CN102165066A

CN102165066A - 用于β-伴大豆球蛋白α’提高的大豆的方法和组合物

Info

Publication number: CN102165066A
Application number: CN2009801375948A
Authority: CN
Inventors: J·詹金森
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co; Monsanto Technology LLC
Priority date: 2008-09-04
Filing date: 2009-09-01
Publication date: 2011-08-24
Also published as: WO2010027948A2; EP2326721A2; CA2735231A1; BRPI0918752A2; AR073496A1; US20110252490A1; WO2010027948A3

Abstract

本发明涉及用于培育包含与种子中提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量有关的基因组区域的大豆植物的方法。另外，本发明提供了包含赋予提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量的基因组区域的种质和该种质在育种计划中基因渗入优良种质的用途。本发明还提供了这些植物的衍生物和植物部分及其用途。

Description

用于β-伴大豆球蛋白α’提高的大豆的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2008年9月4日提交的美国临时申请61/094,277的优先权。该申请的全部内容本文引入作为参考。

发明背景

1.序列表的引入

序列表包含于2009年8月22日创建的、38,062字节(在MS-Windows中确定)的名为“pa_53703D.txt”的文件中。该电子序列表在这里通过电子方式提交，并且通过引用并入本文。

2.发明领域

本发明主要涉及植物育种和分子生物学领域。具体而言，本发明涉及具有提高的β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)α′亚基含量的大豆和用于产生这样的植物的材料。更具体地说，本发明包括一种用于培育包含与提高的α’-亚基相关的数量性状基因座的大豆植物的方法。本发明还包括包含赋予提高的α’-亚基的数量性状基因座(QTL)的种质和该种质在育种计划中基因渗入优良种质的用途。

3.相关技术描述

美国种植者种植两类大豆：豆油(oil)/粗粉(meal)和食品级大豆。豆油/粗粉豆的种植主要是为了美国市场。用作食品配料用的大豆通常为粉、浓缩物、分离物或油的形式。由于它们的功能、营养特性、低成本和丰度(abundance)，大豆成分十分抢手(Zayas等人，Functionality of Proteins in Food，(1997))。

组成和构象决定蛋白质的功能。能够改变功能的组成上的差异包括，例如，蛋白质组分的比例、组分内亚基浓度的变化以及氨基酸分布的不同。大豆蛋白质具有四个主要的可用水萃取的组分(2S、7S、11S和15S)，它们可以根据沉降系数分离。7S(β-伴大豆球蛋白)和11S(大豆球蛋白(glycinin))蛋白质是大豆内的主要组分。

大豆球蛋白(11s球蛋白)由五个不同的亚基组成，它们分别被命名为A1aB2、A2B1a、A1bB1b、A5A4B3、A3B4。每个亚基由通过二硫键共价连接的两个多肽(一个为酸性，一个为碱性)组成。这两个多肽链是通过原大豆球蛋白前体的翻译后切割产生的；这一步在前体进入蛋白质体后发生。已经确定了编码这些多肽亚基的五种主要基因。它们分别被命名为Gy1、Gy2、Gy3、Gy4和Gy5(Nielsen等人，In：Cellular and molecular biology of plant seed development，Larkins和Vasil 1K(编著)，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，The Netherlands，151-220(1997))。另外，也报道了假基因gy6和次要基因Gy7(Beilinson等人，Theor.Appl，Genet.，104(6-7)：1132-1140(2002))。多个研究小组报道了这些基因的遗传图谱(Diers等人，1993，Chen和Shoemaker 1998，Beilinson 等人，2002)。Gy1和Gy2相距3kb，并且定位于连锁群N上(Nielsen等人，Plant Cell.，1：313-328(1989))，Gy3定位于连锁群L上(Beilinson等人，Theor.Appl.Genet.，104(6-7)：1132-1140(2002))。Gy4和Gy5分别定位于连锁群O和F上。

另一方面，β-伴大豆球蛋白(7S)由α(～67kda)、α′(～71kDa)和β(～50kDa)亚基组成，每个亚基通过共翻译和翻译后修饰加工(Ladin等人，Plant Physil.，84：35-41(1987)：Utsumi.In：Advances in Food and Nutrition Research，Kinsella(编著)，36：89-208，Academic Press，San Diego，CA(1992))。β-伴大豆球蛋白亚基分别由基因Cgy1、Cgy2和Cgy3编码。遗传分析表明Cgy2与Cgy3紧密连锁，而Cgy1与另外两个独立分离。Cgy1与α’-亚基相关(Doyle等人，J Biol Chem：261：9225-9238(1986))，且Cgy3与α-亚基相关(Yoshino等人，Genes Genet.Syst.76：99-105(2001))。另外，下调Cgy3导致Cgyl的上调。因此，导致减少α-亚基积累的Cgy3突变可能导致提高的α’-亚基的积累。β-伴大豆球蛋白基因家族包含分为两个主要组的至少15个成员，其分别编码2.5kb和1.7kb的胚mRNA(Harada等人，Japan J.Breed.，33：23-30(1983))。三聚体中α’、α和β链的相对百分比分别占总β-伴大豆球蛋白的约35％、45％和20％(Maruyama等人，J.Agric.Food Chem.47：5278-528(1999))。

大豆蛋白的功能部分取决于β-伴大豆球蛋白与大豆球蛋白的比例和亚基组成的变化，其可在不同基因型之间不同。β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白在组成和结构中的差异表现在营养和功能性质两方面。大豆球蛋白每单位比β-伴大豆球蛋白含有较多的蛋氨酸和半胱氨酸，但是，缺乏大豆球蛋白但富含β-伴大豆球蛋白的大豆可以具有与含有大豆球蛋白的大豆相似的总含硫氨基酸水平。大豆球蛋白对于形成构成坚固的豆腐凝胶的蛋白质微粒是重要的(Tezuka等人，J.Agric.Food Chem.，48：1111-1117(2000))，但是在缺乏β-伴大豆球蛋白的情况下比在缺乏大豆球蛋白的情况下形成更弱的凝胶(Tezuka等人，J.Agric.Food Chem.，52：1693-1699(2004))。β-伴大豆球蛋白的胶凝性质和由富含β-伴大豆球蛋白的大豆制成的大豆蛋白分离物的胶凝性质在某些可能适用于食物应用的情况下为有利的(Nagano，等人，J.Agric.Food Chem.44：3484-3488(1996)；Rickert，等人J.Fd Sci.69：303(2004))。β-伴大豆球蛋白的胶凝特性可以通过变化显示优势的α-亚基的亚基组成来改变(Salleh，2004)。β-伴大豆球蛋白的溶解度和乳化性能良好，部分原因是由于α和α’-亚基的亲水延伸区域(Yamauchi等人，Food Rev.Int.7：283-322(1991)，Maruyama等人，JAOCS.79：139(2002))。有可能产生用于食品应用的有价值的具有提高的β-伴大豆球蛋白水平和降低的大豆球蛋白水平的大豆和原料。

β-伴大豆球蛋白有明显的正面影响人类健康的潜力(Baba等人，J.Nutr.Sci.Vitaminol.(Tokyo)，50(1)：26-31(2004))。尤其是β-伴大豆球蛋白已被发现可降低胆固醇、甘油三酯和内脏脂肪。Kohno等人证明，每天服用5克β-伴大豆球蛋白的人类受试者中的甘油三酸脂水平和内脏脂肪明显降低(Kohno等人，J Atheroscler Thromb，13：247-255(2006))。同样，Nakamura等人发现，β-伴大豆球蛋白在灵长类动物模型中上调与脂代谢相关的基因(Nakamura等人，Soy Protein Res 8：1-7(2005))。此外，Nakamura等人证明β-伴大豆球蛋白具有显著的防止骨矿物密度流失的效果(Nakamura等人，Soy Protein Res 7：13-19(2004))。此外，β-伴大豆球蛋白被证明具有降低血清胰岛素和血糖的效应(Moriyama等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.，68(2)：352-359(2004))。由于β-伴大豆球蛋白对甘油三酸脂、胆固醇、脂肪、胰岛素和糖水平的影响，它可以在健康程序中发挥重要作用。此外，β-伴大豆球蛋白抑制小鼠动脉斑块形成，并可能在人类受试者中也具有类似的效应(Adams等人，J.Nutr.，134(3)：511-516(2004))。另外，β-伴大豆球蛋白可能对于人类肠道菌群具有明显的效应。β-伴大豆球蛋白在许多动物模型中抑制有害细菌诸如大肠杆菌的生长，同时刺激有益细菌诸如双歧杆菌(bifidobacteria)的生长(Nakamura等人，Soy Protein Res 7：13-19(2004).Zuo等人，World J Gastroenterol 11：5801-5806(2005))。β-伴大豆球蛋白可以用于减少感染后大肠杆菌的生长和维持健康的肠道微生物群落。

β-伴大豆球蛋白α’-亚基可能在许多与β-伴大豆球蛋白相关的健康益处中发挥主导作用。许多利用动物模型的实验已经表明，大豆β-伴大豆球蛋白α’-亚基可以降低血浆甘油三酸酯，而且提高从血液去除LDL(“坏”胆固醇)(Duranti等人，J.Nutr.，134(6)：1334-1339(2004)，Moriyama等人，Biosci.Biotechnol，Biochem.，68(2)：352-359(2004)，Adams等人，J.Nutr.，134(3)：511-516(2004)，Nishi等人，J.Nutr.，133(2)：352-357(2003))。因此，具有提高的β-伴大豆球蛋白含量的大豆品种比传统品种具有更高的价值，并将适用于营养饮料和其他食品。在识别生物活性多肽的尝试中，Manzoni等人试图表征β-伴大豆球蛋白中的生物活性多肽，并间接表明α’-亚基具有降低胆固醇的假定作用(Manzoni等人，J.Agric.Food Chem.46：2481-2484(1998))。此外，Manzoni等人还证明了α’-亚基在提高LDL的摄取和降解及LDL受体mRNA水平方面的作用(Manzoni等人，J.Nutr.133：2149-2155(2003))。Duranti等人证明α’-亚基可以在体内降低甘油三酸酯和血浆胆固醇(Duranti等人，J.Nutr.，134(6)：1334-1339(2004))。

β-伴大豆球蛋白β-亚基也具有许多健康益处。例如，β-亚基通过引起胆囊收缩素(cholecystokinin)分泌增加饱足感(satiety)(Nishi等人，J.Nutr.133：352-357 2003，Hara等人Plant Phys Biochem 42：657-662(2004))。胆囊收缩素激素是肠胃系统中负责刺激脂肪和蛋白质消化的肽激素。胆囊收缩素，以前称为肠促胰酶素(pancreozymin)，由I-细胞合成和在十二指肠(小肠的第一部分)分泌，并导致消化酶和胆汁分别从胰腺和胆囊释放。它还作为饥饿抑制剂发挥作用。因此，β-亚基可以抑制食欲，并可以在总体重控制计划中发挥作用。

β-亚基可能也在心理健康方面具有作用。通过用胰弹性蛋白酶和亮氨酸氨基肽酶消化β-亚基释放大豆吗啡-5(soymorphin-5)。大豆吗啡-5是一种阿片肽。阿片类药物是在体内具有吗啡样作用的化学物质。阿片类药物主要用于缓解疼痛。这些药物通过结合主要在中枢神经系统和胃肠道被发现的阿片受体发挥作用。大豆吗啡-5在小鼠口服后显示出抗焦虑效应，这表明β-亚单位的摄入可能会减少精神压力(Agui等人Peptide Science 2005：195-198(2005))。

因此，本发明的目标是产生具有提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基水平的大豆。本发明提供和包括一种用于筛选和选择包含针对改变的α’-亚基水平的QTL的大豆植物的方法，和单核苷酸多态性(SNP)标记技术。

发明内容

本发明涉及大豆种子的增高的α’-亚基和保持的β亚基的组成，与商业大豆蛋白质成分相比，该种子具有改善的物理和人类健康性质。本发明提供了具有赋予增高的α’-亚基表型和降低的种子α-亚基含量的非转基因性状的大豆植物的选择方法。因此，在一方面，本发明的方法包括选择具有提高的α’-亚基含量和降低的α-亚基含量的种子。在某些实施方式中，本发明的植物的种子α’-亚基含量为总蛋白含量的大约或者至少大约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20％或更多。在某些实施方式中，本发明的植物中α-亚基含量与α’-亚基含量的比值为大约1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或甚至0，在其中可推出。

本发明包括将等位基因基因渗入大豆植物的方法，包括：(a)杂交包含选自表3列出的那些核酸序列的核酸序列的至少第一大豆植物与至少第二大豆植物，以形成分离群体；(b)用一种或多种核酸标记筛选该分离群体，以确定来自分离群体的一种或多种大豆植物是否含有列出的核酸序列；和(c)从该分离群体选择一种或多种包含选自表3列出的那些核酸序列的核酸序列的大豆植物。

本发明包括基因渗入等位基因和选择赋予大豆植物种子提高的α’-亚基表型的非转基因性状的方法，包括：(a)杂交至少一种在种子中具有提高的种子α’-亚基含量的大豆植物与第二大豆植物，以形成分离群体；和(b)用一种或多种核酸标记筛选该分离群体，以确定来自该分离群体的一种或多种大豆植物在种子中是否含有与提高的α’-亚基表型和提高的种子α’-亚基含量相关的基因组区域的等位基因。

