CN101845490B - 紫薇微卫星分子标记及在紫薇远缘杂交后代鉴定中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种紫薇微卫星DNA分子标记，其包括12个紫薇的微卫星位点。本发明还提供了该紫薇微卫星DNA分子标记的筛选方法及其在鉴定紫薇与尾叶紫薇远缘杂交后代中的应用。此外，本发明还提供了扩增该12个紫薇微卫星位点的引物序列和扩增方法，同时筛选出2个适用于鉴定紫薇品种‘俏佳人’、‘白云映霞’、‘XTSC3’、‘粉蝴蝶’、‘多花粉’和尾叶紫薇杂交后代的DNA分子标记，建立了紫薇微卫星DNA分子标记技术体系，在紫薇与尾叶紫薇育种实践中，利用这些DNA分子标记可以快速鉴定种间杂交后代的真实性，提高紫薇种质创新和杂交育种效率，重复性好，是一种可靠有效的DNA分子标记。
Description
技术领域
本发明涉及DNA分子标记技术，具体地说，涉及一种紫薇微卫星DNA分子标记以及利用该标记鉴定紫薇与尾叶紫薇远缘杂交后代的方法。
背景技术
紫薇(Lagerstroemia indica)，属千屈菜科(Lythraceae)落叶灌木或小乔木，树皮光滑，花淡红、紫色或白色，径3-4厘米，圆锥花序，花瓣6，皱缩，具长爪，花期6-9月，果期9-12月。紫薇花期长，观赏性强，盛开在夏季，有长达1600多年的栽培历史。目前全世界约有紫薇品种260个(DIX，2005，Cultivars and names ofLagerstroemia，http://www.usna.usda.gov/；ZHANG，1991，Studies oncultivars of Crape-Myrtle(Lagerstroemia indica)and their uses in urbangreening，Journal of Beijing Forestry University，13(4)：59～68；张启翔等，2008，我国紫薇品种调查研究，中国园艺学会观赏园艺专业委员会学术年会论文集，56～65)，大多花色鲜艳、开花繁密，但未见有关培育芳香紫薇品种或早花紫薇品种的报道。尾叶紫薇(L.caudata)为紫薇属落叶大乔木，花期4-5月，花芳香。利用尾叶紫薇与紫薇进行远缘杂交，可培育出具有花香、早花性状的紫薇品种。
研究表明紫薇具有一定的自交亲和性(POUNDERS等，2006，Comparison of self-and cross-pollination on pollen tube growth，seeddevelopment，and germination in crapemyrtle，HortScience，41(3)：575～578)，因此杂交后代可能混杂有部分自交后代。另外，尾叶紫薇和部分紫薇品种的播种实生苗开花需要2～3年时间，这些因素导致紫薇育种工作进展缓慢。利用分子标记手段对杂交后代进行早期鉴定可以提高后代选择效率、缩短育种周期。
简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)，也称微卫星DNA(microsatellite)，是一种由2～5个核苷酸为单位多次串联重复的长达几十甚至几百个核苷酸的序列。这些序列广泛存在于真核生物基因组的不同座位上，每个座位重复单位的数量可能不完全相同，因而形成多态性。由于其具有多态性丰富、重复性高、共显性遗传等优点，被广泛应用于植物的杂种后代鉴定、遗传多样性分析、指纹图谱构建等领域。有研究者利用SSR标记对紫薇和大花紫薇(L.speciosa)远缘杂交后代进行亲子鉴定(Pounders等，2007，Evaluation ofInterspecific Hybrids between Lagerstroemia indica and L.speciosa.HORTSCIENCE，42(6)：1317～1322)。目前已发表的紫薇SSR位点只有15个，无法利用这些SSR位点有效地开展紫薇和尾叶紫薇远缘杂交的分子标记辅助育种工作。因此，开发全新的、多态性高的SSR标记在紫薇育种方面具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种紫薇微卫星DNA分子标记。
本发明的另一目的是提供上述DNA分子标记的筛选方法。
本发明的还一目的是提供上述DNA分子标记在鉴定紫薇与尾叶紫薇远缘杂交后代中的应用。
本发明的再一目的是提供上述DNA分子标记在紫薇筛选或辅助育种中的应用。
本发明更进一步的目的是提供紫薇品种‘俏佳人’、‘白云映霞’、‘XTSC3’、‘粉蝴蝶’、‘多花粉’与尾叶紫薇杂交后代的DNA分子标记。
为了实现本发明目的，本发明的一种紫薇微卫星DNA分子标记，其中扩增所述分子标记的引物选自如下引物对：
1)CI3F F：5′-GAATCAATTACTTTGGGTTG-3′
CI3F R：5′-TGCCTTGTCTACGGTTTT-3′
2)CI5D F：5′-GATTCCCTCCTCCCATTC-3′
CI5D R：5′-TTGAGCCGTCTCGTGTCT-3′
3)CI5G F：5′-CTCTCAAATGACCCTCTT-3′
CI5G R：5′-TTGAGTAATAACAAGTCCC-3′
4)CI6H F：5′-GAGTTCATGCAGTTAGGT-3′
CI6H R：5′-ATATCGGATTTATCTTCC-3′
5)CI7H F：5′-TCTACCTGGGAAATGTTA-3′
CI7H R：5′-GTTGAGTCCTCCTCTGTT-3′
6)CII1A F：5′-GGAAGAGGGATTGGAACC-3′
CII1A R：5′-TCTCACTGAAAGAAACTA-3′
7)CII1C F：5′-ACGGTAGATAAGGTGAGC-3′
CII1C R：5′-GGTTTCGTATCGTCGTAG-3′
8)CII1D F：5′-TACTGGGTATCCGTTTCT-3′
CII1D R：5′-ACAGGTGCATTTACTTCC-3′
9)CII1E F：5′-TGATGGTGGTAATGCTGGTG-3′
