CN101828967A - 一种冠状动脉旁路移植吻合术术前选址的实验模拟方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种冠状动脉旁路移植吻合术术前选址的实验模拟方法,制作不同构型的吻合模型;将分离获得的人血管组织细胞在含10%胎牛血清(GIBCO)的DMEM中,环境为37℃、5%CO2的大气下培养至融合,然后消化制备细胞悬液,细胞培养在载玻片上,细胞载玻片置于6孔板中静置培养6小时,备用,将载有培养好的血管组织细胞的载玻片固定在吻合模型的吻合口区;将整个吻合模型连接于闭合循环的灌流系统中,灌流系统由蠕动泵驱使,模拟人体的血液流动进行力学加载实验,将细胞载玻片取出用荧光显微镜成像以及用电子扫描显微镜扫描。
Description
技术领域
本发明涉及一种冠状动脉旁路移植吻合术术前选址的实验模拟方法。
背景技术
冠状动脉搭桥术是挽救心脏病患者生命的有效方法之一,虽然血管成形术(Angioplasty)和血管支架(Stent)具有更小的手术创伤,但这两种方法一般只适用于冠状动脉仅有一处狭窄的情况,对于连续的多处狭窄,仍需采用动脉搭桥术来旁通狭窄的冠状动脉。过去的几年里,大量的动脉移植管被植入心脏患者体内来恢复病变或受损动脉的血液流动。这种手术使用人造或天然的血管来实现旁通严重狭窄(75%面积减小)的动脉。在冠状动脉的搭桥手术中,一般采用患者自体的静脉血管作为移植管,将移植管前端缝合到升主动脉而下端缝合到冠状动脉狭窄的下游。
通过血流动力学数值计算与模拟流场实验发现,这种手术的26%会在手术后的一年内失效,而动脉缝合处的细胞增生和血栓形成是手术失效的主要原因。为了弄清血管组织细胞增生的发生和发展机制,人们对大量不同的移植管模型进行了研究。临床观察表明,动脉移植管手术中易发生血管组织细胞增生的地方有四个部位:缝合前端(toe),缝合后端(heel),缝合线(sutureline)及缝合区对面底部(floor)。血管组织细胞的增生与局部血流动力学因素密切相关,而血管内的局部血流动力学状态主要依赖于动脉血管的几何形状。对于动脉移植管而言,移植管与动脉缝合的结构形状是影响移植管长期有效性的重要因素。对于动脉吻合术的结构形状,一些研究者研究了移植管与冠状动脉的缝合角度对缝合区局部血流动力学的影响。研究发现小的缝合角度优于大的缝合角度,因为较小的缝合角度,可以避免在缝合区产生较大范围的回流,从而减少血管组织细胞的增生;也有人研究了不同狭窄程度对缝合区及其下游的流场和血流动力学参数的影响。这种研究一般以两个相同或不同直径的圆直管来代替移植管和冠状动脉,而用两管之间不同的流量分配来代替冠状动脉的不同狭窄程度。事实上,动脉搭桥术后,移植管中的血液流量有一个逐渐增加的过程。在多数情况下,术后几个星期狭窄的冠状动脉会完全阻塞。但在最初的几个星期里,狭窄的冠状动脉内有部分血流通过,来自狭窄处的受限射流与来自移植管的血流在缝合区附近相互作用,形成复杂的流场,这对缝合区血管组织细胞增生的始发位置及术后移植管的再阻塞会有重要影响。所以为了准确考量这种影响,必须考虑冠状动脉狭窄的真实存在,而不能简单地以直管中的不同流量来代表不同的狭窄程度。张莹等人的椎基动脉开窗畸形处动脉瘤的血流动力学数值模拟分析研究,研究了包含动脉狭窄的移植管的血流动力学,但他们考虑的移植管和冠状动脉是具有相同直径的圆直管。实际的冠脉搭桥手术中,移植管一般是自体静脉,其直径往往大于冠状动脉的直径,所以在手术缝合时,移植管必须由圆变形为椭圆来适应较小直径的冠状动脉。
