CN101812179A - 网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物与制法及在基因传递中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物与制法及在基因传递中的应用。将双丙烯酸酯或双丙烯酰胺与2-氨基乙醇溶解在有机溶剂中，制备带有侧羟基的线型聚-β-氨酯/酰胺；偶联剂活化线型聚-β-氨酯/酰胺中侧羟基，并形成交联型的网状分子结构，活化后的网状聚-β-氨酯/酰胺加入到含聚乙烯亚胺的有机溶剂中形成接枝共聚物。所述的共聚物是一种聚阳离子基因载体，集成了聚乙烯亚胺和聚-β-氨酯/酰胺的优点，转染效率高，在同等条件下对非洲绿猴肾细胞介导荧光素酶质粒的转染效率最高为美国Invitrogen生物公司转染试剂LipofectamineTM2000的21倍，细胞毒性小，细胞存活率80％以上。
Description
技术领域
本发明涉及网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物与制法及在基因传递中的应用。
背景技术
随着近代生物技术的发展与人类基因库的不断完善，使人类从分子水平上认识某些疾病根源已逐步成为可能，为基因治疗提供了理论基础。在具体实施中，如何获取安全有效的基因载体日益成为制约基因治疗临床应用的瓶颈问题。利用病毒载体介导基因转移是基因治疗中应用最广泛的方法，其中包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒等载体。但是病毒类载体在临床应用中存在着很大的安全隐患，造成了基因治疗历史上首例患者死亡事件以及著名的法国“气泡婴儿”事件。相对于病毒类基因载体的不安全性，人工合成的阳离子聚合物由于其无免疫源性，分子设计多样，尺寸可控并能够连接靶向物质逐渐成为该领域的研究热点。
在众多已经报道的聚阳离子载体中，聚乙烯亚胺(PEI)由于其具有独特的“质子海绵效应”能够实现高效的基因传递而倍受关注[参见Boussif O，Zanta M.A，Behr J.P.et al.AVersatile Vector for Gene and Oligonucleotide Transfer into Cells in Culture and in Vivo-Polyethylenimine.PNAS，1995；92：7297-7301]。PEI的转染性能强烈依赖于分子量，普遍使用分子量25000的PEI(PEI25k)作为转染载体。PEI的优点在于电荷密度集中，对基因物质有强的复合能力，在低氮磷比(N/P)比即能获得最佳转染效率。但是单纯使用均聚物PEI作为基因载体，往往受限于其不可降解性和高的细胞毒性。
聚-β-氨酯/酰胺是一类通过迈克尔(Michael)加成反应制备的具有良好生物相容性并可实现生物体内降解的高分子材料，由于性能优异、制备方法简单，引起越来越多的研究者兴趣，最近其在基因传递中的应用更是受到重点关注。文献报道，Anderson D.G.等研究者通过对聚-β-氨酯的合成和筛选，成功获得了一系列高效低毒的基因载体材料[参见Anderson D.G，Langer R.et al.A polymer library approach to suicide gene therapy for cancer.PNAS，2004；101：16028-16033]；而Lin C.等研究者也通过相似的Michael加成反应制备了一系列可实现高效转染的聚-β-氨酰胺载体材料[参见Lin C，Jan F.J.et al.Linear poly(amido amine)s with secondaryand tertiary amino groups and variable amounts of disulfide linkages：Synthesis and in vitro genetransfer properties.Journal of ControlledRelease，2006；116：130-137]。虽然能够协助外源基因实现高效的体外转染，但是由于分子中的荷质比太低，在与负电荷的基因物质复合时，往往需要大量的聚-β-氨酯/酰胺才能实现有效包裹，严重限制了其在体内传递的应用。
最近的研究报道中，双丙烯酸酯或双丙烯酰胺被直接作为交联剂使用，通过与聚乙烯亚胺Michael加成反应制备交联型的聚阳离子基因载体[参见Kim T.H，et al.A degradablehyperbranched poly(ester amine)based on poloxamer diacrylate and polyethylenimine as a genecarrier.Macromolecular Bioscience，2007；7：611-619]。这类交联型聚阳离子虽然制备简单，但是交联反应难以控制，可重复性差，无法研究分子结构与转染性能之间的关系，并且过度的交联容易造成产物溶解性差，影响其生物应用性能。
发明内容
