CN101810607A - 抗c型肝炎的植物萃取组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗C型肝炎的植物萃取组合物，组合物中包括一有效量的寡聚原花青素，其中所述寡聚原花青素的萃取来源包括：葡萄籽、火炭母草、汉氏山葡萄及广东山葡萄等具有较好的抗C型肝炎作用；以及一药学上可接受的载体或盐类，其中该寡聚原花青素的单体的分子式如下所示。
Description
技术领域
本发明是涉及于一种抗C型肝炎的组合物，且特别涉及一具有含寡聚原花青素的植物萃取组合物，其可抑制C型肝炎病毒活性。
背景技术
全世界有2-3％(约三亿人)人口感染C型肝炎，且每年以新增300-400万例患者的速度蔓延。目前唯一被证实且核准的抗C型肝炎病毒药物为甲型(阿尔发)干扰素(α-Interferon)，而雷巴威林(ribavirin)则是被证实且核准其有加强甲型干扰素的抗C型肝炎病毒疗效。然而，二者都会产生严重的副作用，且多有产生抗药性的现象。
迄今已知原花青素的生化、药理活性，其包括抗氧化剂活性、酶抑制活性、抗致突变活性、降低毛细血管通透性(抗炎活性)心血管活性等，及其在治疗学作用，即包括抗炎作用、抗过敏、抗溃疡以及预防癌症等。
又先前文献(中国台湾专利公告号I274551)曾报导包含牛磺酸、β-胡萝卜素、葡萄籽萃取物中的原花青素、维生素E、维生素C等的营养品具有改善慢性肝炎的效果。
因此由上述可知，原花青素为一对健康十分有益的天然化合物，然而是目前仍未明确得知原花青素是否能有效抑制C型肝炎。
发明内容
本发明的目的在于应用标的萃取技术，提取一些植物中含高寡聚原花青素部份(或其组合物)，作为抗C型肝炎药物。
本发明提供一种抗C型肝炎的植物萃取组合物，组合物中含有有效量的寡聚原花青素，以及一药学上可接受的载体或盐类。
本发明的抗C型肝炎的植物萃取组合物在50μg/ml剂量下，对于C型肝炎病毒的抑制率为59％-89％。
为了让本发明的上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下：
附图说明
图1显示葡萄籽经本发明方法所萃取出寡聚原花青素的分子式与其进行质谱分析的结果。
图2显示火炭母草经本发明方法所萃取出寡聚原花青素的分子式与其进行质谱分析的结果。
具体实施方式
本发明是以含植物萃取寡聚原花青素的组合物做为抑制C型肝炎的药物，且本发明也可以含植物萃取的寡聚原花青素作为抑制C型肝炎病毒活性的保健食品。利用Huh-luc/neo-ET细胞带有I389luc-ubi-NS3-3’/ET构筑基因的C肝病毒细胞复制系统，此复制系统可通过HCV的IRES所转译表现出的萤火虫冷光酵素(firefly luciferase)-泛素(ubiquitin)-新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase)的聚合蛋白质，以及由EMCV的IRES所转译表现出的C肝病毒非结构性蛋白质(NS3-5B)包含蛋白酶(protease)、解旋酶(helicase)及聚合酶(polymerase)多蛋白。当HCV的IRES或HCV非结构性蛋白质组成的复制复合体(replication complex)受到候选物(candidate)影响时，可通过测定萤火虫冷光酵素活性的强度，评估候选物对抑制HCV复制子活性的效果，进而筛选出具有抑制C肝病毒能力的潜力候选物。
首先，可以自一植物材料萃取出含寡聚原花青素的组合物或寡聚原花青素。经过广泛的筛选植物萃取物的抗C型肝炎活性，发现葡萄籽、火炭母草、汉氏山葡萄及广东山葡萄等植物萃取物具有抗C型肝炎作用，经过活性成分追踪的结果，发现这些植物萃取物的极性成分中，含有丰富寡聚原花青素部份为活性成分。本发明的目的在于应用标的萃取技术，提取这些植物含高寡聚原花青素部份(或其组合物)，作为抗C型肝炎药物。
而于本发明中，可使用一般所熟知的方法来进行植物材料的萃取。萃取制备工艺可包括将干燥或新鲜的植物材料经过粉碎、去酯、溶剂萃取、分离纯化、浓缩、造粒等制备工艺。分离制备工艺可包括溶剂沉淀、液/液相萃取、树酯分离等。在一实施例中为将植物材料干燥后进行切片或磨碎，然后再以萃取溶液来对此植物材料进行萃取。
萃取的植物材料可包括葡萄籽、火炭母草、汉氏山葡萄、广东山葡萄或上述的组合，而萃取溶液可以选择极性有机溶剂，或者是其与水的混合溶液。极性溶剂可包括丙酮、低级醇、乙酸乙酯。
