG(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白)以50μg/动物的浓度静脉内施用给18只约1月龄的GA大鼠。24小时后，将动物分为2个组：第1组静脉内得到5000000个细胞(在PBS溶液中)，将荧光标记的细胞施用给该组的两个动物；第2组(对照组)仅静脉内获得PBS。将HSC-T6细胞系形式的肝星状细胞用作对应于OCDP的细胞。对第1组的2只动物，静脉内施用荧光标记的细胞，以检测所施用细胞在CNS中的可达到性(accessibility)和持续性。11天后准备这些动物。另外，对于不通过MOG诱导EAE(实验性自身免疫性脑脊髓炎)的正常(未实验)大鼠来说，静脉内施用相同量的荧光标记的细胞。这些对照动物在CNS中应具有较少的HSC-T6细胞群，这是因为这些动物中血脑屏障保持完好。根据下述神经病学“评分”每日观察MOG处理的动物。

结果

根据下列标准每天测试所述动物的打击运动(striking motor)特征：

评分点

评分标准

[0129]

1	悬尾
		2	后腿的轻微运动疾病
3	后腿完全跛足
		3.5	脊柱不能移动

1	悬尾
		4	具有另外的前腿跛足的得分1-3.5
5	死亡

神经病学状况的中间状态列于附图5中。

在施用MOG后第10周，在大多数动物群中出现了完全的疾病。从此以后，施加细胞的组显示出在进一步的过程中(第42至第54天之间)神经病学状况(得分)的显著改善。细胞处理的组(图5中的绿色曲线)的平均分为0.9±0.05(n＝8)，而PBS处理的组(图1中的红色曲线)显示2.21±0.06的平均分(n＝8)。因此，第1组(图5中的“细胞”)和第2组(“PBS”)之间的平均差异是1.2±0.08的得分，这意味着神经病学症状的显著改善。

MS大鼠和未实验的未处理动物的不同脑区域中CFDA-标记HSC-T6的鉴定

为了证明静脉内施用5000000个细胞的不同脑区域中HSC-T6的持续性，制备了获得CFDA标记的荧光性HSC-T6细胞的动物脑系列切片，通过荧光显微镜进行检测。

在MS动物的小脑(图6A)、前额叶皮层(图6B)和海马(图6C)中鉴定了许多细胞群，而对于未实验大鼠(无MOG施用)则仅在海马中发现了仅个别细胞(图6D)。

上述图示结果明确验证了本发明所实现的优点，特别是：

1.具有分化的稳定表型的HSC-T6细胞的施用导致多发性硬化(MS)动物实验模型中神经病学症状的显著改善；

2.对MS动物来说通过静脉内施用导致的HSC-T6富集显著区别于具有未受损血脑屏障的未实验动物，表明仅在血脑屏障受损的晚期疾病的情况下，大量细胞才确实迁移进入CNS，而健康动物仅个别细胞可到达CNS。

3.施用细胞的动物显示施用细胞没有另外的有毒或致瘤反应(健康未实验大鼠和MS动物都没有)，使得可以认为从毒理学观点来看使用所述细胞是安全的。

Claims (39)

1.表型稳定分化中或已分化的细胞作为供体细胞(第一细胞)用于生产用于治疗生物体第二器官之药物的用途，所述第二器官是退化的和/或处于病理阶段，其具有退化和/或处于病理阶段的第二细胞，第一器官的细胞用作供体细胞，其中所述第一器官在器官类型上不同于所述第二器官，并且在预定的表达基因和/或表型性能之组合方面处于正常生理状态的第一器官的细胞具有与处于正常生理状态的所述第二细胞相反的性能。

2.表型稳定分化中或已分化的细胞作为供体细胞(第一细胞)用于治疗生物体第二器官的用途，所述第二器官是退化的和/或处于病理阶段，其具有退化和/或处于病理阶段的第二细胞，第一器官的细胞用作供体细胞，其中所述第一器官在器官类型上不同于所述第二器官，并且在预定的表达基因和/或表型性能之组合方面处于正常生理状态的第一器官的细胞具有与处于正常生理状态的所述第二细胞相反的性能。

