CN101815433A - α-优化的β-伴大豆球蛋白增高的大豆 - Google Patents

Abstract

本发明通过提供具有非转基因突变的大豆植物克服了现有技术的缺陷，所述突变导致在种子中具有降低的β-伴大豆球蛋白α-亚基含量和提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量。而且，本发明提供了农艺学优良的具有非转基因突变的大豆植物，所述突变导致大豆球蛋白无效表型、种子中提高的β-伴大豆球蛋白含量和提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量。本发明也提供了这些植物的衍生物和植物部分及其用途。也提供了产生这些植物的方法。

Description

α-优化的β-伴大豆球蛋白增高的大豆

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2007年9月11日提交的美国临时申请60/971,336的优先权。该申请的全部内容在此引入作为参考。

发明背景

1.发明领域

本发明一般地涉及植物育种和分子生物学领域。具体而言，本发明涉及具有提高的β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)α′亚基含量的大豆和用于产生这种植物的材料。

2.相关技术描述

大豆种植的主要目的是蛋白质和油。大豆占世界贸易的16100万公吨(MMT)主要蛋白粉的接近69％(USDA，2008)。在美国，每年消耗大约30MMT的大豆粉。尽管大豆产生高质量的经济的蛋白粉，但是对提高的蛋白粉的营养价值和功能有越来越高的需求。

组成和构象决定蛋白质的功能。能够改变功能的组成上的差异包括，例如，蛋白质组分的比例、组分内亚基浓度的变化、以及氨基酸谱的不同。大豆蛋白质具有四个主要的可用水萃取的组分(2S、7S、11S和15S)，它们可以根据沉降系数分离。7S(β-伴大豆球蛋白)和11S(大豆球蛋白)蛋白质是大豆内的主要组分。

大豆球蛋白(11s球蛋白)由五个不同的亚基组成，它们分别被命名为A1aB2、A2B1a、A1bB1b、A5A4B3、A3B4。每个亚基由通过二硫键共价连接的两个多肽(一个为酸性，一个为碱性)组成。这两个多肽链是通过原大豆球蛋白前体的翻译后切割产生的；这一步在前体进入蛋白质体后发生(Chrispeels等人，1982)。已经确定了编码这些多肽亚基的五种主要基因。它们分别被命名为Gy1、Gy2、Gy3、Gy4和Gy5(Nielsen等人，1997)。另外，也报道了假基因gy6和次要基因Gy7(Beilinson等人，2002)。多个研究小组报道了这些基因的遗传作图(Diers等人，1993，Chen和Shoemaker 1998，Beilinson等人，2002)。Gy1和Gy2相距3kb，并且定位于连锁群N上(Nielsen等人，1989)，Gy3定位于连锁群L上(Beilinson等人，2002)。Gy4和Gy5分别定位于连锁群O和F上。另外，B2G2或“11S无效”大豆品种具有独特的种子组成，包括高水平的β-伴大豆球蛋白和低含量的大豆球蛋白。但是，B2G2品种显示农艺学较差的特征，如低产量、过度倒伏和绿色种子。开发了大量育种系，它们携带B2G2系中的所有或部分突变。Wu等人提供了具有农艺学可接受的特征的育种系(美国专利申请No.11/517,186)。

另一方面，β-伴大豆球蛋白(7S)由α(～67kda)、α′(～71kDa)和β(～50kDa)亚基组成，每个亚基通过共翻译和翻译后修饰加工(Ladin等人，1987；Utsumi，1992)。Cgy2、3编码α-亚基。遗传分析表明Cgy2与Cgy3紧密连锁，而Cgy1与另外两个独立分离。Cgy1编码α’-亚基(Tsukada等人，1986)。三聚体中α′、α和β链的相对百分比分别为总β-伴大豆球蛋白的～35％、45％和20％(Maruyama等人，1999)。

大豆蛋白质的功能部分地依赖于β-伴大豆球蛋白与大豆球蛋白的比例和亚基组成的变化，它们在基因型之间可能不同。β-伴大豆球蛋白与大豆球蛋白之间在组成和结构上的不同在营养和功能性质方面展示出来。每单位大豆球蛋白比β-伴大豆球蛋白含有更多的甲硫氨酸和半胱氨酸，但是缺乏大豆球蛋白和富含β-伴大豆球蛋白的大豆可能具有与含大豆球蛋白的大豆相似的总含硫氨基酸水平。大豆球蛋白对于形成构成凝结豆腐凝胶的蛋白质颗粒是重要的(Tezuka，等人，2000)，但是在不含β-伴大豆球蛋白时比不含大豆球蛋白时形成较弱的凝胶(Tezuka，等人，2004)。由富含β-伴大豆球蛋白的大豆制成的β-伴大豆球蛋白和分离大豆蛋白质的胶凝性质在可用于肉类应用的某些条件下显示优点(Nagano，等人，1996；Rickert，等人，2004)。通过用显示优点的α-亚基改变亚基组成可以改变β-伴大豆球蛋白的胶凝性质(Salleh，2004)。部分由于α和α’亚基的亲水延伸区，β-伴大豆球蛋白的溶解度和乳化性质良好(Yamauchi等人，1991，Mauryama等人，2002)。可能产生有价值的用于食用的大豆和成分，其具有提高的β-伴大豆球蛋白水平和降低的大豆球蛋白水平。

β-伴大豆球蛋白具有积极影响人体健康的显著的能力(Baba等人，2004)。特别是，已发现β-伴大豆球蛋白可降低胆固醇、甘油三酯和内脏脂肪。Kohno等人证明每天食用5g β-伴大豆球蛋白的人类受试者中甘油三酯水平和内脏脂肪显著降低(Kohno等人2006)。类似地，Nakamura等人发现在灵长类动物模型中β-伴大豆球蛋白上调与脂质代谢有关的基因(2005)。另外，Nakamura等人证明β-伴大豆球蛋白具有显著的预防骨矿物质密度损失的效应(2006)。另外，证明β-伴大豆球蛋白有降低血清胰岛素和血糖的效果(Moriyama等人2005)。由于β-伴大豆球蛋白对甘油三酯、胆固醇、脂肪、胰岛素和糖水平的效应，它可能在卫生计划中起重要作用。另外，β-伴大豆球蛋白在小鼠中抑制动脉斑形成，并且在人类受试者中也可能具有类似的效果(Adams等人2004)。

此外，β-伴大豆球蛋白对人体中的肠道微生物菌群可能具有显著的影响。在许多动物模型中，β-伴大豆球蛋白抑制有害细菌如大肠杆菌的生长，而刺激有益细菌如双歧杆菌(bifidobacteria)的生长(Nakamura等人2004，Zou等人2005)。β-伴大豆球蛋白可以用来降低感染后的大肠杆菌生长和保持健康的肠道微生物菌群。