中国生物医学工程学报,23.4.2004采用有限元法、数值研究具有狭窄的冠状动脉移植管内的血流动力学,并考虑移植管的这种变形。计算结果表明,在缝合前端下游,存在一个低切应力、高切应力梯度的区域,在吻合区底部存在一个高切应力、高切应力梯度的区域。这两个区域都是血管组织细胞增生并造成移植管术后再阻塞的危险部位。
发明内容
针对上述现有技术,本发明目的在于提供一种冠状动脉旁路移植吻合术术前选址的实验模拟方法。
本发明的技术方案是这样的:一种冠状动脉旁路移植吻合术术前选址的实验模拟方法,所述方法包括下述步骤:
(a)制作不同构型的吻合模型;
(b)将分离获得的人血管组织细胞在含10%胎牛血清(GIBCO)的DMEM中,环境为37℃、5%CO2的大气下培养至融合,然后消化制备细胞悬液,细胞以5.0×105细胞/cm2的密度培养在预先涂布有纤连蛋白(FN;50μg/ml;Roche,Germany)的载玻片上,细胞载玻片置于6孔板中静置培养6小时,备用,将载有培养好的血管组织细胞的载玻片固定在吻合模型的吻合口区;
(c)将整个吻合模型连接于闭合循环的灌流系统中,灌流系统由蠕动泵驱使,模拟人体的血液流动进行力学加载实验;
(d)将细胞载玻片取出在荧光显微镜成像以及用电子扫描显微镜扫描。
所述吻合模型为有机玻璃板上雕刻出的呈30°夹角的两通道构成。
所述吻合模型的主动脉和移植管的内径分别为6毫米和9毫米。
所述灌流系统的培养液为含有自由血清的DMEM,其实验环境为:温度保持在37℃,灌流系统内为含有5%CO2的大气。
所述吻合模型根据狭窄度γ值以及移植管的后端到狭窄区域中心之间的距离D来制作,我们选择γ值为70%、80%、90%和95%,D值为1厘米、2厘米和3厘米。
所述细胞载玻片装在吻合模型中之前,先将模型放置在紫外灯下照射2小时杀菌,然后可密封保存,72小时内使用。
所述荧光显微镜成像的步骤为:
(a)取出力学加载后的细胞玻片,以PBS反复冲洗三遍,用4%的多聚甲醛于4℃固定15min,再以PBS冲洗三遍;
(b)然后加入F-actin和DNA荧光抗体,于37℃湿盒内避光孵育30min;
(c)再以PBS冲洗3次,每次5min,洗掉多余荧光抗体,10%缓冲甘油封片;
(d)激光扫描共聚焦显微镜观察细胞形态及细胞骨架分布情况。
所述电子扫描显微镜扫描步骤为:
(a)对细胞载玻片施加力学加载后,室温下,取出加载装置内的细胞玻片,PBS洗3次;
(b)2.5%戊二醛固定,50%~100%的乙醇梯度脱水,CO2临界点干燥,喷金;
(c)扫描电镜扫描分析。
本发明的有益效果是:实验证明,在狭窄区的近端放置移植管可以最大限度的保护流体形态。然而,在狭窄区的远端放置移植管,在主动脉的狭窄区将造成一个广泛而相对滞流的低剪切应力区域,低剪切应力引起血管组织细胞的肌动蛋白细胞骨架解聚;移植管和术后穿过狭窄区的残留流体引起的竞争流,在低度狭窄(γ小于80%),残留流体保持了一个很大的速度等级,因而对吻合口处的流动模式产生很大的干扰;竞争流动产生振荡的剪切应力,最终将会加速血管组织细胞增生,从而促进损伤处血管动脉粥样硬化的进程;当处于严重的狭窄的情形时(γ大于80%),研究表明可以通过将移植管放置在宿主动脉的近端来改善,尽量靠近蔽塞或者是狭窄区以便保护主近端动脉;相反,当处于轻度狭窄的情形时(γ小于80%),研究表明将移植管放置在越远端将会对移植管产生明显的保护效应,因为它可以避免流体竞争。