本发明还提供了选择和基因渗入与赋予种子降低的α-亚基含量所导致的提高的α’-亚基表型的非转基因性状相关的基因组区域的方法，包括：(a)从多种大豆植物分离核酸；(b)在分离的核酸中检测一种或多种标记分子的存在，其中该标记分子选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18，且任何一个标记分子定位在距离标记分子30cM或更少以内；和(c)选择包含一种或多种标记分子的大豆植物，从而选择在种子中具有提高的种子α’-亚基含量的大豆植物。

作为另一实施方式，本发明提供用于选择能够产生具有降低的大豆球蛋白含量、提高的种子β-伴大豆球蛋白含量和后来提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基的种子的大豆植物的方法。因此，在一方面，本发明的植物包含具有降低的大豆球蛋白含量、提高的β-伴大豆球蛋白含量和β-伴大豆球蛋白α’-亚基的种子。在某些实施方式中，本发明的植物产生的种子具有占种子总蛋白质的大约或低于大约18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0％的种子大豆球蛋白含量。在某些实施方式中，本发明的植物产生的种子具有占种子总蛋白质的大约或至少大约37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60％或更高的种子β-伴大豆球蛋白含量。在另一实施方式中，本发明的植物的种子α’-亚基含量占种子总蛋白质含量的大约或至少大约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40％或更高。在进一步的实施方式中，本发明的植物能够产生具有α-亚基与α’-亚基比值为大约1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或甚至0的β-伴大豆球蛋白组成的种子。

本发明包括用于基因渗入等位基因和选择在大豆植物种子中具有降低的大豆球蛋白含量、提高的种子β-伴大豆球蛋白含量和继而提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量的等位基因的方法，包括：(a)杂交至少一种在种子中具有降低的大豆球蛋白含量、提高的种子β-伴大豆球白质含量和后来提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量的大豆植物与第二大豆植物，以形成分离群体；和(b)用一种或多种核酸标记筛选该分离群体，以确定来自该分离群体的一种或多种大豆植物在种子中是否含有与降低的大豆球蛋白含量、提高的种子β-伴大豆球蛋白含量和后来降低的α-亚基蛋白质含量所导致的提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量相关的基因组区域的等位基因。

本发明还提供了选择和基因渗入与种子中降低的大豆球蛋白含量、提高的种子β-伴大豆球蛋白含量和后来提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量相关的基因组区域的方法，包括：(a)从多种大豆植物分离核酸；(b)在分离的核酸中检测一种或多种标记分子的存在，其中该标记分子选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18，且任何一个标记分子定位在距离标记分子30cM或更少以内；和(c)选择包含一种或多种标记分子的大豆植物，从而选择在种子中具有降低的大豆球蛋白含量、提高的种子β-伴大豆球蛋白含量和继而降低的α-亚基含量所导致的提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量的大豆植物。

本发明也提供植物部分。本发明的植物部分包括但不限于花粉、胚珠、分生组织、细胞和种子。本发明的细胞可以进一步包括可再生细胞，诸如胚分生组织细胞、花粉、叶、根、根尖和花。因此，这些细胞可以用来再生本发明的植物。

本文也提供了本发明的植物的种子的部分。因此，也提供了由本发明的种子制成的碾碎的种子和粗粉或豆粉作为本发明的部分。本发明进一步包括制造大豆粗粉或豆粉的方法，包括碾碎或研磨本发明的种子。本发明的这些大豆粉或粗粉可以包含本发明的植物的基因组材料。在一个实施方式中，食物可以被定义为包含这种植物的基因组。在进一步的实施方式中，本发明的大豆粗粉或豆粉可以被定义为，与由具有相同遗传背景但不含非转基因突变Gy3和Gy4无效等位基因的植物种子制成的粗粉或豆粉相比，具有提高的β-伴大豆球蛋白含量和降低的大豆球蛋白含量。

在本发明的再进一步的方面，提供了一种产生大豆种子的方法，包括使本发明的植物与其自身杂交或与第二大豆植物杂交。因此，该方法可以包括通过使本发明的植物与不同的第二大豆植物杂交产生杂种大豆种子。

本发明的再另一方面是一种生产用于人类或动物食用的食品的方法，包括：(a)获得本发明的植物；(b)栽培该植物至成熟；和(c)由该植物制备食品。在本发明的某些实施方式中，食品可以是蛋白浓缩物、蛋白质分离物、粗粉、面粉或大豆壳。在某些实施方式中，食品可以包括饮料、灌注食物、沙司、咖啡奶油、饼干、乳化剂、面包、糖果速溶奶制饮料、肉汤、面条、黄豆仁酱(soynut butter)、豆奶咖啡、烤大豆、薄饼干、糖果、豆奶、豆腐、印尼豆豉(tempeh)、烘培大豆、焙烤食品成分、饮料粉、早餐谷类食品、营养棒、肉或肉类似物、果汁、甜点、软冷冻产品、蜜饯或中间食物。由本发明的植物生产的食品可以包含提高的α’-亚基含量，因此比用典型大豆品种制成的食品具有更高的营养价值。

本发明的进一步的方面是一种生产营养品的方法，包括：(a)获得本发明的植物；(b)栽培该植物至成熟；和(c)由该植物制备营养品。由本发明的植物生产的产品可以包含提高的α’-亚基含量，因此比用典型大豆品种制成的食品具有更高的营养价值。例如，用具有增高的α’-亚基的大豆种子制成的产品可以在降脂治疗中单独使用或者与其他机制联合使用。

在进一步的实施方式中，本发明的植物可以进一步包含转基因。在一个实施方式中，转基因可以被定义为赋予大豆植物优选的性质，该性质选自除草剂耐受性、提高的产量、昆虫控制、真菌病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌病抗性、支原体病抗性、改变的脂肪酸组成、改变的油产量、改变的氨基酸组成、改变的蛋白质产量、提高的蛋白质产量、改变的碳水化合物产量、发芽和幼苗生长的控制、增强的动物和人类营养、低棉子糖、干旱和/或环境应激抗性、改变的形态特征、提高的可消化性、工业酶、药用蛋白质、肽和小分子、改善的加工性状、改善的风味、固氮、杂种种子的产生、降低的变应原性、生物聚合物、生物燃料，或者这些的任何组合。

在某些实施方式中，本发明的植物可以被定义为是通过一种方法产生的，在该方法中，包含赋予提高的α’-亚基表型和降低的α-亚基含量的非转基因突变的植物与包含农艺学优良特征的植物杂交。可以分析该杂交的后代的农艺学优良特征和α’-亚基蛋白质含量，并且根据这些特征选择后代植物，从而产生本发明的植物。因此在某些实施方式中，本发明的植物可以通过使选择的起始品种与包含农艺学优良特征的第二大豆植物杂交而产生。在某些实施方式中，本发明的植物可以被定义为是通过一种方法产生的，在该方法中，包含赋予降低的大豆球蛋白含量和提高的种子β-伴大豆球蛋白含量的非转基因突变的植物与包含提高的α’-亚基含量的植物杂交。

在本发明的方法和/或组合物范围内讨论的实施方式可以相对于本文描述的任何其他方法或组合物使用。因此，涉及一种方法或组合物的实施方式也可以应用于本发明的其他方法和组合物。

如在说明书或权利要求书中使用的，“一个”或“一种”可指一种或多种。如在权利要求书中使用的，当与“包含”一起使用时，“一个”或“一种”可指一种或一种以上。本文使用的“另一”可以指至少一个第二种或更多种。

通过以下详细描述，本发明的其他目标、特征和优点将是清楚的。但是应当理解，详细描述和特定实施例尽管说明本发明的优选实施方式，但是只是以举例说明的方式提供的，因为基于该详细描述，本领域技术人员将会明白本发明的精神和范围内的各种变化和修改。

附图简述

图1：如SDS-PAGE测量的，与提高的α’-亚基含量相关的标记对于α-亚基含量的影响。

图2：如SDS-PAGE测量的，与提高的α’-亚基含量相关的标记对于α/α’-亚基的比例的影响。

核酸序列的简要说明

SEQ ID NO：1是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆(Glycine max(L.)Merrill)的基因组序列。

SEQ ID NO：2是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：3是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：4是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：5是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：6是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：7是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：8是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：9是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：10是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：11是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：12是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：13是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：14是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：15是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：16是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：17是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：18是对应于与降低的α-亚基水平相关的基因组区域的源自大豆的基因组序列。

SEQ ID NO：19是用于扩增SEQ ID NO：1的PCR引物。

SEQ ID NO：20是用于扩增SEQ ID NO：1的PCR引物。

SEQ ID NO：21是用于扩增SEQ ID NO：2的PCR引物。

SEQ ID NO：22是用于扩增SEQ ID NO：2的PCR引物。

SEQ ID NO：23是用于扩增SEQ ID NO：3的PCR引物。

SEQ ID NO：24是用于扩增SEQ ID NO：3的PCR引物。

SEQ ID NO：25是用于扩增SEQ ID NO：4的PCR引物。

SEQ ID NO：26是用于扩增SEQ ID NO：4的PCR引物。

SEQ ID NO：27是用于扩增SEQ ID NO：5的PCR引物。

SEQ ID NO：28是用于扩增SEQ ID NO：5的PCR引物。

SEQ ID NO：29是用于扩增SEQ ID NO：6的PCR引物。

SEQ ID NO：30是用于扩增SEQ ID NO：6的PCR引物。

SEQ ID NO：31是用于扩增SEQ ID NO：7的PCR引物。

SEQ ID NO：32是用于扩增SEQ ID NO：7的PCR引物。

SEQ ID NO：33是用于扩增SEQ ID NO：8的PCR引物。

SEQ ID NO：34是用于扩增SEQ ID NO：8的PCR引物。

SEQ ID NO：35是用于扩增SEQ ID NO：9的PCR引物。

SEQ ID NO：36是用于扩增SEQ ID NO：9的PCR引物。

SEQ ID NO：37是用于扩增SEQ ID NO：10的PCR引物。

SEQ ID NO：38是用于扩增SEQ ID NO：10的PCR引物。

SEQ ID NO：39是用于扩增SEQ ID NO：11的PCR引物。

SEQ ID NO：40是用于扩增SEQ ID NO：11的PCR引物。

SEQ ID NO：41是用于扩增SEQ ID NO：12的PCR引物。

SEQ ID NO：42是用于扩增SEQ ID NO：12的PCR引物。

SEQ ID NO：43是用于扩增SEQ ID NO：13的PCR引物。

SEQ ID NO：44是用于扩增SEQ ID NO：13的PCR引物。

SEQ ID NO：45是用于扩增SEQ ID NO：14的PCR引物。

SEQ ID NO：46是用于扩增SEQ ID NO：14的PCR引物。

SEQ ID NO：47是用于扩增SEQ ID NO：15的PCR引物。

SEQ ID NO：48是用于扩增SEQ ID NO：15的PCR引物。

SEQ ID NO：49是用于扩增SEQ ID NO：16的PCR引物。

SEQ ID NO：50是用于扩增SEQ ID NO：16的PCR引物。

SEQ ID NO：51是用于扩增SEQ ID NO：17的PCR引物。

SEQ ID NO：52是用于扩增SEQ ID NO：17的PCR引物。

SEQ ID NO：53是用于扩增SEQ ID NO：18的PCR引物。

SEQ ID NO：54是用于扩增SEQ ID NO：18的PCR引物。

SEQ ID NO：55是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：1的第一探针。

SEQ ID NO：56是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：1的第二探针。

SEQ ID NO：57是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：2的第一探针。

SEQ ID NO：58是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：2的第二探针。

SEQ ID NO：59是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：3的第一探针。

SEQ ID NO：60是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：3的第二探针。

SEQ ID NO：61是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：4的第一探针。

SEQ ID NO：62是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：4的第二探针。

SEQ ID NO：63是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：5的第一探针。

SEQ ID NO：64是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：5的第二探针。

SEQ ID NO：65是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：6的第一探针。

SEQ ID NO：66是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：6的第二探针。

SEQ ID NO：67是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：7的第一探针。

SEQ ID NO：68是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：7的第二探针。

SEQ ID NO：69是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：8的第一探针。

SEQ ID NO：70是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：8的第二探针。

SEQ ID NO：71是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：9的第一探针。

SEQ ID NO：72是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：9的第二探针。

SEQ ID NO：73是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：10的第一探针。

SEQ ID NO：74是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：10的第二探针。

SEQ ID NO：75是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：11的第一探针。

SEQ ID NO：76是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：11的第二探针。

SEQ ID NO：77是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：12的第一探针。

SEQ ID NO：78是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：12的第二探针。

SEQ ID NO：79是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：13的第一探针。

SEQ ID NO：80是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：13的第二探针。

SEQ ID NO：81是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：14的第一探针。

SEQ ID NO：82是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：14的第二探针。

SEQ ID NO：83是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：15的第一探针。

SEQ ID NO：84是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：15的第二探针。

SEQ ID NO：85是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：16的第一探针。

SEQ ID NO：86是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：16的第二探针。

SEQ ID NO：87是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：17的第一探针。

SEQ ID NO：88是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：17的第二探针。

SEQ ID NO：89是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：18的第一探针。

SEQ ID NO：90是用于检测与降低的α-亚基水平相关的基因组区域SEQ ID NO：18的第二探针。

发明详述

本文提供的定义和方法限定本发明，并指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有说明，应当根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解术语。分子生物学常用术语的定义也可以在以下文献中找到：Alberts等人，Molecular Biology of The Cell，第3版，Garland Publishing，Inc.：New York，1994；Rieger等人，Glossary of Genetics：Classical and Molecular，第5版，Springer-Verlag：New York，1991；和Lewin，Genes IX，Oxford University Press：New York，1994。使用如37CFR§1.822所述的DNA碱基命名法。