本发明的目的在于提供网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物与制法及在基因传递中的应用。所合成的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物为可降解阳离子聚合物，未见文献报道。网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物兼具了PEI与聚-β-氨酯/酰胺的优点，其分子电荷密度较高，对基因物质负载能力强，具有良好的生物相容性，克服了PEI均聚物高毒性、不可降解性以及聚-β-氨酯/酰胺电荷密度不够集中、复合能力弱的缺点。网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物是对基因物质负载能力强，能够自由调节带电骨架的形状、电荷密度，具有优良生物相容性的高效基因传递载体。
所述的线型聚-β-氨酯的结构式如下：
所述的线型聚-β-氨酰胺的结构式如下：
所述的聚乙烯亚胺，结构为线型或者支化，其结构式如下所示：
其中，聚合度a，b，c均大于或者等于1；
所述的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物的结构如下：
其中，X为偶联剂，其为二异氰酸酯类；PEI为聚乙烯亚胺；PAE为线型聚-β-氨酯PAA为线型聚-β-氨酰胺。
网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物的结构为分子内部分交联，其结构示意的表达方法参照已报道的具有相似分子结构的文献[参见Kim S.W，et al.Biodegradablepoly(ethylenimine)for plasmid DNA delivery.Journal of ControlledRelease，2002；80：273-282或者Kim T.H，et al.A degradable hyperbranched poly(ester amine)based on poloxamer diacrylateand polyethylenimine as a gene carrier.Macromolecular Bioscience，2007；7：611-619]。
所述的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物的制备步骤和条件如下：
(1)按照双丙烯酸酯或者双丙烯酰胺的质量g，与有机溶剂的体积ml的配比1～5∶10～20，将两者投料到反应器中，搅拌溶解，其中有机溶剂选氯仿与甲醇的体积配比为1∶4～4∶1的混合溶剂；再按照2-氨基乙醇与双丙烯酸酯或者双丙烯酰胺的摩尔配比为2∶3～3∶2，将2-氨基乙醇也加入到反应器中，控温0～70℃搅拌反应至少12小时，反应完成后在乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上层清液，保留沉淀于底部的产物，干燥，得到线型聚-β-氨酯/酰胺；
(2)按照线型聚-β-氨酯/酰胺的质量g，与无水氯仿的体积ml的配比1～5∶10～50，将两者投料到干燥的反应器中，搅拌溶解，再按照线型聚-β-氨酯/酰胺中的羟基与偶联剂的摩尔配比2∶1～1∶10，加入偶联剂至反应器中，选二异氰酸酯类作为偶联试剂，控温0～70℃搅拌反应至少2小时，反应完成后，反应液冷却至室温，转移至干燥的滴液漏斗中；按照线型聚-β-氨酯/酰胺中的羟基与聚乙烯亚胺的摩尔配比5∶1～1∶10，取聚乙烯亚胺于另一干燥反应器中，并按照聚乙烯亚胺的质量g，与无水氯仿的体积ml的配比1～5∶50～1000，加入无水氯仿搅拌溶解；将滴液漏斗中的反应液直接滴加到含聚乙烯亚胺的反应器中，至少15分钟滴加完毕，滴加过程中反应器保持冰浴并搅拌，滴加完毕后，控温0～40℃继续搅拌反应2～72小时，反应完成后在乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上层清液，保留沉淀于底部的产物，干燥，再用蒸馏水重新溶解产物，使用截留分子量1000～10000的超滤管，超滤浓缩以除去未反应的小分子，冷冻干燥浓缩液，得到网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物。
网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物在体外转染中作为基因传递载体。其用法的步骤和条件如下：
(1)细胞的培养
细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中连续培养；
(2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％，转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及无血清或者含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养基至终体积200μl，继续培养24小时；
(3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，用PBS洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用照度计测定转染效率；
(4)细胞毒性测试
