CN101827816B - Trpv1介导性疾病治疗剂 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于发现具有通式[I]表示的结构的脲化合物的新药理作用。具有通式[I]表示的结构的脲化合物或其盐类具有优异的TRPV1介导性疾病治疗作用。式中，A表示低级亚烷基或低级亚链烯基；R₁表示氢原子、烷基或链烯基，该烷基及链烯基可以被任意取代基取代；R₂及R₃相同或不同，表示氢原子或低级烷基，该低级烷基可以被单环式环烷基、多环式环烷基或芳基取代。

Description

TRPV1介导性疾病治疗剂

技术领域

本发明涉及一种含有脲衍生物作为有效成分的TRPV1介导性疾病治疗剂。

背景技术

TRPV1是钙离子透过性高的非选择性阳离子通道，隶属于Transient Receptor Potential(TRP)超家族，具有6个跨膜结构域，别名为香草素受体1(vanilloid receptor)(VR1)或辣椒素受体，作为TRPV1激动剂，已知有作为辣椒辣味成分的辣椒素及作为辣椒素衍生物的仙人掌毒素(resiniferatoxin)等香草素。另一方面，作为TRPV1拮抗剂已知有碘代仙人掌毒素(iodoresiniferatoxin)及抗辣椒碱(capsazepine)等化合物。

虽然TRPV1主要存在于感觉神经，但是其不仅表达在以上皮、骨、膀胱、消化管及肺为代表的多数内脏器官的神经组织中，而且也表达在非神经组织中。

已知TRPV1通过酸(pH5.9以下)、热(摄氏43度以上)等侵害刺激被活化，由TRPV1活化所带来的生理作用是多种多样的(参见非专利文献1)。

疼痛，根据其产生机理分为伤害性疼痛(躯体痛和内脏痛)、神经源性疼痛(疼痛由神经障碍引起、且在无侵害刺激下产生)等。

伤害性疼痛是由于热刺激等刺激损伤组织而产生的疼痛。躯体痛为皮肤或深层组织的侵害感受器被活化而产生的疼痛，分为浅表痛(来自皮肤、粘膜)和深部痛(来自肌肉、骨、关节)。躯体痛的特征在于是局限性疼痛。

内脏痛与躯体痛相比，其分布及性质在多数情况下不确定。一般认为疼痛是通过与支配内脏的自主神经一同走向的传入纤维传导的。

神经源性疼痛是由末梢或中枢神经系统自身机能异常引起的病理性疼痛。除灼热感之类的持续性疼痛之外，还包括间歇性·发作性的强烈疼痛。其特征为伴有感觉减退、痛觉过敏、异常性疼痛等现象(参见非专利文献2)。

膀胱过度活动症是呈现出由尿急·尿频·急迫性尿失禁构成的综合症状的病理状态。根据日本排尿功能学会进行的流行病学调查，日本人的患病率在40岁以上为12.4％，推定总数为810万人。其频率与衰老有显著关联，70岁以上的患病率达30％以上。另外，膀胱过度活动症患者的生活质量(QOL)在包括日常生活及精神状态的广泛领域中显示出显著的降低。

作为膀胱过度活动症的病因已知有脑血管障碍、脊髓损伤等神经性病因，及下尿路阻塞等非神经性病因，但大部分病因为突发性，尚无法确定，可以推测其发病与若干机理综合相关。膀胱过度活动症治疗的中心是药物疗法，其中使用毒蕈碱受体拮抗药作为第一选择药用于治疗，但发现有时一些患者不能得到充分的治疗效果，以及有时因口腔干燥等不快感导致服用遵从性降低。因此，人们期望进一步开发膀胱过度活动症治疗剂(参见非专利文献3及非专利文献4)。

消化管粘膜是机体与外界接触的广泛界面，通过应对管腔内各种刺激及变化、诱导出迅速且准确的生理反应，从而维持其内稳态。胃及十二指肠等消化管是对应激非常敏感地作出应答的脏器，其中胃不仅暴露于精神应激及火伤、外伤、手术等身体应激中，还暴露于多种粘膜损伤因素中，所述多种粘膜障碍因素包括食物、酒精、药物等外在因素及胃酸、胆汁等内在因素等，因此胃处于容易产生粘膜损伤的环境下。

作为负责胃粘膜防御机构的代表性内在因素已知有前列腺素。

治疗胃溃疡等消化道障碍(gastrointestinal dysfunction)时使用H₂受体抑制剂之类抑制胃酸分泌的化合物，但停止给药时有时产生溃疡复发等问题(参见非专利文献5)。

另外，通常认为由辣椒素激活的TRPV1介导的交感神经系统的活化，使能量代谢活跃，由此可使脂肪燃烧即预防肥胖。

在这种背景下，人们研究具有各种活性的化合物是否可以用作TRPV1介导性疾病的治疗药，但其成果并不令人满意，期望进一步探索TRPV1介导性疾病的治疗药。

另一方面，专利文献1中记载了作为本发明有效成分的脲衍生物具有TNF-α产生抑制作用，可以用作风湿性关节炎(RA)等自身免疫疾病治疗药。

专利文献1：日本特开2002-53555号公报

非专利文献1：戴毅·野口光一Journal of Clinical andExperimental Medicine，2004 Vol.211 No.5 pp389-392