β-伴大豆球蛋白的α′亚基可能在与β-伴大豆球蛋白有关的健康益处中起主要作用。大量使用动物模型的实验表明，来自大豆β-伴大豆球蛋白的α′亚基可以降低血浆甘油三酯，还增强从血液中清除LDL(“坏的”胆固醇)(Duranti等人，2004，Moriyama等人，2004，Adams等人，2004，Nishi等人，2003)。因此，具有提高的β-伴大豆球蛋白含量的大豆品种将比传统品种具有更高的值，并且将适用于营养饮料和其它食品。在鉴定生物活性多肽的尝试中，Manzoni等人尝试表征β-伴大豆球蛋白中的生物活性多肽，并间接证明了α’-亚基具有推断的降低胆固醇的作用(Manzoni等人，1998)。另外，Manzoni等人也证明了α’亚基对LDL摄取和降解和LDL受体mRNA水平增高的影响(Manzoni等人，2003)。Duranti等人(2004)证明了α’亚基可以降低体内甘油三酯和血浆胆固醇水平。

β-伴大豆球蛋白的β-亚基也具有许多健康益处。例如，β-亚基通过引起胆囊收缩素分泌增强了饱感(Takashi等人2003，Hara等人2004)。胆囊收缩素是胃肠系统的一种肽激素，负责刺激脂肪和蛋白质的消化。胆囊收缩素以前被称为由I细胞合成并且在十二指肠、小肠第一节中分泌，并导致分别从胰和膀胱释放消化性酶和胆汁。它也作为饥饿抑制剂起作用。因此，β-亚基可以抑制食欲，并且可以在总体重控制计划中起作用。

β-亚基在心理健康中也可能具有功能。通过用胰弹性蛋白酶和亮氨酸氨肽酶消化β-亚基释放大豆吗啡-5(Soymorphin-5)。大豆吗啡-5是一种阿片样肽。阿片样物质是在体内具有吗啡样作用的化学物质。阿片样物质主要用于缓解疼痛。这些物质通过与阿片类受体结合起作用，这些阿片类受体主要发现于中枢神经系统和胃肠道中。已证明大豆吗啡-5在小鼠口服后具有抗焦虑作用，提示摄入β-亚基可以减轻心理压力(Agui等人2005)。

因此，本发明产生了具有提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基水平的大豆。在此公开了获得具有希望的蛋白质组成的大豆的方法和组合物。

发明内容

本发明涉及大豆种子的增高的α’-亚基和保守的β亚基组成，与商业大豆蛋白质成分相比，该种子具有改善的物理和人类健康性质。本发明提供了具有赋予种子α’-亚基含量提高的表型的非转基因性状的大豆植物。因此，在一方面，本发明的植物包含具有α’-亚基含量提高的表型的种子。在某些实施方案中，本发明的植物的种子α’-亚基含量为总蛋白质含量的大约或者至少大约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20％或更多。在某些实施方案中，本发明的植物具有总蛋白质的大约或低于大约15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0％的种子α-亚基含量。在进一步的实施方案中，本发明的植物中α-亚基含量与α’-亚基含量的比值为大约1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或甚至0，在其中可推出。

作为另一实施方案，本发明提供能够结出具有降低的大豆球蛋白含量、提高的种子β-伴大豆球蛋白含量和后来提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基的种子的大豆植物。因此，在一方面，本发明的植物包含具有降低的大豆球蛋白含量、提高的β-伴大豆球蛋白含量和β-伴大豆球蛋白α-亚基和α’-亚基的种子。在某些实施方案中，本发明的植物结出的种子具有为种子总蛋白质的大约或低于大约18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0％的种子大豆球蛋白含量。在某些实施方案中，本发明的植物结出的种子具有为种子总蛋白质的大约或至少大约37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60％或更高的种子β-伴大豆球蛋白含量。在另一实施方案中，本发明的植物的种子α’-亚基含量为种子总蛋白质含量的大约或至少大约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40％或更高。在进一步的实施方案中，本发明的植物具有为种子总蛋白质的大约或低于大约15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0％的种子α-亚基含量。在再进一步的实施方案中，本发明的植物能够结出包含比值为大约1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或甚至0的α-亚基和α’-亚基的β-伴大豆球蛋白含量的种子。

本发明也提供植物部分。本发明的植物部分包括但不限于花粉、胚珠、分生组织、细胞和种子。本发明的细胞可以进一步包括可再生细胞，如胚分生组织细胞、花粉、叶、根、根尖和花。因此，这些细胞可以用来再生本发明的植物。

在此也提供了本发明的植物的种子的部分。因此，也提供了由本发明的种子制成的碾碎种子和粗粉或面粉作为本发明的部分。本发明进一步包括制备大豆粗粉或面粉的方法，包括碾碎或研磨本发明的种子。本发明的这些大豆粉或粗粉可以包含本发明的植物的基因组材料。在一个实施方案中，本发明的大豆粗粉或面粉可以被定义为，与由具有相同遗传背景但不含非转基因突变Gy3和Gy4无效等位基因的植物种子制成的粗粉或面粉相比，具有提高的β-伴大豆球蛋白含量和降低的大豆球蛋白含量。

在本发明的进一步的方面，提供了一种产生大豆种子的方法，包括使本发明的植物与其本身杂交或与第二大豆植物杂交。因此，该方法可以包括通过使本发明的植物与不同的第二大豆植物杂交产生杂种大豆种子。

本发明的再另一方面是一种生产用于人类或动物食用的食品的方法，包括：(a)获得本发明的植物；(b)栽培该植物至成熟；和(c)由该植物制备食品。在本发明的某些实施方案中，食品可以是浓缩蛋白质、分离蛋白质、粗粉、面粉或大豆壳。在某些实施方案中，食品可以包括饮料、灌注食品、沙司、咖啡奶油、饼干、乳化剂、面包、糖果速溶奶制饮料、肉汤、面条、大豆黄油、豆奶咖啡、烤大豆、薄饼干、糖果、豆奶、豆腐、印尼豆豉、烘培大豆、焙烤食品成分、饮料粉、早餐谷类食品、营养棒、肉或肉类似物、果汁、甜点、软冷冻产品、蜜饯和中间食品。由本发明的植物生产的食品可以具有提高的α’-亚基含量，因此比用典型大豆品种制成的食品具有更高的营养价值。

本发明的进一步的方面是一种生产营养品的方法，包括：(a)获得本发明的植物；(b)栽培该植物至成熟；和(c)由该植物制备营养品。由本发明的植物生产的产品可以具有提高的α’-亚基含量，因此比用典型大豆品种制成的食品具有更高的营养价值。例如，用具有增高的α’-亚基的大豆种子制成的产品可以在降脂治疗中单独使用或者与其它机制联合使用。

在进一步的实施方案中，本发明的植物可以进一步包含转基因。在一个实施方案中，转基因可以被定义为赋予大豆植物优选的性质，该性质选自除草剂耐受性、产量增高、昆虫控制、真菌病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌病抗性、支原体病抗性、脂肪酸组成改变、油产量改变、氨基酸组成改变、蛋白质产量改变、蛋白质产量提高、碳水化合物产量改变、发芽和幼苗生长的控制、动物和人类营养增强、低棉子糖、干旱和/或环境应激抗性、形状特征改变、可消化性提高、工业酶、药用蛋白质、肽和小分子、加工性状改善、风味改善、固氮、杂种种子的产生、变应原性降低、生物聚合物、生物燃料，或者上述的任何组合。

