CN101821382A - 原代细胞的繁殖及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及繁殖或富集不带有肿瘤特性的原代细胞的方法，及其随后的应用。

Description

原代细胞的繁殖及其应用
本发明涉及繁殖或富集不带有肿瘤特性的原代细胞的方法，及其随后的应用。
提供适用于人类的细胞提出了医学挑战，不论这些细胞是用于体内治疗还是用于开发包括相应的细胞培养物在内的离体细胞体系。而且，迫切需要建立尽可能接近人类细胞的细胞培养物，这些细胞培养物因而可以用于药物测试、研究等。
在现有技术中，已经建立了能够在适当的培养基上无限增殖并且永生的细胞的细胞系。具体而言，肿瘤细胞或肿瘤样细胞，连同以前已知的HeLa细胞——宫颈癌细胞系、COS细胞、HEK-293肾细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEp-2——人喉癌上皮细胞系等是已知的。这种细胞系的产生在例如EP833934(Crucell)中被描述。这种细胞系被用于例如药物测试。然而，这种细胞系的缺陷是基因突变(例如，点突变、染色体片段交换(重排)、基因拷贝数增加(基因扩增)和甚至染色体组的改变(非整倍性))以及由无限增殖化和无限分裂的产生的肿瘤特性。在培养过程中，已知这种细胞系中的细胞通过自发突变逐渐改变；它们可以发展成恶性细胞群体并且具有遗传不稳定性。根据发明人的发现，在这种情况下，培养中累积突变的临界点出现在仅仅在约60次细胞分裂之后。这种突变能够导致癌基因的激活或导致肿瘤抑制基因的失活。从而，作为累积突变的结果，细胞群体可以被具有增加的增殖活性的细胞浸润。这种选择过程对应于肿瘤形成的癌前阶段；另外，多数商业可用的细胞系已经经过了未知次数的倍增，并且甚至其自身可能是源于恶性肿瘤细胞。
表1：与其他细胞系相比具有扩大的倍增能力的细胞的特性
  细胞系统特性 原代细胞   具有扩大的倍增能力的细胞   瘤细胞系
  产生   来自天然的组织   来自原代细胞   来自肿瘤
  可能的细胞分裂次数   限于10-25a   限于30-60   无限的
  表型   天然的   天然的   改变的
  遗传稳定   是   是   否
  在软琼脂中的生长b   否   否   是
  在体内的肿瘤生长c   否   否   是
a)细胞的实际增殖能力取决于细胞供体的年龄；供体的越老，细胞经历的分裂越多。
b)待研究的细胞上涂有特殊的琼脂糖(软琼脂)，已经失去天然的接触抑制能力的细胞作为集落在软琼脂内生长。这也经常被称作转化，并且是肿瘤形成的先决条件。然而，大多数情况下，肿瘤形成需要额外的阶段，例如细胞的无限增殖化。天然细胞在软琼脂中不能生长。
c)通常，软琼脂测试不能提供足够的恶性细胞变性的证据。本领域技术人员已知的一种经常使用的测试包括将待测细胞植入免疫缺陷鼠(裸鼠或SCID鼠)。由于免疫系统的缺陷或缺失，即使是其他物种的细胞(异种移植物)也不会被免疫排斥，并且恶性肿瘤细胞能够发展成肿瘤。
然而，迫切需要从原代细胞培养物中获得细胞，所述细胞与原代细胞相比，具有扩大了的固有增殖能力，但其优选地不具备肿瘤细胞的特性，特别是恶性肿瘤细胞的那些特性，如在软琼脂中的生长或者甚至例如在体内的肿瘤生长，并且其大部分没有累积突变。
原代细胞的可利用性不仅仅对于研究和生物工程以及制药业而言是非常重要的，而且对于基于细胞的变性疾病的治疗也具有极大的重要性。这样的疾病包括，例如，心肌功能不全、肝硬化、帕金森病(Parkinson’s disease)和胰岛素依赖性糖尿病。
然而，迄今为止原代细胞的短缺已经限制了它们的应用。