CII1E R：5′-TCTTCTATAGGCCCATGCAG-3′
10)CII6A F：5′-TCCGAGTCTGACAGAGGT-3′
CII6A R：5′-TATAACGGGTGTATGAAG-3′
11)CII7E F：5′-TTCTGACCCAGCAGTAAA-3′
CII7E R：5′-CGTATCTCATCTGTAGCGTA-3′
12)CII12HF：5′-GGGAATTTGGGATATGGA-3′
CII12HR：5′-TAAAGAAACGACCGAGCC-3′
前述的DNA分子标记，其选自编号分别为CI3F、CI5D、CI5G、CI6H、CI7H、CII1A、CII1C、CII1D、CII1E、CII6A、CII7E、CII12H的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.12所示。
本发明的一种紫薇微卫星DNA分子标记的筛选方法，其包括以下步骤：
(1)提取紫薇基因组DNA，用内切酶Rsa I进行酶切，得到大小为300～1000bp的DNA片段；
(2)将寡核苷酸SuperSNX24F(5’-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC-3’)和末端磷酸化的SuperSNX24R(5’-pGATTCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA-3’)等摩尔混合，形成接头；
(3)将步骤(2)的接头与步骤(1)的酶切产物连接；
(4)以SuperSNX24F为引物，步骤(3)的连接产物为模板，进行PCR反应，富集大小为300～1000bp的DNA片段；
(5)合成3’Biotin标记的探针20种，分为三组，按照[Group2＝(AG)12，(TG)12，(AAC)6，(AAG)8，(AAT)12，(ACT)12，(ATC)8；Group3＝(AAAC)6，(AAAG)6，(AATC)6，(AATG)6，(ACAG)6，(ACCT)6，(ACTC)6，(ACTG)6；Group4＝(AAAT)8，(AACT)8，(AAGT)8，(ACAT)8，(AGAT)8]等体积混合，其中所有探针浓度均为100μM，将混合好的探针稀释100倍待用；
(6)将步骤(4)的DNA片段分别与步骤(5)的三组探针进行杂交；
(7)向杂交后的溶液中加入磁珠，洗涤磁珠；
(8)向洗涤后的磁珠中加入TE，得到含有微卫星DNA片段的上清液；
(9)以SuperSNX24F为引物，步骤(8)的上清液为模板，进行PCR反应，得到目的片段；
(10)将步骤(9)的扩增产物转化至大肠杆菌中，筛选转化子，进行菌液PCR扩增，将产物大小为500～1200bp的菌液测序，得到35个微卫星序列，其中包含微卫星位点39个；
(11)根据微卫星位点两端的侧翼序列设计引物并以8株紫薇个体基因组DNA为模板进行SSR-PCR扩增，产物用6％聚丙烯酰胺凝胶结合银染检测，筛选具有多态性的引物；
(12)得到紫薇微卫星多态标记12个，其编号分别为CI3F、CI5D、CI5G、CI6H、CI7H、CII1A、CII1C、CII1D、CII1E、CII6A、CII7E、CII12H，其核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.12所示。
利用本发明的紫薇微卫星DNA分子标记鉴定紫薇与尾叶紫薇杂交后代的真实性，具体方法为：
(1)分别对CI3F、CI5D、CI5G、CI6H、CI7H、CII1A、CII1C、CII1D、CII1E、CII6A、CII7E、CII12H位点的特异性引物的正向序列的5’端进行6-FAM或JOE标记；
(2)提取紫薇与尾叶紫薇杂交后代的基因组DNA；
(3)分别用CI3F、CI5D、CI5G、CI6H、CI7H、CII1A、CII1C、CII1D、CII1E、CII6A、CII7E、CII12H位点的特异性引物，扩增紫薇与尾叶紫薇杂交后代的基因组DNA；
所述特异性引物的序列分别为：
CI3F F：5′-6-FAM GAATCAATTACTTTGGGTTG-3′
CI3F R：5′-TGCCTTGTCTACGGTTTT-3′
CI5D F：5′-6-FAM GATTCCCTCCTCCCATTC-3′
CI5D R：5′-TTGAGCCGTCTCGTGTCT-3′
CI5G F：5′-6-FAM CTCTCAAATGACCCTCTT-3′
CI5G R：5′-TTGAGTAATAACAAGTCCC-3′
CI6H F：5′-JOE GAGTTCATGCAGTTAGGT-3′
CI6H R：5′-ATATCGGATTTATCTTCC-3′
CI7H F：5′-6-FAM TCTACCTGGGAAATGTTA-3′
CI7H R：5′-GTTGAGTCCTCCTCTGTT-3′
CII1A F：5′-6-FAM GGAAGAGGGATTGGAACC-3′
CII1A R：5′-TCTCACTGAAAGAAACTA-3′
CII1C F：5′-JOEACGGTAGATAAGGTGAGC-3′
CII1CR：5′-GGTTTCGTATCGTCGTAG-3′
CII1D F：5′-JOE TACTGGGTATCCGTTTCT-3′
CII1D R：5′-ACAGGTGCATTTACTTCC-3′
CII1E F：5′-JOE TGATGGTGGTAATGCTGGTG-3′
CII1E R：5′-TCTTCTATAGGCCCATGCAG-3′
CII6A F：5′-JOE TCCGAGTCTGACAGAGGT-3′
CII6A R：5′-TATAACGGGTGTATGAAG-3′
CII7E F：5′-6-FAM TTCTGACCCAGCAGTAAA-3′
CII7E R：5′-CGTATCTCATCTGTAGCGTA-3′
CII12HF：5′-JOE GGGAATTTGGGATATGGA-3′