本发明提供了包含赋予具有α-亚基水平降低所导致的提高的α’-亚基水平的种子β-伴大豆球蛋白组成的非转基因突变的植物以及用于生产该植物的方法。因此，本发明的植物具有极大的价值，因为提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基水平提供改善的大豆粉和蛋白分离物的营养特征和溶解性。此外，本文提供的植物包括农艺学优良特征，从而实现商业意义的产量。

本发明还提供了包含赋予提高的β-伴大豆球蛋白和降低的大豆球蛋白的非转基因突变的植物以及用于生产该植物的方法。提高的β-伴大豆球蛋白和提高的α’-亚基的表型的组合提高了高度功能性的和健康的β-伴大豆球蛋白α’-亚基的含量。

I.本发明的植物

本发明第一次提供了组合有赋予降低的α-亚基蛋白质含量所导致的提高的α’-亚基含量的非转基因突变的大豆植物及其衍生物。在某些实施方式中，本发明植物的种子的α’-亚基含量可以大于种子总蛋白质的大约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或甚至20％。在其他实施方式中，本发明植物的种子的大豆球蛋白含量可以为种子总蛋白质的大约或低于大约15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0％，本发明植物的种子的β-伴大豆球蛋白含量可以为总蛋白质含量的大约或至少大约34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50％或更高，本发明植物的种子的α’-亚基含量可以为总蛋白质的大约或至少大约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40％。在更进一步的实施方式中，本发明的植物的种子具有包含的α-亚基与α’-亚基的比例为大约1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或甚至0的β-伴大豆球蛋白组成。

因此，本发明的一方面涉及上述植物及其部分和使用这些植物和植物部分的方法。植物部分包括但不限于花粉、胚珠和细胞。本发明进一步提供这些植物的可再生细胞的组织培养物，该培养物再生为能够表达起始品种的所有生理和形态特征的大豆植物。这些可再生细胞可以包括胚、分生组织细胞、花粉、叶、根、根尖或花，或由其衍生的原生质体或愈伤组织。本发明也提供由这种组织培养物再生的大豆植物，其中该植物能够表达作为可再生细胞来源的起始植物品种的所有生理和形态特征。

II.用于产生具有赋予提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基和降低的β-伴大豆球蛋白α-亚基含量的非转基因等位基因的大豆品种的标记辅助选择

本发明描述了生产在种子中具有降低的α-亚基蛋白质含量所导致的提高的α’-亚基蛋白质含量的大豆植物的方法。此外，本发明提供了用于将赋予降低的α-亚基蛋白质含量所导致的提高的β-伴大豆球蛋白α’-亚基含量的非转基因等位基因引入农艺学优良的大豆植物的遗传标记和方法。本发明的某些方面也提供了选择用于培育在种子中具有降低的α-亚基蛋白质含量所导致的提高的α’-亚基蛋白质含量的植物的亲本的方法。一种方法包括针对大豆种子α’-亚基含量筛选种质。另一种方法包括通过针对PI88788的存在搜索那些品种的系谱，鉴定可能携带降低的α-亚基蛋白质含量所导致的提高的α’-亚基性状的品种。因此，本发明第一次允许产生组合有这些赋予提高的α’-亚基种子含量的等位基因与商业意义的产量和农艺学优良遗传背景的植物。使用本发明的方法，例如在具有商业意义的产量和高种子β-伴大豆球蛋白含量的新品种的生产中，赋予降低的α-亚基蛋白质含量所导致的提高的α’-亚基的基因座可以被引入所需的大豆遗传背景。

术语数量性状基因座或QTL用来描述显示对于表型具有数量或加性效应的基因组的区域。α’-亚基基因座代表示例性的QTL，由于多个α’-亚基等位基因导致种子的总α-亚基含量降低和α’-亚基含量重要的伴随提高。本文鉴定出针对导致提高的α’-亚基含量的非转基因、降低的α-亚基等位基因的遗传标记，所述遗传标记使得能够用农艺学优良植物培育包含非转基因、降低的α-亚基等位基因的大豆植物，并选择出遗传了降低的α-亚基的等位基因的后代。因此，本发明允许使用分子工具以将这些QTL与需要的农艺学性状组合。

在本发明中，具有降低的α-亚基蛋白质含量所导致的提高的α’-亚基蛋白质含量的基因座位于染色体I上。用于监测基因座渗入的SNP标记包含那些选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18的序列。使用如SEQ ID NO：55至90所示的探针和如SEQ ID NO：19至54所示的引物，可以扩增示例性的基因座SNP标记DNA序列(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18)。

本发明还提供了包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18及其互补序列的核酸分子的大豆植物。本发明还提供了包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18、其片段和二者的互补序列的核酸分子的大豆植物。本发明还提供了包含选自SEQ ID NO：19至SEQ ID NO：90、其片段和二者的互补序列的核酸分子的大豆植物。一方面，大豆植物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18及其互补序列的核酸分子。另一方面，大豆植物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18、其片段和二者的互补序列的核酸分子。进一步的方面，大豆植物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个选自SEQ ID NO：19至SEQ ID NO：90、其片段和二者的互补序列的核酸分子。

本发明还提供了包含基因座的大豆植物，其中，在其一个或多个基因座的一个或多个等位基因选自等位基因1、等位基因2、等位基因3、等位基因4、等位基因5、等位基因6、等位基因7、等位基因8、等位基因9、等位基因10、等位基因11、等位基因12、等位基因13、等位基因14、等位基因15、等位基因16、等位基因17或等位基因18。这种等位基因可能是纯合的或杂合的。

可以在培养基中培养和再生本发明的植物或其部分。从各种组织类型再生大豆植物的方法和大豆的组织培养方法是本领域已知的(参见，例如，Widholm等人，In Vitro Selection and Culture-induced Variation in Soybean，In Soybean：Genetics，Molecular Biology and Biotechnology，Verma和Shoemaker编，CAB International，Wallingford，Oxon，England(1996))。如大豆的植物的再生技术可以使用多种组织或细胞类型作为起始原料。尤其是对于大豆，已经开发了再生方法，其开始于某些分化的组织类型，诸如，分生组织(Cartha等人，Can.J.Bot.59：1671-1679(1981))、下胚轴节(Cameya等人，Plant Science Letters 21：289-294(1981))和茎节点段(Saka等人，Plant Science Letters，19：193-201(1980)；Cheng等人，Plant Science Letters，19：91-99(1980))。已报道了由未成熟大豆胚的外植体产生的体细胞胚再生完整的性成熟的大豆植物(Ranch等人，In Vitro Cellular & Developmental Biology 21：653-658(1985))。也已报道了通过器官发生和胚发生从组织培养物再生成熟大豆植物(Barwale等人，Planta 167：473-481(1986)；Wright等人，Plant Cell Reports 5：150-154(1986))。

本发明还通过筛选大豆植物的种子蛋白质含量，提供了在所选种子中具有提高的α’-亚基蛋白质含量的植物，所述选择包括对基因组核酸探询标记分子的存在，该标记分子遗传连锁到与大豆植物种子中提高的α’-亚基蛋白质含量相关的QTL的等位基因，其中QTL的等位基因也位于与种子中提高的α’-亚基蛋白质含量相关的连锁群上。

一种将等位基因渗入大豆植物的方法，包括：(A)杂交包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18的核酸分子的至少第一大豆植物与至少一种第二大豆植物，以形成分离群体；(B)用一种或多种核酸标记筛选该分离群体，以确定来自该分离群体的一种或多种大豆植物是否含有该核酸分子；和(C)从该分离群体选择一种或多种包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18的核酸分子的大豆植物。

本发明还包括将等位基因渗入大豆植物的方法，包括：(A)杂交至少一种在种子中具有降低的α’-亚基蛋白质含量所导致的提高的α’-亚基蛋白质含量的大豆植物与至少第二大豆植物，以形成分离群体；(B)用一种或多种核酸标记筛选该分离群体，以确定来自分离群体的一种或多种大豆植物是否含有与种子中降低的α’-亚基蛋白质含量所导致的提高的α’-亚基蛋白质含量相关的等位基因。

本发明包括分离的核酸分子。这些分子包括那些能够检测与种子基因座中降低的α-亚基蛋白质含量所导致的提高的α’-亚基含量遗传或物理连锁的多态性的核酸分子。这种分子可以被称为标记。可以通过现有技术获得与种子基因座中降低的α-亚基蛋白质含量所导致的提高的α’-亚基含量连锁的另外的标记。一方面，核酸分子能够检测是否存在位于距离基因座小于30、20、10、5、2或1厘摩(centimorgan)的标记。另一方面，标记显示使用Qgene版本2.23(1996)和默认参数测量的为2或更大、3或更大、或4或更大的LOD得分。另一方面，核酸分子能够检测基因座中的标记。进一步的一方面，核酸分子选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：90、其片段、其互补序列及能够特异性地与这些核酸分子中的一种或多种杂交的核酸分子。

在优选的一方面，本发明的核酸分子包括那些在中度严格条件(例如，大约2.0x SSC和大约65℃)下特异性地与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：90所示的一种或多种核酸分子或其互补序列或其中任一个的片段杂交的核酸分子。在特别优选的一方面，本发明的核酸在高严格条件下特异性地与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：90所示的一种或多种核酸分子或其互补序列或其中任一个的片段杂交。在本发明的一方面，本发明的优选的标记核酸分子具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：90所示的核酸序列或其互补序列或其中任一个的片段。在本发明的另一方面，本发明的优选的标记核酸分子与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：90所示的核酸序列或其互补序列或其中任一个的片段共有80％-100％或90％-100％的序列同一性。在本发明的进一步的一方面，本发明的优选的标记核酸分子与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：90所示的核酸序列或其互补序列或其中任一个的片段共有95％-100％的序列同一性。在本发明的更优选的一方面，本发明的优选的标记核酸分子与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：90所示的核酸序列或其互补序列或其中任一个的片段共有98％-100％的序列同一性。

核酸分子或其片段在某些情况下能够特异性地与其他核酸分子杂交。如本文所用，如果两个核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，那么这两个分子能够特异性地彼此杂交。如果一核酸分子与另一核酸分子表现出完全的互补性，那么它们“互补”。如本文所用，当一个分子的每个核苷酸都与另一分子的核苷酸互补时，这两个分子显示“完全互补性”。如果两个分子在至少常规的“低严格”的条件下能互相杂交，具有足够的稳定性，从而允许它们保持彼此退火，那么这两个分子是“最低限度互补的”。类似地，如果两个分子在常规的“高严格”的条件下能互相杂交，具有足够的稳定性，从而允许它们保持彼此退火，那么这两个分子是“互补的”。Sambrook等人，In：Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)与Haymes等人，In：Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，DC(1985)描述了常规的严格条件。因而偏离完全互补性是允许的，只要这种偏离没有完全消除该分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子作为引物或探针，只需要在序列上充分互补，以在所采用的特定的溶剂和盐浓度下能够形成稳定的双链结构。

如本文所用，基本上同源的序列是在高严格条件下与所比较的核酸序列的互补序列特异性杂交的核酸序列。本发明的核酸探针和引物可以在严格条件下与靶DNA序列杂交。术语“严格的杂交条件”是指在该条件下，探针或引物特异性地与靶序列杂交且不与非靶序列杂交，这可以根据经验确定。术语“严格的条件”是由如下内容功能限定的：通过Sambrook等人，1989的9.52-9.55所述的具体的杂交程序，核酸探针与靶核酸(即，与感兴趣的特定核酸序列)的杂交。也参见Sambrook等人，1989的9.47-9.52，9.56-9.58；Kanehisa 1984 Nucl.Acids Res.12：203-213；Wetmur等人1968 J.Mol.Biol.31：349-370。促进DNA杂交的合适的严格条件是，例如，大约45℃、6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着50℃、2.0x SSC洗涤，这是本领域的技术人员已知的，或可以在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从大约2.0x SSC、50℃的低严格条件到大约0.2x SSC、50℃的高严格条件中选择。另外，洗涤步骤中的温度可以从低严格条件的室温大约22℃提高到高严格条件的大约65℃。温度和盐都可以变化，或者，温度或盐浓度可以保持不变，而另一个变量发生变化。

例如，可以在高严格条件下，在65℃和6x SSC、0.5％SDS、5x Denhardt’s、100μg/mL非特异性DNA(例如，超声处理的鲑精DNA)下利用DNA或RNA探针或引物进行杂交，并用0.5x SSC、0.5％SDS在65℃下洗涤。

