CN104758980B - 一种体外构建具有抗流动剪切力和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种体外构建具有抗流动剪切和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法，通过对人造血管内腔表面的血管内皮细胞施加缓慢地，逐渐增加的流动剪切力，使血管内皮细胞逐步适应剪切力环境，该方法主要包含以下步骤：将内腔表面长满血管内皮细胞的人造血管连接到剪切力诱导系统的管路中；启动剪切力诱导系统的液体驱动泵，使内皮细胞受到的初始剪切力为0‑2dyne/cm2；每隔一段时间，调节液体驱动泵，使内皮细胞受到的剪切力比前一时间段提高一定比例；直到内皮细胞受到的剪切力达到移植部位动脉血管内皮细胞所承受的平均或峰值剪切力水平为止；将剪切力保持在移植部位动脉血管内皮细胞所承受的平均或峰值剪切力水平，培养内皮细胞24‑72小时。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养、组织工程领域，更具体地涉及一种体外构建具有抗生理大小的流动剪切力和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法。
背景技术
用组织工程方法体外构建小口径人造血管植入物是解决临床上小口径血管移植物来源不足的重要途径。但是目前小口径人造血管还不能应用于临床，一个重要原因是小口径人造血管移植后容易发生血小板凝集导致的急性血栓和远期的移植部位的再狭窄，这些问题都是由于小口径血管移植物内表面缺乏完整的、有功能的内皮细胞层造成的。
体内的完整的血管内皮细胞层具有抗血小板凝集、抗炎症、抗动脉硬化的功能，对于维持血管的正常生理功能有重要作用。为此小口径人造血管构建过程中采用了多种方法提高内皮细胞在人造血管内表面的留存。Schneider等通过在人造血管内表面培养血管内皮细胞的方法构建具有完整内皮细胞层的小口径人造血管，但是体外静态培养的血管内皮细胞不能耐受体内水平的流动剪切力，在移植到体内1小时之内，15-85％的内皮细胞被血流冲走(Schneider,P.,Hanson,S.&Price,T.1988.Durability of confluentendothelial cell monolayers on small calibre vascular prostheses in vitroSurgery 103,456-462.)。Ott等通过对体外培养在血管支架上的内皮细胞施加流动剪切力，首先在1-2dyn/cm2的流动剪切力作用下诱导3天，再在25dyn/cm2的流动剪切力作用下诱导3天，最终发现剪切力诱导提高了血管内皮细胞的剪切力耐受能力(Ott,M.J.,Olson,J.L.&Ballermann,B.J.1995.Chronic in vitro fow promotes ultrastructuraldifferentiation of endothelial cells.Endothelium 3,21-30)，但是Ott等施加在内皮细胞上的诱导剪切力变化过于剧烈，可能会损伤内皮细胞的正常功能。诱导剪切力变化过于剧烈是目前以剪切力诱导方式提高内皮细胞剪切力耐受能力的工作中存在的共性问题，因为血管内皮细胞对剪切力的变化非常敏感，Tsou等发现血管内皮细胞能够感受到0.25dyn/cm2的剪切力变化，从而改变基因表达(Tsou,J.K.et al.2008.Spatialregulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a lineargradient of shear stress.Microcirculation 15,311-323)，因此剧烈的剪切力变化可能会损伤血管内皮细胞的正常功能。
综上所述，采用逐渐地、缓慢地增加剪切力的方式诱导血管内皮细胞，提高血管内皮细胞抗流动剪切力的能力，是体外构建具有抗流动剪切力和抗血小板凝集功能的血管内皮层的有效方法。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种简单、快速、能够体外构建具有抗流动剪切力和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法。
采用本发明所述的体外构建具有抗流动剪切力和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法能够对人造血管内腔表面的血管内皮细胞缓慢地，逐渐增加的施加流动剪切力，使内皮细胞处于不断缓慢增加的流动剪切力环境中，从而给予血管内皮细胞充分的时间适应剪切力，诱导内皮细胞改变形态、细胞骨架和细胞外基质排列和其它功能，最终使内皮细胞耐受生理水平的流动剪切力，保持血管内皮层的完整，使血管内皮层具有抗血小板凝集的正常生理功能。采用本发明所述的体外构建具有抗流动剪切力和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法，在人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到移植动脉部位的动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平后，能够对人造血管内腔表面的血管内皮细胞加载移植动脉部位的平均流动剪切力24-72小时，使血管内皮细胞有充分的时间适应生理水平的流动剪切力。