非专利文献2：Journal of Clinical and Experimental Medicine，Vol.195 No.9 2000 582-584疼痛产生的生理机构(physiologicalMechanism of pain generation)角田俊信 花冈一雄

非专利文献3：关于膀胱过度活动症治疗药的临床评价方法的准则(Guideline for Clinical Evaluation Methods of Drugs for OveractiveBladder)(厚生劳动省通知 药食审查发第0628001号)

非专利文献4：日本药理学杂志129卷5号p361-p373

非专利文献5：加藤伸一等、G.I.Research 13卷、367页、2005年

发明内容

探索作为TRPV1介导性疾病特别是疼痛、膀胱过度活动症或消化道障碍的治疗药适合使用的化合物、以及发现公知脲衍生物的新药物用途是一个非常有趣的课题。

因此，本发明人等着眼于作为药物有用的下述通式[I]表示的公知脲衍生物(日本特开2002-53555)，探索研究了TRPV1介导性疾病的治疗药。

结果发现，上述脲衍生物为TRPV1激动剂。并且发现上述脲衍生物在疼痛、膀胱过度活动症及消化道障碍的实验模型中具有治疗效果，故其作为TRPV1介导性疾病特别是疼痛、膀胱过度活动症或消化道障碍治疗剂有用，从而完成了本发明。

本发明涉及以下述通式[I]表示的化合物或其盐类(以下若无特殊说明则记作“本化合物”)为有效成分的TRPV1介导性疾病治疗剂。

[式中，A表示低级亚烷基或低级亚链烯基；R₁表示氢原子、烷基或链烯基，该烷基及链烯基可以被任意取代基取代；R₂及R₃相同或不同，表示氢原子或低级烷基，该低级烷基可以被单环式环烷基、多环式环烷基或芳基取代。]

上述通式[I]表示的本化合物具有肾的虚血性障碍抑制效果，作为急性肾功能不全、慢性肾功能不全等TRPV1介导性疾病的治疗剂有用。

附图说明

[图1]表示化合物1的抑制曲线。

[图2]表示在不存在抗辣椒碱的条件下化合物1的对CGRP游离的剂量反应性的研究结果(平均+SEM)。

[图3]表示使用抗辣椒碱10μM(最终浓度)对化合物1的CGRP游离作用的竞争抑制实验的结果。

[图4]表示化合物1的抗侵害刺激作用(平均+SEM)。

[图5]表示化合物1的排尿间隔。

[图6]表示比较对照药的排尿间隔。

[图7]表示测定值的最大值的平均值，所述测定值为仅用介质(1％甲基纤维素)处置时处置前血流量及处置后的血流量、以及用含有化合物1的液体处置时处置前血流量及处置后的血流量。

[图8]表示化合物1对消炎痛诱发胃粘膜损伤的抑制效果。

具体实施方式

详细说明通式[I]中规定的各基团。

低级亚烷基表示亚甲基、甲基亚甲基、亚乙基、甲基亚乙基、1，3-亚丙基、甲基亚甲基、1，4-亚丁基、甲基1，4-亚丁基、1，5-亚戊基、1，6-亚己基等具有1～6个碳原子的亚烷基，该亚烷基可以被低级烷基取代，即也可以为支链亚烷基；优选低级亚烷基表示具有1～6个碳原子的直链亚烷基，该亚烷基可以被一个或多个甲基取代；更优选低级亚烷基表示具有1～6个碳原子的直链亚烷基，可以被1个甲基取代。

低级亚链烯基表示1，2-亚乙烯基、1，3-亚丙烯基、1，4-亚丁烯基、1，5-亚戊烯基等具有1个以上双键且具有2～6个碳原子的亚链烯基，该亚链烯基可以被低级烷基取代，即也可以为支链亚链烯基；优选低级亚链烯基表示具有2～6个碳原子的直链亚链烯基，该亚链烯基可以被一个或多个甲基取代；更优选低级亚链烯基表示具有2～6个碳原子的直链亚链烯基，也可以被1个甲基取代。

烷基表示甲基、乙基、丙基、丁基、己基、辛基、癸基、十二烷基、异丙基、异丁基、异戊基、异己基、异辛基、叔丁基、3，3-二甲基丁基等具有1～12个碳原子的直链或支链的烷基。

低级烷基表示烷基中特别是具有1～6个碳原子的直链或支链的烷基，优选表示直链的具有1～6个碳原子的烷基。

链烯基表示乙烯基、烯丙基、3-丁烯基、5-己烯基、异丙烯基等具有2～12个碳原子的直链或支链的链烯基，优选为具有2～6个碳原子的直链或支链的链烯基，特别优选为具有2～6个碳原子的直链链烯基。

单环式环烷基表示环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基等具有3～10个碳原子的环烷基，优选表示具有5～7个碳原子的环烷基，较优选表示环己基。

多环式环烷基表示金刚烷基等具有4～10个碳原子的多环式环烷基，优选表示具有10个碳原子的多环式环烷基，较优选表示金刚烷基。

芳基表示苯基、萘基等芳香族烃环，优选表示苯基。

卤原子表示氟原子、氯原子、溴原子或碘原子，优选表示氟原子。

所谓任意取代基，表示例如卤原子、三卤代甲基、低级烷基、环烷基、芳基、杂环基或甲氧基，优选表示卤原子、三卤代甲基、环己基、苯基、呋喃基、噻吩基、噻唑基或吗啉基，更优选表示三卤代甲基。