CII12HR：5′-TAAAGAAACGACCGAGCC-3′
(4)分析PCR产物；
(5)为了对得到的杂交子代进行DNA分子鉴定，首先筛选出在父母本中扩增出不同谱带类型的SSR引物作为杂种鉴定的标记，然后对子代连同亲本进行PCR扩增，当子代显示出双亲的谱带类型时，可鉴定为真实杂种。
利用本发明的紫薇微卫星DNA分子标记可以进行紫薇遗传多样性分析、指纹图谱构建和分子标记辅助育种。
利用本发明的紫薇微卫星DNA分子标记鉴定紫薇品种‘俏佳人’、‘白云映霞’、‘XTSC3’、‘粉蝴蝶’、‘多花粉’和尾叶紫薇杂交后代的真实性，从中筛选出2个适用于鉴定紫薇品种‘俏佳人’、‘白云映霞’、‘XTSC3’、‘粉蝴蝶’、‘多花粉’和尾叶紫薇杂交后代的DNA分子标记CI3F和CII7E。利用两对在父母本中扩增出不同谱带类型的SSR引物对子代连同亲本一起进行了PCR扩增。其中每个杂交组合选择8～16株，结果如图1～图5所示。由图1～图5可以看出，这两对引物在父母本中扩增出不同的谱带，而子代群体分别显示出双亲的谱带，即为杂种类型。
本发明的优点在于，提供了12个紫薇的微卫星位点及扩增该12个微卫星位点的引物序列和扩增方法，建立了紫薇的微卫星DNA分子标记技术体系，并利用这些标记进行紫薇遗传多样性分析、指纹图谱构建和分子标记辅助育种，在紫薇与尾叶紫薇育种实践中，利用这些DNA分子标记可以快速鉴定种间杂交后代的真实性，有利于高效地获得杂种后代，加快紫薇杂交育种进程，重复性好，是一种可靠有效的DNA分子标记。
附图说明
图1为紫薇‘俏佳人’与尾叶紫薇杂交后代在CII7E位点上的STR分型图；
图2为紫薇‘白云映霞’与尾叶紫薇杂交后代在CII7E位点上的STR分型图；
图3为紫薇‘XTSC3’与尾叶紫薇杂交后代在CII7E位点上的STR分型图；
图4为紫薇‘粉蝴蝶’与尾叶紫薇杂交后代在CI3F位点上的STR分型图；
图5为紫薇‘多花粉’与尾叶紫薇杂交后代在CI3F位点上的STR分型图；
其中，图1～图5中：1代表尾叶紫薇；2代表‘俏佳人’；3代表‘白云映霞’；4代表‘XTSC3’；5代表‘粉蝴蝶’；6代表‘多花粉’，其它为相应杂交组合的后代个体；图中横坐标代表扩增产物大小，纵坐标代表扩增强度。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1紫薇与尾叶紫薇杂交后代的获得
选择紫薇(Lagerstroemia indica)品种‘俏佳人’、‘白云映霞’、‘XTSC3’、‘粉蝴蝶’、‘多花粉’与尾叶紫薇(L.caudata)进行杂交。花药散粉前，将紫薇、尾叶紫薇长、短雄蕊的花药混采后置于变色硅胶中干燥6h，用80目分子筛收集花粉，置4℃保存。授粉前采用悬滴法测定各亲本花粉的活力，培养基为150g/L蔗糖+20mg/L硼酸+20mg/L氯化钙+100g/L PEG4000，培养条件为25℃，6h。各亲本花粉的活力大于35％时方可用于授粉。
选择当天开花量大的花序，于早5:00～7:00剖开即将开放的花朵，去掉花冠、花药和未开的花蕾，套袋隔离。早9:00～10:30进行授粉，授粉采用常规柱头授粉法，授粉后继续套袋，一周后去除套袋。授粉于7～8月进行。
果实成熟后，外果皮木质化。此时采集杂交果实，保存于21℃。果实开裂后收集种子，播种前将种子去翅，点播于装有泥炭基质(0～20mm)的288孔穴盘中，播种后孔穴内再覆盖一层基质。将穴盘置于33℃/21℃(昼/夜)培养箱中培养，每天浇水1次，保持基质湿润，一个月后种子萌发。待实生苗长出3对真叶后移栽至营养钵(8cm×8cm)中，每隔2天浇水1次，每周浇1次Hogland营养液。
实施例2紫薇微卫星文库的构建
包括如下步骤：
(1)提取紫薇基因组DNA(DNA secure Plant Kit，购自天根生物)，用内切酶Rsa I和Xmn I进行酶切，酶切体系为：2.5μL连接缓冲液(NEB)，0.25μL 100×BSA(NEB)，0.25μL NaCl(5M)，1μLRsa I(NEB)，1μL Xmn I(NEB)，20μL DNA(100ng/L)，于37℃，酶切40小时，得到大小为300～1000bp的DNA片段；
(2)将10μM寡核苷酸SuperSNX24F(5’-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC-3’)和末端磷酸化的SuperSNX24R(5’-pGATTCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA-3’)等体积混合，95℃变性10分钟，缓慢冷却至室温，形成接头；
(3)将步骤(2)的接头7μL、T4DNA连接酶(NEB)2μL和10×连接缓冲液1μL混合后，加入到(1)的酶切产物中，22℃连接2小时后，置于4℃连接40小时以上；
(4)以SuperSNX24F为引物，步骤(3)的连接产物为模板，进行PCR反应，反应体系为2.5μL 10×PCR缓冲液，2.5μL BSA，1.3μL SuperSNX24F(10μM)，1.5μL dNTPs(各2.5mM)，2μL MgCl2(25mM)，13μL dH2O，0.2μL Taq酶(5U/μL)，2μL连接产物；反应程序为95℃2min；95℃20sec，60℃20sec，72℃1.5min，35个循环反应；15℃保温，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，富集大小为300～1000bp的DNA片段；
(5)合成3’Biotin标记的探针20种，分为三组，分别按照[Group2＝(AG)12，(TG)12，(AAC)6，(AAG)8，(AAT)12，(ACT)12，(ATC)8；Group3＝(AAAC)6，(AAAG)6，(AATC)6，(AATG)6，(ACAG)6，(ACCT)6，(ACTC)6，(ACTG)6；Group4＝(AAAT)8，(AACT)8，(AAGT)8，(ACAT)8，(AGAT)8]等体积混合(所有探针浓度均为100μM)，将混合好的探针稀释100倍待用；