而另一实施例中，可在上述萃取步骤之后，将所萃取出的植物材料萃取组合物进一步溶于高极性溶剂中，然后再以低极性溶剂萃取以除去低极性杂质。
而经由上述所纯化的寡聚原花青素，其单体的分子式如下所示，其中所萃取出的寡聚原花青素的聚合度可为约1-18。
在一实施例中，萃取植物材料为葡萄籽，而其所萃取出的寡聚原花青素的聚合度为约1-18。在另一实施例中，萃取植物材料为火炭母草，而其所萃取出的寡聚原花青素的聚合度为约1-18。又，在另一实施例中，萃取植物材料为汉氏山葡萄，而其所萃取出的寡聚原花青素的聚合度为约1-18。另，在一实施例中，萃取植物材料为广东山葡萄，而其所萃取出的寡聚原花青素的聚合度为约1-18。
所萃取的寡聚原花青素可包括单一聚合度的寡聚原花青素，或者，所萃取的寡聚原花青素也可为包括不同聚合度的寡聚原花青素的混合物。
含寡聚原花青素的植物材料萃取组合物或寡聚原花青素在50μg/ml剂量下，对于C型肝炎病毒的抑制率大于80％。在一实施例中，自葡萄籽萃取出的含寡聚原花青素萃取组合物或寡聚原花青素在50μg/ml剂量下，对于C型肝炎病毒的抑制率为约80％。在另一实施例中，自火炭母草萃取出含寡聚原花青素萃取组合物或寡聚原花青素在50μg/ml剂量下，对于C型肝炎病毒的抑制率为约59％-89％。
而在本发明中，可以上述含寡聚原花青素的植物材料萃取组合物或寡聚原花青素制成一用以抑制C型肝炎的药学组合物，其可包括上述萃取的寡聚原花青素与一药学上可接受的载体或盐类。
药学上可接受的载体可包括，但不限于溶剂、分散媒(dispersion medium)、套膜(coating)、抗菌与抗真菌试剂与一等渗透压与吸收延迟(absorption delaying)试剂等与药学投予相容者。对于不同的给药方式，可利用一般方法将药学组合物配置成剂型(dosage form)。
药学上可接受的盐类可包括，但不限于盐类包括无机阳离子，例如，碱金属盐类，如钠、钾或胺盐，碱土金族盐类，如镁、钙盐，含二价或四价阳离子的盐类，如锌、铝或锆盐。此外，也可是为有机盐类，如二环己胺盐类、甲基-D-葡糖胺，氨基酸盐类，如精氨酸、离氨酸、组织氨酸、麸氨酸酰胺。
而给药可以口服、非口服、经由吸入喷雾(inhalation spray)或通过植入贮存器(implanted reservoir)的方式。非口服可包括皮下(subcutaneous)、皮内(intracutaneous)静脉内(intravenous)、肌肉内(intramuscular)、关节内(intraarticular)动脉(intraarterial)、滑囊(腔)内(intrasynovial)、胸骨内(intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位内(intraleaional)注射以及灌注技术。
口服成分的形式可包括，但不限定于，药锭、胶囊、乳剂(emulsions)、水性悬浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)与溶液。
实施例一
室温下取火炭母草根(Polygonum chinense)生药材1公斤，以95wt％乙醇在120rpm震荡萃取3天，萃取液过滤分离后，减压浓缩，以瓶壁不会有附着物为前提，浓缩到最小体积，进行冷冻干燥，即为酒粗萃层。取90g，加入水∶乙醇(体积比)＝95∶5溶解，再依次以正己烷、乙醚、乙酸乙酯进行液相对液相萃取，得到正己烷层、乙醚及乙酸乙酯产物。萃取程序如下：
用正己烷混合火炭母草根溶解液置于分液漏斗内，混合摇匀，静置分层后，取上层。重复三次动作，得到正己烷层。再将下层液(水层)，加入乙醚置于分液漏斗内，混合摇匀，静置分层后，取上层。重复三次动作，得到乙醚层。再将下层液(水层)，加入乙酸乙酯置于分液漏斗内，混合摇匀，静置分层后，取上层。重复三次动作，得到乙酸乙酯层。各层萃取液及最后层液再进行减压浓缩至干，得正己烷层4.6g、乙醚层2.9g、乙酸乙酯层5.6g、水层60-70g。
将四层萃取物进行抑制C型肝炎病毒活性测试，测试结果显示：抑制C肝病毒的活性主要在水层其细胞毒性为CC50＞1000μg/ml，而活性IC50为5.2±1.2μg/ml。整理如表1所示，可知火炭母草根初萃物的活性IC50为11.8±3.3μg/ml，经以上的再萃取可提高其活性至少两倍。
表1、火炭母草根经正己烷层、乙醚层、乙酸乙酯层、水层与酒粗萃层的抑制C型肝炎病毒活性测试