本发明中的盐类只要为作为药物允许的盐即可，没有特别限定，可以举出与盐酸、硝酸、硫酸、磷酸等无机酸形成的盐，与乙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸等有机酸形成的盐，或者与钠、钾、钙等碱金属或碱土金属形成的盐等。另外，本化合物的季铵盐也包含在本发明的盐类中。进而，本化合物中存在几何异构体或光学异构体时，所述异构体也包括在本发明的范围内。需要说明的是，本化合物还可以为水合物或溶剂合物的形态。

上述通式[I]表示的化合物中，优选用于本发明TRPV1介导性疾病治疗剂的化合物为下述化合物，其中

1)A为低级亚烷基或低级亚链烯基；

2)R₁为低级烷基，该低级烷基可以被任意取代基取代；并且

3)R₂为氢原子，并且R₃为被单环式环烷基、多环式环烷基或芳基取代的低级烷基，或者

R₃为氢原子，并且R₂为被单环式环烷基、多环式环烷基或芳基取代的低级烷基。

上述通式[I]表示的化合物中，较优选用于本发明TRPV1介导性疾病治疗剂的化合物为下述化合物，其中

1)A为低级亚烷基；

2)R₁为低级烷基，该低级烷基可以被任意取代基取代；

3)R₃为氢原子，并且，

4)R₂为被单环式环烷基、或多环式环烷基取代的低级烷基。

此处，该被单环式环烷基或多环式环烷基取代的低级烷基优选为被单环式环烷基或多环式环烷基取代的直链低级烷基。

上述通式[I]表示的化合物中，更优选用于本发明的TRPV1介导性疾病治疗剂的化合物为下述化合物，其中，

A为1，3-亚丙基或甲基1，3-亚丙基；R₁为直链低级烷基，该直链低级烷基可以被任意取代基取代；R₂为金刚烷基乙基或金刚烷基丙基；并且，R₃为氢原子。

本发明的TRPV1介导性疾病治疗剂，含有上述通式[I]表示的化合物中的优选的具体化合物、即选自下述化合物中的化合物或其盐类作为有效成分，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-1-戊基-3-[3-(4-吡啶基)丙基]脲(化合物1)，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[3-(4-吡啶基)丙基]-1-(3，3，3-三氟丙基)脲(化合物2)，

1-[3-(1-金刚烷基)丙基]-1-丙基-3-[3-(4-吡啶基)丙基]脲(化合物3)，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[1-甲基-3-(4-吡啶基)丙基]-1-戊基脲(化合物4)，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[2-甲基-3-(4-吡啶基)丙基]-1-戊基脲(化合物5)，

(+)-1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[2-甲基-3-(4-吡啶基)丙基]-1-戊基脲(化合物6)，及

(E)-1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-1-戊基-3-[3-(4-吡啶基)-2-丙烯基]脲(化合物7)。

特别优选含有上述化合物1～7中的1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-1-戊基-3-[3-(4-吡啶基)丙基]脲或其盐类作为有效成分的TRPV1介导性疾病治疗剂。

本化合物所包含的代表性化合物的结构式如下所示。

[表1]

本化合物可以通过例如日本特开2002-53555号公报记载的方法制备。

本说明书及权利要求书中，所谓疼痛(pain)，不管其是何种性质，表示全部种类的疼痛。

本说明书中，香草素受体表示TRPV1、TRPV2等全部香草素受体。

为了研究本化合物的有用性，首先确认本化合物是否为TRPV1激动剂。其详细内容记载于下述药理试验项中，本化合物与作为公知激动剂的辣椒素相比对含有TRPV1的神经细胞膜标本显示较高的结合亲和性，并且，本化合物对神经递质自神经细胞末梢(neuronalterminal)的游离促进作用，也被作为TRPV1拮抗剂的抗辣椒碱拮抗。上述实验结果表示本化合物为优异的TRPV1激动剂。

作为由TRPV1介导的疾病即TRPV1介导性疾病，例如可以举出疼痛、膀胱过度活动症、消化道障碍、肥胖症、打嗝、暴露于热下而引起的热灼伤、暴露于酸下而引起的热灼伤、晒伤等。由于本化合物具有优异的TRPV1激动剂作用，所以在上述TRPV1介导性疾病治疗中有用，其中特别是作为疼痛、膀胱过度活动症或消化道障碍治疗剂有用。

通过药理试验确认了本化合物作为TRPV1介导疾病的治疗剂有用。

疼痛是机体所需要的不可或缺的感觉信息，用来感受来自外界的侵害刺激并确定障碍部位。TRPV1主要存在于神经末梢，是被酸(pH5.9以下)、热(43℃以上)等侵害刺激活化的离子通道型受体。通过TRPV1的活化，P物质(substance P)、CGRP等神经肽从神经末梢中游离，并参与痛觉传达。

已知在神经末梢中使上述神经肽衰竭是隔断痛觉传达的方法之一。例如，已知辣椒素等TRPV1激动剂诱导神经末梢中的上述神经肽的衰竭。实际上，辣椒素在临床上用于治疗疼痛、特别是伴随炎症的长期疼痛等伤害性疼痛，另外有报道指出在使用坐骨神经损伤模型进行的研究中辣椒素也可以用于治疗神经源性疼痛(Rashid H.等The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 304卷，940页，2003年)。