(6)将步骤(4)的DNA片段分别与步骤(5)三组探针进行杂交；杂交过程为：将25μL 2×杂交溶液(12×SSC，0.2％SDS)，10μL生物素标记的一组探针，10μL步骤(4)的DNA片段，5μL dH2O混合，在PCR仪中进行杂交；杂交程序为：95℃5min，然后迅速降温到70℃，再以0.04℃/sec的速率降温到50℃，然后在50℃保温10min，再以0.1℃/sec的速率降温到40℃，最后迅速降温到15℃保温；
(7)加入50μL平衡后的磁珠(10mg/mL，Dynabeads M-280，Invitrogen)，室温轻摇30分钟，使磁架分离，去除溶液；
(8)用400μL W1洗液(2×SSC，0.1％SDS)的清洗磁珠2次，弃溶液；用400μL W2洗液(1×SSC，0.1％SDS)清洗磁珠2次，弃溶液；加入400μL W2洗液，40℃轻摇2分钟，弃溶液；加入400μLW2洗液，50℃轻摇2分钟，弃溶液；加入400μL W2洗液，45℃轻摇2分钟，弃溶液；
(9)重复步骤(7)一次；
(10)加入200μL TE，95℃保温5min，磁架分离后，得到含有微卫星DNA片段的上清液；
(11)以SuperSNX24F为引物，步骤(10)的上清液为模板，按照步骤(4)的反应体系和反应程序进行PCR反应，得到目的片段；
(12)将步骤(11)的扩增产物连接到pCR2.1-TOPO(InvitrogenTOPO Cloning Kit)载体上，然后将连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将转化菌液涂布在含有50μg/mL氨苄青霉素和40mg/mLX-gal的LB固体培养基平板上进行蓝白斑筛选。
实施例3含紫薇微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序以及紫薇微卫星引物的设计
包括如下步骤：
(1)用牙签挑取136个白色菌落并接种到含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，150rmp培养40小时。以菌液为模板，进行PCR反应；
PCR反应体系为：2.5μL 250μg/mL BSA，2.5μL 10×PCR缓冲液，1μL 10mM引物M13F：5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’，1μL 10mM引物M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’，2μL 25mM MgCl2，1.5μL 2.5mM dNTP，0.2μL TaqDNA聚合酶，1.5μL菌液，12.8μLdH2O；反应程序：95℃3min；35个循环反应，95℃20sec，50℃20sec，72℃1.5min，15℃保温；
(2)用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，选取PCR条带单一，产物大小为500～1200bp的菌液进行测序，得到35个微卫星序列，其中包含微卫星位点39个；
(3)根据微卫星位点两端的侧翼序列设计引物并以8株紫薇个体基因组DNA为模板进行SSR-PCR扩增，10μL反应体系为包括10ng基因组DNA，1×PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM KCl，pH8.3)，dNTPs(各250μM)，MgCl2(1.5mM)，正、反向引物(各0.5μM)，Taq酶(0.5U)，反应程序为95℃3min；95℃30sec，最佳退火温度(48～52℃)30sec，72℃1min，30个循环反应；72℃5min，15℃保温，将各PCR产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上检测各引物多态性，筛选出非特异性条带扩增少、结果稳定、多态性丰富的微卫星标记12个，分别为CI3F、CI5D、CI5G、CI6H、CI7H、CII1A、CII1C、CII1D、CII1E、CII6A、CII7E、CII12H，其核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.12所示。
实施例4利用紫薇微卫星DNA分子标记鉴定紫薇与尾叶紫薇杂交后代的真实性
具体方法为：
(1)分别对CI3F、CI5D、CI5G、CI6H、CI7H、CII1A、CII1C、CII1D、CII1E、CII6A、CII7E、CII12H位点的特异性引物的正向引物的5’端进行6-FAM或JOE标记；
(2)提取紫薇与尾叶紫薇杂交后代的基因组DNA(DNA securePlant Kit，购自天根生物)；
(3)分别用CI3F、CI5D、CI5G、CI6H、CI7H、CII1A、CII1C、CII1D、CII1E、CII6A、CII7E、CII12H位点的特异性引物，扩增紫薇与尾叶紫薇杂交后代的基因组DNA。10μL反应体系为包括10ng基因组DNA，1×PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM KCl，pH 8.3)，dNTPs(各250μM)，MgCl2(1.5mM)，正、反向引物(各0.5μM)，Taq酶(0.5U)，反应程序为95℃3min；30个循环反应，95℃30sec，最佳退火温度(48～52℃)30sec，72℃1min；72℃5min，15℃保温；
所述特异性引物的序列分别为：
CI3F F：5′-6-FAMGAATCAATTACTTTGGGTTG-3′
CI3F R：5′-TGCCTTGTCTACGGTTTT-3′
CI5D F：5′-6-FAMGATTCCCTCCTCCCATTC-3′
CI5D R：5′-TTGAGCCGTCTCGTGTCT-3′
CI5G F：5′-6-FAMCTCTCAAATGACCCTCTT-3′