在本发明范围内，术语“原代细胞”指的是从多细胞生物，例如，人类的体液或身体组织直接获得的外植块，并且具有正常的，也就是，没有变性的细胞。原代细胞培养物指的是被培养到第一代的原代细胞。原代细胞具有天然的分化特性并且是必死的。
在本发明范围内，术语“I型细胞”指的是可以在培养基中繁殖、但是经过很少的群体倍增就停止生长并相继死亡的原代细胞。I型细胞构成数的原代细胞类型。这类细胞的必死性严重地限制了它们在商业上的应用。这类I型细胞的实例包括内皮细胞(脉管细胞)、角质形成细胞(皮肤细胞)和成纤维细胞(结缔组织细胞)。
在本发明范围内，术语“II型细胞”指的是在培养基中的增殖能力从开始就被抑制了的原代细胞，并且因此其不能够进行繁殖。II型细胞构成了多细胞生物，例如，如人类的原代细胞的绝大多数。这种II型细胞的实例包括心肌细胞(cardiomyocyte)(心肌细胞)、胰岛细胞(胰腺的胰岛素产生细胞)、神经元(神经细胞)等。
长久以来已知原代细胞培养物的增殖能力受到限制。早在1961年，Wistar Institute(US)的Leonard Hayflick发现，新生婴儿的成纤维细胞能够进行80-90次分裂，而70岁老人的成纤维细胞只复制20-30次(summary in：HAYFLICK，LEONARD The biology of humanaging.American Journal of the Medical Sciences.265(6)：432-446，June 1973)。在这些次的分裂之后，细胞开始衰老。同样对原代细胞进行描述的是所谓的延长的寿命，其中原代细胞的增殖能力被增强，以用来研究由病毒癌基因如：SV40 Tag、腺病毒E1A、HPVE6和E7或者细胞癌基因如：c-ras和c-myc的浸润产生的致癌作用。在所研究的系统中，通过选择、诱变和其他手段进行了永生化细胞超过其“延长的寿命”的努力，从而允许研究病毒或细胞基因对致癌作用的影响。
为了繁殖超过其延长的寿命的细胞，必须使用这样的处理，所述处理补偿了伴随每次细胞分离而发生染色体端粒的缩短。这样一种可能的处理涉及端粒酶的使用(Harley，C.B.和B.Villeponteau.1995.Telomeres and telomerase in aging and cancer.Curr.Opin.Genet.Dev.5：249-255)。能够使用端粒酶来补偿端粒损失的细胞，例如，具有无限的增殖能力或永生化。然而，不利地是，在细胞分裂的过程中，突变不可避免地发生，这迟早导致癌发生。
然而现有技术中并未知的是靶向富集或繁殖——包括提取——原代细胞，在所述原代细胞中，肿瘤细胞特性，例如，在软琼脂中生长或在体内的肿瘤生长的发展被阻止。
因此本发明的目的是提供一种富集或繁殖原代细胞的方法，根据本方法富集或繁殖的原代细胞优选地不具有肿瘤特性。
所述目的通过繁殖原代细胞的方法达到，其中在下列步骤中人的原代细胞
a.)被分离
b1.)至少一个增殖基因或其基因产物被功能性引入细胞和/或
b2.)至少一个引起细胞分裂抑制的细胞因子被失活，
c.)所述细胞是被培养和/或传代和
d.)被收获，其中所述收获的细胞不具有肿瘤特性。
与未经处理的原代细胞相比，优选地，可以实现多于额外的三代、多于额外的五代，优选地额外20-40代。
通过将细胞分裂限制在20-40次额外的倍增，不期望的突变——其不可避免地发生在多于60次倍增之后的永生化细胞中——可以被消除。
因此本发明涉及这样一种类型的方法，其包括步骤a.)-d.)，其中在步骤c.)中可以获得20-40代，并且得到的细胞不具有肿瘤特性。
因此，特别有利地，本发明的方法确保得到的细胞不具有肿瘤细胞，特别是恶性肿瘤细胞的特性，例如，在软琼脂中生长和在体内的肿瘤生长(肿瘤在异种移植的动物模型体内的生长)。然而，术语“肿瘤特性”不是指由本发明的方法得到的靶细胞的扩大的倍增能力。