在某些实施方案中，本发明的植物可以被定义为是通过一种方法产生的，在该方法中，包含赋予提高的α’-亚基含量的非转基因突变的植物与包含农艺学优良特征的植物杂交。可以分析该杂交的后代的农艺学优良特征和α-和α’-亚基蛋白质含量，并且根据这些特征选择后代植物，从而产生本发明的植物。因此在某些实施方案中，本发明的植物可以通过使选择的起始品种与包含农艺学优良特征的第二大豆植物杂交而产生。在某些实施方案中，本发明的植物可以被定义为是通过一种方法产生的，在该方法中，包含赋予降低的大豆球蛋白含量和提高的种子β-伴大豆球蛋白含量的非转基因突变的植物与具有提高的α’-亚基含量的植物杂交。

附图说明

图1：商业品种MV0028、大豆球蛋白无效系和大豆球蛋白无效+α’-亚基增高系中β-伴大豆球蛋白α-、α’-、β-亚基占总蛋白质的百分比。

说明性实施方案描述

本发明提供植物和产生植物的方法，该植物包含非转基因突变，该突变赋予种子包括提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基水平的β-伴大豆球蛋白含量。因此，本发明的植物具有极高的价值，因为种子中提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基水平提供了改善的营养特征和大豆粉和分离蛋白质的溶解度。另外，此处提供的植物包含农艺学优良的特征，能够获得具有商业意义的产量。

本发明还提供包含导致β-伴大豆球蛋白增高和大豆球蛋白减少的非转基因突变的植物和生产该植物的方法。β-伴大豆球蛋白增高和α’-亚基增高表型的组合提供了提高的高度功能性的和健康的β-伴大豆球蛋白α’-亚基的含量。

I.本发明的植物

本发明第一次提供了组合有赋予提高的α’-亚基含量的非转基因突变的大豆植物及其衍生物。在某些实施方案中，本发明植物的种子的α’-亚基含量可以大于种子总蛋白质的大约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或甚至20％。在其它实施方案中，本发明植物的种子的大豆球蛋白含量可以为种子总蛋白质的大约或低于大约15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0％，本发明植物的种子的β-伴大豆球蛋白含量可以为总蛋白质含量的大约或至少大约34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50％或更高，本发明植物的种子的α’-亚基含量可以为总蛋白质的大约或至少大约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40％或更高，且本发明植物的种子的α-亚基含量为总蛋白质的大约或低于大约15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0％。在再进一步的实施方案中，本发明的植物的种子具有包含比例为大约1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或甚至0的α-亚基和α’-亚基的β-伴大豆球蛋白含量。

因此，本发明的一方面涉及上述植物及其部分和使用这些植物和植物部分的方法。植物部分包括但不限于花粉、胚珠和细胞。本发明进一步提供这些植物的可再生细胞的组织培养物，该培养物再生为能够表达起始品种的所有生理和形态特征的大豆植物。这些可再生细胞可以包括胚、分生组织细胞、花粉、叶、根、根尖或花，或由其衍生的原生质体或愈伤组织。本发明也提供由这种组织培养物再生的大豆植物，其中该植物能够表达作为可再生细胞来源的起始植物品种的所有生理和形态特征。

II.具有提高的α’-亚基含量的大豆品种的产生

本发明描述了产生在种子中具有提高的α’-亚基蛋白质含量的大豆植物的方法。本发明的某些方面也提供了选择亲本用于培育在种子中具有提高的α’-亚基蛋白质含量的植物的方法。一种方法包括针对大豆种子中的α’-亚基和α-亚基含量筛查种质。另一种方法包括评价可能的亲本的谱系中的PI88788，其可以携带α’-亚基增高性状。

本发明的某些方面也提供了培育植物的方法，其能够将非转基因α’-亚基增高性状引入异源大豆遗传背景中。通常，育种技术利用植物的授粉方法。有两种常用的授粉方法：如果来自一朵花的花粉被转移到同一植物的相同或另一花上时发生的自花授粉，和如果花粉来自不同植物上的花时发生的异花授粉。已经自花授粉并且进行多代类型选择的植物在几乎全部基因座处成为纯合的，并且产生真正育种后代、纯合植物的均一群体。

在合适的品种的开发中，可以使用谱系育种。针对特定性状的谱系育种方法包括杂交两个基因型。每个基因型可以具有一个或多个在另一基因型中缺乏的希望的特征；或者，每个基因型可以与另一个互补。如果两个原始亲本基因型不提供所有希望的特征，其它基因型可以包括在育种群体中。作为这些杂交的产物的优良植物进行自交，并且在每一连续世代中再次改良。作为自花授粉和选择的结果，每一随后的世代成为更纯合的。这种育种方法一般包括五代或更多代的自交和选择：S₁→S₂；S₂→S₃；S₃→S₄；S₄→S₅，等等。自交代(S)可以被认为是一种子代(F)类型，并且可以被称为F。在至少五代后，近交植物被认为是遗传学上纯的。

每个育种计划应当包括对育种程序效率的定期的、客观的评价。评价标准根据目的和对象而不同。全面测试有希望的选出的育种系，并且在代表商业目标地区的环境中与合适的标准进行通常三年或更长的比较。遗传学上优良的个体的鉴别是困难的，因为基因型值可以被混杂的植物性状或环境因素所掩盖。一种鉴别优良植物的方法是观察其相对于其它实验植物和一个或多个广泛种植的标准品种的表现。单次观察可能是非结论性的，而重复观察提供对遗传价值的更好的评估。

混合选择和轮回选择可以用来改良自花授粉和异花授粉作物的群体。杂合个体的遗传变异性群体通过几个不同亲本的互交来鉴别或产生。基于个体优势、突出的后代或出色的组合能力来选择最佳的植物。将选择的植物互交，以产生新群体，在该新群体中继续进一步的选择循环。其它常用于不同性状和作物的育种方法的描述可见于几本参考书之一中(例如，Allard，1960；Simmonds，1979；Sneep等人，1979；Fehr，1987a，b)。

在育种程序中选择具有感兴趣的性状(例如，产量提高、抗病性、脂肪酸谱)的基因型的有效性将取决于：1)群体中个体植物的目的性状的变异性是遗传因素的结果并且因此传递给选择的基因型的后代的程度；和2)植物之间目的性状的变异性有多少是由于不同基因型的生长环境。性状的遗传是从被一个其表达不受环境影响的主要基因控制(即质量性状)到被其效应受环境很大影响的许多基因控制(即数量性状)。对于数量性状如产量的育种进一步通过以下事实来表征：1)每个基因的效应引起的差异较小，使得难以或不可能分别鉴别它们；2)对性状有贡献的基因的数量较大，使得很少获得不同的分离比；和3)基因的效应可以基于环境变化以不同方式表达。因此，具有目的性状的超亲分离子或优良基因型的准确鉴别极其困难，其成功依赖于植物育种者使影响群体中数量性状表达的环境变化最小化的能力。

随着组合为一个基因型的性状数量的增高，鉴别超亲分离子的可能性大大降低。例如，如果在三个复合性状如产量、α’-亚基含量和至少第一农艺学性状不同的栽培种之间进行杂交，不使用分子工具极难以通过重组将三个性状中每一个的最大数量的有利基因同时恢复到一个基因型中。因此，所有育种者通常可能希望的是，除了选择的基因以外，获得第一复合性状的有利基因分类与第二性状的有利基因分类组合为一个基因型。