| 样品名称 | IC50(μg/ml) |
| 酒粗萃物 | 11.8±3.3 |
| 水层 | 5.2±1.2 |
由表1可得知水层的抑制C型肝炎病毒活性最佳，因此选择水层进行开放式层析管柱分离。
开放式层析管柱分离：
取1.0077g具抑制C型肝炎病毒活性的实施例一的火炭母草水层，以开放式层析管柱(充填RP C-18/30.4419克硅胶，2.2x25.3cm)进行分离，移动相的变化为水∶丙酮(体积比)＝4∶1→3∶1→2∶1→1∶1→丙酮，经薄层层析分析合并后，共有10个样品进行抗C肝活性测试。表2为此10个样品中6个抑制C型肝炎病毒活性结果，其中以水∶丙酮＝3∶1第126-250c.c的分萃层活性最佳。
表2、火炭母草根粗萃及分萃后抑制C型肝炎病毒活性的结果
| 样品名称 | 活性(50μg/ml)抑制率(％) | 细胞毒性CC50(μg/ml) |
| 火炭母草-水萃层 | 39.6±4.7 | 900.1 |
| 火炭母草-水∶丙酮＝4∶1 | 43.9±5.4 | ＞1000 |
| 第1-125c.c | ||
| 火炭母草-水∶丙酮＝4∶1第126-250c.c | 37.1±5 | ＞1000 |
| 火炭母草-水∶丙酮＝4∶1第251-500c.c | 32.7±8 | 757.5 |
| 样品名称 | 活性(50μg/ml)抑制率(％) | 细胞毒性CC50(μg/ml) |
| 火炭母草-水∶丙酮＝3∶1第1-125c.c | 40.6±16.3 | 413.8 |
| 火炭母草-水∶丙酮＝3∶1第126-250c.c | 72.3±4.4 | 269.1 |
| 火炭母草-水∶丙酮＝3∶1第251-500c.c | 13.7±14.8 | ＞1000 |
实施例二
1.室温下取火炭母草根(Polygonum chinense)生药材5g，加入纯水50ml浸泡以120rpm震荡萃取24小时，减压浓缩干燥。取0.0676g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml下抑制率为58.7±5.9％。
2.同步骤1，将溶剂改为丙酮50ml。取0.0043g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为88.7±1.3％。
3.同步骤1，将溶剂改为丙酮∶水＝1∶1共50ml。取0.0488g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为87.3±1.9％。
4.同步骤1，将溶剂改为丙酮∶水＝1∶2共50ml。取0.0082g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为79.9±2.2％。
5.同步骤1，将溶剂改为丙酮∶水＝2∶1共50ml。取0.0552g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为82.3±2.7％。
6.同步骤1，将溶剂改为甲醇50ml。取0.0379g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为83.5±2.8％。
7.同步骤1，将溶剂改为甲醇∶水＝1∶1共50ml。取0.0435g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为84±4.6％。
8.同步骤1，将溶剂改为甲醇∶水＝1∶2共50ml。取0.0622g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为79±6.8％。
9.同步骤1，将溶剂改为甲醇∶水＝2∶1共50ml。取0.0272g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为85±3.4％。
10.同步骤1，将溶剂改为乙酸乙酯水溶液50ml。取0.0337g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为75.7±0.8％。
将上述各溶剂对火炭母草根的萃取物的抑制C型肝炎病毒活性结果整理如表3所示。
表3、火炭母草根粗萃及分萃后抑制C型肝炎病毒活性的结果
| 火炭母草根(Polygonum chinense) | 活性(50μg/ml)抑制率(％) | 细胞毒性CC50(μg/ml) |