采用噻唑蓝(MTT)比色法比较评价基因载体材料的细胞毒性；
实验前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用DMEM培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度到达80～90％，将不同浓度的材料与细胞共同培养24小时后，每孔分别加入20μl含质量分数为0.5％MTT的PBS溶液，混合物在37℃继续作用4小时，加入200μl二甲基亚砜溶解MTT甲臢结晶10分钟，然后用酶标仪测试每孔的吸收，测试波长选用492nm，细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100
Asample是转染后的细胞样品孔的吸收，hcontrol是不与复合物溶液作用的细胞样品孔的吸收，每组实验重复三次。
网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物在体内转染中作为基因传递载体。其用法的步骤和条件如下：
取5周的巴比赛裸鼠，在腹侧皮下接种人宫颈癌上皮细胞的细胞株，待肿瘤直径长至0.4cm后，随机分为两组，每组6只，分别在瘤内注射含5μg荧光素酶质粒的基因组转染的复合物颗粒溶液100μl；第二天重复注射一次，注射后48小时，用精诺真活体成像仪观测体内转染效果；在进行活体成像观察之前，将小鼠麻醉，麻醉5分钟后，向小鼠体内注入200μl荧光素酶底物，10分钟后，用活体成像系统观察体内转染效果。
有益效果：所制备的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物是一种聚阳离子基因载体，集成了聚乙烯亚胺和聚-β-氨酯/酰胺各自的优点，转染效率高，其在同等条件下对非洲绿猴肾细胞细胞介导荧光素酶质粒的转染效率最高为美国Invitrogen生物公司商业转染试剂LipofectamineTM 2000的21倍，细胞毒性小，在最佳转染比例范围内，细胞存活率在80％以上。
本发明所制备的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物具有低毒并可生物降解性，因为其所选用的网状聚-β-氨酯/酰胺骨架具有良好的生物相容性，在生理条件下可自行降解、崩溃和代谢，进而被生物体吸收或排出体外，对人体无毒副作用。
因此，本发明所合成的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物在基因传递上有很高的使用价值，有广泛的应用前景。
附图说明
图1为对比不同载体材料在系列浓度下的细胞毒性测试结果图。测试细胞选用非洲绿猴肾细胞(Cos-7细胞)，测试浓度为0～70微克/毫升，测试材料分别为网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物的代表N-PAE-PEI-6和N-PAA-PEI-4、PEI25k和商业转染试剂LipofectamineTM 2000，测试结果以处理后的细胞存活率(％)来表示。
具体实施方式
实施例1：使用不同原料合成含侧羟基线型聚-β-氨酯
分别按照表1所列投料质量，称取不同种类的双丙烯酸酯分子10mmol置于不同的反应安瓶中，再按照表1中相应的溶剂体积，分别量取氯仿与甲醇体积配比2∶1的混合溶剂，加入相应的反应安瓶中，搅拌溶解后，再分别向各个反应安瓶中加入10mmol的2-氨基乙醇，控温在45℃搅拌反应72小时，反应完成后，分别在500ml的乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上层清液，保留沉淀于底部的产物，干燥得到线型聚-β-氨酯(PAE)，使用凝胶渗透色谱分析产物数均分子量(Mn)及分子量分布(PDI)，结果见表1。
表1使用不同原料合成含侧羟基线型聚-β-氨酯
| 产物 编号 | 双丙烯酸酯种类 | 双丙烯酸酯 投料质量(g) | 溶剂 体积(ml) | 产物 数均 分子 量 (Mn ) | PDI |
| PAE -1 | 1，4-丁二醇二丙烯酸酯 | 1.98 | 6 | 7400 | 1.24 |
| PAE -2 | 1，6-己二醇二丙烯酸酯 | 2.26 | 7 | 8460 | 1.15 |
| PAE -3 | 聚乙二醇二丙烯酸酯(Mn＝258) | 2.58 | 13 | 3500 | 1.56 |
| PAE -4 | 聚乙二醇二丙烯酸酯(Mn＝700) | 7 | 70 | 7890 | 1.42 |
实施例2：使用不同原料合成含侧羟基线型聚-β-氨酰胺
分别按照表2所列投料质量，称取不同种类的双丙烯酰胺分子10mmol置于不同的反应安瓶中，再按照表2中相应的溶剂体积，分别量取氯仿与甲醇体积配比2∶1的混合溶剂，加入相应的反应安瓶中，搅拌溶解后，再分别向各个反应安瓶中加入10mmol的2-氨基乙醇，控温在45℃搅拌反应72小时，反应完成后，分别在500ml的乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上层清液，保留沉淀于底部的产物，干燥得到线型聚-β-氨酰胺(PAA)，使用凝胶渗透色谱分析产物数均分子量(Mn)及分子量分布(PDI)，结果见表2。