本发明考虑：如果保持探针或引物与靶序列结合的特异性，可以使用如较低的杂交温度和/或洗涤温度的较低严格杂交条件，来确认具有较低的序列相似性的相关的序列。因此，本发明的核苷酸序列可以用于选择性地与DNA、RNA或cDNA片段的互补延伸形成双链分子的能力。

核酸分子片段可以是任何大小的片段，且示例性的片段包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：90所示的核酸序列及其互补序列的片段。一方面，片段可以是15-25、15-30、15-40、15-50、15-100、20-25、20-30、20-40、20-50、20-100、25-30、25-40、25-50、25-100、30-40、30-50及30-100。另一方面，片段可以是大于10、15、20、25、30、35、40、50、100或250个核苷酸。

另外的遗传标记可以用来选择具有与本发明大豆植物种子中的降低的α-亚基含量所导致的提高的α’-亚基含量相关的QTL的等位基因的植物。公共标记数据库的例子包括，例如，Soybase，美国农业部的农业研究局(Agricultural Research Service，United States Department of Agriculture)。

本发明的遗传标记包括“显性”或“共显性”标记。“共显性标记”揭示两个或多个等位基因的存在(每个二倍体个体中有两个)。“显性标记”揭示只存在一个等位基因。显性标记表型(例如，DNA带)的存在表明在纯合或杂合条件下存在一个等位基因。不存在显性标记表型(例如，不存在DNA带)仅能证明存在“某些其他”不明确的等位基因。在群体中的个体主要是纯合的且基因座主要是二态性(dimorphic)的情况下，显性和共显性标记可能具有同样的价值。随着群体变得越来越杂合和多等位基因化的(multiallelic)，共显性标记往往比显性标记提供更多的基因型信息。

在另一种实施方式中，可以利用以下各种标记，诸如单序列重复标记(SSR)、AFLP标记、RFLP标记、RAPD标记、表型标记、同工酶标记、单核苷酸多态性(SNP)、插入或缺失(Indel)、单特征多态性(SFP，例如，如Borevitz等人2003 Gen.Res.13：513-523所述)、微阵列转录分布(microarray transcription profile)、DNA衍生的序列和RNA衍生的序列，它们与本发明的QTL的等位基因遗传连锁或相关。

在一种实施方式中，对于遗传多态性存在与否的基于核酸的分析可以用于在培育群体中选择种子。用于遗传多态性分析的各种遗传标记对于本领域的技术人员来说是可用且已知的。该分析可以用于选择包含遗传标记或与之连接的基因、QTL、等位基因或基因组区域(单倍型)。

在本文中，核酸分析方法是本领域已知的，包括但不限于：基于PCR的检测方法(例如，TaqMan分析)、微阵列方法和核酸测序方法。在一种实施方式中，可以通过使用核酸扩增方法促进DNA、RNA或cDNA样品中的多态性位点的检测。这些方法特异性地提高跨越多态性位点或包含位于其远端或近端的位点和序列的多核苷酸的浓度。这些扩增的分子可以通过凝胶电泳、荧光检测方法或其他方法很容易地检测。

实现这种扩增的方法采用聚合酶链反应(PCR)(Mullis等人1986 Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263-273；欧洲专利50,424；欧洲专利84,796；欧洲专利258,017；欧洲专利237,362；欧洲专利201,184；美国专利4,683,202；美国专利4,582,788；和美国专利4,683,194)，该方法使用能够与以其双链形式限定多态性的近端序列杂交的引物对。

通过本领域熟知的各种有效方法可以检测DNA序列多态性或对其进行分型，包括但不限于那些在美国专利5,468,613和5,217,863、5,210,015、5,876,930、6,030,787、6,004,744、6,013,431、5,595,890、5,762,876、5,945,283、5,468,613、6,090,558、5,800,944和5,616,464中公开的方法，本文完整引入这些专利作为参考。然而，本发明的组合物和方法可以与任何多态性分型方法结合使用，以对大豆基因组DNA样品中的多态性进行分型。所用的这些大豆基因组DNA样品包括但不限于直接从大豆植物分离出的大豆基因组DNA、克隆的大豆基因组DNA或扩增的大豆基因组DNA。

例如，如美国专利5,468,613和5,217,863所公开的，通过与等位基因特异性的寡核苷酸(ASO)探针杂交可以检测DNA序列的多态性。美国专利5,468,613公开了等位基因特异性的寡核苷酸的杂交，其中，在核酸中通过以下程序可以检测核酸序列中的一个或多个核苷酸的变异，其中，扩增含有核苷酸变异的序列，点样到膜上，并用标记的序列特异性寡核苷酸探针进行处理。

也可以通过美国专利5,800,944公开的探针连接方法检测靶核酸序列，其中，扩增感兴趣的序列，并将其与探针杂交，接着通过连接以检测探针的标记的部分。

微阵列也可用于多态性检测，其中，以重叠的方式组装寡核苷酸探针组以代表单一序列，这样，在靶序列一个点上的差异会导致部分探针杂交(Borevitz等人，Genome Res.13：513-523(2003)；Cui等人，Bioinformatics 21：3852-3858(2005))。在任何一个微阵列上，预计会有多个靶序列，其可以代表基因和/或非编码区，其中每个靶序列由一系列重叠的寡核苷酸，而不是由单个探针所代表。该平台提供高通量筛选多种多态性。单特征多态性(SFP)是通过寡核苷酸阵列中的单个探针检测的多态性，其中，特征是阵列中的探针。美国专利6,799,122、6,913,879和6,996,476公开了通过基于微阵列的方法对靶序列分型。

也可以通过美国专利5,616,464公开的探针连接方法检测靶核酸序列，该方法采用至少一对探针，该探针具有与靶核酸序列的相邻部分同源的序列且具有侧链，所述侧链在所述探针与所述靶核酸序列碱基配对时非共价结合以形成茎。至少一个侧链具有光可活化的基团，该基团可以与茎的其他侧链元件形成共价交联。

检测SNP和Indel的其他方法包括单碱基延伸(SBE)方法。SBE方法的例子包括但不仅限于：那些在美国专利6,004,744、6,013,431、5,595,890、5,762,876和5,945,283中公开的方法。SBE方法基于核苷酸引物的延伸，该引物邻近多态性以在引物延伸后掺入可检测的核苷酸残基。在某些实施方式中，SBE合成方法使用三种合成的寡核苷酸。其中两种寡核苷酸作为PCR引物，且与位于含有待测多态性的区域两侧的大豆基因组DNA的基因座序列互补。在对含有多态性的大豆基因组区域扩增后，PCR产物与第三寡核苷酸(称为延伸引物)混合，所述第三寡核苷酸设计用来在DNA聚合酶和两种差异标记的双脱氧核苷三磷酸的存在下，与邻近多态性的扩增的DNA杂交。如果模板上存在多态性，可以在单碱基链延伸中将标记的双脱氧核苷三磷酸中的一个添加到引物中。然后通过确定两个差异标记中的哪一个添加到延伸引物中推断存在的等位基因。纯合的样品将导致两个标记的碱基中只有一个被掺入，因此两个标记中只有一个被检测到。杂合的样品存在两个等位基因，因此直接掺入两个标记(进入延伸引物中的不同的分子)，因此这两个标记都被检测到。

在一种优选的检测多态性的方法中，可以通过美国专利5,210,015、5,876,930和6,030,787中公开的方法检测SNP和Indel，其中，寡核苷酸探针具有与探针的5’和3’末端共价连接的5’荧光报告染料和3’淬灭染料。当探针完整时，报告染料接近淬灭染料导致报告染料荧光被抑制，例如通过福斯特型能量转移(Forster-type energy transfer)。在PCR正向和反向引物与位于多态性两侧的靶DNA的特定序列杂交过程中，杂交探针与位于扩增的PCR产物中的含有多态性的序列杂交。在随后的PCR循环中，具有5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶切开探针，并分离报告染料与淬灭染料，导致报告染料的荧光增强。

为了QTL作图，包括的标记应当是来源诊断性的，以对随后的群体作出推断。SNP标记对于作图是理想的，因为特定的SNP等位基因源自特定物种的现存群体中的独立来源的可能性较低。因此，SNP标记可用于示踪和协助QTL的渗入，特别是在单倍型的情况下。

可以通过基因作图模型建立另外的标记分子的遗传连锁，所述基因作图模型例如，但不限于，Lander等人报道的侧翼标记模型(Lander等人，Genetics，121：185-199(1989))，和区间作图(interval mapping)，其基于其中所述的最大似然法，并用软件包MAPMAKER/QTL执行(Lincoln和Lander，Mapping Genes Controlling Quantitative Traits Using MAPMAKER/QTL，Whitehead Institute for Biomedical Research，Massachusetts，(1990))。另外的软件包括Qgene，Version 2.23(1996)，Department of Plant Breeding and Biometry，266 Emerson Hall，Cornell University，Ithaca，NY。使用Qgene软件是一种特别优选的方法。

对于标记的存在，计算最大似然估计值(MLE)，以及假设没有QTL效应的MLE，以避免假阳性。然后计算优势率(odds ratio)的log₁₀(LOD)：LOD＝log₁₀(假定没有相关的QTL，对于QTL/MLE的存在的MLE)。LOD得分基本上指示，假定存在QTL，相对于不存在QTL，获得数据的可能性增大多少。为了避免比如95％的给定置信度时的假阳性的LOD阈值取决于标记的数量和基因组的长度。Lander等人(1989)描述了显示LOD阈值的曲线图，且Arús和Moreno-González，Plant Breeding，Hayward，Bosemark，Romagosa(编)Chapman & Hall，London，第314-331页(1993)进一步对其描述。

可以使用另外的模型。已经报导了对于区间作图的许多修改和可供选择的方法，包括使用非参数法(Kruglyak等人，1995 Genetics，139：1421-1428)。也可以使用多元回归方法或模型，其中，在大量标记上对性状进行回归(Jansen，Biometrics in Plant Breed，van Oijen，Jansen(编辑)Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding，The Netherlands，第116-124页(1994)；Weber和Wricke，Advances in Plant Breeding，Blackwell，Berlin，16(1994))。Jansen等人(Jansen等人，1994 Genetics，136：1447-1455)和Zeng(Zeng 1994Genetics 136：1457-1468)报道了组合了区间作图与回归分析的程序，由此将表型回归到给定的标记区间的单个假定的QTL上，且同时回归到作为’辅助因素’的标记数量上。一般来说，辅助因素的使用减少了估计的QTL位置的偏差和抽样误差(Utz和Melchinger，Biometrics in Plant Breeding，van Oijen，Jansen(编)Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding，The Netherlands，第195-204页(1994))，从而提高QTL作图的精度和效率(Zeng 1994)。这些模型可以扩展到多环境实验，以分析基因型-环境的相互作用(Jansen等人，1995 Theor.Appl.Genet.91：33-3)。

合适的作图群体的选择对于图谱的构建是重要的。合适的作图群体的选择取决于所用的标记系统的类型(Tanksley等人，Molecular mapping in plant chromosomes.chromosome structure and function：Impact of new concepts J.P.Gustafson和R.Appels(编).Plenum Press，New York，第157-173页(1988))。必须考虑在作图群体中所用的亲本的来源(适应的相对于外来的)。染色体配对和重组率在远缘杂交(适应的x外来的)中会受到严重干扰(抑制)，且一般产生大大降低的连锁距离。当与近缘杂交(适应的x适合的)的后代相比，远缘杂交通常会提供具有相对较大的多态性阵列的分离群体。

标记辅助渗入包括将由一种或多种标记定义的染色体区域从一种种质转移到另一种种质。该方法中的初始步骤是通过基因作图的性状的定位，这是通过连锁分析确定一个基因相对于其他基因和遗传标记的位置的方法。连锁作图的基本原则是，两个基因在染色体上越接近，它们就越有可能被一起遗传。简单地说，杂交一般是在两个遗传兼容但相对于研究的性状不同的亲本之间进行。遗传标记然后可以被用来追踪在杂交后代(经常是回交(BC1)、F₂或重组近交系群体)中研究性状的分离。

A.连锁遗传标记的开发和使用

根据遗传的遗传标记，可以对第一植物群体样品基因分型，以形成基因型数据库。如本文所用，术语“遗传的遗传标记”是单一基因座处的等位基因。基因座是染色体上的位置，而且等位基因是指基因条件；也就是说，在这些基因座处的不同的核苷酸序列。每个基因座处的标记等位基因组成可以是纯合或杂合的。为了从杂交中获得遗传标记的信息，该标记必须是多态性的；也就是说，它必须以不同的形式存在，使得通过它也携带的标记的形式，携带突变基因的染色体可以与具有正常基因的染色体区别。

表型数据库的形成可以通过以下来完成：直接观察源自植物样品的人工或自然自花授粉的后代的一种或多种性状，或定量评估植物样品的配合力(combining ability)。例如，一种植物系可以与或被一种或多种测试系杂交。测试系可以是近交系、单交、双交或多交的杂种，或通过控制的或自由的杂交产生或维持的植物的任何其他集合，或其任何组合。对于一些自花授粉植物，优选没有后代测试的直接评估。