同样有利地是，本发明的方法得到的细胞不会产生无限增殖化。本发明的方法从而允许得到的非永生化细胞的富集或繁殖。
培养是使用本领域普通技术人员公知的培养基进行的。
本发明的方法允许具有扩大的倍增能力的原代细胞进行有利的富集和繁殖，所述原代细胞也基本没有遗传改变，如同培养后的原代细胞，而大多数细胞系含有很多遗传改变。
本发明中使用的术语“收获”指的是得到的细胞能够被连续地或间断地从繁殖中去除或提取，并且能随后被应用，以及能被以任意单位使用(数量、质量等)。
术语“原代细胞的繁殖或富集”指的是制备“具有扩大的倍增能力的细胞”(见对照表1)，其中权利要求1中的方法特征b1.)和b2.)导致母质(parent material)的原代细胞的结构发生改变。所述的扩大的倍增能力有利地促使了细胞数量充分增加的发生。
在本发明范围内，增殖基因是促进细胞分裂并且能够使原代细胞的细胞增殖能力有限地扩大的基因，其中细胞转化或改变成分化特性的概率相较于现有技术中的细胞系有非常显著的降低。特别是，增殖基因不是无限增殖化的基因。根据本发明，增殖基因优选地选自病毒增殖基因：乳头瘤病毒E6和E7，例如，如HPV(人乳头瘤病毒)和BPV(牛乳头瘤病毒)；多瘤病毒的大和小TAg，例如，如SV40、JK-病毒和BC-病毒；腺病毒蛋白E1A和E1B，Epstein-Barr病毒(EBV)的EBNA蛋白；以及HTLV增殖基因和松鼠猴疱疹病毒及其各自的编码蛋白，或者选自细胞增殖基因，特别是下述类别的基因：myc、jun、ras、src、fyg、myb、E2F和Mdm2以及TERT(端粒酶的催化亚基)，优选人端粒酶(hTERT)。
在进一步的实施方式中，通过点突变、缺失和/或插入消除了在氨基酸1-121和/或137到708的区域中的前述TAg(1-708AS，例如，SV40)的转化活性，同时保留了p53结合结构域(“二分结构域”)(Ruppert，Stilman(1993)，Analysis of a protein binding domainp53，Mol.Cell.Biol.13，3811-3820)。
然而，根据本发明，优选地是病毒增殖基因，特别优选地是HPV的E6和E7或BPV。也可以使用与恶性疾病相关的HPV型增殖基因。最广为人知的“高危型(high risk)”乳头瘤病毒的例子是HPV16和HPV18。来自“高危型”组中其他的例子包括HPV 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82。然而，也可以使用所谓的“低危型”HPV的增殖基因E6和E7。已知的例子包括HPV型6和11；来自低危型组的其他的HPV型包括HPV 40、42、43、44、54、61、70、72和81。
E6蛋白与增殖的增加有关的重要性特别涉及p53通路的失活和端粒酶的诱导。E7蛋白与增殖的增加有关的重要性特别涉及pRB通路的失活。在本发明中，不同血清型的一种病毒种或不同病毒种的增殖基因也可以被结合，或者甚至不同血清型的一种病毒种或不同病毒种的嵌合增殖基因可以被制造和使用。例如，嵌合基因的一个E6结构域可以源自HPV 16，而另外一个源自HPV6。当然，增殖基因还可以被截短或可以具有一个或多个碱基交换，而并不背离本发明的范围。前述的增殖基因代表了优选地实施方式，而并不意图限制本发明。增殖基因也可以是合成或人工制造地基因序列的对象。
