CN104313024A - 半日花微卫星位点、引物及其用途 - Google Patents

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CN104313024A CN201410641084.7A CN201410641084A CN104313024A CN 104313024 A CN104313024 A CN 104313024A CN 201410641084 A CN201410641084 A CN 201410641084A CN 104313024 A CN104313024 A CN 104313024A
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helianthemum
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智颖飙
张保卫
赵利清
路战远
杨永华
张荷亮
雷达
张德健
姚一萍
王云飞
华宇鹏
赵凯
王强
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Abstract

本发明公开了半日花微卫星位点、引物及其用途，包括10个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：10所示。通过对14个半日花个体的基因分型数据进行分析后，等位基因数为3-13，期望杂合度He为0.569-0.937，观测杂合度Ho为0.429-0.857所有位点均表现出较高的多态性，达到了个体识别的要求。这些位点在对半日花的保护遗传学研究、种质资源调查和辅助育种中起到重要作用，也为研究植物抗旱机制的研究提供基础材料。

Description

半日花微卫星位点、引物及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是半日花微卫星位点、引物及其用途。
背景技术
半日花(Helianthemum soongoricum)是半日花科的一种半灌木或灌木，稀为一年生或多年生草本孑遗植物。全世界约有8属200种，多分布于地中海沿岸。中国内蒙古、新疆有2种分布，分别是新疆半日花和内蒙半日花，珍惜濒危物种，被国家列为二级保护植物。
干旱是世界农牧业面临的最严重问题之一。特别是我国北方地区干旱尤其严重。即使在我国湿润和半湿润地区，也常常受到旱灾的侵袭。干旱对世界作物产量的影响，在自然环境胁迫中居首位，其危害相当于其他自然灾害之合。因此，植物抗旱性研究一直是各国科学家关注的重要问题，是当前研究的热点。对半日花微卫星多态性的的研究可为研究植物抗旱机制的研究提供基础材料。
发明内容
本发明首次提供尖嘴魟的微卫星位点及引物，也是目前国内首次针对软骨鱼类的分子遗传学研究结果。
本发明的技术方案如下：
半日花微卫星位点，包括10个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：10所示。
所述的半日花微卫星位点的引物，其序列分别如SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：30所示。
所述的半日花微卫星位点或者所述的引物的用途，包括分子生态学研究，谱系分析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述10个稳定的多态性微卫星位点组合使用，或者其对应的引物组合使用。
本发明公开了半日花的10条微卫星序列及10对微卫星引物。这些位点在对半日花的保护遗传学研究、种质资源调查和辅助育种中起到重要作用，也为研究植物抗旱机制的研究提供基础材料。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
1、DNA抽提
样品采集后使用硅胶干燥，采用植物DNA抽提试剂盒进行DNA抽提
2、半日花微卫星富集文库的构建
利用提取基因组DNA，采用AFLP快速分离法(Fast Isolation by AFLP of SequencesContaining repeats，FIASCO)来构建微卫星富集文库，具体过程如下：取基因组DNA250ng左右，使用MseI消化，同时与MseI的AFLP受体接头(5’TAC TCA GGA CTCAT-3’/5’-GAC GAT GAG TCC TGA G-3')进行连接。将消化产物稀释十倍以后，用AFLP受体特异的引物(5’-GAT GAG TCC TGA GTAAN-3’，简称MseI-N)做PCR扩增。扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳30分钟后为大于200bp的弥散带。
使用探针(AC)12或者(AG)12与酶切连接液PCR扩增片段进行杂交后，使用磁珠进行吸附洗脱，即可获得所需的单链微卫星重复序列。以捕获的DNA为模板，以MseI-N为引物进行双链DNA恢复。PCR反应体积为50μL，反应体系组成为：dNTP 5μL，Buffer5μL，rTaq 0.5μL，MseI-N Primer 2μL，磁珠洗脱液5μL。PCR的循环设置为：95℃预变性5min；95℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸45sec，进行5个循环；进行另外92℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸45sec的30个循环，72℃延伸10min。