作为被TRPV1激动剂治疗的疼痛的种类，可以举出伤害性疼痛、神经源性疼痛、内脏痛、躯体痛、急性疼痛、慢性疼痛、伴有由酸或热引起的热灼伤的疼痛、牙痛、通常的头痛、偏头痛、丛集性头痛(cluster headache)、神经痛等。

详细情况如下述药理试验项中的记载所示，使用醋酸扭体模型研究本化合物的镇痛作用，结果发现本化合物抑制数次扭体，具有优异的镇痛效果。即，作为TRPV1激动剂的本化合物，作为下述疼痛的治疗剂有用：例如伤害性疼痛、神经源性疼痛、内脏痛、躯体痛、急性疼痛、慢性疼痛、伴有由酸或热引起的热灼伤的疼痛、牙痛、通常的头痛、偏头痛、丛集性头痛、神经痛，特别是作为伤害性疼痛、神经源性疼痛、内脏痛或躯体痛的治疗剂有用。

近年，在尿路上皮细胞中确认到TRPV1的表达，逐渐明确排尿与TRPV1的关系。进而，有报道指出TRPV1激动剂对神经性、非神经性任一种的膀胱过度活动症也有效，Kuo等人报道了仙人掌毒素等TRPV1激动剂在临床上对膀胱过度活动症的治疗有用(Kuo，H等、The Journal of Urology第176卷、641-645页2006年)。

使用向大鼠膀胱内持续注入生理盐水的模型，对本化合物作为膀胱过度活动症治疗剂的活性进行了研究。详细情况如下述药理试验项中的记载所示，本化合物显示显著的TRPV1激动剂活性，在向大鼠膀胱内持续注入生理盐水的模型中显示优异的排尿间隔延长效果，因此作为膀胱过度活动症、特别是尿急、尿频或急迫性尿失禁的治疗剂有用。本化合物特别是作为神经性或非神经性膀胱过度活动症的治疗剂有用，作为神经性膀胱过度活动症的例子，可以举出伴有下述疾病的膀胱过度活动症，即，位于脑干桥上位的中枢疾病(脑血管障碍、帕金森病、多系统萎缩症、痴呆(dementia)、脑肿瘤、脑炎、髓膜炎等)或脊髓疾病(脊髓损伤、多发性硬化症、脊髓小脑性共济失调、脊髓肿瘤、颈椎病、后纵韧带骨化症、脊管狭窄症、脊髓血管障碍、脊髓炎、脊柱裂等)，作为非神经性膀胱过度活动症的例子，可以举出伴有下尿路阻塞的膀胱过度活动症、伴随衰老的膀胱过度活动症、伴有骨盆底脆化的膀胱过度活动症、特发性膀胱过度活动症等。

另外，已知辣椒素等TRPV1激动剂使CGRP等递质从支配消化管的感觉神经末梢中游离。有报道指出因TRPV1活化而游离的CGRP通过微小循环改善作用增加消化管粘膜的血流量，另外CGRP通过促进由NO或PGI₂等递质介导的粘液分泌等而发挥消化管粘膜保护作用，经上述递质对消化道障碍显示出抑制作用。(原田直明等、Progress in Medicine 22卷，1997页，2002年)(加藤伸一等、G.I.Research 13卷、367页、2005年)

使用大鼠消化管粘膜血流量及消化道障碍模型，对本化合物作为消化道障碍治疗剂的活性进行了研究。详细情况如下所述，由于本化合物为TRPV1激动剂，并且显示出优异的粘膜血流增加作用及胃粘膜损伤的治疗效果，所以作为消化道障碍、特别是胃溃疡、十二指肠溃疡、吻合口溃疡(anastomotic ulcer)、反流性食管炎、非糜烂性胃食管反流病、上部消化管出血、急性胃炎、慢性胃炎等上部消化道障碍的治疗剂有用。

本化合物的给药可以非口服也可以口服。作为给药剂型可以举出片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、注射剂、贴剂、软膏剂、洗剂、混悬剂、膀胱内灌注剂等。本化合物的制剂例如日本特开2002-53555、日本特开2003-226686公报所示，但不限于这些专利文献记载的方法，可以使用常用技术对本化合物进行制剂化。例如，片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂等口服制剂，可以根据需要在本化合物中加入下述辅料进行制备：乳糖、结晶纤维素、淀粉、植物油等稀释剂(dilluting agent)，硬脂酸镁、滑石等润滑剂，羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等粘合剂，羧甲基纤维素钙、低取代羟丙基甲基纤维素等崩解剂，羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇、硅树脂等包衣剂，明胶皮膜等成膜剂等。

本化合物的给药量可以根据症状、年龄、剂型等适当选择，如果为口服制剂则通常可以每1日分一次或数次给药0.1～5000mg，优选1～1000mg。

实施例

(制剂例)

作为本化合物的口服制剂及注射剂通常的制剂例如下所示。

1)片剂

处方1(100mg中)