3.治疗生物体器官(第二器官)的方法，所述器官是退化的和/或处于病理阶段，其具有退化和/或处于病理阶段的细胞(第二细胞)，其中将表型稳定分化中或已分化的细胞作为第一器官的供体细胞(第一细胞)来施用，其中所述第一器官在器官类型上不同于所述第二器官，并且在预定的表达基因和/或表型性能之组合方面处于正常生理状态的第一器官的细胞具有与处于正常生理状态的所述第二细胞相反的性能。

4.根据前述权利要求中任一项的用途/方法，其特征在于，所述处于退化和/或病理状态的第二细胞在预定的表达基因和/或表型性能之组合方面具有与其正常生理状态相反的性能。

5.根据前述权利要求中任一项的用途/方法，其特征在于，在预定的表达基因和/或表型性能之组合方面处于其正常生理状态下的供体细胞与退化和/或处于病理状态的所述细胞相等同和/或具有相同的性能。

6.根据前述权利要求中任一项的用途/方法，其特征在于，与所述第二细胞相比，在预定的表达基因和/或表型性能之组合方面，所述供体细胞具有从正常生理状态到退化和/或病理状态的相反分化程序。

7.表型稳定分化中或已分化的生物体特定第一细胞类型细胞用于生产用于保护和/或再生退化和/或处于病理阶段的生物体特定第二细胞类型细胞之药物的用途，在预定的表达基因和/或表型性能之组合方面处于正常生理状态的所述第一细胞类型细胞具有与处于正常生理状态的所述第二细胞类型细胞相反的性能。

8.表型稳定分化中或已分化的生物体特定第一细胞类型细胞用于保护和/或再生退化和/或处于病理阶段的生物体特定第二细胞类型细胞的用途，处于正常生理状态的所述第一细胞类型细胞在预定的表达基因和/或表型性能之组合方面具有与处于正常生理状态的所述第二细胞类型细胞相反的性能。

9.保护和/或再生退化和/或处于病理阶段的生物体特定第二类型细胞的方法，其中应用表型稳定分化中或已分化的生物体特定第一细胞类型的细胞，在特定的表达基因和/或表型性能之组合方面处于正常生理状态的所述第一细胞类型细胞具有与处于正常生理状态的所述第二细胞类型细胞相反的性能。

10.根据前述权利要求中任一项的用途/方法，其特征在于，所述表型稳定分化中或已分化的细胞处于正常生理状态。

11.根据权利要求7-10中任一项的用途/方法，其特征在于，所述处于退化和/或病理状态的第二细胞类型细胞在预定的表达基因和/或表型性能之组合方面具有与其正常生理状态相反的性能。

12.根据权利要求7-11中任一项的用途/方法，其特征在于，所述处于正常生理状态的第一细胞类型细胞在预定的表达基因和/或表型性能之组合方面与退化和/或处于病理状态的所述第二细胞类型细胞相等同和/或具有相同的性能。

13.根据权利要求7-12中任一项的用途/方法，其特征在于，所述处于正常生理状态的第一细胞类型细胞在预定的表达基因和/或表型性能之组合方面具有与退化和/或处于病理状态的所述第二细胞类型细胞相对和/或相反的活化、调控和/或分化状态。

14.根据权利要求7-12中任一项的用途/方法，其特征在于，在预定的表达基因和/或表型性能之组合方面，所述处于正常生理状态的第一细胞类型细胞的活化、调控和/或分化的程度与退化和/或处于病理状态下的所述第二细胞类型细胞的活化、调控和/或分化的程度相反。

15.根据前述权利要求中任一项的用途/方法，其特征在于，所述第二细胞与所述供体细胞，或者所述第一细胞类型细胞与所述第二细胞类型细胞，在其各自器官中都具有器官组织稳态、不同器官区室之间物质转移、器官解毒和/或器官再生的功能。

16.根据前述权利要求的用途/方法，其特征在于，所述预定的表达基因和/或表型性能之组合实现以下范围内的功能：器官组织稳态、不同器官区室之间物质转移、器官解毒和/或器官再生。