这些因子被“功能性引入”到分裂能力将被扩大的靶细胞中，在其过程中可以使用下列基因转移系统，其中：将前述的基因功能的表达构建物转移到细胞中，通过经典的磷酸钙法(Wigler，M.等，1977.Cell 11：223-232)、通过脂质体转染法(Felgner，P.L.e t al，1987.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：7413-7417)、通过电穿孔(Wolf，H.等，1994.Biophys.J.66：524-531)、通过显微注射法(Diacumakos，E.G.1973.Methods Cell Biol.7：287-311)或通过配合(Konjugate)，所述配合是通过细胞受体摄取或者不依赖于受体。前述的基因功能还可以利用病毒载体来转移到靶细胞上。实例包括逆转录病毒载体、AAV载体、腺病毒载体和HSV载体，列举少数载体的实例(关于病毒载体的概况，参见：Lundstrom，K.2004.Technol.Cancer Res.Treat.3：467-477；Robbins，P.D.和S.C.Ghivizzani.1998.Pharmacol.Ther.80：35-47)。术语“功能性引入”包括，具体而言，使用至少一个增殖基因转染靶细胞。
前述的病毒或细胞增殖基因的表达可以由强的或弱的组成型启动子、组织特异的启动子、诱导型促进子来控制(Meyer-Ficca，M.L.等2004.Anal.Biochem.334：9-19)，或者表达盒可以由用于分子剪切系统的特异侧翼。实例包括Cre/Lox系统(US专利4,959,317)，所述系统的使用导致表达构建物从靶细胞的基因组的分子去除。
在进一步的实施方式中，该增殖基因的基因产物还可以地被直接功能引入到靶细胞中，或者利用融合蛋白进行功能引入。后者是优选的信使蛋白，例如VP22、HIV TAT(Suzuki等，277 J.Biol.Chem.2437-24432002和Futaki 245 Int.J.Pharmaceut.1-7(2002)，(HIV)REV，触角足多肽(WO97/12912和WO99/11809)或穿膜肽(Derossi等，8 Trends Cell Biol.，84-87(1998)，同源盒蛋白转录因子(Gherbassi，D.& Simon，H.H.J.Neural Transm.Suppl47-55(2006)，Mor gan，R.580 FEBS Lett.，2531-2533(2006)，Han，K.等，10 Mol.Cells 728-732(2000))，或Hoxa-5(Chatelin等，55 Mech.Dev.111-117(1996))，L-精氨酸或D-精氨酸氨基酸残余的加聚物(Can.Patent No.2，094，658；U.S.Pat.No.4，701，521；WO98/52614)，L-赖氨酸或D-赖氨酸氨基酸残余的加聚物(Mai等，277 J.Biol.Chem.30208-30218(2002)，Park等，13 Mol.Cells 202-208(2002)，Mi等，2 Mol.Ther.339-347(2000))，转录因子例如BETA2/神经D，PDX-1(Noguchi and Matsumoto60 Acta Med.Okayama 1-11，(2006)，Noguchi等52 Diabetes1732-1737(2003)，Noguchi等332 Biochem.Biophys.Res.Commun.68-74(2005))，核定位信号，(Yoneda等201 Exp.Cell Res.313-320(1992))，组蛋白衍生的缩氨酸(Lundberg and Johansson291 Biochem.Biophys.Res.Comm.367-371(2002))，阳离子型大分子、FGF-1和FGF-2、乳糖肝褐质的加聚物，i.a.，如先前文献中所述。