CI5G R：5′-TTGAGTAATAACAAGTCCC-3′
CI6H F：5′-JOEGAGTTCATGCAGTTAGGT-3′
CI6H R：5′-ATATCGGATTTATCTTCC-3′
CI7H F：5′-6-FAMTCTACCTGGGAAATGTTA-3′
CI7H R：5′-GTTGAGTCCTCCTCTGTT-3′
CII1A F：5′-6-FAMGGAAGAGGGATTGGAACC-3′
CII1A R：5′-TCTCACTGAAAGAAACTA-3′
CII1C F：5′-JOEACGGTAGATAAGGTGAGC-3′
CII1C R：5′-GGTTTCGTATCGTCGTAG-3′
CII1D F：5′-JOETACTGGGTATCCGTTTCT-3′
CII1D R：5′-ACAGGTGCATTTACTTCC-3′
CII1E F：5′-JOETGATGGTGGTAATGCTGGTG-3′
CII1E R：5′-TCTTCTATAGGCCCATGCAG-3′
CII6A F：5′-JOETCCGAGTCTGACAGAGGT-3′
CII6A R：5′-TATAACGGGTGTATGAAG-3′
CII7E F：5′-6-FAMTTCTGACCCAGCAGTAAA-3′
CII7E R：5′-CGTATCTCATCTGTAGCGTA-3′
CII12HF：5′-JOEGGGAATTTGGGATATGGA-3′
CII12HR：5′-TAAAGAAACGACCGAGCC-3′
所述特异性引物的退火温度分别为：50℃、50℃、48℃、48℃、48℃、48℃、52℃、50℃、52℃、52℃、50℃、52℃。
(4)将PCR产物用ABI377遗传分析仪(Applied Biosystem公司)进行STR基因分型，使用GeneMapper 4.0软件(Applied Biosystem公司)判读等位基因的具体数值；
(5)为了对得到的杂交子代进行DNA分子鉴定，首先筛选出在父母本中扩增出不同谱带类型的SSR引物作为杂种鉴定的标记，然后对子代连同亲本进行PCR扩增，当子代显示出双亲的谱带类型时，可鉴定为真实杂种。
利用紫薇微卫星DNA分子标记鉴定紫薇品种‘俏佳人’、‘白云映霞’、‘XTSC3’、‘粉蝴蝶’、‘多花粉’和尾叶紫薇杂交后代真实性的结果如图1～图5所示，由图1～图5可见，本发明筛选出的2个微卫星序列CI3F(如SEQ ID No.1所示)和CII7E(如SEQ ID No.11所示)可以鉴定出紫薇品种和尾叶紫薇远缘杂交的真实杂种。由此可见，本发明的微卫星标记能够用于紫薇和尾叶紫薇的杂种鉴定，是一种可靠有效的分子标记。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>北京林业大学
<120>紫薇微卫星分子标记及在紫薇远缘杂交后代鉴定中的应用
<130>KHP09113882.2
<160>40
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>440
<212>DNA
<213>Lagerstroemia indica
<400>1
ttctgatgac aaaaggtgca aaagagaata agaagacgta agcatgtgaa tcaattactt 60
tgggttgaaa gagaataaac catgcaggat ttacatgtaa accctttaaa aaagaaagaa 120
agaaagaaag aaattagcta gagagcaggt atattggaat ttgacaataa tttgcgattt 180
atcttcagga gctaaatgat aggaattcat caatagccac caaggagtga aaatccatat 240
accaaaaatg aaagattaaa agccatttct cttgctcaat atgtctacca gagtatcctc 300
aaaattcttt tatggctaac tgaaatttac tttacagtct ccacattaat aaataattgg 360
atatccctgg gtattcaagt aaaaaccgta gacaaggcat agctccagta attcccaata 420
aataatttca aagtatgatg 440
<210>2
<211>294
<212>DNA
<213>Lagerstroemia indica
<400>2
accaaaagca aaaggaaagg aaaggaaagg aaaggaaagg aaactccgca gcatcacatt 60
ctattcttcc actcactgtc actgattccc tcctcccatt catacccaaa taattccttc 120
atggttaatt agttctctct ctataccttt tttttttttt tttaaatttc attaaaaaat 180
tccacttcat atctatctat ctatctatat catatcagcc agcctgccct gccactgggc 240
ttcgcagaca cgagacggct caaatagtcc attttttacc caacccccgg cccc 294
<210>3
<211>360
<212>DNA
<213>Lagerstroemia indica
<400>3
ctactctcaa atgaccctct tgagcatact tatctatcag attgggtcag cccattttga 60
ttaaaaaagg agcaaaagga tattcaaata aagaaaagaa agaaagaaag aaagataatg 120
aaagttttga attacctaag cagcatggca ctgggaggga gcggcagtcc aagatagtgg 180
agtccagagg aatgttggaa aagaaaccct ctgcataaaa agcaaaggca acactttatg 240