回交是一种有效的转移希望的特定性状的方法。这可以如下实现，例如：首先将优良近交品种(A)(轮回亲本)与携带所述性状的合适的基因的供体近交系(非轮回亲本)杂交(Fehr，1987)。这种杂交的后代然后与优良轮回亲本(A)回交，然后针对将要从非轮回亲本转移的希望的性状在得到的后代中进行选择。这种选择可以基于遗传分析或后代植物的表型。在针对希望的性状进行五代或更多代的杂交以及选择后，后代对于控制所转移的特征的基因座而言是杂合的，但是在大多数或几乎全部其它基因方面类似于优良亲本。最后一代回交是自交或者同胞杂交，产生对于所转移的基因例如给植物提供降低的种子大豆球蛋白含量的基因座而言为纯的育种后代。

在本发明的一个实施方案中，回交转换过程可以定义为包括以下步骤的过程：

(a)使种子中含有一种或多种理想性状如提高的α’-亚基含量的第一基因型植物与缺乏所述理想性状的第二基因型植物杂交；

(b)选择一个或多个含有理想性状的后代植物；

(c)使所述后代植物与第二基因型植物杂交；和

(d)重复步骤(b)和(c)，以将所述理想性状从第一基因型植物转移到第二基因型植物中。

特定性状向植物基因型中的渗入被定义为回交转换过程的结果。已经渗入性状的植物基因型可以被称为回交转换的基因型、株系、近交系或杂种。类似地，缺乏该理想性状的植物基因型可以被称为非转换基因型、株系、近交系或杂种。回交可以用于本发明，以通过该性状的转换将本发明的α’-亚基含量性状引入任何品种中。

对于成功的回交程序而言，合适的轮回亲本的选择是一个重要的步骤。回交方案的目的是改变或置换原近交系中的性状或特征。为了实现这一点，将回交近交系的一个或多个基因座修饰或替换为来自非轮回亲本的理想的基因，而保留原近交系的基本上其余全部理想的遗传学组成、因此保留其理想的生理和形态学组成。特定非轮回亲本的选择取决于回交的目的，在本发明的情况下可以是添加一个或多个赋予提高的α’-亚基含量的等位基因。精确回交方案取决于经过改变以确定合适的测试方案的特征或性状。尽管当被转移的特征是显性等位基因时简化了回交方法，但隐性等位基因也可以被转移。在这种情况下，可能必需引入后代测试，以确定理想的特征是否已经被成功转移。在本发明的情况下，可以测试在回交程序中产生的后代系的α’-亚基含量，例如通过SDS-PAGE/考马斯染色(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)、Western印迹分析、毛细管电泳(CE)或ELISA(酶联免疫吸附测定)。

SDS-PAGE用来根据蛋白质的电泳迁移率(多肽链长度或分子量以及高级蛋白质折叠、翻译后修饰和其它因素的函数)分离蛋白质。具有相同荷质比的样品的SDS凝胶电泳导致根据大小分级分离。蛋白质可以基于它们的大小而确认。Western印迹法是一种使用凝胶电泳根据多肽长度(变性条件)或根据蛋白质的三维结构(非变性条件)分离非变性或变性蛋白质来检测特定蛋白质的方法。然后将蛋白质转移到膜上，使用靶蛋白质特异性抗体在膜上对其进行检测。CE用来根据电荷和摩擦力分离离子种类。蛋白质在充有电解质的小毛细管的内部基于大小与电荷的比值分离，CE提供出色的分辨率和选择性，因而允许分离具有极小物理差异的分析物。ELISA是一种用来检测样品中是否存在抗体或抗原的生化技术。在ELISA中，未知量的抗原附着于表面上，然后用特异性抗体洗涤该表面，使得它能够结合所述抗原，即目标分子。该抗体与酶连接，在最后一步添加底物，该酶可以将该底物转化为某些可检测的信号。因此在荧光ELISA中，当用光照射样品时，任何抗原/抗体复合物都将发出荧光，使得可以测定样品中的抗原量。

大豆植物(Glycine max L.)可以通过自然或机械技术杂交(参见，例如，Fehr，1980)。自然授粉在大豆中通过自花授粉或自然异花授粉发生，这一般由传粉生物辅助。在自然或人工杂交中，开花和开花时间是重要的考虑因素。大豆是短日照植物，但是对光周期的敏感性存在显著的遗传变异(Hamner，1969；Criswell和Hume，1972)。开花的临界昼长范围是从适应热带纬度的基因型的大约13h到在较高纬度生长的光周期不敏感性基因型的24h(Shibles等人，1975)。大豆在出苗后9天似乎对昼长不敏感。短于临界昼长的光周期需要7-26天，以完成开花诱导(Borthwick和Parker，1938；Shanmugasundaram和Tsou，1978)。

使用或者不使用雌花去雄，人工授粉可以如下进行：通过用镊子从雄性亲本的花上除去雄蕊和雌蕊，并靠着雌花的柱头轻轻刷花药。通过除去前萼片和龙骨瓣，或者用闭合的镊子刺穿龙骨瓣，并且使它们打开来推开花瓣，可以靠近雄蕊。在柱头上刷花药使它们破裂，并且当花粉在柱头上清晰可见时获得最高比例的成功杂交。花粉散落可以通过在刷柱头前拍打花药来检查。当条件不理想时，可能必须使用几朵雄花来获得适量的花粉散落，或者可以用相同的雄花对几个具有良好花粉散落的花授粉。

遗传雄性不育性在大豆中可以获得，并且可用于在本发明中促进杂交，特别是用于轮回选择程序(Brim和Stuber，1973)。杂交区组完全分离所需的距离还不清楚；但是，当雄性不育植物距离外源花粉来源12m或更远时，远交小于0.5％(Boerma和Moradshahi，1975)。杂交区组边界上的植物可能维持大多数与外源花粉的远交，并且可以在收获时消除，以使混杂最小化。

一旦收获，豆荚一般在不高于38℃的温度下风干，直到种子含有13％或更低的水分，然后用手取出种子。如果相对湿度为50％或更低，种子可以在大约25℃下令人满意地贮存长达一年。在湿润气候下，百分发芽率快速下降，除非种子被干燥到7％的含水量并且室温贮存在气密容器中。在任何气候下的长期贮存最好伴随将种子干燥到7％的含水量并且在10℃或更低的温度下在保持50％相对湿度的房间中或气密容器中贮存。

III.用于大豆品种的改性和改良的性状

在某些实施方案中，本发明提供的大豆植物可以包含一个或多个转基因。这种转基因的一个例子赋予除草剂抗性。常用的除草剂抗性基因包括赋予草甘膦抗性的EPSPS基因、赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因(Fraley等人，1983)、赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因(Vanden Elzen等人，1985)、赋予草丁膦或溴苯腈抗性的基因(Comai等人，1985；Gordon-Kamm等人，1990；Stalker等人，1988)如二氢叶酸还原酶和乙酰乳酸合酶(Eichholtz等人，1987，Shah等人，1986，Charest等人，1990)。进一步的实例包括赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变ALS和AHAS酶(Lee等人，1988；Miki等人，1990)、赋予膦丝菌素抗性的膦丝菌素乙酰转移酶基因(欧洲申请0 242 246)、赋予苯氧基丙酸和环己酮如稀禾定和盖草能抗性的基因(Marshall等人，1992)；和赋予三嗪(psbA和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)抗性的基因(Przibila等人，1991)。