可以在测交一代和作图的标记基因座中确定标记基因型。为了通过连锁方法对特定性状作图，有必要建立特定染色体基因座的遗传与该性状的遗传之间的正相关。在复杂遗传性(诸如数量性状，具体包括α-亚基含量和产量)的情况下，连锁一般会更加难以辨别。在这种情况下，可能需要统计程序以建立表型和基因型之间的相关性。这可能进一步使得检查来自特定杂交的许多后代成为必要，因为单独的基因座可能对于整体表型贡献较小。

特定性状和标记的共同遗传(coinheritance)或遗传连锁表明它们在染色体上物理地紧密接近。通过分析杂交中的基因和标记的遗传模式确定连锁。遗传图距单位是厘摩(cM)，随重组的增加而提高。如果两个标记在减数分裂中每大约100次必须进行的重组机会中发生一次重组，则它们是距离1厘摩。厘摩是遗传学量度标准，不是物理学的。那些位于距离第二基因座小于50cM的标记据说是遗传连锁的，因为它们不是相互独立遗传的。因此，在每代基因座之间观察的重组百分率低于50％。在本发明特定的实施方式中，所用的标记可以被定义为位于距离基因座小于大约45、35、25、15、10、5、4、3、2或1或更小的cM。

减数分裂过程中，同源染色体对集合并且在称为重组的过程中交换片段。标记越是来自基因，基因和标记之间存在重组的几率越大。在连锁分析中，在特定的杂交中，接着进行标记和基因或性状的共同遗传。计算以下概率：它们观察到的遗传模式可能会偶然单独发生，也就是说，它们完全不关联。然后假定存在特定程度的连锁，进行重复计算，并确定两个概率之比(没有连锁相对于特定程度的连锁)。这个比率表示连锁程度的优势率，而且由于使用比例的对数，已知它为优势率的对数，例如lod得分。例如，通过等于或大于3的lod得分可以确认，基因和标记为连锁的。这代表两个基因座连锁的1000∶1的优势率。通过使用统计分析应用程序(statistical analysis employing program)，大大方便了连锁计算。

可以通过基因作图模型建立标记分子的遗传连锁，所述基因作图模型例如但不限于，Lander和Botstein(1989)报道的侧翼标记模型，和区间作图(interval mapping)，其基于Lander和Botstein(1989)所述的最大似然法，并用软件包MAPMAKER/QTL执行。另外的软件包括Qgene，Version 2.23(1996)(Department of Plant Breeding and Biometry，266 Emerson Hall，Cornell University，Ithaca，NY)。

B.遗传的标记

遗传标记包括在由两种或多种植物携带的遗传信息中检测到的差异(多态性)。用遗传标记的基因座遗传作图通常需要两个基本成分：可检测的多态性等位基因及这些等位基因的重组或分离。在植物中，测量的重组实质上总是减数分裂的，因此，植物基因作图的两个内在需求是多态性遗传标记和一种或多种其中这些等位基因是分离的植物。

标记优选以共显性方式遗传，使得两个等位基因在二倍体基因座中的存在是很容易察觉，而且它们不受环境变化影响，即它们的遗传性为1。标记基因型通常在二倍体生物体诸如大豆中的每个基因座处包括两个标记等位基因。每个基因座处的标记等位基因组成可以是纯合或杂合的。纯合性是一种情形，其中一个基因座处的两个等位基因的特征是相同的核苷酸序列。杂合性是指一个基因座处的基因不同的情形。

许多不同的标记类型可以用于遗传作图。本发明所用的示例性的遗传标记包括但不限于，限制性片段长度多态性(RFLP)、简单序列长度多态性(SSLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)、核苷酸插入和/或缺失(INDEL)和同工酶。可以以多种方式分析包含尽可能少的单核苷酸变化的多态性。例如，检测可以通过电泳技术来进行，所述电泳技术包括单链构象多态性(Orita等人，1989)、变性梯度凝胶电泳(Myers等人，1985)或裂解片段长度多态性(Life Technologies，Inc.，Gathersberg，MD 20877)，但DNA测序机的普及往往使得对于只是序列扩增产物的直接检测更容易。一旦已知多态序列的差异，快速检测可以被设计用于后代测定，通常包括一些版本的特定等位基因的PCR扩增(PASA，Sommer，等人，1992)，或多个特定等位基因的PCR扩增(PAMSA，Dutton和Sommer，1991)。分析可以用来选择包括或连接遗传标记的基因、QTL、等位基因或基因组区域(单倍型)。

核酸分析方法是本领域的技术人员已知的，包括但不限于，基于PCR的检测方法(例如，TaqMan分析)、微阵列方法和核酸测序方法。通过使用核酸扩增方法可以促进在DNA、RNA或cDNA样品中检测多态性位点。

如Livak等人，1995和美国专利5,604,099所述(通过参考引入本文)，一种用于检测DNA、RNA和cDNA样品中的SNP的方法是使用PCR结合对于多态性的荧光探针。这种方法特别提高了跨越多态性位点或包括该位点和位于其远端或近端的序列的多核苷酸的浓度。可以通过凝胶电泳、荧光检测方法或其他方法很容易地检测这种扩增的分子。简单地说，合成寡核苷酸探针，其中一个与SNP位点退火，另一个与野生型序列退火。优选SNP位点在探针寡核苷酸的5’末端附近。然后在3’末端用分别降低背景荧光和降低寡核苷酸的T_m的非荧光猝灭剂和小沟结合部分标记每个探针。用不同的荧光染料标记每个探针的5’末端，其中荧光取决于从探针切割的染料。这种染料的一些非限制的例子包括VIC^TM和6-FAM^TM。使用具有5’-3’外切酶活性的聚合酶和侧翼引物，然后对怀疑包含特定SNP的DNA进行PCR。在两种寡核苷酸探针都存在的情况下，进行PCR。如果探针结合测试DNA中的互补序列，那么聚合酶的外切酶活性释放激活其荧光活性的荧光标记。因此，只含有野生型序列的测试DNA显示与野生型探针的标记相关的荧光。另一方面，只包含SNP序列的DNA具有来自SNP探针的标记的荧光活性。然而，在DNA来自异源的情况下，观察到两个标记的显著的荧光。这种在已知的SNP位点间接基因分型的类型使得能够高通量、廉价筛选DNA样品。因此，这种系统对于鉴定包含α’-亚基等位基因的后代大豆植物是理想的。

限制性片段长度多态性(RFLP)是通过DNA片段长度可检测的遗传差异，通常经过限制性内切酶消化DNA后由琼脂糖凝胶电泳显示。存在大量可用的、以其核苷酸切割位点及其来源为特征的限制性内切酶，例如EcoRI。RFLP源自限制性位点序列内的单bp多态性和特定的限制片段内的可测量的插入或缺失。RFLP的生成容易且相对便宜(需要克隆的DNA，但不需要测序)，且是共显性的。RFLP在分型阶段具有劳动密集的缺点，尽管这可以通过同时进行多项任务和再利用印迹而在一定程度上缓解。大多数RFLP为双等位基因的，且比微卫星具有较低的多态性含量。基于这些原因，RFLP在植物遗传图谱的使用已减弱。

本领域的技术人员会认识到，许多类型的分子标记用作监测遗传性的工具，并不限于利用RFLP、SSR和SNP，且本领域的技术人员也明白，多种检测方法可能会被用来跟踪各种分子标记。本领域的技术人员也认识到，不同类型的标记可以用于作图，特别是随着技术的发展和用于鉴定的新型标记和方法的确定。

为方便起见，遗传标记基因型可以被转换成数字得分，例如，如果使用特定的酶，在特定基因座处存在两种形式的分别命名为A和B的SNP或其他标记，那么二倍体互补物可以转换为数字得分，例如，AA＝2，AB＝1，和BB＝0；或AA＝1，AB＝0和BB＝-1。这些得分的绝对值并不重要。重要的是数字表示的附加性质。上述得分涉及共显性标记。可以得到类似的与显性标记一致的评分系统。

C.标记辅助选择

本发明提供了具有提高的β-伴大豆球蛋白含量以及商业意义的产量和农艺学优良特征的大豆植物。根据本发明，可以通过标记辅助选择方法产生这样的植物，所述方法包括分析基因组DNA是否存在与非转基因、α-亚基等位基因1至等位基因18(包括其所有可能的组合)遗传连锁的标记。

在本发明的某些实施方式中，可能需要获得与α-亚基等位基因连锁的其他标记。这可以通过以下方法进行，例如，首先通过自交由杂交近交品种产生的F₁杂种来制备F₂群体，所述近交品种中只有一个包含赋予降低的α-亚基含量所导致的提高的α’-亚基含量的α-亚基等位基因。重组近交系(RIL)(遗传相关的系，通常是＞F₅，从继续自交的F₂系向纯合性发展)然后被制备，并可以作为作图群体使用。通过使用RIL可以将从显性标记获得的信息最大化，因为所有的基因座都是纯合的或接近纯合的。

携带之前不存在的性状的回交群体(例如，通过需要的品种(轮回亲本)和另一品种(供体亲本)之间杂交产生的)也可以作为作图群体来使用。可以与轮回亲本进行一系列回交，以恢复大部分其需要的性状。因此，产生由个体组成的群体，该个体与轮回亲本类似，但每个个体携带不同量的来自供体亲本的基因组区域。如果轮回亲本中的所有基因座都是纯合的，且供体亲本和轮回亲本具有截然不同的多态性标记等位基因，回交群体可以用于对显性标记作图(Reiter等人(1992))。

用于作图目的的有用的群体是近等基因系(NIL)。通过多次回交产生NIL，以产生除了需要的性状或基因组区域之外在遗传组成上几乎相同的个体阵列，它们可用作作图群体。在用NIL作图时，预计仅有一部分多态性基因座定位于选定的区域。也可以对转化的植物系进行作图。

D.植物育种方法

本发明的某些方面也提供了标记辅助培育植物的方法，其能够将非转基因α-亚基等位基因引入异源大豆遗传背景中。通常，育种技术利用植物的授粉方法。有两种常用的授粉方法：如果来自一朵花的花粉被转移到同一植物的相同或另一花上时发生的自花授粉，和如果花粉来自不同植物上的花时发生的异花授粉。已经自花授粉并且经过多代类型选择的植物在几乎全部基因座处成为纯合的，并且产生真正育种后代、纯合植物的均一群体。

在合适的品种的开发中，可以使用谱系育种。针对特定性状的谱系育种方法包括杂交两个基因型。每个基因型可以具有一种或多种希望的特征，而该特征在另一基因型中缺乏；或者，每个基因型可以与另一个互补。如果两个原始亲本基因型不提供所有希望的特征，其他基因型可以被包括在育种群体中。作为这些杂交的产物的优良植物进行自交，并且在每一连续世代中再次改良。作为自花授粉和选择的结果，每一随后的世代成为更纯合的。这种育种方法一般包括五代或更多代的自交和选择：S₁→S₂；S₂→S₃；S₃→S₄；S₄→S₅，等等。自交代(S)可以被认为是子代(F)的一种，并且可以被称为F。在至少五代后，近交植物被认为是遗传学上纯的。

每个育种计划应当包括对育种程序效率的定期的、客观的评价。评价标准根据目标和对象而不同。全面测试有希望的选出的育种系，并且在代表商业目标地区的环境中与合适的标准进行通常三年或更长的比较。遗传学上优良的个体的鉴别是困难的，因为基因型值可以被混杂的植物性状或环境因素所掩盖。一种鉴别优良植物的方法是观察其相对于其他实验植物和一种或多种广泛种植的标准品种的表现。单次观察可能是非结论性的，而重复观察提供对遗传价值的更好的评估。

混合选择(mass selection)和轮回选择可以用来改良自花授粉或异花授粉作物的群体。杂合个体的遗传变异性群体通过几个不同亲本的互交来鉴别或产生。基于个体优势、突出的后代或出色的组合能力来选择最佳的植物。将选择的植物互交，以产生新群体，在该新群体中继续进一步的选择循环。其他常用于不同性状和作物的育种方法的描述可见于几本参考书之一中(例如，Allard，1960；Simmonds，1979；Simmonds，1979；Sneep等人，1979；Fehr，1987a，b)。

在育种程序中选择具有感兴趣的性状(例如，高产量、抗病性、脂肪酸分布)的基因型的有效性将取决于：1)群体中个体植物的目标性状的变异性是遗传因素的结果并且因此传递给选择的基因型的后代的程度；和2)植物之间目标性状的变异性有多少是由于不同基因型的生长环境。性状的遗传是从被一个其表达不受环境影响的主要基因控制(即质量性状)到被其效应受环境很大影响的许多基因控制(即数量性状)。对于数量性状诸如产量的育种进一步通过以下事实来表征：1)每个基因的效应引起的差异较小，使得难以或不可能单独地鉴别它们；2)对性状有贡献的基因的数量较多，使得即使获得也很少获得不同的分离比；和3)基因的效应可以基于环境变化以不同方式表达。因此，具有目标性状的超亲分离子(transgressive segregate)或优良基因型的准确鉴别极其困难，其成功依赖于植物育种者使影响群体中数量性状表达的环境变化最小化的能力。