ggacttgtta ttactcaaga aaaagatggg caaagaaagc attatacttt atgggagctc 300
gcacagtgaa atcactcttc gactttggac aaaagctggt ctgctctcgg cacttttggt 360
<210>4
<211>267
<212>DNA
<213>Lagerstroemia indica
<400>4
cgtcaaaggg gcaaaaactt tctacaaaat atcggtcaat atttccggga agaaatagat 60
gtgaaacttg agttcatgca gttaggttcg accgaccaat aaaactaaat ttttttttaa 120
aaaatagaag tgaaaaaaaa atgaagaaga agaagaagaa gacaattaat gttttgaaat 180
gggaagataa atccgatatt gttcttcagg taatttaaaa tgcatggtag agtctaaagt 240
ttcgaaaatg tcaattaaat tattttt 267
<210>5
<211>516
<212>DNA
<213>Lagerstroemia indica
<400>5
caagcagatt atcaattcct gggcggtatg ccctgtgttg aattggatac atcacaatga 60
tctctattat catccccaaa gcaattgaac atatacagaa attcccgata gcagtcagca 120
ccttcaacat catgaaacaa gaaatgatta gattaaaata aaaccttcaa gaaaataggc 180
gcattattgg attactctac ctgggaaatg ttagaactgg aagctataca agatcactga 240
aaacaacaac aacaacaaca acaacaacaa atatttacat agaaacgtaa tggctgttgg 300
aagttgctga aaaagtggca attctttgat gtttaaaggg gtcattggtt tgcaatcagt 360
cttcgctgag atcaacaaag tcccattcat ccatccaaaa aagacgagat aaagattgtc 420
tcaggaagtc agcaatggaa cctctaaaac aaagcagggt taacagagga ggactcaaca 480
ggatgcaaat gaatttgaaa ttaatctatt cagggt 516
<210>6
<211>346
<212>DNA
<213>Lagerstroemia indica
<400>6
actagacttc ttcttctctc ggaagcgcgt aactttttta tgcatctgtc tatatatatt 60
gctctcatat atgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgttgctat tcatgaaacc ctagcatacg 120
gccttttccg aactgaagca gaagagaaag aaaaggcgtg aggtccgaac ggtggacgag 180
agagagaggg gtaagaaaga gacgggaaga gggattggaa cctctgtatc cattcagctc 240
ccggtatctg atactctgga acatcgttaa tggaagaaat ggagattgtg aacgtctgag 300
agagagaggg aggaggagga tagtttcttt cagtgagagc tgaaat 346
<210>7
<211>306
<212>DNA
<213>Lagerstroemia indica
<400>7
aattcgatct actattaaga aaactctcta atacataaat ttatgaataa actcatcatt 60
gtaataaaaa aaaattcaaa ttcatgttat catatgaact gtcacacggt agataaggtg 120
agcacgggag caggtgatca gatcaaccac tatctctctc tctctctctc ttctgtgtct 180
gtctgtctgt ctgtctatgg gtcagcagtg gcgacagaca gagaagacag agactgaccc 240
taaagccttt gagctacgac gatacgaaac ccaaaaacct tacacagata tataaatatg 300
gggccg 306
<210>8
<211>354
<212>DNA
<213>Lagerstroemia indica
<400>8
actacgttaa ccttgaatat actagcacta ctactgggta tccgtttctc aagcatccga 60
gtagttgatt ttgcagtgag cattttgaca ctaggagcaa agttcaaaat gtatctcttc 120
tttttaccag cagtaataat cgaaccgtgt caatcttcga gcaccaaata atgggatcca 180
ggcaaaagtc atatatgttc agggttctta ctatatcaac gcagctcctc cacagtaatt 240
actttatgtg acattttatc gtatgcatag gcccaagaga atctctctct ctctctctct 300
ctctctccct ctctctctct cccccatccc ggaagtaaat gcacctgtct tttg 354
<210>9