附图说明
图1为本发明的闭合循环的灌流系统;
图2为本发明的吻合模型的结构示意图;
图3为D为3厘米时吻合模型的速度分布图;
图4为D为3厘米时吻合模型的速度分布图的局部放大图;
图5为D为2厘米时吻合模型的速度分布图;
图6为D为2厘米时吻合模型的速度分布图的局部放大图;
图7为D为1厘米时吻合模型的速度分布图;
图8为D为1厘米时吻合模型的速度分布图的局部放大图;
图9为D为3厘米时吻合模型的壁面剪切应力分布图;
图10为D为3厘米时吻合模型的壁面剪切应力分布图的局部放大图;
图11为D为2厘米时吻合模型的壁面剪切应力分布图;
图12为D为2厘米时吻合模型的壁面剪切应力分布图的局部放大图;
图13为D为1厘米时吻合模型的壁面剪切应力分布图;
图14为D为1厘米时吻合模型的壁面剪切应力分布图的局部放大图;
图15为γ为70%时吻合模型的速度以分布图;
图16为γ为70%时吻合模型的壁面剪切应力分布图;
图17为γ为80%时吻合模型的速度分布图;
图18为γ为80%时吻合模型的壁面剪切应力分布图;
图19为γ为95%时吻合模型的速度分布图;
图20为γ为95%时吻合模型的壁面剪切应力分布图;
图21静态下人血管组织细胞的荧光显像;
图22为暴露于壁面剪切应力(2Pa)2小时后人血管组织细胞的荧光显像;
图23静态下人血管组织细胞的扫描电镜扫描图片;
图24暴露于壁面剪切应力(2Pa)2小时后的人血管组织细胞的扫描电镜扫描图片。
具体实施方式:
1.闭合循环的灌流系统
闭合循环的灌流系统,包括储液罐1以及与其相连的蠕动泵2,还包括缓冲槽3、第一阀门4、吻合模型6、第二阀门5以及压力罐8,所述缓冲槽3侧壁上部和下部分别设置有一个溢出口,所述缓冲槽3通过管道与蠕动泵2连接,所述缓冲槽3上端的溢出口通过管道与储液罐1相连,下端的溢出口通过管道依次连接第一阀门4、吻合模型6、第二阀门5和压力罐8,所述第一阀门4和第二阀门5之间还连接有压力计7,所述压力罐8的出水管通过管道接入储液罐1。
参见图1,位于储液罐1中的流体由蠕动泵2压入有一个溢出口的缓冲槽3中,为了保持模型中的持续的固定的压力,再此处过量的流体流回储液罐1中,流体流过吻合模型6和压力罐8然后流回储液罐1中,第一阀门4和第二阀门5用于控制各自的入口流量以及防止倒流,当在做细胞力学加载实验的时候,将载有血管组织细胞的盖玻片9固定在吻合模型6的吻合口区域。
2.吻合模型的制作
如图2所示,吻合模型为有机玻璃板上雕刻出的呈30°夹角的两通道构成。“主动脉”和“移植管″的内径分别为为6mm和9mm,硅密封环和几个不锈钢螺丝用于防止液体从有机玻璃模型的水槽溢出。
在我们的研究中,狭窄程度γ根据正常的主动脉和狭窄区域横截面面积比来计算,γ通常选择:70%、80%、90%和95%。运用依照面积比例γ切割出来的两个半圆形的硅胶板,狭窄区域将能很轻松的在主动脉的近端定位,我们用D表示移植管的后端与狭窄区域中心之间的距离,考虑到外科手术,D为1-3厘米是比较普遍的选择,因此我们的吻合模型设定D为1厘米、2厘米和3厘米。