本发明的植物也可以包含赋予昆虫、害虫、病毒或细菌攻击抗性的基因。例如，赋予害虫如大豆胞囊线虫抗性的基因在PCT申请WO96/30517和PCT申请WO93/19181中有描述。Jones等人，(1994)描述了黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)抗性的西红柿Cf-9基因的克隆；Martin等人，(1993)描述了丁香假单胞菌致病变种(Pseudomonassyringae pv.)抗性的西红柿Pto基因，Mindrinos等人，(1994)描述了丁香假单胞菌抗性的拟南芥(Arabidopsis)RSP2基因。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素也可以用于昆虫抗性。(参见，例如，Geiser等人，(1986))。维生素结合蛋白如抗生物素蛋白也可以用作杀幼虫剂(PCT申请US93/06487)。

已知在转化的植物细胞中使用病毒外壳蛋白可以提供对病毒感染和/或受该外壳蛋白基因所来源的病毒以及相关病毒影响的病害发展的抗性(参见Beachy等人，1990)。已经对转化的植物提供了针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性。同上。也可以使用由病原体或寄生虫在自然中产生的发育阻滞性蛋白。例如，Logemann等人，(1992)已经证明表达大麦核糖体灭活基因的转基因植物具有提高的真菌病抗性。

也可以使用提供提高的营养价值或另一价值增加性状的转基因。一个例子是改变的脂肪酸代谢，例如，通过用硬脂酰-ACP去饱和酶的反义基因转化植物，以提高植物的硬脂酸含量。(参见Knutzon等人，1992)。也可以引入有义去饱和酶基因以改变脂肪酸含量。通过引入编码肌醇六磷酸酶的基因可以改变肌醇六磷酸盐的含量，以增强肌醇六磷酸盐的分解，向转化的植物中增加更多的游离磷酸盐。例如，通过用编码改变淀粉分支模式的酶的基因转化植物，也可以实现改变的碳水化合物组成(参见Shiroza等人，1988)(变异链球菌(Streptococcusmutans)果糖基转移酶基因的核苷酸序列)；Steinmetz等人，(1985)(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)；Pen等人，(1992)(表达地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶的转基因植物的产生)；Elliot等人，(1993)(西红柿转化酶基因的核苷酸序列)；

等人，(1993)(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)；和Fisher等人，(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II))。

转基因也可以用来改变蛋白质代谢。例如，美国专利No.5,545,545描述了对赖氨酸不敏感的玉米二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)，该酶基本耐受会抑制天然DHPS活性的L-赖氨酸的浓度。类似地，EP 0640141描述了编码能够引起产生高于正常的苏氨酸的赖氨酸不敏感性天冬氨酸激酶(AK)的序列，以及编码用于增高赖氨酸的反义赖氨酸酮戊二酸还原酶的亚片段。

在另一实施方案中，可以使用改变植物碳水化合物代谢的转基因。例如，已知果糖激酶基因用于转基因植物及其果实中果糖激酶基因表达的代谢工程(参见美国专利No.6,031,154)。可以使用的转基因的另一个例子是改变谷物产量的基因。例如，美国专利No.6,486,383描述了具有腺苷二磷酸葡糖焦磷酸化酶(“ADPG PPase”)的亚单位蛋白质的植物中淀粉含量的改变。在EP0797673中讨论了转基因植物，其中特定DNA分子的引入和表达导致在液泡外形成容易移动的磷酸盐池和增高的生物质产生和/或改变的开花行为。另外已知用于改变植物成熟的基因。美国专利No.6,774,284描述了编码植物脂肪酶的DNA和使用它们控制植物枯萎的方法。美国专利No.6,140,085讨论了改变开花特征，特别是开花时机的FCA基因。美国专利No.5,637,785讨论了遗传学修饰的植物，该植物具有调节的花发育，例如具有早期花分生组织发育，并且在其基因组中包含编码LEAFY蛋白的结构基因。

改变植物形态特征的基因也是已知的，并且可以根据本发明使用。美国专利No.6,184,440讨论了由于表达细胞壁调节转基因而显示改变的结构和形态学的遗传工程植物。细胞壁调节转基因的例子包括纤维素结合域、纤维素结合蛋白或细胞壁修饰蛋白或酶，如内木糖葡聚糖转移酶、木糖葡聚糖内转糖基酶、棒曲霉素、纤维素合酶或分离的新型内-1，4-β-葡聚糖酶。

转基因引入方法是本领域公知的，包括生物和物理学植物转化方案。参见，例如，Miki等人(1993)。

一旦转基因被引入品种中，它可以容易地通过杂交转移。通过使用回交，除了通过回交技术转移到该品种中的基因座以外，品种的基本上全部希望的形态和生理特征被恢复。回交方法可以用于本发明，以改良或向植物中引入特征(Poehlman等人，1995；Fehr，1987a，b)。

IV.大豆植物的组织培养物和体外再生

本发明的另一方面涉及本发明的大豆品种的组织培养物。如本文使用的术语“组织培养物”是指包含分离的相同或不同类型的细胞的组合物或组织为植物部分的这些细胞的集合。示例性的组织培养物类型是原生质体、愈伤组织和在植物或植物部分中为完整的植物细胞，如胚、花粉、花、叶、根、根尖、花药等。在一个优选实施方案中，组织培养物包括胚、原生质体、分生组织细胞、花粉、叶或花药。

用于制备可再生大豆细胞的组织培养物以及从其再生大豆植物的示例性程序在美国专利4,992,375、美国专利5,015,580、美国专利5,024,944和美国专利5,416,011中公开，上述各专利的公开内容均引入本文作为参考。

组织培养物的一个重要的能力是能够再生为能育的植物。这允许，例如，转化组织培养细胞，然后再生为转基因植物。为使转化有效和成功，DNA必须引入将产生植物或种系组织的细胞中。

大豆一般通过两种不同的过程再生：芽形态发生和体细胞胚发生(Finer，1996)。芽形态发生是芽分生组织组织化和发育的过程。芽从来源组织中长出，并且切下并生根，以获得完整的植物。在体细胞胚发生过程中，由体细胞植物组织形成含有芽和根轴的胚(类似于合子胚)。完整的植物而不是生根的芽通过体细胞胚的发芽而产生。

芽形态发生和体细胞胚发生是不同的过程，并且具体再生途径主要取决于外植体来源和用于组织培养操作的培养基。尽管其系统是不同的，但这两种系统都显示品种特异性的应答，其中某些株系比其它株系对组织培养操作有更强的反应性。在芽形态发生中具有高度反应性的株系可能不产生许多体细胞胚。在“诱导”步骤过程中产生许多胚的株系可能不产生快速生长的增殖培养物。因此，可能需要优化用于每个大豆株系的组织培养条件。组织培养领域的熟练技术人员通过小规模的培养研究可以容易地进行这些优化。除了株系特异性应答外，使用形态发生和体细胞胚发生都可以观察到增殖培养物。增殖对于两种系统都是有益的，因为它允许单个转化细胞扩增到可有助于种系组织的点。