在本发明的范围内，“至少一种导致细胞分裂抑制的细胞因子失活”指的是在衰老程序过程中细胞分裂的抑制作用被激活，例如(概况参见：Ben Porath，I.和R.A.Weinberg.2005.Int.J.Biochem.Cell Biol.37：961-976.)，或者指的是在分化程序范围内细胞分裂的抑制作用被激活。例如，已知心肌细胞在初生之后不久就失去它们的增殖能力，这是调节的过程，即，通过细胞周期抑制剂例如p16、p21、p27的表达来调节(Brooks，G.，等1998.Cardiovasc.Res.39，301-311；Flink，I.L.等，1998.J.Mol.Cell Cardiol.30，563-578；Walsh，K.和Perlman，H.1997.Curr.Opin.Genet.Dev.7，597-602)。类似的过程毫无疑问适用于所有原代细胞类型的大多数之中。因而，去除分化的细胞中的细胞周期抑制剂可以使细胞重新进入增殖相。在本发明的上下文中，这同样适用于此处未提及的其他细胞周期-抑制蛋白。
在本发明范围内，对于调整细胞周期而言非常重要的p53蛋白，以及所有的直接与p53结合的蛋白和该p53通路的上游和/或下游因子通常可以被去除，从而达到扩大的细胞增殖能力的目标(关于p53通路的概况，参见：Giono，L.E.和J.J.Manfredi.2006.J.CellPhysiol 209：13-20；Farid，N.R.2004.Cancer Treat.Res.122：149-164)。
在本发明范围内，对于调整细胞周期而言非常重要的p16/INK4a蛋白，以及所有直接与p16/INK4a结合的蛋白和该p16通路的上游和/或下游因子通常可以被去除，从而达到扩大的细胞增殖能力的目标(关于p16/INK4a通路的概况，参见：Shapiro，G.I.等，2000.CellBiochem.Biophys.33：189-197)。
在本发明范围内，对于调整细胞周期而言非常重要的pRb蛋白和/或pRb家族的其他成员(例如，p107，p130)，以及所有直接与pRb家族成员结合的蛋白和该pRb通路的上游和/或下游因子通常可以被去除，从而达到扩大的细胞增殖能力的目标(关于pRb通路的概况，参见：Godefroy，N.等2006.Apoptosis.11：659-661；Seville，L.L.等2005.Curr.Cancer Drug Targets.5：159-170)。
细胞因子如p53、pRB、p16等的失活可以通过相应因子的显性失活突变体的表达来实现，例如(Herskowitz，I.1987.Nature 329：219-222；Küpper，J.H.，等1995.Biochimie 77：450-455)，通过使用反义寡核苷酸来抑制这些因子的基因表达(Zon，G.1990.Ann.N.Y.Acad.Sci.616：161-172)，RNAi分子(Aagaard，L.and J.J.Rossi.2007.Adv.Drug Deliv.Rev.59：75-86；Chakraborty，C.2007.Curr.Drug Targets.8：469-482)，吗啉代(Angerer，L.M.and R.C.Angerer.2004.Methods Cell Biol.74：699-711)，核糖酶(Sioud，M.and P.O.Iversen.2005.Curr.Drug Targets.6：647-653)，或通过基因敲除(Le，Y.和B.Sauer.2000.MethodsMol.Biol.136：477-485；Yamamura，K.1999.Prog.Exp.TumorRes.35：13-24)。这些方法对于本领域技术人员而言是公知的，并且在文献中被充分记述。失活还可以通过特异性抗体的作用来实现(例如，单链抗体、内抗体等；概况参见：Leath，C.A.，III，等2004.Int.J.Oncol.24：765-771；Stocks，M.R.2004.Drug Discov.Today 9：960-966)。失活还可以通过使用细胞因子化学抑制剂来实现，例如使用激酶抑制剂。