数值模拟实验采用有限体积法,在商业CFD软件FLUENT(Fluent Inc.,USA)中完成。该软件涉及的核心计算程序包括:(1)使用前处理软件包Gambit构建几何模型,(2)对计算区域进行网格划分,(3)指定速度和流量边界条件,(4)指定流体属性,和(5)求解法则。
数值模拟实验模型的几何尺寸与有机玻璃吻合模型严格一致。计算区域网格的划分除了必要的楔形元以外,主要是结构化的六面体元。网格划分后所有模型均不少于65,936个单元。
使用Flunet的求解法则对控制方程进行后续求解。因为控制方程为非线性的,所以在结果收敛之前需要完成几次迭代循环。控制方程使用半隐式的简单算法求解。时间步长采用全隐格式。使用二阶迎风格式来提高计算结果的精度。当两次连续迭代计算的残差低于设定的收敛标准103时,计算结果被认为是收敛的。依据宿主动脉宽度和血液粘度0.0035kg m-1s-1,可得流动雷诺数为230。流动边界条件设置:入、出口压力条件分别与宿主动脉的入、出口压力值相同。壁面采用非滑移边界条件。
4.人血管组织细胞培养
将分离获得的人血管组织细胞在含10%胎牛血清(GIBCO)的Dulbecco’smodified Eagle’s medium(DMEM)中,环境37℃、5%CO2下培养至融合,然后消化制备细胞悬液。细胞形态的研究,细胞以5.0×105细胞/cm2的密度培养在预先涂布有纤连蛋白(FN;50μg/ml;Roche,Germany)的载玻片上,细胞载玻片置于6孔板中静置培养6小时,备用。细胞载玻片装在吻合模型中之前,先将模型放置在紫外灯下照射2小时杀菌,然后可密封保存,72小时内使用。
5.力学加载实验
为了研究我们吻合模型中的力学加载对细胞的影响,应用的是如图1所示的闭环的灌流系统,对所培养在上述载玻片上的人血管组织细胞施加力学刺激。载有培养细胞的载玻片被以60°的角度固定在实验系统的吻合处。吻合模型整体载入含有血清的DMEM培养液的闭环灌流系统中。灌流系统由蠕动泵驱使,环境为含有5%CO2/95%的大气并且温度保持在37℃。
6.荧光显微镜显像
如前所述,取出力学加载后的细胞玻片,以PBS反复冲洗三遍,用4%的多聚甲醛于4℃固定15min,再以PBS冲洗三遍,然后加入F-actin和DNA荧光抗体,于37℃湿盒内避光孵育30min,再以PBS冲洗3次,每次5min,洗掉多余荧光抗体,10%缓冲甘油封片,Leica激光扫描共聚焦显微镜观察细胞形态及细胞骨架分布情况。
7.电子扫描显微镜扫描
如前所述,对细胞载玻片施加力学加载后,室温下,取出加载装置内的细胞爬片,PBS洗3次后,2.5%戊二醛固定,50%~100%的乙醇梯度脱水,CO2临界点干燥,喷金,日立S-450型扫描电镜扫描分析。
8.结果
1)我们设定D分别为1厘米、2厘米、3厘米,如图3-图8所示,在相同的边界条件下,得出当逆行的流体流过狭窄区域的时候与术后的残留流体相互作用,导致了大面积的滞流。而滞流区的长短直接取决于距离D,D值越大滞流区越长。残留流体在流过狭窄区时对主动脉管壁产生不同的壁面剪切应力,最后与移植管内流体在吻合处汇合。
2)图9-图14显示了壁面剪切应力也有与图3类似的曲线。从放大的壁面剪切应力曲线,我们观察到最高壁面剪切应力出现在吻合前端和狭窄区的中心。从狭窄区的中心到滞流区附近急剧下降,这意味着壁面剪切应力在狭窄管壁上呈现出很大的梯度。