采用本发明所述的体外构建具有抗流动剪切力和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法，在人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到移植动脉部位的动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平后，能够对人造血管内腔表面的血管内皮细胞加载移植动脉部位的动脉脉搏波24-72小时，使血管内皮细胞有充分的时间适应生理水平的脉动剪切力。根据本发明的一个方面，体外构建具有抗流动剪切力和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法，其特征在于：
(1)在人造血管内腔表面接种血管内皮细胞；
(2)将接种了血管内皮细胞的人造血管培养24-48小时，从而使血管内皮细胞长满人造血管内腔表面；
(3)将长满血管内皮细胞的人造血管两端连接到充满了培养液的剪切力诱导系统的管路中，从而使人造血管和剪切力诱导系统的管路构成一个封闭的回路；
(4)启动剪切力诱导系统的液体驱动泵，设定初始流速，从而使流经人造血管内腔的培养液对血管内皮细胞的初始剪切力为0-2dyne/cm2；
(5)在剪切力施加一段时间后，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一时间段流速提高一定比例，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一时间段提高一定比例；
所述的剪切力施加一段时间，是施加剪切力1-4小时；
所述的调节液体驱动泵使培养液的流速比前一时间段流速提高一定比例，是培养液的流速比前一时间段流速提高5-20％之间的一个固定值；
所述的使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一时间段提高一定比例，是流动剪切力比前一时间段流速提高5-20％之间的一个固定值；
(6)此后每隔一段时间，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一时间段流速提高一定比例，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一时间段提高一定比例；直到人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到移植部位动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平为止；
所述的此后每隔一段时间，是每隔1-4小时；
所述的调节液体驱动泵使培养液的流速比前一时间段流速提高一定比例，是培养液的流速比前一时间段流速提高5-20％之间的一个固定值；
所述的使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一时间段提高一定比例，是流动剪切力比前一时间段流速提高5-20％之间的一个固定值；
(7)保持人造血管内腔的血管内皮细胞受到的平均剪切力在移植部位动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平，继续培养24-72小时；
(8)结束剪切力诱导，取下人造血管，用于后续生理指标检测及血管移植。
根据本发明的另一个方面，体外构建具有抗流动剪切力和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法，其特征在于：
(1)在人造血管内腔表面接种血管内皮细胞；
(2)将接种了血管内皮细胞的人造血管培养24-48小时，从而使内皮细胞长满人造血管内腔表面；
(3)将长满内皮细胞的人造血管两端连接到充满了培养液的剪切力诱导系统的管路中，从而使人造血管和剪切力诱导系统的管路构成一个封闭的回路；
(4)启动剪切力诱导系统的液体驱动泵，设定初始流速，从而使流经人造血管内腔的培养液对血管内皮细胞的初始剪切力为0-2dyne/cm2；
(5)在剪切力施加1小时后，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％；
(6)此后每隔1小时，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％，直到人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到移植部位动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平为止；(7)对人造血管内腔的血管内皮细胞加载定常流，保持培养基的流速从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力保持在移植部位动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平24-72小时，使血管内皮细胞有充分的时间适应生理水平的脉动剪切力；
使血管内皮细胞有充分的时间适应生理水平的流动剪切力；
(8)结束剪切力诱导，取下人造血管，用于后续生理指标检测及血管移植。
根据本发明的另一个方面，提供了一种体外构建具有抗流动剪切和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法，其特征在于：
(1)在人造血管内腔表面接种血管内皮细胞；
(2)将接种了血管内皮细胞的人造血管培养24-48小时，从而使内皮细胞长满人造血管内腔表面；
(3)将长满内皮细胞的人造血管两端连接到充满了培养液的剪切力诱导系统的管路中，从而使人造血管和剪切力诱导系统的管路构成一个封闭的回路；
(4)启动剪切力诱导系统的液体驱动泵，设定初始流速，从而使流经人造血管内腔的培养液对血管内皮细胞的初始剪切力为0-2dyne/cm2；