芽形态发生最早由Wright等人(1986)报道，作为一种由大豆幼苗的子叶节从头获得芽的系统。芽分生组织在外皮下形成，并且形态发生组织在含有苄基腺嘌呤(BA)的培养基上可以增生。如果知道芽的外皮下多细胞来源，并且使用增殖培养，则该系统可用于转化。想法是针对将产生新芽的组织，并且使分生组织内的这些细胞增殖，以减轻与嵌合性有关的问题。如果转化的细胞不能充分增殖，并且不产生种系组织，则在分生组织中只有一个细胞转化导致嵌合体形成成为一个问题。一旦该系统被很好地认识，并且令人满意地再生，则可以用作用于大豆转化的一种靶组织。

大豆中的体细胞胚发生最早由Christianson等人(1983)报道，作为一种最初由合子胚轴获得胚发生组织的系统。这些胚发生培养物是增殖性的，但是该系统的可重复性较低，并且胚的来源没有报道。后来对不同增殖性胚发生大豆培养物的组织学研究表明，增殖性胚是顶端或表面来源的，少量的细胞对胚形成有贡献。初生胚(由最初的外植体产生的第一个胚)的来源取决于外植体组织和诱导培养基中的植物生长素水平(Hartweck等人，1988)。使用增殖性胚培养物，“较老的”体细胞胚的单细胞或小组表面细胞形成“较新的”胚。

如果知道胚的来源并且理解增殖性胚发生培养物的生物学限制，胚发生培养物也可以成功用于再生，包括转基因植物的再生。生物学限制包括难以发展增殖性胚发生培养物和与由长期增殖性胚发生培养物再生的植物相关的生育性降低问题(培养诱导的变异)。某些这样的问题在长期培养中被突出。使用最近培养的细胞可以减少或消除这些问题。

V.大豆植物的应用

本发明提供的大豆植物可用于任何认为具有价值的目的。常见的应用包括制备供人消费的食物、供非人动物食用的饲料以及工业应用。如本文使用的“工业应用”或“工业用途”是指大豆或基于大豆的产品的非食品和非饲料应用。

大豆通常被加工为两种主要的产品：大豆蛋白质(粗粉)和粗大豆油。为了特定用途，这两种产品通常进一步精制。精制油产品可以分解为甘油、脂肪酸和甾醇。它们可以用于食品、饲料或工业用途。可食用的食品应用实例包括咖啡奶油、人造黄油、蛋黄酱、药品、色拉调料、起酥油、焙烤食品和巧克力糖衣。

大豆蛋白质产品(例如粗粉)可以分为浓缩大豆粉和分离大豆粉，它们都有食品/饲料和工业用途。大豆粉和粗磨粉常用于生产肉增量剂和类似物、宠物食品、焙烤食品配料和其它食品。由大豆粉和分离物制成的食品包括婴儿食品、糖果、谷物、食品饮料、面条、酵母、啤酒、麦芽酒等。大豆粗粉尤其常用作家畜(主要是猪和家禽)饲料中的蛋白质的来源。饲料应用因此包括但不限于水产养殖饲料、蜜蜂饲料、牛饲料代用品、鱼饲料、家畜饲料、家禽饲料和宠物饲料等。

完整的大豆产品也可以用作食品或饲料。常见的食品应用包括如种子、豆芽、烤豆、在各种焙烤食品中使用的全脂豆粉、用作糖果点心的烤大豆、大豆黄油、豆奶咖啡和东方食品的其它大豆衍生物等产品。对于饲料用途，常从大豆上除下外壳，并用作饲料。

大豆另外还具有许多工业用途。大豆的一种常见的工业用途是制备可用于生产复合材料的粘合剂。例如，木复合材料可以使用改性的大豆蛋白质、水解大豆蛋白质与PF树脂的混合物、含有粉状树脂的大豆粉和含有泡沫胶的大豆蛋白质生产。70多年来，基于大豆的粘合剂已经用于生产普通木制品，如胶合板。尽管引入尿素-甲醛和苯酚-甲醛树脂减少了在木制品中使用基于大豆的粘合剂，但是对环境的关注和消费者对由可再生原料制成的粘合剂的偏爱重新引起了开发新的基于大豆的产品用于木材复合材料工业的兴趣。

粘合剂的制备是大豆的另一个常见的工业用途。大豆粘合剂的例子包括大豆水解物粘合剂和大豆粉粘合剂。大豆水解物是一种通过在热(120℃)和压力(30psig)下在5％氢氧化钠溶液中反应大豆蛋白质分离物制成的无色水溶液。产生的降解的大豆蛋白质溶液在室温下是碱性的(pH 11)和可流动的(大约500cps)。大豆粉是由大豆制成的磨细的脱脂粉。各种粘合剂制剂可以由大豆粉制成，第一步通常需要将大豆粉溶解在氢氧化钠溶液中。产生的制剂的强度和其它性质将随制剂中的添加剂而不同。大豆粉粘合剂也可以与其它可商购的树脂混合。

大豆油可以用于许多工业应用中。大豆油是最容易获得的，并且是世界上成本最低的植物油之一。大豆油常见的工业用途包括用作抗静电剂、嵌缝化合物、消毒剂、杀真菌剂、墨水、涂料、保护性涂层、壁板、消沫剂、醇、人造奶油、涂料、墨水、橡胶、起酥油、化妆品等的成分。大豆油多年来也已作为醇酸树脂的主要成分，它们溶解在载体溶剂中，形成油基涂料。在热和压力下将植物油转化为醇酸树脂的基础化学方法是本领域技术人员公知的。

大豆油在其购买到的未精制或精制的食用级状态时，是相当稳定的和干燥缓慢的油。大豆油也可以进行修饰，以增强它在环境条件下的反应性，或者利用各种形式的能量的输入，使油共聚合或熟化为干膜。一些这样的修饰形式包括环氧化、醇解或酯基转移、直接酯化、复分解、异构化、单体修饰和各种形式的聚合作用，包括热稠化。具有双键的大豆油的反应性亚油酸成分可能比主要的油酸和亚油酸成分在许多工业应用中更有用。

也可以使用基于大豆的成分制备溶剂。例如，大豆油脂肪酸甲酯(methyl soyate)，一种基于大豆油的甲酯，作为用于诸如部件清洗和脱脂、涂料和墨水清除、溢油补救等应用中的出色的溶剂替代品，逐渐得到市场的接受。它也销售用于许多配制消费产品中，包括洗手剂、汽车蜡和污迹清除剂。大豆油脂肪酸甲酯通过用甲醇对大豆油进行酯基转移作用来生产。可以从许多生产商和供应商处获得。作为溶剂，大豆油脂肪酸甲酯具有重要的环境和安全性相关的性质，使其在工业应用上具有吸引力。其毒性低于其它大多数溶剂，易于生物降解，并且具有极高的闪点和低水平的挥发性有机化合物(VOC)。大豆油脂肪酸甲酯与金属、塑料、大部分弹性体和其它有机溶剂的兼容性是出色的，大豆油脂肪酸甲酯目前的用途包括清洁剂、油漆剥离剂、溢油清除剂和生物修复剂、杀虫剂辅剂、防蚀剂和生物柴油燃料添加剂。