表2使用不同原料合成含侧羟基线型聚-β-氨酰胺
| 产物编 号 | 双丙烯酰胺种类 | 双丙烯酰胺投料质量 (g) | 溶剂体积 (ml) | 产物 Mn | PD I |
| PAA-1 | 亚甲基双丙烯酰胺 | 1.54 | 5 | 8400 | 1.46 |
| PAA-2 | 双丙烯酰胱胺 | 2.6 | 8 | 7230 | 1.34 |
| PAA-3 | 六亚甲基双丙烯酰 胺 | 2.24 | 11 | 3360 | 1.27 |
实施例3：使用不同原料合成网状聚-β-氨酯接枝聚乙烯亚胺共聚物
分别按照表3中所述的投料种类和投料质量，称取实施例1中制备的线型聚-β-氨酯(PAE)置于不同的反应安瓶中，再按照表3所示，分别量取相应体积的无水氯仿加入各自的反应安瓶中，搅拌溶解后，分别向每个反应安瓶加入20mmol的1，6-己二异氰酸酯(HDI)，控温在50℃搅拌反应12小时，反应完成后，反应液冷却至室温，分别转移至不同的干燥滴液漏斗中，得到侧羟基活化的网状聚-β-氨酯(N-PAE-HDI)；
表3侧羟基活化的网状聚-β-氨酯(N-PAE-HDI)
| 产物编号 | PAE投料种 类 | PAE投料质量 (g) | 无水氯仿体积 (ml) |
| N-PAE-HDI-1 | PAE-2 | 2.9 | 30 |
| N-PAE-HDI-2 | PAE-2 | 2.9 | 60 |
| N-PAE-HDI-3 | PAE-3 | 3.2 | 32 |
| N-PAE-HDI-4 | PAE-3 | 3.2 | 65 |
| N-PAE-HDI-5 | PAE-1 | 2.6 | 25 |
| N-PAE-HDI-6 | PAE-1 | 2.6 | 55 |
按照表4所示，分别称取不同种类和摩尔量的聚乙烯亚胺(PEI)投料于不同的干燥反应安瓶中，向每个反应安瓶分别加入1500ml的无水氯仿搅拌溶解；将上述表3制备的侧羟基活化的网状聚-β-氨酯(N-PAE-HDI)，分别按照表4所示的排列顺序，通过滴液漏斗直接滴加到含相应PEI的反应安瓶中，滴加过程中反应安瓶保持冰浴并搅拌，2小时滴加完毕后，控温在20℃继续搅拌反应24小时，反应完成后分别在乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上层清液，保留沉淀于底部的产物，干燥，再分别用蒸馏水重新溶解产物，使用截留分子量3500的超滤管，分别超滤浓缩，以除去未反应的小分子，冷冻干燥浓缩液，得到网状聚-β-氨酯接枝聚乙烯亚胺共聚物(N-PAE-PEI)。使用核磁共振和凝胶渗透色谱分析PEI接枝率及产物数均分子量，结果见表4。
表4使用不同原料合成网状聚-β-氨酯接枝聚乙烯亚胺共聚物(N-PAE-PEI)
| 产物编 号 | N-PAE-HDI 投料种类 | PEI投料种类 | PEI投料 摩尔量 | PEI接 枝率 | 产物 Mn |
| N-PAE- PEI-1 | N-PAE-HDI-1 | 线型PEI(Mn＝423) | 20mmol | 43％ | 52400 |
| N-PAE- PEI-2 | N-PAE-HDI-1 | 支化PEI(Mn＝600) | 20mmol | 56％ | 60460 |
| N-PAE- PEI-3 | N-PAE-HDI-2 | 线型PEI(Mn＝423) | 20mmol | 64％ | 29890 |
| N-PAE- PEI-4 | N-PAE-HDI-2 | 支化PEI(Mn＝600) | 20mmol | 47％ | 32470 |
| N-PAE- PEI-5 | N-PAE-HDI-3 | 线型PEI(Mn＝423) | 30mmol | 65％ | 23500 |
| N-PAE- PEI-6 | N-PAE-HDI-3 | 支化PEI(Mn＝600) | 30mmol | 58％ | 25460 |
| N-PAE- PEI-7 | N-PAE-HDI-4 | 线型PEI(Mn＝423) | 30mmol | 67％ | 13890 |
| N-PAE- PEI-8 | N-PAE-HDI-4 | 支化PEI(Mn＝600) | 30mmol | 62％ | 14300 |
| N-PAE- PEI-9 | N-PAE-HDI-5 | 线型PEI(Mn＝423) | 40mmol | 65％ | 60260 |
| N-PAE- PEI-10 | N-PAE-HDI-5 | 支化PEI(Mn＝600) | 40mmol | 73％ | 73600 |
| N-PAE- PEI-11 | N-PAE-HDI-6 | 线型PEI(Mn＝423) | 40mmol | 69％ | 36170 |
| N-PAE- PEI-12 | N-PAE-HDI-6 | 支化PEI(Mn＝600) | 40mmol | 76％ | 57490 |
实施例4：使用不同原料合成网状聚-β-氨酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物
分别按照表5中所述的投料种类和投料质量，称取实施例2中制备的线型聚-β-氨酰胺(PAA)置于不同的反应安瓶中，再按照表5所示，分别量取相应体积的无水氯仿加入各自的反应安瓶中，搅拌溶解后，分别向每个反应安瓶加入20mmol的1，6-己二异氰酸酯(HDI)，控温在50℃搅拌反应12小时，反应完成后，反应液冷却至室温，分别转移至不同的干燥滴液漏斗中，得到侧羟基活化的网状聚-β-氨酰胺(N-PAA-HDI)；