我们设定狭窄度分别为70%、80%、90%、95%制定吻合模型,从图15-图20中我们发现当狭窄程度增加的时候残留流体也变得越来越细。然而,残留流体依然与移植流竞争。这种流体的竞争对管口以及吻合处的远端是有害的,图15-图20还显示外部的速度峰值在整个的数值模型中有相同的值,但是壁面剪切应力峰值就完全不一样。越是狭窄,狭窄管壁就拥有较高的壁面剪切应力。在95%狭窄度的狭窄中心,壁面剪切应力的峰值达到12Pa。
3)壁面剪切应力对细胞肌动蛋白细胞骨架的影响
为了探讨本装置中不同壁面剪切应力对细胞骨架蛋白网络的影响,细胞暴露于低壁面剪切应力(2Pa)环境2小时,然后固定并由绿色荧光染料BODIPFL phallacidin(B-607,Modecular probes Inc.,USA)将肌动蛋白骨架染成绿色,使用DNA荧光抗体(D-1306,Modecular probes Inc.,USA)将细胞核染成蓝色,以便观察纤维型肌动蛋白和双链DNA。静态未加载力学时,如图21所示,细胞的伪足扩展开来,细胞显现出典型的鹅卵石形态,张力纤维非常的充足,细胞核呈现出椭圆形;细胞施加壁面剪切应力后,如图22所示,细胞形态变为不规整的圆形,随着丝状肌动蛋白的减少,张力纤维收缩在一起。表明壁面剪切应力导致了肌动蛋白细胞骨架的解聚。
图23显示了静态培养以及力学加载2小时后的细胞扫描电子显微照片。静态培养的细胞受到壁面剪切应力作用2小时后,其伸长的伪足逐渐收缩,如图24所示,细胞边缘伪足向细胞核中心方向缩小。
9.结论
在狭窄区的近端放置移植管可以最大限度的保护流体形态。然而,在狭窄区的远端放置移植管,在主动脉的狭窄区将导致一个广泛相对滞流的区域和低的壁面剪切应力,在一定流动条件下,滞流区会产生双漩涡,这将导致流动不稳定以及涡流扩散,这些地方会促进血栓的形成,最终导致主动脉逆流区的阻塞。壁血栓的增长会导致粥样硬化斑块的生长。我们知道血小板和凝血因子一旦被吻合前端高的壁面剪切应力激活,将会被捕集到回流区,由于滞流时间加长,激活的这些凝血物质与相邻-管壁受损的细胞壁相互作用进一步富集而加重血管阻塞。血小板的沉积又最容易导致滞流区域的出现。
移植管内的流体和术后穿过狭窄区的残留流体形成竞争流。在低度狭窄(γ小于80%),残留流体保持了一个很大的速度等级,因此他对吻合处的流动模式产生很大的干扰。竞争流动导致一个振荡的壁面剪切应力,最终将会加速动脉粥样硬化的发展。临床研究显示低度狭窄的移植术失败的风险更大,他们研究表明内乳动脉移植在越远侧,对于动脉移植将会产生保护效应,因为它可以阻止流体竞争。
术后,狭窄处的管壁突然得到很大的空间以及短暂的壁面剪切应力的一个梯度,这种壁面剪切应力的振荡能戏剧性的随着狭窄度的变化而改变。振荡的强度和动脉壁上壁面剪切应力的分布主要由主动脉的狭窄性影响。振荡的壁面剪切应力的特性是在心脏收缩和心脏舒张时应力的方向以及量值都有显著变化。振荡的壁面剪切应力在很短的距离上会经历显著的空间的变化,尤其是在狭窄的区域以及几何形状不规则的区域,导致很高的空间梯度。
我们设计的吻合模型和灌注系统可以控制机械因素,简化了细胞对机械力的反应的研究。我们调整进口压力和出口压力以便模拟冠状动脉旁路移植术中壁面剪切应力水平。此外,在细胞实验中,采用层流壁面剪切应力刺激细胞。这个模型的好处就在于可以精确的控制细胞加载的壁面剪切应力的强度。另外,它简化了实验设备,降低了实验的可变性。