本化合物                1mg

乳糖                    66.4mg

玉米淀粉                20mg

羧甲基纤维素钙          6mg

羟丙基纤维素            4mg

硬脂酸镁                0.6mg

上述处方的片剂中使用2mg包衣剂(例如羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇、硅树脂等通常的包衣剂)进行包衣，可以得到作为目标的包衣片(以下处方的片剂也相同)。另外，通过适当改变本化合物及添加物的量，可以得到所期望的片剂。

2)胶囊剂

处方1(150mg中)

本化合物                5mg

乳糖                    145mg

通过适当改变本化合物及乳糖的混合比，可以得到所期望的胶囊剂。

3)注射剂

处方1(10ml中)

本化合物                10～100mg

氯化钠                  90mg

氢氧化钠            适量

盐酸                适量

灭菌精制水          适量

通过适当改变本化合物及添加物的混合比，可以得到所期望的注射剂。

以下举出使用了本化合物的药理试验的结果，这些例子用于更好地理解本发明，并不限定本发明的范围。

药理试验

1.大鼠脊髓膜标本中本化合物的结合活性

已知TRPV1表达于存在于大鼠脊髓中的感觉神经中。Szallasi等使用大鼠脊髓神经细胞膜标本，报道了作为TRPV1激动剂的仙人掌毒素与膜标本中含有的香草素受体结合，并报道了由作为辣椒素拮抗药的抗辣椒碱引起的拮抗实验的结果(Journal of Phamacologyand Experimental Therapeutics，267卷、728-733页)。基于Szallasi等方法研究了本化合物对大鼠脊髓膜标本中含有的香草素受体的结合活性。

(含有受试化合物的液体等的制备)

制备含有受试化合物的液体及含有竞争化合物的液体，所述含有受试化合物的溶液及含有竞争化合物的溶液分别含有受试化合物、竞争化合物，并且含有具有1％DMSO的精制水。竞争化合物使用氚标记仙人掌毒素(³H-RTX)，使含有竞争化合物的溶液中³H-RTX的浓度为0.2nM。

(膜标本的制备)

采用通用方法将大鼠脊髓均化，清洗数次后离心分离，将所得的颗粒悬浮于培养缓冲液(10mM HEPES，pH7.4，0.25mg/ml BSA，0.75mM CaCl₂，5mM KCl，2mM MgCl₂，5.8mM NaCl，137mM Sucrose)中使其为10mg/mL，制备膜标本。

(结合实验)

将5.25μL含有受试化合物的液体及500μL膜标本混合后，向该混合物中加入20μL含有竞争化合物的液体，将所得的全部混合物在37℃下培养60分钟。过滤并回收生成的膜/³H-RTX复合体，清洗后用闪烁计数器测定放射活性。

(实验结果的解析)

使用含有各种浓度受试化合物的含有受试化合物的液体进行上述实验，如下所示对结果进行解析。

通过下式求出受试化合物在各浓度下的抑制率(％)。

抑制率(％)＝{1-[受试化合物存在下的结合活性(cpm)-非特异性结合的放射活性(cpm)]/[全部结合的放射活性(cpm)-非特异性结合的放射活性(cpm)]}×100

然后，将各浓度下的抑制率绘图，通过非线性回归分析求出50％抑制浓度(IC)及希尔系数。回归方程使用以下二参数Logistic方程(two-parameter logistic equation)。

Y＝bottom+(top-bottom)/{1+10^[(LogIC₅₀-X)×希尔系数]}

此处，X表示化合物的浓度(对数)，Y表示抑制率(％)，Y自bottom开始至top呈S形曲线变化。使用0％作为bottom，使用100％作为top。

另外，用下式求出抑制常数(Ki值)。

Ki＝IC₅₀/(1+放射标记配体浓度/解离常数)

此处，解离常数使用相同实验系统中确立的解离常数(作为香草素受体为0.046nM)。

作为由此求得的本化合物的实验结果，举出化合物1的实验结果。

举出化合物1的抑制曲线如图1所示，化合物1针对大鼠脊椎神经细胞膜标本香草素受体的IC₅₀值为191±28nM(三次相同实验的平均±SEM)，Ki值为35.8±5.2nM，希尔系数为1.83±0.449。另外，在相同实验系统中求得的辣椒素的IC₅₀值为3.14±0.76μM，Ki值为0.587±0.142μM。以上表明与作为公知激动剂的辣椒素相比本化合物对香草素受体具有极强的结合亲和性。

2.本化合物在TRPV1激动剂诱发CGRP游离系统中的效果，所述TRPV1激动剂诱发CGRP游离系统使用来自大鼠脊髓背根神经节的神经细胞。

已知TRPV1表达于脊椎背根神经节(DRG)，已知通过TRPV1的活化作为神经递质的CGRP从神经末梢中游离。基于Ahluwalia等的方法(European Journal of Neuroscience，17卷、2611页、2003年)，研究本化合物在来自大鼠DRG的培养神经细胞中的CGRP游离活性。

(含有受试化合物的液体等的制备)

称量受试化合物将其溶解于DMSO中，用培养基稀释该溶液制备含有受试化合物的液体。需要说明的是，制备含有受试化合物的液体使其分别含有0.4％的DMSO。作为阳性对照使用作为TRPV1激动剂的辣椒素，作为针对受试化合物的竞争化合物使用作为TRPV1拮抗剂的抗辣椒碱，同样地制备含有竞争化合物的液体。