表5侧羟基活化的网状聚-β-氨酰胺(N-PAA-HDI)
| 产物编号 | PAA投料种 类 | PAE投料质量 (g) | 无水氯仿体积 (ml) |
| N-PAA-HDI-1 | PAA-2 | 3.2 | 32 |
| N-PAA-HDI-2 | PAA-2 | 3.2 | 65 |
| N-PAA-HDI-3 | PAA-3 | 2.9 | 30 |
| N-PAA-HDI-4 | PAA-3 | 2.9 | 60 |
| N-PAA-HDI-5 | PAA-1 | 2.2 | 25 |
| N-PAA-HDI-6 | PAA-1 | 2.2 | 45 |
按照表6所示，分别称取不同种类和摩尔量的聚乙烯亚胺(PEI)投料于不同的干燥反应安瓶中，向每个反应安瓶分别加入1500mi的无水氯仿搅拌溶解；将上述表5制备的侧羟基活化的网状聚-β-氨酰胺(N-PAA-HDI)，分别按照表6所示的排列顺序，通过滴液漏斗直接滴加到含相应PEI的反应安瓶中，滴加过程中反应安瓶保持冰浴并搅拌，2小时滴加完毕后，控温在20℃继续搅拌反应24小时，反应完成后分别在乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上层清液，保留沉淀于底部的产物，干燥，再分别用蒸馏水重新溶解产物，使用截留分子量3500的超滤管，分别超滤浓缩，以除去未反应的小分子，冷冻干燥浓缩液，得到网状聚-β-氨酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物(N-PAA-PEI)。使用核磁共振和凝胶渗透色谱分析PEI接枝率及产物数均分子量，结果见表6。
表6使用不同原料合成网状聚-β-氨酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物(N-PAA-PEI)
| 产物编号 | N-PAA-HDI 投料种类 | PEI投料种类 | PEI投料 摩尔量 | PEI接枝率 | 产物 Mn |
| N-PAA-PEI -1 | N-PAA-HDI-1 | 线型PEI(Mn＝423) | 20mmol | 47％ | 57400 |
| N-PAA-PEI -2 | N-PAA-HDI-1 | 支化PEI(Mn＝600) | 20mmol | 57％ | 63790 |
| N-PAA-PEI -3 | N-PAA-HDI-2 | 线型PEI(Mn＝423) | 20mmol | 52％ | 22390 |
| N-PAA-PEI -4 | N-PAA-HDI-2 | 支化PEI(Mn＝600) | 20mmol | 45％ | 31060 |
| N-PAA-PEI -5 | N-PAA-HDI-3 | 线型PEI(Mn＝423) | 30mmol | 60％ | 26540 |
| N-PAA-PEI -6 | N-PAA-HDI-3 | 支化PEI(Mn＝600) | 30mmol | 52％ | 27360 |
| N-PAA-PEI -7 | N-PAA-HDI-4 | 线型PEI(Mn＝423) | 30mmol | 57％ | 13930 |
| N-PAA-PEI -8 | N-PAA-HDI-4 | 支化PEI(Mn＝600) | 30mmol | 42％ | 13500 |
| N-PAA-PEI -9 | N-PAA-HDI-5 | 线型PEI(Mn＝423) | 40mmol | 62％ | 64010 |
| N-PAA-PEI -10 | N-PAA-HDI-5 | 支化PEI(Mn＝600) | 40mmol | 59％ | 68990 |
| N-PAA-PEI -11 | N-PAA-HDI-6 | 线型PEI(Mn＝423) | 40mmol | 63％ | 39760 |
| N-PAA-PEI -12 | N-PAA-HDI-6 | 支化PEI(Mn＝600) | 40mmol | 69％ | 52410 |
实施例5：使用不同工艺合成含侧羟基线型聚-β-氨酯
分别按照表7所列投料质量，称取数均分子量为258的聚乙二醇二丙烯酸酯置于不同的反应安瓶中，再按照表7中溶剂的配比和体积，分别量取氯仿与甲醇的混合溶剂，加入相应的反应安瓶中，搅拌溶解后，再按表7所示分别向各个反应安瓶中加入相应量的2-氨基乙醇，并按照表7中的条件控温搅拌反应，反应完成后，分别在500ml的乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上层清液，保留沉淀于底部的产物，干燥得到线型聚-β-氨酯(PAE)，使用凝胶渗透色谱分析产物数均分子量，结果见表7。
表7使用不同工艺合成含侧羟基线型聚-β-氨酯
| 产物 编号 | 聚乙二醇 二丙烯酸 酯(Mn ＝258)投 料质量 (g) | 溶剂体积 (ml) | 溶剂配比 氯仿∶甲醇 体积比 | 2-氨基乙醇 投料量 (mol) | 反应温 度 | 反应时 间 | 产物Mn |