VI.定义

在说明书和下面的表格中，使用了大量术语。为了提供对说明书和权利要求书的清楚和一致的理解，给出了以下定义：

α-亚基：在此使用时是指β-伴大豆球蛋白α-亚基。

α’-亚基：在此使用时是指β-伴大豆球蛋白α’-亚基。

β-亚基：在此使用时是指β-伴大豆球蛋白β-亚基。

一种：当在权利要求书中与“包括”或其它开放性词语一起使用时，“一种”表示“一种或多种”。

农艺学优良的：在此使用时是指一种基因型，其具有许多可识别的性状如种子产量、发芽、活力、生长活力、抗病性、结籽、可直立性和脱粒性(threshability)，它们允许生产者收获具有商业意义的产品。

等位基因：基因座的一种或多种替代形式中的任一种，所有等位基因都与性状或特征相关。在二倍体细胞或生物体中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上相应的基因座。

回交：育种者将杂种后代例如第一代杂种(F₁)与杂种后代的亲本之一反复杂交的过程。回交可以用来将来自一个遗传背景的一个或多个单基因座转换引入到另一个遗传背景中。

具有商业意义的产量：对于种植者而言具有商业意义的谷物的产量，其代表为在相同条件下生长的对照系AG2703和DKB23-51的至少95％的实际谷物产量。

杂交：两个亲本植物的杂交。

异花授粉：通过来自不同植物的两个配子的融合的受精。

下调性突变：对于本申请，下调性突变定义为降低由给定基因表达蛋白质的表达水平的突变。因此下调性突变包括无效突变。

F₁杂种：两个非等基因植物杂交的第一代后代。

基因型：细胞或生物体的遗传组成。

大豆球蛋白无效：突变大豆植物，其具有赋予降低的大豆球蛋白含量和提高的β-伴大豆球蛋白含量的突变。具有提高的β-伴大豆球蛋白含量的植物可以具有Gy1、Gy2、Gy3、Gy4和/或Gy5的非转基因无效等位基因。

INDEL：核苷酸序列插入或缺失引起的基因突变。

工业应用：大豆植物的非食品和非饲料应用。术语“大豆植物”包括大豆植物的植物部分和衍生物。

连锁：一种现象，其中同一染色体上的等位基因倾向于比偶然预期的更经常地一起分离，如果它们的传播是独立的话。

标记：容易检测的表型，优选地以共显性的方式遗传(二倍体杂合子中一个基因座处的两个等位基因可容易地检测到)，没有环境变化成分，即遗传性为1。

非转基因突变：天然发生的或通过常规方法(例如将植物暴露于辐射或诱变化合物)诱导的突变，不包括使用重组DNA技术获得的突变。

无效表型：此处使用的无效表型是指给定蛋白质的表达水平无法检测到。对于Gy亚基，表达水平通过SDS-PAGE和考马斯染色来确定。

表型：细胞或生物体的可检测的特征，该特征是基因表达的表现。

数量性状基因座(QTL)：数量性状基因座(QTL)是指以一定程度控制通常连续分布的可用数字表示的性状的基因座。

SNP：是指当比较两个同源序列时的单核苷酸多态性或单核苷酸突变。

严格条件：是指5X SSC、50％甲酰胺和42℃的核酸杂交条件。

基本等同：一种特征，当进行比较时，与平均值不显示统计学显著性差异(例如，p＝0.05)。

组织培养物：包含相同或不同类型的分离细胞的组合物或组织化为植物部分的这些细胞的集合。

转基因：包含已通过转化引入大豆植物基因组中的序列的基因座。

营养品：对人类健康具有医疗效果的食品。

在本发明的方法和/或组合物范围内讨论的实施方案可以相对于此处描述的其它任何方法或组合物使用。因此，涉及一种方法或组合物的实施方案也可以应用于本发明的其它方法和组合物。

如在说明书或权利要求书中使用的，“一个”或“一种”可指一种或多种。如在权利要求书中使用的，当与“包含”一起使用时，“一个”或“一种”可指一种或一种以上。在此使用的“另一”可以指至少一个第二种或更多种。

通过以下详细描述，本发明的其它目的、特征和优点将是清楚的。但是应当理解，详细描述和特定实施例尽管说明本发明的优选实施方案，但是只是以举例说明的方式提供的，因为基于该详细描述，本领域技术人员将会明白本发明的精神和范围内的各种变化和修改。

VII.实施例

包括以下实施例是为了证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，下面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在本发明的实施中作用良好的技术，因此可以认为构成实施本发明的优选模式。但是，本领域技术人员根据本发明的公开内容应当认识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的特定实施方案进行许多改变，而仍然获得同样的或相似的结果。

实施例1

具有提高的α’-亚基含量的大豆品种

β-伴大豆球蛋白三聚体中α′、α和β亚基的相对百分比分别为～35％、45％和20％(Maruyama等人，1999)。在大多数种子中α∶α’比约为1.28。针对提高的α’-亚基含量筛选商业品种。蛋白质分析如下进行：混合来自一个品种的大豆种子，并使用CAT Mega-研磨器(SOPAsci-01-0002)研磨。将磨碎的样品贮存在4℃下。为了分析，每种称取～30mg粉置入96孔2ml微孔板的一个孔中。在振摇下，在含有作为还原剂的0.1M二硫苏糖醇(DTT)的1.0ml 1X Laemmli SDS缓冲液pH 6.8中提取蛋白质1小时。离心后，每个提取物的一部分在SDS缓冲液中进一步稀释，以产生0.2-0.5μg/μL总蛋白质，加热至90-100℃ 10min，并冷却。对于每个样品，使用12通道移液器将1-2μg总蛋白质加至26泳道15％T梯度Tris/HCl Criterion凝胶上。分子量标准和亲本对照包括在每个凝胶的两个泳道中。对凝胶进行电泳，直到示踪染料到达凝胶底部，大约1.2hrs，然后在胶态考马斯蓝G-250中染色过夜，在去离子水中脱色，并且使用GS800校准的光密度计成像。使用Bio-Rad Quantity One^TM软件进行定量。利用该软件确定样品泳道中每条带的相对量。酸性大豆球蛋白的百分比和β-伴大豆球蛋白亚基带的百分比报告为泳道中总蛋白质的相对百分比。样品身份和重量使用MasterLIMS^TM示踪。

筛选结果在表1中示出。值得注意的是，在筛选的大多数种子中α∶α’比大约为1.28。鉴别出具有独特种子组成，即其中α∶α’比小于1的品种，并且选出用于进一步的育种工作。意料之外的是，在选择的品种中，β-亚基含量保持不变或者保守，尽管α′-亚基含量提高。

实施例2

商业品种中提高的α’-亚基含量的来源

在针对提高的α’-亚基含量筛选商业品种后，选出种子α∶α’比小于1的品种进行将来的育种工作。另外，评价了每个品种的谱系。在背景中具有PI88788的筛选品种中，有80％其α∶α’比小于1(表1)。另外，100％的α∶α’比小于1的筛选品种在其背景中具有PI88788。因此，育种者可以通过评价品种谱系PI88788来针对提高的α’-亚基预筛选品种。需要蛋白质分析来证实表型，但是预筛选可以减少初始筛选工作中的植物数。