通过以上结果我们得出:当处于严重的狭窄的情形时(γ大于80%),研究表明可以通过将移植管放置在宿主动脉的近端来改善,尽量靠近蔽塞或者是狭窄区以便保护主近端动脉。相反,当处于轻度狭窄的情形时(γ小于80%),研究表明将移植管放置在越远端,将会对移植管产生明显的保护效应,因为它可以避免流体竞争。
Claims (8)
1.一种冠状动脉旁路移植吻合术术前选址的实验模拟方法,所述方法包括下述步骤:
(a)制作不同构型的吻合模型;
(b)将分离获得的人血管组织细胞在含10%胎牛血清(GIBCO)的DMEM中,环境为37℃、5%CO2的大气下培养至融合,然后消化制备细胞悬液,细胞以5.0×105细胞/cm2的密度培养在预先涂布有纤连蛋白(FN;50μg/ml;Roche,Germany)的载玻片上,细胞载玻片置于6孔板中静置培养6小时,备用,将载有培养好的血管组织细胞的载玻片固定在吻合模型的吻合口区;
(c)将整个吻合模型连接于闭合循环的灌流系统中,灌流系统由蠕动泵驱使,模拟人体的血液流动进行力学加载实验;
(d)将细胞载玻片取出用荧光显微镜成像以及用电子扫描显微镜扫描。
2.根据权利要求1所述的一种冠状动脉旁路移植吻合术术前选址的实验模拟方法,其特征在于:所述吻合模型由有机玻璃板上雕刻出的呈30°夹角的两通道构成。
3.根据权利要求1所述的一种冠状动脉旁路移植吻合术术前选址的实验模拟方法,其特征在于:所述吻合模型的主动脉和移植管的内径分别为6毫米和9毫米。
4.根据权利要求1所述的一种冠状动脉旁路移植吻合术术前选址的实验模拟方法,其特征在于:所述吻合模型根据狭窄度γ值以及移植管的后端到狭窄区域中心之间的距离D来制作,我们选择γ值为70%、80%、90%和95%,D值为1厘米、2厘米和3厘米。
5.根据权利要求1所述的一种冠状动脉旁路移植吻合术术前选址的实验模拟方法,其特征在于:所述灌流系统的培养液为含有自由血清的DMEM,其实验环境为:温度保持在37℃,灌流系统内为含有5%CO2的大气。
6.根据权利要求1所述的一种冠状动脉旁路移植吻合术术前选址的实验模拟方法,其特征在于:所述细胞载玻片装在吻合模型中之前,先将吻合模型放置在紫外灯下照射2小时杀菌,然后密封保存,72小时内使用。
7.根据权利要求1所述的一种冠状动脉旁路移植吻合术术前选址的实验模拟方法,所述荧光显微镜成像的步骤为:
(a)取出力学加载后的细胞玻片,以PBS反复冲洗三遍,用4%的多聚甲醛于4℃固定15min,再以PBS冲洗三遍;
(b)然后加入F-actin和DNA荧光抗体,于37℃湿盒内避光孵育30min;;
(c)再以PBS冲洗3次,每次5min,洗掉多余荧光抗体,10%缓冲甘油封片;
(d)激光扫描共聚焦显微镜观察细胞形态及细胞骨架分布情况。
8.如权利要求1所述的一种冠状动脉旁路移植吻合术术前选址的实验模拟方法,所述电子扫描显微镜扫描步骤为:
(a)对细胞载玻片施加力学加载后,室温下,取出加载装置内的细胞玻片,PBS洗3次;
(b)2.5%戊二醛固定,50%~100%的乙醇梯度脱水,CO2临界点干燥,喷金;
(c)扫描电镜扫描分析。
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