| PAE -3-1 | 2.58 | 5.16 | 1∶4 | 15 | 70℃ | 12小 时 | 4320 |
| PAE -3-2 | 2.58 | 12.9 | 1∶1 | 10 | 40℃ | 96小 时 | 3680 |
| PAE -3-3 | 1.29 | 25.8 | 4∶1 | 3.33 | 0℃ | 60小 时 | 1740 |
实施例6：使用不同工艺合成含侧羟基线型聚-β-氨酰胺
分别按照表8所列投料质量，称取双丙烯酰胱胺置于不同的反应安瓶中，再按照表8中溶剂的配比和体积，分别量取氯仿与甲醇的混合溶剂，加入相应的反应安瓶中，搅拌溶解后，再按表8所示分别向各个反应安瓶中加入相应量的2-氨基乙醇，并按照表8中的条件控温搅拌反应，反应完成后，分别在500ml的乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上层清液，保留沉淀于底部的产物，干燥得到线型聚-β-氨酰胺(PAA)，使用凝胶渗透色谱分析产物数均分子量，结果见表8。
表8使用不同工艺合成含侧羟基线型聚-β-氨酰胺
| 产 物 编 号 | 双丙烯酰胱 胺投料质量 (g) | 溶剂体积 (ml) | 溶剂配比 氯仿∶甲醇 体积比 | 2-氨基乙醇 投料量 (mol) | 反 应温 度 | 反应时 间 | 产物Mn |
| PA A- 2-1 | 2.6 | 5.2 | 1∶4 | 15 | 70 ℃ | 12小 时 | 3220 |
| PA A- 2-2 | 2.6 | 13 | 1∶1 | 10 | 40 ℃ | 96小 时 | 5430 |
| PA A- 2-3 | 1.3 | 26 | 4∶1 | 3.33 | 0 ℃ | 60小 时 | 1570 |
实施例7：使用不同工艺合成网状聚-β-氨酯接枝聚乙烯亚胺共聚物
分别按照表9中所述的投料种类和投料质量，称取实施例5制备的线型聚-β-氨酯(PAE)置于不同的反应安瓶中，再按照表9所示溶剂I的体积，分别量取相应体积的无水氯仿加入各自的反应安瓶中，搅拌溶解后，按照表9所示投料量分别向每个反应安瓶加入1，6-己二异氰酸酯(HDI)，按照表9所示活化温度和活化时间进行搅拌反应，反应完成后，反应液冷却至室温，分别转移至不同的干燥滴液漏斗中，得到侧羟基活化的网状聚-β-氨酯；
按照表9所示，分别称取相应摩尔量的数均分子量600支化聚乙烯亚胺(PEI)投料于不同的干燥反应安瓶中，按照表9所示溶剂II的体积，向每个反应安瓶分别加入相应量的无水氯仿搅拌溶解；将上述制备的侧羟基活化的网状聚-β-氨酯，分别按照表9所示的排列顺序，通过滴液漏斗直接滴加到含相应PEI的反应安瓶中，滴加过程中反应安瓶保持冰浴并搅拌，2小时滴加完毕后，按照表9所示反应温度和反应时间进行搅拌反应，反应完成后分别在乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上层清液，保留沉淀于底部的产物，干燥，再分别用蒸馏水重新溶解产物，使用截留分子量3500的超滤管，分别超滤浓缩，以除去未反应的小分子，冷冻干燥浓缩液，得到网状聚-β-氨酯接枝聚乙烯亚胺共聚物(N-PAE-PEI)。使用凝胶渗透色谱分析产物数均分子量，结果见表9。
实施例8：使用不同工艺合成网状聚-β-氨酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物
分别按照表10中所述的投料种类和投料质量，称取实施例6制备的线型聚-β-氨酰胺(PAA)置于不同的反应安瓶中，再按照表10所示溶剂I的体积，分别量取相应体积的无水氯仿加入各自的反应安瓶中，搅拌溶解后，按照表10所示投料量分别向每个反应安瓶加入1，6-己二异氰酸酯(HDI)，按照表10所示活化温度和活化时间进行搅拌反应，反应完成后，反应液冷却至室温，分别转移至不同的干燥滴液漏斗中，得到侧羟基活化的网状聚-β-氨酰胺；
按照表10所示，分别称取相应摩尔量的数均分子量600支化聚乙烯亚胺(PEI)投料于不同的干燥反应安瓶中，按照表10所示溶剂II的体积，向每个反应安瓶分别加入相应量的无水氯仿搅拌溶解；将上述制备的侧羟基活化的网状聚-β-氨酰胺，分别按照表10所示的排列顺序，通过滴液漏斗直接滴加到含相应PEI的反应安瓶中，滴加过程中反应安瓶保持冰浴并搅拌，2小时滴加完毕后，按照表10所示反应温度和反应时间进行搅拌反应，反应完成后分别在乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上层清液，保留沉淀于底部的产物，干燥，再分别用蒸馏水重新溶解产物，使用截留分子量3500的超滤管，分别超滤浓缩，以除去未反应的小分子，冷冻干燥浓缩液，得到网状聚-β-氨酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物(N-PAA-PEI)。使用凝胶渗透色谱分析产物数均分子量，结果见表10。
实施例9：网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物介导荧光素酶质粒对非洲绿猴肾细胞(Cos-7细胞)的体外转染
1、Cos-7细胞的培养
取Cos-7细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中连续培养。