<211>370
<212>DNA
<213>Lagerstroemia indica
<400>9
tttctaatta acaattcaga tgctttatac tcaatcttac catgttgatt atattgttag 60
caagacaagt ttccattttg acaggtccat ggatgacact gtagagagtg tcatttctaa 120
agttcgccga gcgttgaaca tggacggact tgatggtggt aatgctggtg agctaccttt 180
gcctaagcaa ttgttttctt tctttctttc tttcctagaa aaaaaagagt tccaaactag 240
gaaactcatc tgagttaaag agcaggcctc tatgcactat ttcttgtccg gacaaaaccc 300
caatttaagg cttggaaaat ctgcatgggc ctatagaaga ctcccaaaaa cctaagttac 360
taggtagtgg 370
<210>10
<211>588
<212>DNA
<213>Lagerstroemia indica
<400>10
acacgcagaa aaggttgatc agatgggcgt gtgttatagt gaacgagaga gagttttgta 60
aaactttcaa tgcaaacctt ttcaataccg aaacggcagt tttgtcatag tgaatgagag 120
atctcaatga caagttcaaa tgtggaactt ttgaattcag ggtccgagtc tgacagaggt 180
ctcagttatc ttattggcat gtcaatagtg aacgagatct catgagccat taacggtatc 240
cagtcttgca gagtcatgcg atcaaaagag ttttgtaaac ttttccatat gtcactggag 300
atcatcctct cgactattga tgcctgctct gagagagaga gagagagaga gagagggaga 360
gagagatctc atgagtcatt aacggtatcc agtcttgcac aatcatacga tcaagagagt 420
tttgtaaact tttccatatg tcactggaga tcatcctctc gactattgat gcctgctcta 480
ctttcttttg cagcttaact tcatacaccc gttatagatg atcttccgac catatcaaaa 540
ttcatcccga acggctaatc acaagtaata tctttcttgg caagaaag 588
<210>11
<211>354
<212>DNA
<213>Lagerstroemia indica
<400>11
accttggcat caagacacgc ccatagacac actacatgca aacctatgac atgttcttga 60
ctaagccagc cttcattctg acccagcagt aaaacacggt cagatactat acagggactc 120
acctctgatc actatatatc tggtctctca gcaatgaaga tgggtaggta ggtaggtagg 180
tagtttgtag tggtacgcta cagatgagat acgatcacct tacatgaatt acggcagggg 240
aagatttgtt ctctctcagt gaaaaccgtg gaggaccttc cgaggatcca actgcccact 300
gcagtaactc gacgagactg tagaaatctc ctgacggcct ctccactctt cgaa 354
<210>12
<211>432
<212>DNA
<213>Lagerstroemia indica
<400>12
catggttgca caaatttttg caagagaact cggggacttt tacgattatt tcagtgaaat 60
ctctgagact agtggtggct ggggtgtttt gaatcgtgat gcgactgctt tttagccttt 120
ctatttctgc tagagaactc aaatgaaatt ttgactggga atttgggata tggaccggct 180
tattatgtga ggtagagaaa aggaaccaaa aaagaaagag agaaagaaag aaagaaagaa 240
agaaaatctc aaaactaaag acaggatata agagggttag tggtgtgctt caagagctat 300
caggcttttg agtcagcggc tcggtcgttt ctttatttat cattttcctg ggaggcatgg 360
agtttggatg tcgaagtgcc ttttgttatg ttctgagatg tcaatccaca aagttctttt 420
gagaaccacg ag 432
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
gtttaaggcc tagctagcag aatc 24
<210>14
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
gattctgcta gctaggcctt aaacaaaa 28
<210>15
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
gtaaaacgac ggccag 16
<210>16
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