(5)在剪切力施加1小时后，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％；
(6)此后每隔1小时，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％，直到人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到6-10dyne/cm2；
(7)此后每隔2小时，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一时段流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一时段提高10％，直到人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到移植动脉部位的动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平为止；
(8)保持培养基的流速从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力保持在移植动脉部位动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力水平，启动脉动电机，对人造血管内腔的血管内皮细胞加载移植动脉部位的动脉脉搏波24-72小时，使血管内皮细胞有充分的时间适应生理水平的脉动剪切力；
(9)结束剪切力诱导，取下人造血管，用于后续生理指标检测及血管移植。
附图说明
图1示意显示了根据本发明的一个实施例的剪切力诱导系统的结构。
图2示意显示了根据本发明的一个实施例的体外构建具有抗流动剪切和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法的流程图。
图3示意显示了根据本发明的一个实施例的剪切力诱导和脉动波形诱导方法的流程图。
图4a-4b显示了利用根据本发明的一个实施例的为股腘动脉远端的血管移植准备内皮化的人造血管植入物过程中使用的剪切力增加程序和使用的股腘动脉脉搏波波形。
图5显示了利用根据本发明的一个实施例的为股腘动脉远端的血管移植准备内皮化的人造血管植入物过程中使用的剪切力增加程序。
具体实施方式
如图1所示，根据本发明的一个实施例的剪切力诱导系统包括一个储液瓶101和一个液体驱动泵102，一个脉动发生器103，人造血管104，一个控制器105，和连接管路107。其中连接管路107将储液瓶101和液体驱动泵102，脉动发生器103，人造血管104连接成为一个封闭的回路。
根据一个具体实施例，液体驱动泵102动驱培养基在剪切力诱导系统的封闭回路中循环流动，从而对人造血管104内腔表面的血管内皮细胞106产生流动剪切力；控制器105控制液体驱动泵102的启动、关闭和流速调节。
根据一个具体实施例，脉动发生器103加载不同形式的脉搏波到人造血管的内皮细胞上。控制器105控制脉动发生器103的启动、关闭和脉动波形的调节。
如图2所示，根据一个具体实施例，体外构建具有抗流动剪切和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法在于：
(1)在人造血管内腔表面接种血管内皮细胞；
(2)将接种了血管内皮细胞的人造血管培养24-48小时，从而使内皮细胞长满人造血管内腔表面；
(3)将长满内皮细胞的人造血管两端连接到充满了培养液的剪切力诱导系统的管路中，从而使人造血管和剪切力诱导系统的管路构成一个封闭的回路；
(4)启动剪切力诱导系统的液体驱动泵，设定初始流速，从而使流经人造血管内腔的培养液对血管内皮细胞的初始剪切力为0-2dyne/cm2；
(5)在剪切力施加1小时后，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％；
(6)此后每隔1小时，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％，直到人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到移植部位动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平为止；
(7)保持培养基的流速从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力保持在移植部位动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平48小时，使血管内皮细胞有充分的时间适应生理水平的脉动剪切力；
(8)结束剪切力诱导，取下人造血管，用于后续生理指标检测及血管移植。
如图3所示，根据一个具体实施例，体外构建具有抗流动剪切和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法在于：
(1)在人造血管内腔表面接种血管内皮细胞；
(2)将接种了血管内皮细胞的人造血管培养24-48小时，从而使内皮细胞长满人造血管内腔表面；
(3)将长满内皮细胞的人造血管两端连接到充满了培养液的剪切力诱导系统的管路中，从而使人造血管和剪切力诱导系统的管路构成一个封闭的回路；
(4)启动剪切力诱导系统的液体驱动泵，设定初始流速，从而使流经人造血管内腔的培养液对血管内皮细胞的初始剪切力为0-2dyne/cm2；
(5)在剪切力施加1小时后，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％；