2、体外转染
转染前24小时内，取对数生长期Cos-7细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次后，更换200μl/孔含有10％胎牛血清的新鲜DMEM培养液，再选用荧光素酶质粒(pGL3)为报告基因，分别加入N-PAE-PEI-6/pGL3；N-PAA-PEI-4/pGL3、PEI25k/pGL3以及商业化转染试剂Lipofectamine TM 2000/pGL3的复合物颗粒进行转染对比，继续培养24小时。
3、体外转染效率的测定
取出培养板，吸弃培养液，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，使用照度计测定转染效率，表示为每毫克蛋白的发光单元数(RLU/mg Protein)。
表11介导荧光素酶质粒的体外转染效率
| 序号 | 载体材料 | 最佳转染效率，RLU/mg Protein |
| 1 | PEI25k | 9.492×108 |
| 2 | Lipofectamine TM 2000 | 1.091×109 |
| 3 | N-PAA-PEI-4 | 8.653×109 |
| 4 | N-PAE-PEI-6 | 2.292×1010 |
本发明中的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物是一种非常高效的基因传递载体材料。表7分别给出了体外转染实验中N-PAE-PEI-6、N-PAA-PEI-4、PEI25k与LipofectamineTM 2000的最佳转染效率，通过对比可以看出本发明中N-PAE-PEI-6和N-PAA-PEI-4所代表的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物具有更高的转染效率。
实施例10：网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物的细胞毒性测试
1、Cos-7细胞的培养
取Cos-7细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中连续培养。
2、毒性测试
采用MTT的方法比较评价不同浓度N-PAE-PEI-6、N-PAA-PEI-4、PEI25k和商业转染试剂Lipofectamine TM 2000的材料细胞毒性。实验前24小时内，取对数生长期的Cos-7细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％。将不同浓度的材料与细胞共同培养24小时后，每孔分别加入20μl含质量分数为0.5％MTT的PBS溶液。混合物在37℃继续作用4小时，加入200μl二甲基亚砜溶解MTT甲臢结晶10分钟。然后用酶标仪测试每孔的吸收，测试波长选用492nm。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100
Asample是转染后的细胞样品孔的吸收，Acontrol是不与复合物溶液作用的细胞样品孔的吸收，每组实验重复三次，测试结果见图1。
通过图1我们可以看出不同浓度下各种载体材料处理后的细胞存活率。相对于PEI25k和Lipofectamine TM 2000，本发明中N-PAE-PEI-6和N-PAA-PEI-4所代表的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物材料是一种对细胞毒性很小的转染试剂。
实施例11：网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物介导体内转染实验
取5周的巴比赛裸鼠，在腹侧皮下接种人宫颈癌上皮细胞株，待肿瘤直径长至0.4cm后，随机分为两组，每组6只，分别在瘤内注射含5μg荧光素酶质粒(pGL3)的N-PAE-PEI-6/pGL3、N-PAA-PEI-4/pGL3与Lipofectamine TM 2000/pGL3复合物颗粒溶液100μl。第二天重复注射一次，注射后48小时，用精诺真活体成像仪观测体内转染效果。在进行活体成像观察之前，将小鼠麻醉。麻醉5分钟后，向小鼠体内注入200μl荧光素酶底物。10分钟后，用活体成像系统观察体内转染效果。结果表明N-PAE-PEI-6和N-PAA-PEI-4所代表的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物材料比Lipofectamine TM 2000具有更高的转染效率。
Claims (6)
1.网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物，其特征在于，其结构式如下：
所述的线型聚-β-氨酯的结构式如下：
所述的线型聚-β-氨酰胺的结构式如下：
所述的聚乙烯亚胺，结构为线型或者支化，其结构式如下所示：
其中，聚合度a，b，c均大于或者等于1；
所述的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物的结构如下：
其中，X为偶联剂，其为二异氰酸酯类；PEI为聚乙烯亚胺；PAE为线型聚-β-氨酯PAA为线型聚-β-氨酰胺。