| 纯水 | 58.7±5.9 | ＞333 |
| 丙酮 | 88.7±1.3 | ＞333 |
| 丙酮/水＝1∶1 | 87.3±1.9 | ＞333 |
| 丙酮/水＝1∶2 | 79.9±2.2 | ＞333 |
| 丙酮/水＝2∶1 | 82.3±2.7 | ＞333 |
| 甲醇 | 83.5±2.8 | ＞333 |
| 甲醇/水＝1∶1 | 84±4.6 | ＞333 |
| 甲醇/水＝1∶2 | 79±6.8 | ＞333 |
| 甲醇/水＝2∶1 | 85±3.4 | ＞333 |
| 饱和乙酸乙酯水 | 75.7±0.8 | ＞333 |
实施例三
1.室温下取萃取葡萄籽(一般市售葡萄)生药材5g，加入纯水50ml。取0.236g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为81.6±3.3％。
2.同步骤1，将溶剂改为丙酮50ml。取0.687g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，抑制率(％)为5±12.2。
3.同步骤1，将溶剂改为丙酮∶水＝1∶1共50ml。取0.1164g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为82.1±4.7％。
4.同步骤1，将溶剂改为丙酮∶水＝1∶2共50ml。取0.034g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为87.3±2.9％。
5.同步骤1，将溶剂改为丙酮∶水＝2∶1共50ml。取0.1213g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为80.4±7.9％。
6.同步骤1，将溶剂改为饱和乙酸乙酯水溶液50ml。取0.0506g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为87.1±2.5％。
将上述各溶剂对葡萄籽的萃取物的抑制C型肝炎病毒活性结果整理如表4所示。
表4、葡萄籽粗萃及分萃后抑制C型肝炎病毒活性的结果
| 葡萄籽(一般市售葡萄) | 活性(50μg/ml)抑制率(％) | 细胞毒性CC50(μg/ml) |
| 纯水 | 81.6±3.3 | ＞333 |
| 丙酮 | 5±12.2 | ＞333 |
| 丙酮/水＝1∶1 | 82.1±4.7 | ＞333 |
| 丙酮/水＝1∶2 | 87.3±2.9 | ＞333 |
| 丙酮/水＝2∶1 | 80.4±7.9 | ＞333 |
| 饱和乙酸乙酯水 | 87.1±2.5 | ＞333 |
实施例四
1.室温下取汉氏山葡萄(Ampelopsis brevipedunculata)生药材5g，加入纯水50ml浸泡以120rpm震荡萃取24小时，减压浓缩干燥。取0.0175g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为84.7±1.7％。
2.同步骤1，将溶剂改为甲醇50ml。取0.0474g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为92.1±0.7％。
3.同步骤1，将溶剂改为甲醇∶水＝1∶1共50ml。取0.0279g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为92.1±1.2％。
4.同步骤1，将溶剂改为甲醇∶水＝1∶2共50ml。取0.0674g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为92.7±0.3％。
5.同步骤1，将溶剂改为甲醇∶水＝2∶1共50ml。取0.0536g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为90±2.5％。
6.同步骤1，将溶剂改为饱和乙酸乙酯水溶液50ml。取0.0408g，将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试，在浓度50μg/ml抑制率为91.3±0.7％。
将上述各溶剂对汉氏山葡萄的萃取物的抑制C型肝炎病毒活性结果整理如表5所示。