随着组合为一个基因型的性状数量的增高，鉴别超亲分离子的可能性大大降低。例如，如果在三个复合性状诸如产量、α’-亚基含量和至少第一农艺学性状中不同的栽培种之间进行杂交，不使用分子工具极难以通过重组将三个性状中每一个的最大数量的有利基因同时恢复到一个基因型中。因此，所有育种者通常可能希望的是，除了选择的基因以外，还获得第一复合性状的有利基因分类与第二性状的有利基因分类组合为一个基因型。

回交是一种有效的转移希望的特定性状的方法。这可以如下实现，例如：首先将优良近交品种(A)(轮回亲本)与携带所述性状的合适的基因的供体近交系(非轮回亲本)杂交(Fehr，1987)。这种杂交的后代然后与优良轮回亲本(A)回交，然后针对将要从非轮回亲本转移的希望的性状在得到的后代中进行选择。这种选择可以基于如下所述的遗传分析，或可以基于后代植物的表型。在进行五代或更多代的回交来选择希望的性状后，后代对于控制所转移的特征的基因座而言是杂合的，但是在大多数或几乎全部其他基因方面类似于优良亲本。最后一代的回交是自交或者同胞杂交(sibbed)，产生对于所转移的基因(例如给植物提供降低的种子大豆球蛋白含量的基因座)而言为纯的育种后代。

在本发明的一个实施方式中，回交转换过程可以定义为包括以下步骤的过程：

(a)使含有一种或多种理想基因、DNA序列或元件诸如与提高的种子α-亚基含量相关的α-亚基的等位基因1至α-亚基的等位基因18的第一基因型植物与缺乏所述理想基因、DNA序列或元件的第二基因型植物杂交；

(b)选择一种或多种含有理想基因、DNA序列或元件的后代植物；

(c)使所述后代植物与第二基因型植物杂交；和

(d)重复步骤(b)和(c)，以将所述理想基因、DNA序列或元件从第一基因型植物转移到第二基因型植物中。

特定DNA元件或元件的集合向植物基因型中的渗入被定义为回交转换过程的结果。已经渗入DNA序列的植物基因型可以被称为回交转换的基因型、系、近交系或杂种。类似地，缺乏理想的DNA序列的植物基因型可以被称为非转换基因型、系、近交系或杂种。在育种过程中，与降低的α-亚基含量所导致的提高的α’-亚基含量连锁的遗传标记可以被用来帮助以生产具有提高的α’-亚基含量的大豆植物为目标的育种。回交和标记辅助选择尤其可以用于本发明，以通过转换具有有关的非转基因α’-亚基等位基因1至等位基因18的品种，将本发明的提高的α’-亚基含量性状引入任何品种中。

对于成功的回交程序而言，合适的轮回亲本的选择是一个重要的步骤。回交方案的目标是改变或置换原近交系中的性状或特征。为了实现这一点，将轮回近交系的一种或多种基因座修饰或替换为来自非轮回亲本的理想的基因，而保留原近交系的基本上其余全部理想的遗传学组成，因此保留其理想的生理和形态学组成。特定非轮回亲本的选择取决于回交的目标，在本发明的情况下可以是添加一种或多种赋予提高的α’-亚基含量的等位基因。精确回交方案取决于经过改变以确定合适的测试方案的特征或性状。尽管当被转移的特征是显性等位基因时简化了回交方法，但隐性等位基因也可以被转移。在这种情况下，可能必需引入后代测试，以确定理想的特征是否已经被成功转移。在本发明的情况下，可以测试在回交程序中产生的后代系的大豆球蛋白含量，例如通过SDS-PAGE/考马斯染色，以及使用本文所述的标记系统，以选择基于标记而不是视觉性状的系。

大豆植物(Glycine max L.)可以通过自然或机械技术杂交(参见，例如，Fehr，In：Hybridization of Crop Plants，Fehr and Hadley(编)，Am.Soc.Agron.and Crop Sci.Soc.Am.，Madison，WI，90-599(1980))。自然授粉在大豆中通过自花授粉或自然异花授粉发生，这一般由传粉生物辅助。在自然或人工杂交中，开花和开花时间是重要的考虑因素。大豆是短日照植物，但是对光周期的敏感性存在显著的遗传变异(Hamner，1969；Criswell和Hume，1972)。开花的临界昼长范围是从适应热带纬度的基因型的大约13小时到在较高纬度生长的光周期不敏感性基因型的24小时(Shibles等人，1975)。大豆在出苗后9天似乎对昼长不敏感。短于临界昼长的光周期需要7-26天，以完成开花诱导(Borthwick和Parker，1938；Shanmugasundaram和Tsou，1978)。

使用或者不使用雌花去雄，人工授粉可以如下进行：通过用镊子从雄性亲本的花上除去雄蕊和雌蕊，并靠着雌花的柱头轻轻刷花药。通过除去前萼片和龙骨瓣，或者用闭合的镊子刺穿龙骨，并且使它们打开来推开花瓣，可以靠近雄蕊。在柱头上刷花药使它们破裂，并且当花粉在柱头上清晰可见时获得最高比例的成功杂交。花粉散落可以通过在刷柱头前拍打花药来检查。当条件不利时，可能必须使用几朵雄花来获得适量的花粉散落，或者可以用相同的雄花对几个具有良好花粉散落的花授粉。

遗传雄性不育性在大豆中可以获得，并且可以用于在本发明中促进杂交，特别是用于轮回选择程序(Brim和Stuber，1973)。杂交区组完全分离所需的距离还不清楚；但是，当雄性不育植物距离外源花粉来源12m或更远时，远交小于0.5％(Boerma和Moradshahi，1975)。杂交区组边界上的植物可能维持大多数与外源花粉的远交，并且可以在收获时消除，以使混杂最小化。

一旦收获，豆荚一般在不高于38℃的温度下风干，直到种子含有13％或更低的水分，然后用手取出种子。如果相对湿度为50％或更低，种子可以在大约25℃下令人满意地贮存长达一年。在湿润气候下，发芽百分率快速下降，除非种子被干燥到7％的含水量并且室温贮存在气密容器中。在任何气候下的长期贮存最好伴随将种子干燥到7％的含水量并且在10℃或更低的温度下在保持50％相对湿度的房间中或气密容器中贮存。

III.用于大豆品种的改性和改良的性状

在某些实施方式中，本发明提供的大豆植物可以包含一种或多种转基因。这种转基因的一个例子赋予除草剂抗性。常用的除草剂抗性基因包括赋予草甘膦抗性的EPSPS基因、赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因(Fraley等人，1983)、赋予抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因(Vanden Elzen等人，1985)、赋予草丁膦或溴苯腈抗性的基因(Comai等人，1985；Gordon-Kamm等人，1990；Stalker等人，1988)诸如二氢叶酸还原酶和乙酰乳酸合酶(Eichholtz等人，1987，Shah等人，1986，Charest等人，1990)。进一步的实例包括赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变ALS和AHAS酶(Lee等人，1988；Miki等人，1990)、赋予膦丝菌素抗性的膦丝菌素乙酰转移酶基因(欧洲申请0 242 246)、赋予苯氧基丙酸类和环己酮类诸如稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾灵(haloxyfop)抗性的基因(Marshall等人，1992)；和赋予三嗪(psbA和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)抗性的基因(Przibila等人，1991)。

本发明的植物也可以包含赋予昆虫、害虫、病毒或细菌攻击抗性的基因。例如，赋予害虫(诸如大豆胞囊线虫(Soybean cyst nematode))抗性的基因在PCT申请WO96/30517和PCT申请WO93/19181中有描述。Jones等人，(1994)描述了番茄叶霉菌(Cladosporium fulvum)抗性的西红柿Cf-9基因的克隆；Martin等人，(1993)描述了丁香假单胞菌致病变种(Pseudomonas syringae pv.)抗性的西红柿Pto基因，Mindrinos等人，(1994)描述了丁香假单胞菌抗性的拟南芥(Arabidopsis)RSP2基因。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素也可以用于昆虫抗性。(参见，例如，Geiser等人，(1986))。维生素结合蛋白诸如抗生物素蛋白也可以用作杀幼虫剂(PCT申请US93/06487)。

已知在转化的植物细胞中使用病毒外壳蛋白可以提供对病毒感染和/或受该外壳蛋白基因所来源的病毒以及相关病毒影响的病害发展的抗性(参见Beachy等人，1990)。已经对转化的植物提供了针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒(tobacco streak virus)、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus)和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性。同上。也可以使用由病原体或寄生虫在自然中产生的发育阻滞性蛋白。例如，Logemann等人，(1992)已经证明表达大麦核糖体灭活基因的转基因植物具有提高的真菌病抗性。

也可以使用提供提高的营养价值或另一价值提高性状的转基因。一个例子是改变的脂肪酸代谢，例如，通过用硬脂酰-ACP去饱和酶的反义基因转化植物，以提高植物的硬脂酸含量。(参见Knutzon等人，1992)。也可以引入有义去饱和酶基因以改变脂肪酸含量。通过引入编码肌醇六磷酸酶的基因以增强肌醇六磷酸盐的分解，可以改变肌醇六磷酸盐的含量，向转化的植物中提供更多的游离磷酸盐。例如，通过用编码改变淀粉分支模式的酶的基因转化植物，也可以实现改变的碳水化合物组成(参见Shiroza等人，1988)(变异链球菌(Streptococcus mutans)果糖基转移酶基因的核苷酸序列)；Steinmetz等人，(1985)(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)；Pen等人，(1992)(表达地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶的转基因植物的产生)；Elliot等人，(1993)(西红柿转化酶基因的核苷酸序列)；

等人，(1993)(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)；和Fisher等人，(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II))。

转基因也可以用来改变蛋白质代谢。例如，美国专利5,545,545描述了对赖氨酸不敏感的玉米二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)，该酶基本耐受会以其他方式抑制天然DHPS活性的L-赖氨酸的浓度。类似地，EP0640141描述了编码能够引起产生高于正常的苏氨酸的赖氨酸不敏感性天冬氨酸激酶(AK)的序列，以及编码用于提高赖氨酸的反义赖氨酸酮戊二酸还原酶的亚片段。

在另一实施方式中，可以使用改变植物碳水化合物代谢的转基因。例如，已知果糖激酶基因用于转基因植物及其果实中果糖激酶基因表达的代谢工程(参见美国专利6,031,154)。可以使用的转基因的另一个例子是改变谷物产量的基因。例如，美国专利6,486,383描述了具有腺苷二磷酸葡糖焦磷酸化酶(“ADPG PPase”)的亚单位蛋白质的植物中淀粉含量的改变。在EP0797673中讨论了转基因植物，其中特定DNA分子的引入和表达导致在液泡外形成容易移动的磷酸盐池和增高的生物质产生和/或改变的开花行为。另外已知用于改变植物成熟的基因。美国专利6,774,284描述了编码植物脂肪酶的DNA和使用它们控制植物枯萎的方法。美国专利6,140,085讨论了改变开花特征，特别是开花时机的FCA基因。美国专利5,637,785讨论了遗传学修饰的植物，该植物具有调节的花发育，例如具有早期花分生组织发育，并且在其基因组中包含编码LEAFY蛋白的结构基因。

改变植物形态特征的基因也是已知的，并且可以根据本发明使用。美国专利6,184,440讨论了由于表达细胞壁调节转基因而显示改变的结构和形态学的遗传工程植物。细胞壁调节转基因的例子包括纤维素结合域、纤维素结合蛋白或细胞壁修饰蛋白或酶，诸如内质网糖基转移酶(endoxyloglucan transferase)、木糖葡聚糖内转糖基酶、棒曲霉素、纤维素合酶或分离的新型内-1，4-β-葡聚糖酶。

转基因引入方法是本领域公知的，包括生物和物理学植物转化方案。参见，例如，Miki等人(1993)。

一旦转基因被引入品种中，它可以容易地通过杂交转移。通过使用回交，除了通过回交技术转移到该品种中的基因座以外，品种的基本上全部希望的形态和生理特征被恢复。回交方法可以用于本发明，以改良或向植物中引入特征(Poehlman等人，1995；Fehr，1987a，b)。

IV.大豆植物的组织培养物和体外再生

本发明的另一方面涉及本发明的大豆品种的组织培养物。如本文使用的术语“组织培养物”是指包含分离的相同或不同类型的细胞的组合物或组织成为植物部分的这些细胞的集合。示例性的组织培养物类型是在植物或植物部分中为完好的原生质体、愈伤组织和植物细胞，诸如胚、花粉、花、叶、根、根尖、花药等。在一个优选实施方式中，组织培养物包括胚、原生质体、分生组织细胞、花粉、叶或花药。

用于制备可再生大豆细胞的组织培养物以及从其再生大豆植物的示例性程序在美国专利4,992,375、美国专利5,015,580、美国专利5,024,944和美国专利5,416,011中公开，上述各专利的公开内容均完整引入本文作为参考。

组织培养物的一个重要的能力是能够再生能育的植物。这允许，例如，转化组织培养细胞，然后再生为转基因植物。为使转化有效和成功，DNA必须引入将产生植物或种系组织的细胞中。