17.根据前述权利要求中任一项的用途/方法，所述退化和/或处于病理阶段的器官的细胞或者所述第二类型的细胞的至少一种或多种预定功能和/或性能降低和/或丧失。

18.根据前述权利要求中任一项的用途/方法，所述生物体是脊椎动物和/或哺乳动物。

19.根据前述权利要求中任一项的用途/方法，所述生物体是人。

20.根据前述权利要求中任一项的用途/方法，所述供体细胞或所述第一细胞类型细胞产生作为保护性因子的预定的细胞性能和/或功能。

21.根据前述权利要求中任一项的用途/方法，所述供体细胞或所述第一细胞类型细胞产生一种或多种因子，其对于所述第二细胞或所述第二类型细胞来说是特异性的并且促进生长和/或再生，所述第二细胞或所述第二细胞类型细胞不产生所述因子或者产生不充分。

22.根据前述权利要求中任一项的用途/方法，使用/施加GFAP阳性细胞，特别是血管周围GFAP阳性细胞。

23.根据前述权利要求的用途/方法，所使用/施加的细胞产生促红细胞生成素和/或BDNF和/或金属硫蛋白和/或谷氨酰胺合成酶和/或NGF和/或I型胶原和/或GPR 49和/或另外的保护性因子。

24.根据前述权利要求中任一项的用途/方法，使用/施加神经胶质细胞。

25.根据前述权利要求中任一项的用途/方法，其用于治疗非神经器官的纤维化疾病，使用/施加表型稳定分化中或已分化的星形细胞或者具有类似分化程序的细胞。

26.根据前述权利要求中任一项的用途/方法，其用于治疗肝硬化，使用/施加表型稳定分化中或已分化的星形细胞或者具有类似分化程序的细胞。

27.根据权利要求25的用途/方法，其用于治疗肾纤维化，使用/施加表型稳定分化中或已分化的星形细胞或者具有类似分化程序的细胞。

28.根据权利要求1-23的用途/方法，其用于治疗神经退行性疾病，使用/施加表型稳定分化中或已分化的肝星状细胞和/或系膜细胞或者具有类似分化程序的细胞。

29.根据权利要求1-23和28的用途/方法，其用于治疗特征为神经元和/或其功能损失的疾病和/或器官特异性稳态的疾病，使用/施加表型稳定分化中或已分化的肝星状细胞、系膜细胞、胰腺星状细胞、脾脏树突细胞和/或皮肤成纤维细胞。

30.根据权利要求1-23和28-29的用途/方法，其用于治疗阿尔茨海默病，使用/施加表型稳定分化中或已分化的肝星状细胞、系膜细胞、胰腺星状细胞、脾脏树突细胞和/或皮肤成纤维细胞。

31.根据权利要求1-23和28-29的用途/方法，其用于治疗多发性硬化，使用/施加表型稳定分化中或已分化的肝星状细胞、系膜细胞、胰腺星状细胞、脾脏树突细胞和/或皮肤成纤维细胞。

32.根据权利要求1-23和28-29的用途/方法，其用于治疗帕金森病，使用/施加表型稳定分化中或已分化的肝星状细胞、系膜细胞、胰腺星状细胞、脾脏树突细胞和/或皮肤成纤维细胞。

33.根据权利要求1-23和28-29的用途/方法，其用于治疗中风，使用/施加表型稳定分化中或已分化的肝星状细胞、系膜细胞、胰腺星状细胞、脾脏树突细胞和/或皮肤成纤维细胞。

34.药剂，其特征在于，在至少一种或多种预定的细胞性能和/或功能方面，其包含表型稳定分化中或已分化的细胞。

35.根据权利要求34的药剂，其特征在于，所述表型稳定分化中或已分化的细胞产生作为保护性因子的预定的细胞性能和/或功能。

36.根据权利要求34-35中任一项的药剂，其特征在于，所述表型稳定分化中或已分化的细胞是GFAP阳性细胞，特别是血管周围GFAP阳性细胞。

37.根据权利要求34-36中任一项的药剂，其特征在于，所述表型稳定分化中或已分化的细胞是神经胶质细胞。

38.根据权利要求30-36中任一项的药剂，其特征在于，所述表型稳定分化中或已分化的细胞是星形细胞或具有类似分化程序的细胞。

39.根据权利要求30-36中任一项的药剂，其特征在于，所述表型稳定分化中或已分化的细胞是肝星状细胞、系膜细胞、胰腺星状细胞、脾脏树突细胞和/或皮肤成纤维细胞。

Images