(6)此后每隔1小时，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％，直到人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到6-10dyne/cm2；
(7)此后每隔2小时，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一时段流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一时段提高10％，直到人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到移植动脉部位的动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平为止；
(8)保持培养基的流速从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力保持在移植动脉部位动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力水平，启动脉动电机，对人造血管内腔的血管内皮细胞加载移植动脉部位的动脉脉搏波72小时，使血管内皮细胞有充分的时间适应生理水平的脉动剪切力；
(9)结束剪切力诱导，取下人造血管，用于后续生理指标检测及血管移植。
根据一个具体实施例，剪切力诱导的初始剪切力为0-2dyne/cm2，使用较低的初始剪切力以减少内皮细胞从静止培养状态骤然受流动剪切力刺激时对细胞结构和功能带来的不良影响；根据一个具体实施例，流动剪切力的增加速率为每隔一定时间间隔内皮细胞受到的流动剪切力比前一间间隔内皮细胞受到的流动剪切力增加一定的百分比。所述的时间间隔为1-4小时；所述的一定的百分比为5-20％之间的一个固定值。
根据一个具体实施例，增加流动剪切力的时间间隔在整个剪切力增加过程中是固定不变的；例如根据一个具体实施例，诱导剪切力的增加是每隔一小时增加前一小时血管内皮细胞所受剪切力的15％；
根据一个具体实施例，增加流动剪切力的时间间隔在整个剪切力增加过程中是变化的：在流动剪切力低于6-10dyn/cm2时，增加流动剪切力的时间间隔短，在流动剪切力高于6-10dyn/cm2时增加剪切力的时间间隔长。例如根据一个具体的实施例，当内皮细胞受到的流动剪切力小于5-10dyne/cm2时，每隔一小时增加前一小时血管内皮细胞所受剪切力的10％；当内皮细胞受到的流动剪切力达到5-10dyne/cm2范围后,诱导剪切力每隔两个小时增加前两小时血管内皮细胞所受剪切力的10％,从而延长血管内皮细胞对流动剪切力变化的适应时间，降低流动剪切力增加对血管内皮细胞的刺激。
根据一个具体的实施例，流动剪切力增加的比例在整个剪切力增加过程中是固定不变的；例如根据一个具体的实施例，内皮细胞受到的流动剪切力每隔一小时增加前一小时血管内皮细胞所受剪切力的15％。
根据一个具体的实施例，流动剪切力增加的比例在整个剪切力增加过程中是变化的：在流动剪切力低于6-10dyn/cm2时，剪切力增加的比例高，在流动剪切力高于6-10dyn/cm2时剪切力增加的比例低。例如根据一个具体的实施例在流动剪切力低于6-10dyn/cm2时，剪切力每隔一小时增加前一小时内皮细胞受到剪切力的10％，在流动剪切力高于6-10dyn/cm2时，剪切力每隔一小时增加前一小时内皮细胞受到剪切力的5％，从而延长血管内皮细胞对流动剪切力变化的适应时间，降低流动剪切力增加对血管内皮细胞的刺激。
根据一个具体的实施例，当人造血管内腔表面的血管内皮细胞受到的流动剪切力达到移植部位动脉血管内皮细胞受到的平均剪切力或剪切力峰值水平时，保持该流动剪切力(定常流)培养人造血管24-72小时，使血管内皮细胞更好地适应流动剪切力，并有时间对内皮细胞的结构和功能作出调整。
根据一个具体的实施例，当人造血管内腔表面的血管内皮细胞受到的流动剪切力达到移植部位动脉血管内皮细胞受到的平均剪切力或剪切力峰值水平时，对血管内皮细胞施加与移植部位动脉生理脉搏波特征一致的脉动流24-72小时，使血管内皮细胞更好地适应移植部位的动脉血流动力学环境，并有时间对血管内皮细胞的结构和功能作出调整。
根据一个具体的实施例，人造血管的管材包括：
－脱细胞基质的血管
－由胶原、蚕丝纤维、羊毛纤维等天然材料构成的人造血管
－由PLGA、PLA、PLG、海藻酸钠、聚四氟乙烯等高聚物构成的人造血管
根据一个具体的实施例。血管内皮细胞包括来源于自体、异体和干细胞体外分化而来的血管内皮细胞。
根据一个具体的实施例，人造血管内接种的细胞是内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪肝细胞等干细胞，经过剪切力诱导和脉动流诱导，向血管内皮细胞定向分化而来；
实施例1
1.为股腘动脉远端的血管移植准备内皮化的人造血管植入物，在内径为4mm的人造血管内腔表面接种血管内皮细胞；
2.将接种了血管内皮细胞的人造血管培养24-48小时，从而使内皮细胞长满人造血管内腔表面；
3.将长满内皮细胞的人造血管两端连接到充满了培养液的剪切力诱导系统的管路中，从而使人造血管和剪切力诱导系统的管路构成一个封闭的回路；
4启动剪切力诱导系统的液体驱动泵，设定初始流速为8ml/min，从而使流经人造血管内腔的培养液对血管内皮细胞的初始剪切力为1.2dyne/cm2；
5.按照图4a所示的剪切力增加程序施加剪切力诱导：在剪切力施加1小时后，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，即8.8ml/mim，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％，即受到的剪切力达到1.32dyne/cm2；