激酶抑制剂的一个例子是物质Imatinib
Figure GPA00001094790400091
使用这种物质可以达到细胞增殖的减少。Imatinib是一种特异性抑制剂，其阻断了患病细胞中酪氨酸激酶ABL的活性，从而抑制了突变的血干细胞繁殖中的病态增加。
这些根据所述方法获得的具有扩大的倍增能力的细胞可以在被归类在介于原代细胞和永生化细胞系之间：具有扩大的倍增能力的细胞具有大多数的原代细胞天然特性，并且可以有利地经历明显更多的细胞分裂。其优势如下：
具有扩大的倍增能力的细胞可以全部由所有的I型和II型细胞产生。具有扩大的倍增能力的细胞适合用于于基础生物医药研究、药物的开发和测试、化妆品、食品和织物添加剂。
一个进一步的优势是其简单且成本低廉的细胞培养操作，即，不需要昂贵的培养基添加剂。
阐明由本发明的方法收获细胞的的扩大的倍增能力的实例：起始培养物由1000个具有15倍的复制能力的原代内皮细胞组成：
可获得细胞的产量＝2E15×1000＝3.3×10E7个细胞
1000个“具有扩大的倍增能力的细胞”的起始培养物具有40倍的复制能力：
可获得细胞的产量＝2E40×1000＝1.1×10E15个细胞，也就是说10的8次方多。
基于这些根据本发明得到的收获的“具有扩大的倍增能力的细胞”的有利特性，这些收获的细胞随后的处理和应用可以被有利地实施。
因此，在本发明的一个优选地具体实施方式中还涉及一种制造化验物(assay)的方法，其包括如下步骤：
a.)制备基质材料，
b.)将至少一个根据本发明的方法收获的细胞固定或定位于所述基质材料上，和
将b.)中的细胞与分析物(analyte)相接触。
本发明进一步涉及使用根据本发明的方法获得的细胞来进行分析，其中这种“具有扩大的倍增能力的细胞”与至少一种分析物混合，所述分析物选自化学物质(例如，合成或天然的物质及其混合物)、药物、活性物质、化妆品、细胞。
这样的分析物可以具有任何目标，例如，DNA、RNA、蛋白质、脂肪、糖等。就细胞化验物而言，经常测量一个或多个目标的活性。例如，一个或多个酶的反应、物质透过生物膜的运输、配体与受体的结合，或者广而言之，DNA的复制、细胞分裂或细胞死亡，仅列举少数的例子。
可以使用广义上的分析纯试剂来提供阳性事件的证据，例如，使用荧光标记的抗体及其类似物。这也可以包括，特别是合适的生物分析过程，例如免疫组织化学、抗体阵列、Luminex/Luminol、ELISA、免疫荧光法、放射免疫法。
本发明进一步涉及包含根据本发明的方法收获的细胞的细胞库，也就是说，这种“具有扩大的倍增能力的细胞”，其可以在悬浮液中或者可以被放置在固体基质上。
术语“固体基质”具体地包括例如过滤器、膜、磁珠、硅晶片、玻璃、塑料、金属、芯片、质谱测定靶、或含有蛋白质的基质，或者其他基质，如PEG等。
在本发明的排列的进一步优选地实施方式中(同义词：阵列)，所述阵列对应于一个与微量板数量级上的点阵(96孔、384孔或更多)、硅晶片、芯片、质谱测定靶或基质。
所述基底材料(基质)可以是球形的、未凝聚的微粒、所谓的珠子、纤维或膜，其中基质的多孔性增加了表面积。多孔性可以通过将成孔剂，例如环己醇或1-十二烷醇添加到悬浮聚合反应混合物中的惯用方式实现。
本发明进一步涉及含有由本发明方法收获的细胞的的制药物质，其用于疾病治疗，尤其是用于治疗心肌功能不全、肝硬化、帕金森病和胰岛素依赖性糖尿病。对于这些变性疾病，所述繁殖的细胞是从病人自身体内的原代细胞获得的。该收获的细胞被返回病人的体内(例如，通过将心脏细胞注射进心脏肌肉内等)。
在一个优选地实施方式中，低危型HPV的E6和E7被用作病毒增殖基因。
本发明进一步涉及含有由本发明方法收获的细胞的起始培养物，换言之，收获的细胞由“具有扩大的倍增能力的细胞”和常用的添加剂以及辅助剂组成。