大豆一般通过两种不同的过程再生：芽形态发生和体细胞胚发生(Finer，1996)。芽形态发生是芽分生组织组织化和发育的过程。芽从来源组织中长出，并且切下并生根，以获得完整的植物。在体细胞胚发生过程中，由体细胞植物组织形成含有芽和根轴的胚(类似于合子胚)。完整的植物而不是生根的芽通过体细胞胚的发芽而产生。

芽形态发生和体细胞胚发生是不同的过程，并且具体再生途径主要取决于外植体来源和用于组织培养操作的培养基。尽管其系统是不同的，但这两种系统都显示品种特异性的应答，其中某些系比其他系对组织培养操作有更强的反应性。在芽形态发生中具有高度反应性的系可能不产生许多体细胞胚。在“诱导”步骤过程中产生许多胚的系可能不产生快速生长的增殖培养物。因此，可能需要优化用于每个大豆系的组织培养条件。组织培养领域的熟练技术人员通过小规模的培养研究可以容易地进行这些优化。除了系特异性应答外，使用芽形态发生和体细胞胚发生都可以观察到增殖培养物。增殖对于两种系统都是有益的，因为它允许单个转化的细胞扩增到可有助于种系组织的点。

芽形态发生最早由Wright等人(1986)报道，作为一种由大豆幼苗的子叶节从头获得芽的系统。芽分生组织在表皮下形成，并且形态发生组织在含有苄基腺嘌呤(BA)的培养基上可以增生。如果知道芽的表皮下多细胞来源，并且使用增殖培养，则该系统可用于转化。想法是针对将产生新芽的组织，并且使分生组织内的这些细胞增殖，以减轻与嵌合性有关的问题。如果转化的细胞不能充分增殖，并且不产生种系组织，则在分生组织中只有单细胞转化导致嵌合体形成成为一个问题。一旦该系统被很好地认识，并且令人满意地再生，则可以用作用于大豆转化的一种靶组织。

大豆中的体细胞胚发生最早由Christianson等人(1983)报道，作为一种最初由合子胚轴获得胚发生组织的系统。这些胚发生培养物是增殖性的，但是该系统的可重复性较低，并且胚的来源没有报道。后来对不同增殖性胚发生大豆培养物的组织学研究表明，增殖性胚是顶端或表面来源的，少量的细胞对胚形成有贡献。初生胚(由最初的外植体产生的第一胚)的来源取决于外植体组织和诱导培养基中的生长素(auxin)水平(Hartweck等人，1988)。使用增殖性胚培养物，“较老的”体细胞胚的单细胞或小组表面细胞形成“较新的”胚。

如果知道胚的来源并且理解增殖性胚发生培养物的生物学限制，胚发生培养物也可以成功用于再生，包括转基因植物的再生。生物学限制包括难以发展增殖性胚发生培养物和与由长期增殖性胚发生培养物再生的植物相关的生育性降低问题(培养诱导的变异)。某些这样的问题在长期培养中被突出。使用更新近培养的细胞可以减少或消除这些问题。

V.大豆植物的应用

本发明提供的大豆植物可以用于任何认为具有价值的目标。常见的应用包括制备供人消费的食物、供非人动物食用的饲料以及工业应用。如本文使用的“工业应用”或“工业用途”是指大豆或基于大豆的产品的非食品和非饲料应用。

大豆通常被加工为两种主要的产品：大豆蛋白质(粗粉)和粗大豆油。为了特定用途，这两种产品通常进一步精制。精制油产品可以分解为甘油、脂肪酸和甾醇。它们可以用于食品、饲料或工业用途。可食用的食品应用实例包括咖啡奶油、人造黄油、蛋黄酱、药品、色拉调料、起酥油、焙烤食品和巧克力糖衣。

大豆蛋白质产品(例如粗粉)可以分为浓缩大豆粉和分离大豆粉，它们都有食品/饲料和工业用途。大豆粉和粗磨粉常用于生产肉增量剂和类似物、宠物食品、焙烤食品配料和其他食品。由大豆粉和分离物制成的食品包括婴儿食品、糖果、谷物、食品饮料、面条、酵母、啤酒、麦芽酒等。大豆粗粉尤其常用作家畜(主要是猪和家禽)饲料中的蛋白质的来源。饲料应用因此包括但不限于水产养殖饲料、蜜蜂饲料、牛饲料代用品、鱼饲料、家畜饲料、家禽饲料和宠物饲料等。

完整的大豆产品也可以用作食品或饲料。常见的食品应用包括诸如种子、豆芽、烤豆、在各种焙烤食品中使用的全脂豆粉、用作糖果点心的烤大豆、黄豆仁酱、豆奶咖啡和东方食品的其他大豆衍生物等产品。对于饲料用途，常从大豆上除下外壳，并用作饲料。

大豆另外还具有许多工业用途。大豆的一种常见的工业用途是制备可用于生产复合材料的粘合剂。例如，木复合材料可以使用改性的大豆蛋白质、水解大豆蛋白质与PF树脂的混合物、含有粉状树脂的大豆粉和含有泡沫胶的大豆蛋白质来生产。70多年来，基于大豆的粘合剂已经用于生产普通木制品诸如胶合板。尽管引入尿素-甲醛和苯酚-甲醛树脂减少了在木制品中使用基于大豆的粘合剂，但是对环境的关注和消费者对由可再生原料制成的粘合剂的偏爱重新引起了开发新的基于大豆的产品用于木材复合材料工业的兴趣。

粘合剂的制备代表大豆的另一个常见的工业用途。大豆粘合剂的例子包括大豆水解物粘合剂和大豆粉粘合剂。大豆水解物是一种通过在热(120℃)和压力(30psig)下在5％氢氧化钠溶液中反应大豆蛋白质分离物制成的无色水溶液。产生的降解的大豆蛋白质溶液在室温下是碱性的(pH 11)和可流动的(大约500cps)。大豆粉是由大豆制成的磨细的脱脂粗粉。各种粘合剂制剂可以由大豆粉制成，第一步通常需要将大豆粉溶解在氢氧化钠溶液中。产生的制剂的强度和其他性质将随制剂中的添加剂而变化。大豆粉粘合剂也可以与其他可商购的树脂潜在地混合。

大豆油可以用于许多工业应用中。大豆油是最容易获得的，并且是世界上成本最低的植物油之一。大豆油常见的工业用途包括用作抗静电剂、嵌缝化合物、消毒剂、杀真菌剂、墨水、涂料、保护性涂层、壁板、消沫剂、醇、人造黄油、涂料、墨水、橡胶、起酥油、化妆品等的成分。大豆油多年来也已作为醇酸树脂的主要成分，它们溶解在载体溶剂中，形成油基涂料。在热和压力下将植物油转化为醇酸树脂的基础化学方法是本领域技术人员公知的。

大豆油在其购买到的未精制或精制的食用级状态时，是相当稳定的和干燥缓慢的油。大豆油也可以进行修饰，以增强它在环境条件下的反应性，或者利用各种形式的能量的输入，使油共聚合或固化为干膜。一些这样的修饰形式包括环氧化、醇解或酯基转移、直接酯化、复分解、异构化、单体修饰和各种形式的聚合作用，包括热稠化。具有双键的大豆油的反应性亚油酸成分可能比主要的油酸和亚油酸成分在许多工业应用中更有用。

也可以使用基于大豆的成分制备溶剂。例如，大豆油甲酯(methyl soyate)，一种基于大豆油的甲酯，作为用于诸如部件清洗和脱脂、涂料和墨水清除、溢油补救等应用中的出色的溶剂替代品，逐渐得到市场的接受。它也销售用于许多配制消费产品中，包括洗手剂、汽车蜡和污迹清除剂。大豆油甲酯通过用甲醇对大豆油进行酯基转移作用来产生。可以从许多生产商和供应商处获得。作为溶剂，大豆油甲酯具有重要的环境和安全性相关的性质，使其在工业应用上具有吸引力。其毒性低于其他大多数溶剂，易于生物降解，并且具有极高的闪点和低水平的挥发性有机化合物(VOC)。大豆油甲酯与金属、塑料、大部分弹性体和其他有机溶剂的兼容性是出色的。大豆油甲酯目前的用途包括清洁剂、油漆剥离剂、溢油清除剂和生物修复剂、杀虫剂辅剂、防蚀剂和生物柴油燃料添加剂。

VI.试剂盒

本文所述的任何组合物可以包括在试剂盒中。在非限制性的例子中，用于检测本文所述的多态性的组合物和/或附加剂可以包括在试剂盒中。试剂盒可能因此在适当的容器工具中包括本发明的用于检测多态性的探针或底物和/或附加剂。在具体实施方式中，该试剂盒将允许检测至少一个与提高的α’-亚基的水平相关的等位基因，例如，通过检测这些等位基因的多态性和/或与等位基因连锁不平衡的其他方面。

试剂盒可以包括本发明的适当分装的试剂组合物，它们可以是标记或非标记的、用于检测这种等位基因的需要的分析格式。试剂盒的组分可以以水介质或冻干形式包装。试剂盒的容器工具一般包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器工具，组分可以放置且优选适当地分装在其中。当试剂盒中存在一种以上的组分时，该试剂盒一般还包含第二、第三或其他额外的容器，其他组分可以单独放置在其中。然而，组分的各种组合可以包含在小瓶中。本发明的试剂盒还通常包括用于包含检测组合物的工具和密闭用于商业销售的任何其他试剂容器。这些容器可能包括注射成型容器或吹塑容器，所需的小瓶容器被保留在其中。

当试剂盒的组分以一种和/或多种液体溶液提供时，液体溶液可能是水溶液，特别优选用无菌水溶液。但是，该试剂盒的组分可以提供为干粉。当试剂和/或组分以干粉提供时，这些粉末可以通过加入合适的溶剂来重构。可以预见，也可以在另一个容器工具中提供溶剂。该容器工具一般包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其他容器工具，检测无效等位基因的组分可以放置且优选适当地分装在其中。试剂盒还包括用于包含无菌缓冲液和/或其他稀释剂的第二容器工具。

本发明的试剂盒通常还包括包含密闭用于商业销售的小瓶的工具，例如，注射成型容器和/或吹塑容器，所需的小瓶容器被保留在其中。不论容器的数量和/或类型，本发明的试剂盒还可以包括用于帮助检测组合物应用的仪器，和/或用其包装。

VII.定义

在说明书和下面的表格中，使用了大量术语。为了提供对说明书和权利要求书的清楚和一致的理解，给出了以下定义：

α-亚基：本文使用时是指β-伴大豆球蛋白α-亚基。

α’-亚基：本文使用时是指β-伴大豆球蛋白α’-亚基。

β-亚基：本文使用时是指β-伴大豆球蛋白β-亚基。

一种：当在权利要求书中与“包括”或其他开放性词语一起使用时，“一种”表示“一种或多种”。

农艺学优良的：本文使用时是指一种基因型，其具有许多可识别的性状的最大值(culmination)，诸如种子产量、发芽、活力、生长活力、抗病性、结籽、可直立性和脱粒性(threshability)，它们允许生产者收获具有商业意义的产品。

等位基因：基因座的一种或多种替代形式中的任一种，所有等位基因都与性状或特征相关。在二倍体细胞或生物体中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上相应的基因座。

回交：育种者将杂种后代例如第一代杂种(F₁)与杂种后代的亲本之一反复杂交的过程。回交可以用来将来自一个遗传背景的一种或多种单基因座转换引入到另一个遗传背景中。

共有序列：构建的DNA序列，其鉴定基因座处等位基因的SNP和Indel多态性。共有序列可以基于基因座处DNA的任一链，并且表示该基因座中各SNP的任一个的核苷酸碱基及该基因座中的所有Indel的核苷酸碱基。因此，虽然共有序列可能不是一个实际的DNA序列的拷贝，但共有序列可用于精确设计用于基因座中的实际多态性的引物和探针。

具有商业意义的产量：对于种植者而言具有商业意义的谷物的产量，其由在相同条件下生长的对照系AG2703和DKB23-51的至少95％的实际谷物产量表示。

杂交：两个亲本植物的杂交。

异花授粉：通过来自不同植物的两个配子的融合的受精。

下调性突变：对于本申请，下调性突变定义为降低从给定基因表达蛋白质的表达水平的突变。因此下调性突变包括无效突变。

F₁杂种：两个非等基因植物杂交的第一代后代。

基因型：细胞或生物体的遗传组成，或在生物体中存在的指定基因座中的特定的等位基因。

基因分型：划定生物体中的指定基因座中的等位基因的类型。这通常是通过对从生物体中提取的DNA样品进行标记分析来实现的。

大豆球蛋白无效：突变大豆植物，其具有赋予降低的大豆球蛋白含量和提高的β-伴大豆球蛋白含量的突变。具有提高的β-伴大豆球蛋白含量的植物可以具有Gy1、Gy2、Gy3和/或Gy4的非转基因无效等位基因。

邻近：描述与包含多态性的DNA杂交的核酸分子，指的是与直接邻接该多态性核苷酸碱基位置的DNA序列杂交的核酸。例如，可在单碱基延伸分析中使用的核酸分子“邻近”该多态性。