6.此后每隔1小时，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％，直到人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到股腘动脉远端的动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力水平(12dyne/cm2)为止；
7.保持培养基的流速从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力保持在股腘动脉远端的动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力水平(12dyne/cm2)，启动脉动电机，对人造血管内腔的血管内皮细胞加载股腘动脉远端脉搏波(如图4b所示)24-48小时，使血管内皮细胞有充分的时间适应生理水平的脉动剪切力，并作出相应的形态和功能的调整；
8.结束剪切力诱导，取下人造血管，用于后续生理指标检测及血管移植。
实施例2
1.为股腘动脉远端的血管移植准备内皮化的人造血管植入物，在内径为4mm的人造血管内腔表面接种血管内皮细胞；
2.将接种了血管内皮细胞的人造血管培养24-48小时，从而使内皮细胞长满人造血管内腔表面；
3.将长满内皮细胞的人造血管两端连接到充满了培养液的剪切力诱导系统的管路中，从而使人造血管和剪切力诱导系统的管路构成一个封闭的回路；
4启动剪切力诱导系统的液体驱动泵，设定初始流速为8ml/min，从而使流经人造血管内腔的培养液对血管内皮细胞的初始剪切力为1.2dyne/cm2；
5.按照图5所示的剪切力增加程序施加剪切力诱导：在剪切力施加1小时后，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，即8.8ml/mim，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％，即受到的剪切力达到1.32dyne/cm2；
6.此后每隔1小时，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％，直到人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到6.3dyne/cm2；
7.此后每隔2小时，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％，直到人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到股腘动脉远端的动脉血管内皮细胞所承受的剪切力峰值水平(20dyne/cm2)为止；
8.保持培养基的流速从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力保持在股腘动脉远端的动脉血管内皮细胞所承受的剪切力峰值水平(20dyne/cm2)，继续培养24-48小时，使血管内皮细胞有充分的时间适应生理水平的剪切力；
9.结束剪切力诱导，取下人造血管，用于后续生理指标检测及血管移植。
实施例3
1.为颈动脉血管移植准备内皮化的人造血管植入物，在内径为3mm的人造血管内腔表面接种血管内皮细胞；
2.将接种了血管内皮细胞的人造血管培养24-48小时，从而使内皮细胞长满人造血管内腔表面；
3.将长满内皮细胞的人造血管两端连接到充满了培养液的剪切力诱导系统的管路中，从而使人造血管和剪切力诱导系统的管路构成一个封闭的回路；
4启动剪切力诱导系统的液体驱动泵，设定初始流速为8ml/min，从而使流经人造血管内腔的培养液对血管内皮细胞的初始剪切力为1.2dyne/cm2；
5.在剪切力施加1小时后，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，即8.8ml/mim，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％，即受到的剪切力达到1.32dyne/cm2；
6.此后每隔1小时，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％，直到人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到6.3dyne/cm2；
7.此后每隔2小时，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一小时流速提高10％，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一小时提高10％，直到人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到颈动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力水平(15dyne/cm2)为止；
8.保持培养基的流速从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力保持在颈动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力水平(15dyne/cm2)，启动脉动电机，对人造血管内腔的血管内皮细胞加载颈动脉脉搏波24-48小时，使血管内皮细胞有充分的时间适应生理水平的脉动剪切力；
9.结束剪切力诱导，取下人造血管，用于后续生理指标检测及血管移植。
应当理解的是，在以上叙述和说明中对本发明所进行的描述只是说明而非限定性的，且在不脱离如所附权利要求书所限定的本发明的前提下，可以对上述实施例进行各种改变、变形、和/或修正。
Claims (6)