2.如权利要求1所述的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物的制备方法，其特征在于步骤和条件如下：
(1)按照双丙烯酸酯或者双丙烯酰胺的质量g，与有机溶剂的体积ml的配比1～5∶10～20，将两者投料到反应器中，搅拌溶解，其中有机溶剂选氯仿与甲醇的体积配比为1∶4～4∶1的混合溶剂；再按照2-氨基乙醇与双丙烯酸酯或者双丙烯酰胺的摩尔配比为2∶3～3∶2，将2-氨基乙醇也加入到反应器中，控温0～70℃搅拌反应至少12小时，反应完成后在乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上层清液，保留沉淀于底部的产物，干燥，得到线型聚-β-氨酯/酰胺；
(2)按照线型聚-β-氨酯/酰胺的质量g，与无水氯仿的体积ml的配比1～5∶10～50，将两者投料到干燥的反应器中，搅拌溶解，再按照线型聚-β-氨酯/酰胺中的羟基与偶联剂的摩尔配比2∶1～1∶10，加入偶联剂至反应器中，选二异氰酸酯类作为偶联试剂，控温0～70℃搅拌反应至少2小时，反应完成后，反应液冷却至室温，转移至干燥的滴液漏斗中；按照线型聚-β-氨酯/酰胺中的羟基与聚乙烯亚胺的摩尔配比5∶1～1∶10，取聚乙烯亚胺于另一干燥反应器中，并按照聚乙烯亚胺的质量g，与无水氯仿的体积ml的配比1～5∶50～1000，加入无水氯仿搅拌溶解；将滴液漏斗中的反应液直接滴加到含聚乙烯亚胺的反应器中，至少15分钟滴加完毕，滴加过程中反应器保持冰浴并搅拌，滴加完毕后，控温0～40℃继续搅拌反应2～72小时，反应完成后在乙醚中沉降，沉降混合液静置后，倾去上层清液，保留沉淀于底部的产物，干燥，再用蒸馏水重新溶解产物，使用截留分子量1000～10000的超滤管，超滤浓缩以除去未反应的小分子，冷冻干燥浓缩液，得到网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物。
3.如权利要求1所述的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物在基因传递中的应用，其特征在于，网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物在体外转染中作为基因传递载体。
4.如权利要求3所述的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物在体外转染中作为基因传递载体的用法，其特征在于，步骤和条件如下：
(1)细胞的培养
细胞置于含体积分数为10％胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中连续培养，
(2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80～90％，转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，基因组转染的复合物颗粒以及无血清或者含有体积分数为10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200μl，继续培养24小时；
(3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用照度计测定转染效率；
(4)细胞毒性测试
采用噻唑蓝比色法比较评价基因载体材料的细胞毒性；
实验前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度到达80～90％，将不同浓度的材料与细胞共同培养24小时后，每孔分别加入20μl含质量分数为0.5％噻唑蓝的磷酸盐缓冲液，混合物在37℃继续作用4小时，加入200μl二甲基亚砜溶解噻唑蓝甲臢结晶10分钟，然后用酶标仪测试每孔的吸收，测试波长选用492nm，细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100
Asample是转染后的细胞样品孔的吸收，Acontrol是不与复合物溶液作用的细胞样品孔的吸收，每组实验重复三次。
5.如权利要求1所述的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物在基因传递中的应用，其特征在于，网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物在体内转染中作为基因传递载体。
6.如权利要求5所述的网状聚-β-氨酯/酰胺接枝聚乙烯亚胺共聚物在体内转染中作为基因传递载体的用法，其特征在于，步骤和条件如下：
取5周的巴比赛裸鼠，在腹侧皮下接种人宫颈癌上皮细胞的细胞株，待肿瘤直径长至0.4cm后，随机分为两组，每组6只，分别在瘤内注射含5μg荧光素酶质粒的基因组转染的复合物颗粒溶液100μl，第二天重复注射一次，注射后48小时，用精诺真活体成像仪观测体内转染效果，在进行活体成像观察之前，将小鼠麻醉，麻醉5分钟后，向小鼠体内注入200μl荧光素酶底物，10分钟后，用活体成像系统观察体内转染效果。
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