INDEL：核苷酸序列插入或缺失引起的基因突变。

工业应用：大豆植物的非食品和非饲料应用。术语“大豆植物”包括大豆植物的植物部分和衍生物。

探询位置：固体载体上的物理位置，可以对其进行查询以获得一种或多种预定的基因组多态性的基因分型数据。

单元型：由至少一种多态性分子标记限定的单元型窗口内的染色体区域。每个单元型窗口中的独特的标记指纹组合限定了该窗口的各个单元型。此外，例如重组导致的单元型的变化可能导致单元型的修饰，使其只包含与性状可操作地连锁的初始(亲本)单元型的一部分，例如，通过与基因、QTL或转基因物理连锁。单元型中的任何这样的变化都包括在我们对于构成单元型的内容的定义中，只要该基因组区域的功能完整性不变或改善。

单元型窗口：通过本领域技术人员已知的统计分析建立的，且处于连锁不平衡的染色体区域。因此，将位于该区域内的一种或多种分子标记基因座处的两个近交个体(或两个配子)之间的状态同一性(identity by state)作为整个区域的谱系同一性(identity-by-descent)的证据。每个单元型窗口包含至少一个多态性分子标记。单元型窗口可以沿基因组中的每个染色体作图。单元型窗口本身不是固定不变的，且考虑到逐渐提高的分子标记密度，本发明预计单元型窗口的数目和大小将会发展，窗口数目逐渐提高，其各自的大小逐渐减小，从而导致在根据标记基因座的状态同一性确定谱系同一性方面的置信度逐渐提高。

连锁：一种现象，其中同一染色体上的等位基因倾向于比偶然预期的更经常地一起分离，如果它们的传播是独立的话。

标记：容易检测的表型，其优选地以共显性的方式遗传(二倍体杂合子中一个基因座处的两个等位基因均可容易地检测到)，没有环境变化成分，即遗传性为1。此外，“标记”是指多态性核酸序列或核酸特征。“多态性”是个体之间的序列、特别是在DNA序列或特征(诸如转录谱或甲基化模式)的变异。有用的多态性包括单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列的插入或缺失(InDel)、DNA序列的简单重复序列(SSR)、限制性片段长度多态性、单倍型和标记物SNP。遗传标记、基因、DNA衍生的序列、RNA衍生的序列、启动子、基因的5’非翻译区域、基因的3’非翻译区域、微RNA、siRNA、QTL、卫星标记、转基因、mRNA、ds mRNA、转录谱和甲基化模式可以包括多态性。在更广泛的方面，“标记”可以是可检测的特征，可以用于区别生物之间的可遗传的差别。这样的特征的例子可以包括遗传标记、蛋白质组成、蛋白质水平、油组成、油水平、碳水化合物组成、碳水化合物水平、脂肪酸组成、脂肪酸水平、氨基酸组成、氨基酸水平、生物聚合物、药品、淀粉组成、淀粉水平、可发酵的淀粉、发酵产量、发酵效率、能量产量、次生化合物、代谢物、形态特征和农艺学特征。

标记分析：使用特定方法检测特定基因座处的多态性的方法，例如，至少一种表型的测定(诸如种子颜色、花的颜色或其他视觉可检测的性状)、限制性片段长度多态性(RFLP)、单碱基延伸、电泳、序列比对、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、随机扩增的多态性DNA(RAPD)、基于微阵列的技术和核酸测序技术、单核苷酸多态性等。

非转基因突变：天然发生的或通过常规方法(例如将植物暴露于辐射或诱变化合物)诱导的突变，不包括使用重组DNA技术获得的突变。

无效表型：本文使用的无效表型是指给定蛋白质的表达水平无法检测到。对于Gy亚基，表达水平通过SDS-PAGE和考马斯染色来确定。

表型：细胞或生物体的可检测的特征，该特征是基因表达的表现。

多态性：在一种或多种个体的群体中，在一个或多个基因座处存在核酸序列的一种或多种变异。该变异可以包括但不限于一种或多种碱基的变化、一种或多种核苷酸的插入或一种或多种核苷酸的缺失。多态性包括单核苷酸多态性(SNP)、简单序列重复(SSR)及插入和缺失indels。多态性的产生可能是由于核酸复制中的随机过程，通过诱变，由于移动的基因组元件，拷贝数变异，和在减数分裂过程中，诸如不等交换、基因组复制和染色体断裂和融合。在群体中，变异可能常被发现或可能以低频率存在，前者在普通植物育种中具有更大的应用，而后者则可能与罕见但重要的表型变异有关。

数量性状基因座(QTL)：数量性状基因座(QTL)是指以一定程度控制通常连续分布的可用数字表示的性状的遗传基因座。

SNP：是指当比较两个同源序列时的单核苷酸多态性或单核苷酸突变。

大豆：是指大豆(Glycine max)，且包括可用于大豆培育的所有植物品种，包括野生大豆种。

严格条件：是指5X SSC、50％甲酰胺和42℃的核酸杂交条件。

基本等同：一种特征，当进行比较时，与平均值不显示统计学显著性差异(例如，p＝0.05)。

组织培养物：包含相同或不同类型的分离细胞的组合物或组成植物部分的这些细胞的集合。

转基因：包含已通过转化引入大豆植物基因组中的序列的遗传基因座。

分型：是指确定给定的大豆基因组多态性的特定等位基因形式的任何方法。例如，通过确定存在哪种核苷酸(即，A、G、T或C)，对单核苷酸多态性(SNP)进行分型。通过确定是否存在Indel来确定插入/缺失(Indel)。通过包括但不仅限于标记分析的多种分析方法可以对Indel进行分型。

营养品：对人类健康具有医疗效果的食品。

IX.实施例

包括以下实施例是为了证明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解，下面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在本发明的实施中作用良好的技术，因此可以认为构成实施本发明的优选模式。但是，本领域技术人员根据本发明的公开内容应当认识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的特定实施方式进行许多改变，而仍然获得同样的或相似的结果。

实施例1

与提高的α’-亚基表型相关的基因组区域

β-伴大豆球蛋白三聚体中α’、α和β亚基的相对百分比分别为约35％、45％和20％(Maruyama等人，1999)。在大多数种子中α∶α’比大约为1.28。针对提高的α’-亚基含量选择品种。蛋白质分析如下进行：集中来自一个品种的大豆种子，并使用CAT Mega-研磨器(SOP Asci-01-0002)研磨。将磨碎的样品贮存在4℃下。为了分析，每种称取～30mg粉置入96孔2ml微孔板的一个孔中。在振摇下，在含有作为还原剂的0.1M二硫苏糖醇(DTT)的1.0ml 1X Laemmli SDS缓冲液pH 6.8中提取蛋白质1小时。离心后，每个提取物的一部分在SDS缓冲液中进一步稀释，以产生0.2-0.5μg/μL总蛋白质，加热至90-100℃持续10分钟，并冷却。对于每个样品，使用12通道移液器将1-2μg总蛋白质加至26泳道15％T梯度Tris/HCl Criterion凝胶上。分子量标准和亲本对照包括在每个凝胶的两个泳道中。对凝胶进行电泳，直到示踪染料到达凝胶底部大约1.2小时，然后在胶态考马斯蓝G-250中染色过夜，在去离子水中脱色，并且使用GS800校准的光密度计成像。使用Bio-Rad Quantity One^TM软件进行定量。利用该软件确定样品泳道中每条带的相对量。酸性大豆球蛋白的百分比和β-伴大豆球蛋白亚基带的百分比报告为泳道中总蛋白质的相对百分比。样品身份和重量使用Master LIMS^TM示踪。

大部分品种的α’并没有提高(见表1)。此外，大多数品种中α∶α’比的平均值大约为1.28。鉴别出具有独特种子组成，即其中α∶α’比小于1的品种，并且选出用于分析。此外，选择具有正常α’水平的品种用于比较评估。

表1：大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白亚基的表型水平的蛋白质分析

用1423 SNP标记对具有提高的α’水平和正常的α’水平的大豆品种进行指纹分析，并比较多态区域。评价SNP标记基因型和降低的α-亚基含量所导致的提高的α’-亚基表型之间的关联。LGI上45-60.3cM之间的区域证明提高的α水平和降低的α水平的系之间的多态性，并如表2报道。对于降低的α水平的信息序列在表3中列出。

表3：对于降低的α-亚基的SNP标记以及对于每个标出的标记的等位基因的列表，其中“D”表明缺失和“I”表明插入

实施例2

不同遗传背景中与提高的α’-亚基相关的遗传标记的效用

产生4个群体，以验证与大豆种子中提高的α’-亚基含量相关的等位基因。降低的α-亚基系MV0064与两个正常的α-亚基系MV0040和MV0112杂交，以产生两个群体。MV0064具有降低的α-亚基含量所导致的提高的α’-亚基含量，且在祖代亲本水平(grandparent level)享有与MV0060相同的降低的α-亚基的共同来源。MV0040或MV0112享有一些与MV0060共同的亲本，但具有正常的α-亚基含量。针对α’-亚基和α-亚基含量，对F₂群体进行基因分型，并用实施例1中确定的SNP标记进行筛选。此外，通过杂交MV0064与低大豆球蛋白的亲本MV0113来发展群体。MV0113具有降低的大豆球蛋白含量(总蛋白量的5％)和提高的β-伴大豆球蛋白含量(总蛋白的48％)。低大豆球蛋白亲本具有突变的Gy等位基因，其降低种子中的大豆球蛋白水平和随后提高β-伴大豆球蛋白水平。针对α’-亚基和α-亚基含量，对F₂群体进行基因分型，并用实施例1中确定的SNP标记进行筛选。群体证实在存在突变的Gy等位基因的情况下标记的预测能力。

从每个杂交收获杂种种子，并重新种植。F₁植物通过表型和/或分子表征被证实是真正的杂种。如实施例1所述，评估提高的α’-亚基表型。从3个杂交的每个的F₁植物收获F₂种子，并重新种植。从每个群体中的各个个体F₂植物采集组织样品，并用SNP标记SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15分析DNA。关联分析表明，提高的α’-亚基的品种在SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15中均具有CC核苷酸，而正常的α’-亚基品种分别在SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15具有TT和AA。

在SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15中具有CC的F₂植物被认为是对于推定的突变等位基因呈阳性，而分别在SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15中具有TT和AA的F₂植物被认为是对于突变等位基因呈阴性。从每个群体中的每个阳性和每个阴性植物收获单荚，且单荚用来形成对于每个杂交的分别的阳性单荚世系群体和阴性单荚世系群体。批量脱粒来自每个群体中的每个阳性F2植物和每个阴性F₂植物的其余F₃种子，以形成对于每个杂交的分别的阳性大量群体和阴性大量群体。如实施例1所述，大量种子的一些被用于评估蛋白质组成。

在3个群体中，在两个标记基因座处的推定的突变等位基因(阳性F₃群体)的存在与α’-亚基含量的6.5％提高(p＝0.015)(图1)和α亚基/α’-亚基比的8％的下降有关(p＝0.0002)(图2)。这些标记都与种子中α’-亚基含量的68％变化有关。在阳性和阴性类型之间在以下水平上没有显著性差异：α’-亚基(p＝0.5)、β-亚基(p＝0.9)或总β-伴大豆球蛋白(p＝0.2)。这三个群体的筛选证实，标记提供不同遗传背景中的信息。此外，由MV0064与MV0040或MV0112杂交产生的F₂群体针对SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15分为两类：分别为CCCC和TTAA。没有观察到具有TTCC或CCAA单元型的植物。种植来自每F₂群体的样品。对这些植物组织采样以使用SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15进行基因分型。单独收获每个植物的F₃种子(表4和5)。使用SDS-PAGE，使用来自每个植物的8个F₃种子来评估α-亚基和α’-亚基的含量(表4和5)。

分子标记SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15在培育大豆中提高的α’-亚基含量方面非常有用。对于提高的α’-亚基含量的表型选择标准是α-亚基/α’-亚基大于1。对于小于1的α-亚基/α’亚基比，虽然分子标记不是完全预测性的，但标记有助于减少使用SDS-PAGE进行基因分型所需的群体大小。通过SDS-PAGE针对α-亚基和α’-亚基水平评价单个植物的费用估计为每个样品18美元。此外，对植物进行基因分型接着经SDS-PAGE确认表型减少了昂贵的基因分型费用至少50％(表4和5)。此外，获得满足小于1的α-亚基/α’-亚基比的选择标准的植物的概率大大提高(表4和5)。

表4：利用分子标记在群体中选择提高的α’-亚基水平

表5：利用分子标记在群体中选择提高的α’-亚基水平

根据本发明的公开内容，不需要过多的实验就可以制备和实施本文公开和请求保护的所有组合物和方法。尽管本发明的组合物和方法已经以优选实施方式的形式描述，但是本领域技术人员应当清楚，可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，对所述组合物和方法和本文所述的方法的步骤或步骤顺序进行改变。更具体地，应当理解，某些化学和生理学都相关的物质可以替代本文描述的物质，而将获得相同或相似的结果。本领域技术人员清楚所有这些类似的替代物和改变可被认为是在所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。