PCR产物经PCR清洁试剂盒(Axygen)纯化，并用2％琼脂糖-EB凝胶检测，结果为大于200bp的弥散带则视为成功。将纯化后的双链恢复产物与pMD19-T载体(Takara)连接后转化于DH5-α感受态细胞(Takara)中。将已转化的感受态细胞涂布于添加0.5mM IPTG和0.5μg/mL X-Gal的Amp+LB平板上，在37℃下培养13h，得到包含AC、AG两种重复的微卫星文库。
3、阳性克隆的筛选、测序及引物设计
挑取白色饱满的菌落置于Amp+LB液体培养基中扩大培养(37℃，5h)。采用三引物PCR法(Zane et al.，2002)检测含有微卫星片段的阳性重组子。实验中选用M13载体通用引物(M13-47)和克隆对应的无生物素标记的探针(AC)12/(AG)12进行反应。如果产物出现两条或两条以上的条带即可认为该单克隆含有目的序列，反之则认为无目的序列。通过三引物法成功检验出有目的序列的阳性重组子130个，对这些重组子进行测序。
4、序列分析、引物设计及微卫星位点的初步筛选
检查测序结果，去除M13的载体序列后，使用TRF软件(Tandem RepeatsFinder，Version3.2.1)寻找其中含有微卫星重复单元的序列(Benson，1999)。使用PRIMER5软件(Lalitha，2000；Singh et al.，1998)在重复单元序列上、下游的侧翼序列中设计引物，将目的片段设置为100-200bp之间。共选择20个微卫星重复位点作为备选标记。
5、基因分型数据的读取和微卫星位点的获得
对初选出的20个微卫星位点的单侧引物5’端进行荧光标记(FAM/HEX/TAMRA)，然后使用50个半日花个体的DNA对上述微卫星位点进行扩增筛选，过程如下：首先对待选位点的PCR扩增，循环设置为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，Tm温度下退火60sec，72℃延伸60sec，反应30个循环；72℃延伸10min。扩增产物使用Tamara350荧光分子量标准在ABI 377DNA测序仪中使用聚丙烯酰胺凝胶进行基因分型，基因分析的结果使用Genescan 2.0软件进行读取。基因分型结果的分析，去除下列备选位点：无基因分型结果的位点；在任一个体中等位基因数在两个以上的位点；在14个半日花中等位基因在两个以下的位点。经过筛选后，最终获得10个稳定的微卫星位点，微卫星序列如下所示：
HSO29
TAATAAAAGTTTATGGTATTGAATGATATAAAAGAAAAAGGGACTAAATAAACAAAAACC
TGTAGTTTTAGTCCTAGTTTCGACCTTTAGCCAACAATCTAGGTGGGGGTATATATACCA
CCCCACATCACCGAACACACACCCTCACTCTCTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTGAT
CTTTCTCCTCTCGACCAAGACCCAAGGACCCACTTTTTGCCCTCCGAAAACTAACTCGAA
TTTTTGAGCCTAAACTGCCTCCTCCTTGCCGTATGACACACACACACACATATACACACA
CACACACACACATATACACACACACACACACACACACACACACACACACAAGACAAGGTA
ATTATTCAATTCGATTATTTTTAGAAAGTGAGAATTTTTGACATTGCATGT
HSO65
TAACGATTTTACTGAGTGGCCGGTTCTTGACCGGTTTGACCAGTCAGCGAAGTTTATGGG
TAAATAGGATCGGACACCAGACTGAATCCCAGTTCAACTGGTCGAACTGGCCGGTCTGTC
TGGTTTTGACAATATTGGCTGAAAGTCAATTTTACAAGTTTTCAAACAAGATATAATGAT
TTTCAGATTTTTTCTGAATAATATATAAGCGCAAATATACACATGTACATTCATAAATAT
AAATTATACATCCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACATA
TATATATCAGTGTTCTAAAAATCAGTTTAGGCGGCTGCCTAGGCATATTTTTATGGTGTA
AGCGTTCTGATTTTTCACTAATCGGTCAAAAAAAGACCTAAACTACCTAGGTGGTGCCTA
AACGATCTGAGCAATCTAGGCGGTCTAATCGCTAT
HSO66
TAATATAAACATACGAGTAAAGTCAAGCAACGTCCAATCCAAAAATAAAGCAAAGACTCA
AAAAAGACTTATACAGTGCAGCGGAGTATATCGCATCATACAAACACACTACACAACACC