实施例3

大豆球蛋白无效和α’-亚基增高性状的组合进一步提高了种子中的α’-亚基含量

大豆球蛋白基因对大豆种子中的β-伴大豆球蛋白含量具有直接的影响。具有赋予降低的Gy1、Gy2、Gy3、Gy4和Gy5蛋白质含量的突变的大豆植物在种子中具有提高的β-伴大豆球蛋白含量和随后提高的α’-亚基含量。例如，典型的大豆含有大约40％的大豆球蛋白、20％的β-伴大豆球蛋白，α’-亚基占总蛋白质的9％。但是，β-伴大豆球蛋白增高的大豆含有例如低于40％、30％、20％或6％的大豆球蛋白，和高于20％、30％或40％的β-伴大豆球蛋白。具有赋予降低的大豆蛋白质含量和提高的β-伴大豆球蛋白含量的突变的突变大豆植物被称为大豆球蛋白无效。

在来自于B2G2的大豆球蛋白无效植物与确定具有α’-亚基增高性状的植物之间进行杂交。针对蛋白质含量，包括α-、α’-和β-亚基的相对百分比，来筛选后代(表2)。α’-亚基含量最高达总蛋白质的25.9％。另外，具有α’-亚基增高和大豆球蛋白无效性状的植物在种子中产生几乎三倍于普通商业品种的α’-亚基(图1)。

根据本发明的公开内容，不需要过多的实验就可以制备和实施此处公开和请求保护的所有组合物和方法。尽管本发明的组合物和方法已经以优选实施方案的形式描述，但是本领域技术人员应当清楚，可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，对所述组合物和方法和此处所述的方法的步骤或步骤顺序进行改变。更具体地，应当理解，某些化学和生理学都相关的物质可以替代此处描述的物质，而将获得相同或相似的结果。本领域技术人员清楚的所有这些类似的替代物和改变可被认为是在所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。

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Claims (27)

1.一种大豆植物，其能够结出具有显著降低的大豆球蛋白含量和提高的β-伴大豆球蛋白含量的种子，其中以种子总蛋白质的百分比计，β-伴大豆球蛋白三聚体中α’-亚基的水平至少等于α-亚基的水平。

2.权利要求1的大豆植物，其中所述β-伴大豆球蛋白三聚体的β-亚基的水平基本保持不变。

3.权利要求1的大豆植物，其中所述大豆球蛋白含量降至总蛋白质的大约1％至大约39％的水平。

4.权利要求3的大豆植物，其中所述大豆球蛋白含量降至总蛋白质的大约4％至大约20％的水平。

5.权利要求1的大豆植物，其中所述β-伴大豆球蛋白三聚体中α-亚基的水平和α’-亚基的水平的比例为大约0.1至大约1。

6.权利要求5的大豆植物，其中所述β-伴大豆球蛋白三聚体中α-亚基的水平和α’-亚基的水平的比例为大约0.3至大约0.8。

7.权利要求5的大豆植物，其中所述大豆球蛋白含量降至总蛋白质的大约4％至大约20％的水平。

8.一种大豆种子，其具有显著降低的大豆球蛋白含量和提高的β-伴大豆球蛋白含量，其中以种子总蛋白质的百分比计，β-伴大豆球蛋白三聚体中α’-亚基的水平至少等于α-亚基的水平。

9.权利要求8的大豆种子，其中所述大豆球蛋白含量降至总蛋白质的大约4％至大约20％的水平。

10.权利要求9的大豆种子，其中所述β-伴大豆球蛋白三聚体中α-亚基的水平和α’-亚基的水平的比例为大约0.3至大约0.8。

11.权利要求10的大豆种子，其中所述α’-亚基的水平为种子总蛋白质的大约9％至大约60％。

12.权利要求11的大豆种子，其中所述α’-亚基的水平为种子总蛋白质的大约15％至大约30％。

13.一种产生大豆植物的方法，该植物能够结出具有相对于α-亚基含量提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量的种子，该方法包括：

(a)针对提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量筛选至少两个大豆种子；

(b)选择一个具有提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量的种子；和

(c)使所述选择的种子生长为开花植物。

14.权利要求13的方法，其中所述至少两个大豆种子中的每一个在其谱系中具有PI88188。

15.权利要求13的方法，进一步包括以下步骤：

(a)使所述开花植物与第二大豆植物杂交，以形成群体；和

(b)选择并种植至少一个具有提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量的后代种子。

16.一种产生大豆植物的方法，该植物能够结出具有相对于α-亚基含量提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量的种子，该方法包括：

(a)使在种子中具有提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量的第一大豆植物与第二大豆植物杂交，以形成种子群体；

(b)针对种子蛋白质中提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量筛查所述种子群体；和

(c)选择并种植至少一个具有提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量的种子。

17.权利要求16的方法，其中以总蛋白质的百分比计，所述β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量提高至至少等于α-亚基含量的水平。

18.一种植物育种方法，包括：

(a)使大豆球蛋白无效植物与能够结出具有相对于α-亚基含量提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量的种子的植物杂交；和

(b)选择具有高于其任一亲本的α’-亚基含量的后代种子。

19.权利要求18的方法，其中所述植物能够结出具有相对于α-亚基含量提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量的种子。

20.权利要求19的方法，其中所述后代种子进一步具有显著降低的大豆球蛋白水平和基本未变的β-伴大豆球蛋白β-亚基水平。

21.权利要求20的方法，其中所述后代种子进一步包含β-伴大豆球蛋白三聚体，该β-伴大豆球蛋白三聚体中α-亚基水平与α’-亚基水平的比例为大约0.3至大约0.8。

22.一种大豆蛋白质产品，其具有占总蛋白质的大约1％至大约35％的大豆球蛋白含量，和提高的β-伴大豆球蛋白含量，其中β-伴大豆球蛋白三聚体中α’-亚基的水平至少等于α-亚基的水平。

23.权利要求22的大豆蛋白质产品，包括大豆粗粉、豆粉、脱脂豆粉、毛豆、大豆坚果、豆奶、喷雾干燥的豆奶、浓缩大豆蛋白质、组织化的大豆蛋白质、水解大豆蛋白质、大豆蛋白质分离物和喷雾干燥的豆腐。

24.用权利要求23的大豆蛋白质产品制成的食品，包括饮料、灌注食品、沙司、咖啡奶油、饼干、乳化剂、面包、糖果速溶奶制饮料、肉汤、面条、大豆黄油、豆奶咖啡、烤大豆、薄饼干、糖果、豆奶、豆腐、印尼豆豉、烘培大豆、焙烤食品成分、饮料粉、早餐谷类食品、果汁、糖浆、甜点、糖衣和馅料、软冷冻产品、蜜饯和中间食品。

25.权利要求22的大豆蛋白质产品，其中提高的β-伴大豆球蛋白含量包括比例为大约0.3至大约0.8的α-亚基水平和α’-亚基水平。

26.一种检测种子群体中是否存在具有相对于α-亚基含量提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量的大豆种子的方法，该方法包括：

(a)获得大豆种子群体；和

(b)检测所述群体中是否存在权利要求1的种子。

27.权利要求26的方法，其中所述检测方法包括SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析、Western印迹分析、毛细管电泳(CE)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。

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