(实验方法)

将从大鼠脊髓取出的背根神经节切成细丝后，用胶原酶-DNaseI溶液在37℃下进行酶处理1小时，然后用胰蛋白酶DNase I溶液在37℃下进行酶处理20分钟。将游离出的神经细胞清洗并回收，播种于经Poly-D-lysine/laminin涂布的培养皿中，在37℃、5％二氧化碳条件下，用添加有神经生长因子的神经细胞用培养基(NGF/NCS培养基)培养1日。将培养基改为含有阿糖胞苷的NGF/NCS培养基进一步培养2日。将培养基改为NGS/NCS培养基并培养1日，在抗辣椒碱存在下或不存在下培养30分钟后，进一步添加化合物1培养10分钟，回收培养上清液。

使用市售的根据ELISA法的定量试剂盒，按照试剂盒的说明书进行操作，测定培养上清液中的CGRP。按照一组为3例进行研究，求出各组培养上清液中CGRP浓度的平均值及SEM。通过Student t检验或Dunnett多重比较进行统计解析。

(实验结果)

作为试验结果的例子，在不存在抗辣椒碱下化合物1对CGRP游离的剂量反应性的研究结果(平均+SEM)如图2所示，抗辣椒碱10μM(最终浓度)对化合物1的CGRP游离作用的竞争抑制实验结果(同)如图3所示。在上述图中，##表示通过Student t检验相对无处置组的概率(P值)为1％以下，**表示通过Dunnett多重比较相对无处置组的概率为1％以下，++表示通过Student t检验相对化合物处置组的概率为1％以下。

如图2所示，化合物1呈剂量依赖性地使CGRP游离，其作用与作为阳性对照的辣椒素相比，在低浓度下即显示出相同程度的作用强度。另一方面，如图3所示，由化合物1引起的CGRP游离被抗辣椒碱拮抗，其拮抗程度与使用辣椒素时程度相同。上述实验结果表明本化合物是TRPV1的特异性激动剂。

由以上药理试验结果可以确认本化合物为优异的TRPV1激动剂。

3.人TRPV1表达细胞中本化合物引起的细胞内钙流入的测定

已知TRPV1为离子通道型受体，通过其活化引起钙离子流入细胞内。基于Phelps等的方法(Eur.J.Pharmacol.，513：57-66，2005)，使用转染了编码人TRPV1的基因的CHO细胞，研究本化合物对人TRPV1的活化作用。

(含有受试化合物的液体等的制备)

将CHO细胞悬浮于DMEM中，并播种于培养板上使其为3.5×10⁴cell/孔。将受试化合物或对照化合物溶解于DMSO制备DMSO溶液，并制备分别含有所得的DMSO溶液的、由HBSS形成的、被浓缩10倍的含有受试化合物的液体及含有对照化合物的液体。对照化合物使用辣椒素，使含有对照化合物的液体中及含有受试化合物的液体中的药物浓度均为10μM。

(钙流入实验)

在CHO细胞中添加钙指示剂，在37℃下培养30分钟后，进一步在22℃下培养30分钟，进行平衡化。继续上述培养，添加1/10量的受试化合物、对照化合物(最终浓度1μM)或HBSS溶液，测定细胞内钙浓度指示剂的荧光强度的变化。

(实验结果的解析)

由受试化合物引起刺激时的荧光强度相对于由作为对照化合物的1μM辣椒素引起刺激时的荧光强度的比例，由下式求出，以％表示。

钙流入(％)＝(受试化合物存在下的荧光强度·背景荧光强度)/(对照化合物存在下的荧光强度·背景荧光强度)×100

如上所述求出的本化合物的实验结果如表2所示。

[表2]

化合物	钙流入(％)
		化合物2	74.1
化合物3	59.8
		化合物4	43.9
化合物5	64.3
		化合物6	76.6
化合物7	36.1

4.通过醋酸扭体法测定本化合物的镇痛效果

作为评价药物镇痛效果的方法，常用Anderson等人的小鼠醋酸扭体法(Fed.Proc.，18卷，412页、1959年)。因此，使用该小鼠醋酸扭体法，进行受试化合物的抗侵害刺激作用试验，评价研究受试化合物的镇痛效果。

(0.7％醋酸溶液的制备)

在99.7％醋酸中加入生理盐水，制备0.7％醋酸溶液。

(实验方法)

经口给与受试化合物20分钟后，以每10g小鼠体重给与0.1ml的比例腹腔内给与0.7％醋酸溶液。接着，计算给与醋酸后10分钟至20分钟之间出现的扭体次数，由此测定抗侵害刺激作用。

(试验结果)

作为试验结果的例子，化合物1的抗侵害刺激作用(平均+SEM)如图4所示。图4中，*表示相对于无处置组(化合物0mg/kg给药组)通过Dunnett的多重比较概率小于5％，**表示相对于无处理组通过Dunnett的多重比较概率小于1％。