ATTCTCTCTCTCTCACACACACACACACACACACACACACTCACGCAAACACAAGAACAG
TACACTAAAAGAAACATATTTTTGTTGTGTTGTTCGTTTTCTCTGAGTCTTACACCAACT
GAAAACAGAACAAATGGCTTTGTTGTCACGTACGACGTCGTCTAGCTCCTTGTACTCTTG
CCCTGCTTCTTCTTTTGAGGAAAAGTTTACAAATTTACCAGTAACTAATCTGAGAGAGAA
GATCGTCGATAAAATCTTGGATAATCGCGTCACTCTCATCATCGGCGAAGCTGGATGTGG
TTCGTCCACAATTCACCATCTTTTTTTTTTGT
HSO67
TAATCAACTAACCACCTAATGACCACATAATGCTGACGTGAAGATCCCAGCACATCTTAT
AGAACTATTAGATACATAAAAAAACAAACACACACACACACACACACACACACACACACA
CACACACACACACACGCATACGGTTACAGAGAGACAAGACAAGAAAAATGGAGAGCATAG
AGCACAAGGTACATGCAAGAGTGGGGCTGTTGGGAAATCCAAGCGATGTGTATTTCGGCA
ATACAATATCTTTCAGTCTCGGCAATTTCTGGGCTTCCGT
HSO94
TAATCCTTTTATTTCCTTAGTATCCATATTGGCTCTTATAAAATTCGTATTCCCATTTGAAACCCCA
AAATTTGTGAGTTTCCTATCATTACCAACAAATTTTTTTTGTCACAAACAAGTCCTTCTTAGCCA
AATAAATTCAAAAATATCCAAATTATTTAGGAAATGGAAACTTTAGGTAAAACACACACACACA
CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACATATATAAGTATCTAGATTTTAGGA
ATTTTCTACCGTACTTTTCTAAAAATTGCAACTTAGCCCAAAATTTTTCCATTTCTTACAAATCAA
CCTTCCACTTTTTTGTTTCGATACTTCAGCGACATAACATGAGACATGGGTTATTGCAAAGCACT
HSO102
TAATAAAAGTTTATGGTATTGAATGATATAAAAGAAAAAGGAACTAAATAAACAAAAACC
TGTAGTTTTAGTCCTAGTTTGGACCTTTAGCCAACAATCTAGGTGGGGGTATATATACCA
CCCCACCATCACCGAACACACACCCTCACTCTCTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC
TCTCTCTCTCTCTCGATCTTTCTCCTCTCGACCAAGACCCAAGGACCCACTTTTTGCCCT
CCGAAAAACAACTCGAATTTTTGAGCCTAAACTGCCTCCTCCTTGCCGTCTGACATATAT
ATATACACACACACACACACACACACACACACACACAACACAAGGTAATTATTCAATTCG
ATTATTTTTAGAAAGTGAGAATTTTTGACATTGCATGT
HSO112
ACAGTTATTATGAGCACAACTTTGTAGTTTGAATGATAAACAATATTTTACAGTCGGAGAAAGCA
GTTGGAGACTGTATCTAAGAAAACAGACCAGAAGCAGGATGTTGAGACAGAAGTGCCGGCAG
AAAGTGATGATTCGTCTGGGAATGATACAGCTTAAACATAAACAACAACTAAAGGGTAGTAAAA
AGGATATAGGAGGGAGGAAGACTAAGGAACAAAGGGTGAGACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT
CACACACACACACACACACACACACACACACACAAAATTTGGTTATCCTAAATTTGTACATTGC
TGTTTATGCAGAGAGAATACTATGAAAAGGAGACGGAGAAACAAATAATACGCAGTAACCCGC
TAGGTAAAGACAGGGAGTATAACAGATATTGGTGGTTTAGGCGTGATGGGAGGATATTTGTGGA
GAGTTGTGATGGCAAGCAATGGGGCTATTATAGTAGCAAGGAAGAGGTATCTTTACT
HSO120
TAATCAGTAACTAATATGCATGGAATCTCCTGATGCATTTGTGAAGATGCAATGCCTTTT
ATAGTCTTTATTATTTCAAATGTAAATTGCATCTAATCAGTTTCAGATTCTTTATTGTTG
ATCTTTTTTTCAGATGCTATTTCACAAGGGGTTCAGCCAGACCAGATTATTTTCACTGAT