表5、汉氏山葡萄粗萃及分萃后抑制C型肝炎病毒活性的结果
| 汉氏山葡萄(Ampelops is brevipedunculata) | 活性(50μg/ml)抑制率(％) | 细胞毒性CC50(μg/ml) |
| 纯水 | 84.7±1.7 | ＞1000 |
| 甲醇 | 92.1±0.7 | ＞1000 |
| 汉氏山葡萄(Ampelops is brevipedunculata) | 活性(50μg/ml)抑制率(％) | 细胞毒性CC50(μg/ml) |
| 甲醇/水＝1∶1 | 92.1±1.2 | ＞1000 |
| 甲醇/水＝1∶2 | 92.7±0.3 | ＞1000 |
| 甲醇/水＝2∶1 | 90±2.5 | ＞1000 |
| 饱和乙酸乙酯水 | 91.3±0.7 | ＞1000 |
实施例五
室温下取广东山葡萄(Ampelopsis cantoniensis)生药材100g，以95％乙醇在120rpm震荡萃取3天，萃取液过滤分离后，减压浓缩，以瓶壁不会有附着物为前提，浓缩到最小体积，进行冷冻干燥，取样将其进行抑制C型肝炎病毒活性测试。在50μg/ml的浓度下，抑制率约为72-80％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求书所界定的范围为准。
Claims (16)
1.一种抗C型肝炎的植物萃取组合物，包括一有效量的寡聚原花青素；以及一药学上可接受的载体或盐类，其中所述寡聚原花青素单体的分子式如下：
2.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中所述寡聚原花青素的聚合度为1-18。
3.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中所述寡聚原花青素为单一聚合度的寡聚原花青素或不同聚合度的寡聚原花青素的混合物。
4.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中所述植物为葡萄籽、火炭母草、汉氏山葡萄、广东山葡萄或上述的组合。
5.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中所述植物为葡萄籽。
6.根据权利要求5所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中所述寡聚原花青素的单体聚合度为1-18。
7.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中所述植物为火炭母草。
8.根据权利要求7所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中所述寡聚原花青素的单体聚合度为1-18。
9.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中所述植物为汉氏山葡萄。
10.根据权利要求9所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中所述寡聚原花青素的单体聚合度为1-18。
11.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中所述植物为广东山葡萄。
12.根据权利要求11所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中所述寡聚原花青素的单体聚合度为1-18。
13.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中萃取所述植物的溶剂为极性有机溶剂或极性有机溶剂与水的混合物。
14.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中萃取所述植物的溶剂为丙酮或丙酮与水的混合物。
15.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中萃取所述植物的溶剂为低级醇或低级醇与水的混合物。
16.根据权利要求1所述的抗C型肝炎的植物萃取组合物，其中萃取所述植物的溶剂为乙酸乙酯或乙酸乙酯与水的混合物。
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