如图4所示，本化合物呈剂量依赖性地抑制醋酸扭体模型中的扭体次数。

由上述药理试验结果可以确认，本化合物显示出优异的疼痛治疗效果，特别显示出对伤害性疼痛的抑制效果，作为疼痛治疗药有用。

5.在向大鼠膀胱内持续注入生理盐水的模型中本化合物的排尿间隔延长作用

作为评价针对膀胱过度活动症的治疗效果的方法，常用Yu等人的方法即向膀胱内持续注入生理盐水的模型中排尿间隔的延长作用的测定(Journal of Phamacology and Experimental Therapeutics，290，825(1999))。基于Yu等人的方法，测定受试化合物在膀胱内持续注入生理盐水的模型中的排尿间隔延长作用，评价研究受试化合物的膀胱过度活动症治疗效果。

(含有受试化合物的液体的制备)

将受试化合物溶解于含有1％聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)的生理盐水中，制备含有受试化合物的液体。

(比较对照药的制备)

将作为对照药的盐酸奥昔布宁溶解于生理盐水中，制备含有其的液体。

(使用动物)

将CD系大鼠(雄性、8周龄)检疫驯化1周后，按照每1组2～6只用于实验。

(实验方法)

用乌拉坦(urethane)麻醉大鼠(1.2g/kg)。将药物注入用第1导管插入大鼠大腿静脉并结扎。沿正中线将腹部切开约2cm，露出膀胱，在膀胱顶部用19G的针打开小孔，插入用于继续注入生理盐水的第2导管并结扎。将第2导管与三通阀(three-way stopcock)连接，三通阀的一个通路连接用于将生理盐水注入膀胱内的25mL注射器(设置于注射器泵上)，另一个通路连接压力转换器。

(排尿间隔的测定)

排尿间隔的测定如下进行，连续记录排尿压，将排尿压图上排尿压迅速降低的时间点作为排尿的时间点，将上述时间点的间隔作为排尿间隔并用于解析。

以在2.4～4.8mL/hr范围内且可以得到稳定的排尿反射的流速从注射器泵向膀胱内持续注入生理盐水。由第1导管向大腿静脉内注入溶剂，测定排尿间隔。确认在适当时间后排尿间隔变恒定，同样地注入受试化合物或比较对照药，测定排尿间隔。

(结果评价)

分别算出给与溶剂时及给与药物时各个体的2次排尿间隔的平均值，并作为该个体排尿间隔，分别求出各组排尿间隔的平均值。使用相应的t检验进行统计解析。

作为试验结果的例子，化合物1的排尿间隔如图5所示，比较对照药的排尿间隔如图6所示。

如图5及图6所示，本化合物以极低用量显示出优异的排尿间隔延长作用，其作用强度强于临床上用作膀胱过度活动症治疗药的盐酸奥昔布宁。

由上述药理试验结果可以确认，本化合物显示出极优异的排尿间隔延长作用，作为膀胱过度活动症治疗药有用。

6.本化合物对正常大鼠消化管粘膜血流的血流量增加作用

正常动物中消化管粘膜血流量的增加作用为消化管溃疡治疗剂的药效评价等中使用的模型。Matsumoto等使用相同方法研究了辣椒素的胃粘膜血流增加作用(Japanese Journal of Phamacology 57卷、205页、1991年)。基于Matsumoto的方法，评价本化合物对正常大鼠的胃粘膜血流量的增加作用。

(含有受试化合物的液体的制备)

在即将使用前通过将受试化合物悬浮于作为介质的1％甲基纤维素水溶液中来制备含有受试化合物的液体。

(实验方法)

粘膜血流量的测定中使用激光组织血流计(OMEGAFLO FLO-N1)，以每单位重量组织的血流量的形式求出血流量。

将禁食18小时以上的大鼠在乌拉坦麻醉下剖腹，露出胃并置于灌流用室中。将胃沿着大弯切开并使其不出血，将内容物洗掉后，使胃在灌流用室内伸展，在小弯中央附近设置激光血流计的探针。一边用生理盐水对胃进行灌流一边等待胃粘膜血流量趋于稳定，将血流量保持一定值时的血流量作为处置前血流量。暂时停止灌流除去全部的生理盐水，滴入含有受试化合物的液体，测定60分钟的血流量。

(结果评价)

对于每个动物记录处置前血流量及受试化合物处置后每5分钟的胃粘膜血流量。

作为本化合物的消化管粘膜血流增加作用的例子，举出化合物1的胃粘膜血流量增加作用。对于仅用介质(1％甲基纤维素)进行处置时的处置前血流量及处置后的血流量、以及用含有化合物1的液体进行处置时的处置前血流量及处置后的血流量的测定值的最大值，它们的平均值分别如图7所示。通过对应的t检验进行统计解析。

如图7所述，本化合物显示出显著的胃粘膜血流增加作用。

7.对大鼠消化道障碍模型的效果

消炎痛(indomethacin)诱发胃粘膜损伤模型为在溃疡治疗剂的药效评价中常用的消化道障碍模型。基于星野等的方法(日本药理学杂志97卷、287页、1991年)，研究本化合物在大鼠消炎痛诱发胃粘膜损伤模型中的效果。

(含有受试化合物的液体等的制备)

在即将使用前通过将受试化合物悬浮于作为介质的1％甲基纤维素水溶液中来制备含有受试化合物的液体。作为对照化合物使用质子泵抑制剂，作为消化性溃疡治疗剂使用临床使用的奥美拉唑，同样地制备含有对照化合物的溶液。

(实验方法)