caggaaacag ctatgac 17
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
gaatcaatta ctttgggttg 20
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tgccttgtct acggtttt 18
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
gattccctcc tcccattc 18
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
ttgagccgtc tcgtgtct 18
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
ctctcaaatg accctctt 18
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
ttgagtaata acaagtccc 19
<210>23
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
gagttcatgc agttaggt 18
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
atatcggatt tatcttcc 18
<210>25
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
tctacctggg aaatgtta 18
<210>26
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
gttgagtcct cctctgtt 18
<210>27
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
ggaagaggga ttggaacc 18
<210>28
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
tctcactgaa agaaacta 18
<210>29
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
acggtagata aggtgagc 18
<210>30
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
ggtttcgtat cgtcgtag 18
<210>31
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
tactgggtat ccgtttct 18
<210>32
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
acaggtgcat ttacttcc 18
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
tgatggtggt aatgctggtg 20
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
tcttctatag gcccatgcag 20
<210>35
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
tccgagtctg acagaggt 18
<210>36
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
tataacgggt gtatgaag 18
<210>37
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
ttctgaccca gcagtaaa 18
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
cgtatctcat ctgtagcgta 20
<210>39
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
gggaatttgg gatatgga 18
<210>40
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
taaagaaacg accgagcc 18
Claims (6)
1.一种紫薇微卫星DNA分子标记，其特征在于，扩增所述分子标记的引物选自如下引物对：
1)CI3F F：5′-GAATCAATTACTTTGGGTTG-3′
CI3F R：5′-TGCCTTGTCTACGGTTTT-3′
2)CII7E F：5′-TTCTGACCCAGCAGTAAA-3′
CII7E R：5′-CGTATCTCATCTGTAGCGTA-3′。
2.如权利要求1所述的DNA分子标记，其选自如SEQ ID No.1或SEQ ID No.11所示的核苷酸序列。
3.权利要求1或2所述的紫薇微卫星DNA分子标记在鉴定紫薇与尾叶紫薇远缘杂交后代中的应用。
4.如权利要求1或2所述的紫薇微卫星DNA分子标记在鉴定紫薇品种‘俏佳人’、‘白云映霞’、‘XTSC3’、‘粉蝴蝶’和‘多花粉’与尾叶紫薇杂交后代中的应用。
5.权利要求1或2所述的紫薇微卫星DNA分子标记在紫薇筛选中的应用。
6.权利要求1或2所述的紫薇微卫星DNA分子标记在紫薇辅助育种中的应用。
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Applications Claiming Priority (1)
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