在本发明进一步的实施方式中，所述由本发明方法收获的细胞被用于在传统培养基中的培养，特别是作为共培养细胞(饲养细胞(Feederzellen))，用来富集靶细胞(例如，干细胞等)。
在本发明进一步的实施方式中，由本发明的方法收获的细胞被用来制造3D细胞模型或离体组织，包括作为人类皮肤和其他器官(心脏、肝脏等)、骨骼、软骨的模型，优选地应用到基质上(所谓的支架生物材料)。

Claims (15)

1.繁殖或富集原代细胞的方法，其特征在于人原代细胞
a.)被分离
b1.)以至少一个增殖基因或其基因产物功能性引入所述细胞和/或
b2.)至少一个引起细胞分裂抑制的细胞因子被失活，
c.)所述细胞是被培养和/或传代并且
d.)被收获，其中所述收获的细胞不具有肿瘤特性。
2.权利要求1的繁殖或富集原代细胞的方法，其中在步骤c.)中出现20到40次传代。
3.权利要求1或2的繁殖或富集原代细胞的方法，其中步骤d.)中所述的收获的细胞不能够在软琼脂中生长或显示出体内肿瘤生长。
4.前述任一项权利要求的繁殖或富集原代细胞的方法，其中所述得到的细胞是非永生化的。
5.权利要求1的繁殖或富集原代细胞的方法，其特征在于步骤b1.)中的所述增殖基因是细胞增殖基因和/或病毒增殖基因。
6.前述任一项权利要求的繁殖或富集原代细胞的方法，其特征在于所述细胞增殖基因选自myc、jun、ras、src、fyg、myb、E2F和Mdm2以及TERT，或所述病毒增殖基因选自乳头瘤病毒的E6和E7，例如，如HPV；多瘤病毒的大和小TAg，例如，如SV40、JK-病毒和BC-病毒；腺病毒蛋白E1A和E1B、来自Epstein-Barr病毒(EBV)的EBNA蛋白；以及HTLV和松鼠猴疱疹病毒。
7.前述任一项权利要求的繁殖或富集原代细胞的方法，其特征在于b.)中所述细胞因子选自p53、p16、pRB、p107、p130或其各自的上游或下游因子或在该通路中结合到其上的蛋白质，并且这些细胞因子的失活是通过显性失活突变体的表达或使用反义寡核苷酸、RNAi分子、吗啉代、核糖酶来抑制这些因子的基因表达，或通过基因敲除，通过特异性抗体、化学抑制剂的来实现的。
8.前述任一项权利要求的繁殖或富集原代细胞的方法，其特征在于所述病毒增殖基因是HPV的E6和E7或BPV，特别是HPV16和HPV18以及HPV 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82和/或HPV6和HPV11，以及HPV 40、42、43、44、54、61、70、72和81。
9.制造化验物的方法，其包括如下步骤：
a.)制备基基质材料，
b.)将权利要求1至少一种收获的细胞固定或定位于所述基质材料上，和
将来自b.)中的该细胞与分析物相接触。
10.权利要求9的制造化验物的方法，其特征在于，所述分析物选自化学物质、药物、活性物质、化妆品、细胞。
11.细胞库，其包括权利要求1到8任一项所述的收获的细胞，所述细胞在固体基质上或在悬浮液中。
12.3D细胞模型或体外组织，包括权利要求1到8任一项所述的收获的细胞，其任选地在固体基质上。
13.起始培养物、共培养细胞或培养物，其包括根据权利要求1到8任一项所述的收获的细胞和常用的添加剂和辅助剂。
14.制药物质，包括根据权利要求1到8任一项权利要求收获的细胞和常用的添加剂和赋形剂，其尤其是用于疾病治疗，特别是变性疾病，例如，心肌功能不全、肝硬化、帕金森病和胰岛素依赖性糖尿病。
15.根据权利要求1到8任一项所述的收获的细胞在产生细胞库、3D细胞模型或体外组织、起始培养物、培养物、共培养细胞、制药物质中的应用。
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