对禁食24小时的大鼠口服给与含有受试化合物的液体、含有对照化合物的液体或介质(病理对照组)，之后立即按照30mg/kg的用量皮下给与消炎痛(和光纯药)。将未进行消炎痛处置、之后进行相同操作的组作为正常对照组。用消炎痛处置6小时后由尾静脉向静脉内注入5％Chicago Sky Blue 6B溶液，使大鼠安乐死后取出胃，沿着大弯将胃切开。用生理盐水清洗胃后使用1％中性福尔马林液进行半固定。使用游标卡尺通过肉眼测定含有瘀斑的染成蓝色的损伤部位的长径。

(结果评价)

求出各个体的损伤部位长径的总和的平均值，记作Ulcer index。另外，通过下式算出胃粘膜损伤抑制率。

胃粘膜损伤抑制率(％)＝{-[(化合物给药组的Ulcer index)-(正常对照组的Ulcer index)]/[(病理对照组的Ulcer index)-(正常对照组的Ulcer index)]}×100

作为本化合物的消化道障碍抑制效果的例子，化合物1对消炎痛诱发胃粘膜损伤的抑制效果如图8所示，另外，如上所述求出的胃粘膜损伤抑制率如表3所示。

[表3]

如图8及表3所示，本化合物与作为消化性溃疡治疗剂的奥美拉唑相比以低用量即显示出相同的胃粘膜损伤抑制作用，显示出明显的效果。

由以上药理试验结果可以确认，本化合物作为消化道障碍的治疗剂极其有效。

产业上的可利用性

本化合物为TRPV1激动剂，在疼痛、膀胱过度活动症及消化道障碍实验模型中具有治疗效果，因此作为TRPV1介导性疾病特别是疼痛、膀胱过度活动症或消化道障碍的治疗剂有用。

Claims (6)

1.下述通式[I]表示的化合物或其盐类在制备治疗TRPV1介导性疾病的药物中的应用，所述TRPV1介导性疾病为膀胱过度活动症，

其中，A为1，3-亚丙基或甲基1，3-亚丙基；R₁为碳原子数为1～6的直链烷基，所述碳原子数为1～6的直链烷基可以被卤原子或三卤代甲基取代；R₂为金刚烷基乙基或金刚烷基丙基；并且，R₃为氢原子。

2.如权利要求1所述的通式[I]表示的化合物或其盐类在制备治疗TRPV1介导性疾病的药物中的应用，其中，化合物选自下述物质，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-1-戊基-3-[3-(4-吡啶基)丙基]脲，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[3-(4-吡啶基)丙基]-1-(3，3，3-三氟丙基)脲，

1-[3-(1-金刚烷基)丙基]-1-丙基-3-[3-(4-吡啶基)丙基]脲，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[1-甲基-3-(4-吡啶基)丙基]-1-戊基脲，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[2-甲基-3-(4-吡啶基)丙基]-1-戊基脲，

(+)-1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[2-甲基-3-(4-吡啶基)丙基]-1-戊基脲。

3.下述通式[I]表示的化合物或其盐类在制备治疗TRPV1介导性疾病的药物中的应用，所述TRPV1介导性疾病为疼痛，

其中，A为1，3-亚丙基或甲基1，3-亚丙基；R₁为碳原子数为1～6的直链烷基，所述碳原子数为1～6的直链烷基可以被卤原子或三卤代甲基取代；R₂为金刚烷基乙基或金刚烷基丙基；并且，R₃为氢原子。

4.如权利要求3所述的通式[I]表示的化合物或其盐类在制备治疗TRPV1介导性疾病的药物中的应用，其中，化合物选自下述物质，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-1-戊基-3-[3-(4-吡啶基)丙基]脲，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[3-(4-吡啶基)丙基]-1-(3，3，3-三氟丙基)脲，

1-[3-(1-金刚烷基)丙基]-1-丙基-3-[3-(4-吡啶基)丙基]脲，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[1-甲基-3-(4-吡啶基)丙基]-1-戊基脲，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[2-甲基-3-(4-吡啶基)丙基]-1-戊基脲，

(+)-1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[2-甲基-3-(4-吡啶基)丙基]-1-戊基脲。

5.下述通式[I]表示的化合物或其盐类在制备治疗TRPV1介导性疾病的药物中的应用，所述TRPV1介导性疾病为消化道障碍；

其中，A为1，3-亚丙基或甲基1，3-亚丙基；R₁为碳原子数为1～6的直链烷基，所述碳原子数为1～6的直链烷基可以被卤原子或三卤代甲基取代；R₂为金刚烷基乙基或金刚烷基丙基；并且，R₃为氢原子。

6.如权利要求5所述的通式[I]表示的化合物或其盐类在制备治疗TRPV1介导性疾病的药物中的应用，其中，化合物选自下述物质，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-1-戊基-3-[3-(4-吡啶基)丙基]脲，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[3-(4-吡啶基)丙基]-1-(3，3，3-三氟丙基)脲，

1-[3-(1-金刚烷基)丙基]-1-丙基-3-[3-(4-吡啶基)丙基]脲，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[1-甲基-3-(4-吡啶基)丙基]-1-戊基脲，

1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[2-甲基-3-(4-吡啶基)丙基]-1-戊基脲，

(+)-1-[2-(1-金刚烷基)乙基]-3-[2-甲基-3-(4-吡啶基)丙基]-1-戊基脲。

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