1.体外构建具有抗流动剪切和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法，在人造血管内腔表面接种血管内皮细胞，培养24-48小时，从而使血管内皮细胞长满人造血管内腔表面，对血管组织培养物施加剪切力刺激，诱导内皮细胞具有抗剪切、抗凝血能力，其特征在于所述的剪切力加载方式包含：
(1)在剪切力诱导的起始阶段，设定流经人造血管内腔的培养液对血管内皮细胞的初始剪切力为0-1.2dyne/cm2；
(2)在剪切力施加一段时间后，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一时间段流速提高一定比例，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一时间段提高一定比例；
所述的剪切力施加一段时间，是施加剪切力1-4小时；
所述的调节液体驱动泵使培养液的流速比前一时间段流速提高一定比例，是培养液的流速比前一时间段流速提高5-20％之间的一个固定值；
所述的使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一时间段提高一定比例，是流动剪切力比前一时间段流动剪切力提高5-20％之间的一个固定值；
(3)此后每隔一段时间，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一时间段流速提高一定比例，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一时间段提高一定比例；直到人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力达到移植部位动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平为止；
所述的此后每隔一段时间，是每隔1-4小时；
所述的调节液体驱动泵使培养液的流速比前一时间段流速提高一定比例，是培养液的流速比前一时间段流速提高5-20％之间的一个固定值；
所述的使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一时间段提高一定比例，是流动剪切力比前一时间段的流动剪切力提高5-20％之间的一个固定值；
(4)保持培养基的流速从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力保持在移植动脉部位动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力水平，对人造血管内腔的血管内皮细胞加载移植动脉部位的动脉脉搏波24-72小时，使血管内皮细胞有充分的时间适应生理水平的脉动剪切力。
2.根据权利要求1所述的体外构建具有抗流动剪切和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法，其特征在于：
权利要求1步骤(3)中，此后每隔一段时间，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一时间段流速提高一定比例，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一时间段提高一定比例；所述的增加流动剪切力的时间间隔在整个剪切力增加过程中是固定不变的；或者增加流动剪切力的时间间隔在整个剪切力增加过程中是变化的：在流动剪切力低于6-10dyn/cm2时，剪切力增加的间隔时间短，在流动剪切力高于6-10dyn/cm2时剪切力增加的间隔时间长。
3.根据权利要求1所述的体外构建具有抗流动剪切和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法，其特征在于：
权利要求1步骤(3)中，此后每隔一段时间，调节液体驱动泵使培养液的流速比前一时间段流速提高一定比例，从而使人造血管内腔的内皮细胞受到的剪切力比前一时间段提高一定比例；所述的培养基流速的提高比例在整个剪切力增加过程中是固定不变的；或者培养基流速的提高比例在整个剪切力增加过程中是变化的：在流动剪切力低于6-10dyn/cm2时，培养基流速增加的比例高，从而使剪切力增加的比例高，在流动剪切力高于6-10dyn/cm2时，培养基流速增加的比例低，从而使剪切力增加的比例低。
4.根据权利要求1所述的体外构建具有抗流动剪切和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法，其特征在于：
使人造血管内腔的血管内皮细胞在生理水平的脉动流作用下继续培养24-72小时，所述的生理水平的脉动流是指平均剪切力在移植部位动脉血管内皮细胞所承受的平均剪切力或剪切力峰值水平，与体内血管移植部位动脉的生理脉搏波特征一致的脉动流。
5.根据权利要求1所述的体外构建具有抗流动剪切和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法，其特征在于：
所述的人造血管的管材包括：
-脱细胞基质的血管
-由胶原、蚕丝纤维、羊毛纤维天然材料构成的人造血管
-由PLGA、PLA、PLG、海藻酸钠、聚四氟乙烯高聚物构成的人造血管。
6.根据权利要求1所述的体外构建具有抗流动剪切和抗血小板凝集功能的血管内皮层的方法，其特征在于：
所述的血管内皮细胞包括来源于自体、异体和干细胞体外分化而来的血管内皮细胞，或者可以分化为血管内皮细胞的内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞。
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