GTTGCTATGAAGCATGAACATATCAGGCGCAGTGCCTTGGCAGATTTGTTCCTTGATACG
TAACACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTCACACACACACACACACACACACAC
ACACACACACACACACACACATTTCAGTGCACGATTTGAATTTTATTGTTTGCTCCCTCG
TGATGTTATTGTTATCTATGTTTACTGTGTTGTCACTTTTATTGAAGGCCTTTATGCAAT
GCGCATACAACGGGCACAGATATTTTATGGGCTGGTTTACCTATGGTGACCCTACCCCTT
GAGAAAATGGCTACGAGGGTTGCTGGATCACTTTGTGTTTCTACTGGGCTCGGTGATGAG
ATGATAGTGAACAGGTGTGCATATTCACAAATCTATACTTTGCACAATTTTGCTGGACGC
GCTTGTAAGAGTTTGCCTAATTAGTTAGATGTGTCAGCGCTTTTATTTGGACGATGTTTC
TTATGTGTGGGTTTGATATGATCAATGTGTTGGCAGTATGAAAGAATACGAGGACAGAGC
AGTGTCCTTGGCAT
HSO121
TAACTTTTTCTTCAGTACTATGAGGTAAAGAATTGTTCATCACTCTAATATGAACAATTC
TGGGGCAAACGTGTTGATTTTCCTATTTATTACTTAGTAAAATGGTGTTTTGGAAGGGGT
CTAGAAAGAAAAATCACTGCAGAAATATATAAGATAATGCTTATAACTAAAGAAAAAGAT
GGGAAAATCACACACTAACACACAAATGGATACATGGAACATGCCTGATACCAGGGAACA
TCCACACGTAGATACACATACACACTTACACACACACACACACACACACACACACAAGTA
TACACTTGTCCACACACGCACCCCCGCACACTCGCATACACACACCGTGCATATATCTCG
AGAGAATATTTTAGTATTGCAAGTCAAGTTCTTCCAT
HSO129
TAATAGCTCTATAAGATGTGATTATGGAAAAGGACAACTGACATTTTGGGAGGTCAGCTA
AATTGCACAAGTTATCATTAGGACAAGTAACTAGTAGTCACCGTAAACTTCCAATGTAGA
TCATATAAATAAACTTTTGGACATATATATACATATAAACATGTATATATACACATATAT
ACTTGTATACACACACACACACACACACACACACACACACACATAGATATATATATGAAT
GTATGCATGTTACTATTTTTGTATGTAGTCAGATCACTTGGCACTATAAAATTGTCTGTA
TGGCTTCGTTATAGATTCCACCTTGTAAGTTCACTTTAGTCCTGACTTTTTGGGTATGAT
TTTGATTTTATTCGATCATTCGTTGGGCAACTTATGAATTTGTCTTGCTAAATTTATTTT
GGGCTTTGGCTTTGGCATCTCCAGT
表1 10个位点的引物序列
表2 14个半日花个体的基因分型结果
分型数据经分析后(表3)，等位基因数为3-13，期望杂合度He为0.569-0.937，观测杂合度Ho为0.429-0.857所有位点均表现出较高的多态性，达到了个体识别的要求。
表3分型数据经分析结果
等位基因数 期望杂合度He 观测杂合度Ho 多态性信息量PIC
HSO29 3 0.601 0.571 0.514
HSO65 8 0.778 0.714 0.715
HSO66 10 0.868 0.857 0.818
HSO67 13 0.937 0.857 0.895
HSO80 3 0.569 0.429 0.485
HSO102 7 0.828 0.786 0.77
HSO112 6 0.82 0.714 0.761
HSO120 9 0.86 0.643 0.808
HSO121 9 0.833 0.786 0.779
HSO129 4 0.601 0.286 0.501
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (3)

1.半日花微卫星位点，包括10个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQID NO：1-SEQID NO：10所示。
2.根据权利要求1所述的半日花微卫星位点的引物，其序列分别如SEQ IDNO：11-SEQID NO：30所示。
3.权利要求1所述的半日花微卫星位点或者权利要求2所述的引物的用途，包括分子生态学研究，谱系分析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述10个稳定的多态性微卫星位点组合使用，或者其对应的引物组合使用。
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