CN101808635A - 胡椒碱及其衍生物治疗神经疾病的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及胡椒碱及其衍生物在制备治疗和/或预防需要神经保护作用和/或神经再生的神经元疾病的药用组合物方面的用途。本发明进一步涉及胡椒碱及其衍生物在神经干细胞的体外分化方面的用途和这类经预处理细胞在干细胞治疗von神经疾病方面的用途。

Description

胡椒碱及其衍生物治疗神经疾病的用途
本发明涉及胡椒碱及其衍生物在制备治疗和/或预防神经学和/或精神病学疾病的药物方面的用途。本发明进一步涉及胡椒碱及其衍生物在神经干细胞的体外分化方面的用途和这类经预处理细胞在干细胞治疗von神经疾病方面的用途。
神经疾病是包括影响神经系统的疾病或障碍的医学病症。神经疾病可能伴有，例如，由于疾病或障碍的神经系统的病理学损伤功能，或者可能仅仅需要，例如，通过为了改善学习和记忆力而提高认知能力所达到的神经学功能的改善。
这类神经疾病的实例是具有大脑缺血或缺氧的病理生理学机理的疾病，包括中风(以及出血性脑中风)、脑微血管病(小血管病变)、分娩期内的(intrapartal)大脑缺血、心脏停搏或复苏期间/之后的大脑缺血、由于术中问题导致的大脑缺血、颈动脉手术期间的大脑缺血、大脑供血动脉的狭窄导致的慢性大脑缺血、窦血栓形成或脑静脉的血栓形成、脑血管畸形和糖尿病性视网膜病变。这些神经疾病的其它实例包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿氏舞蹈病、威尔逊氏病、多系统性萎缩、阿尔茨海默氏病、青光眼、皮克病(Pick’s disease)、路易体病(Lewy-body disease)、哈-施病(Hallervorden-Spatz disease)、变形性肌张力障碍、遗传感觉运动神经病变(HMSN)、格-施-沙病(Gerstmann-Strussler-Schanker disease)、克-雅病(creutzfeld-Jakobdisease)、马-约病(Machado-Josephr disease)、弗里德赖希共济失调、非-弗里德赖希共济失调、抽动秽语综合征、家族性震颤、橄榄体脑桥小脑变性(olivopontocerebellar degenerations)、伴脑癌综合征(paraneoplastic cerebral syndromes)、遗传性痉挛性截瘫、遗传性视神经病变(Leber)、视网膜色素变性、斯特格氏病(Stargardt disease)和卡恩斯-赛尔综合征(Kearns-Sayre syndrome)和感染性休克、脑内出血、蛛网膜下出血、多梗死性痴呆、炎性疾病(诸如脉管炎、多发性硬化，和吉-巴综合征(Guillain-Barre-syndrome))、神经外伤(诸如脊髓损伤，和脑外伤)、周围神经病变、多发性神经病、精神分裂症、抑郁症、代谢性脑病和中枢神经系统的感染(病毒、细菌、真菌)。
对大脑缺血的大部分研究和药理学物质的体内试验仅关注药物或研究的范式(paradigm)的即时作用(即引起中风后24h的梗死面积)。然而，特定物质的真实疗效的更有效的参数是对功能恢复的长期作用，这也反映在人的中风研究中，其中的临床评分(例如，斯堪的纳维亚(Scandinavian)中风评分、NIH评分、Barthel指数)也反映履行日常生活活动的能力。病灶后最初几天的康复可能由于水肿的消退或缺血半影带(penumbra)的再灌注。随着邻近的脑皮层区域接替原先由被损伤区域所履行的功能，急性期后大量的功能恢复可能归因于脑可塑性(Chen等，Neuroscience 2002；111：761-773)。为解释重组而提出的两个主要机理揭示出先前存在的、但是功能失活的连接和新连接诸如侧枝发芽的生长(Chen等，Neuroscience 2002；111：761-773)。通过对兴奋性突触除去抑制介导短期塑性变化，这可能是由于减少的GABA能抑制所致(Kaas，Annu Rev Neurosci.1991；14：137-167；Jones，CerebCortex.1993；3：361-372)。除了揭示潜在突触诸如长期增强(LTP)外，出现较长时间的塑性变化涉及一些机理，这需要NMDA受体活化和增加的细胞内钙浓度(Hess&Donoghue，Neurophysiol.1994；71：2543-2547)。长期变化还涉及随着突触形状、数量、大小和类型的变化的轴突再生和发芽(Kaas，Annu Rev Neurosci.1991；14：137-167)。近来的研究表明，大脑缺血之后的神经再生过程的增强改善了结果(Fisher等.Stroke 2006；37：1129-1136)。迫切需要开发在中风超急性期后将采用的细胞和药理学治疗方法。因此，被设计用于减少中风后神经学缺陷的成功的未来中风疗法除了血管再生成外，同时还应预防细胞死亡、刺激神经再生和可塑性。
大脑缺血可能源自减少脑血流(CBF)和导致氧和葡萄糖缺乏的多种原因。另一方面，创伤性脑损伤(TBI)涉及通常导致颅骨骨折并伴随着剪切和撕裂血管和脑组织的突然破坏脑软组织的原发性机械碰撞。这依次引发一系列以分子激活和细胞响应为特征的导致继发性损害的后果。这类继发性损害的发展是活动的过程，其中涉及许多生物化学途径(Leker&Shohami，Brain Res.Rev.2002；39：55-73)。已经鉴别出在缺血半影区和在暴露于继发性外伤后损害的区域导致继发性细胞死亡的损害途径之间的许多类似性(例如，过量谷氨酸释放导致的兴奋毒性、氧化氮、活性氧类、炎症和细胞凋亡(Leker&Shohami，BrainRes.Rev.2002；39：55-73))。此外，据报道，早期的缺血事件发生在创伤性脑损伤之后，增加了原发性机械损伤的缺血部分。
在西方世界，中风是死亡的第三大主要死因，残疾的主要原因。这表现出大量的社会经济重负。病因学可能是或者缺血(在大多数情况下)或者出血。缺血性中风的原因往往是栓塞或血栓形成。迄今为止，仍未有对大多数中风患者的有效治疗。而且，对已经患有中风的患者没有有效的治疗，以允许功能性神经元的神经发生。迄今为止，仅有的经临床验证的药物是组织纤溶酶原激活剂(TPA)和阿司匹林。由于阿司匹林的血小板聚集的抑制作用，仅能实现血栓形成风险的降低。这种作用并不适于在急性缺血性中风的情况下溶解已经存在的血栓。因此，仅仅抑制血小板聚集的药物只能适应于预防缺血性中风，却不能治疗急性缺血性中风。而且，在出血性中风的病例中，明确禁忌阿司匹林以及TPA。在由于缺乏葡萄糖和氧的即时梗死核心中的大量细胞死亡后，由于继发性机理，诸如谷氨酸兴奋毒性、细胞凋亡机理和自由基的产生，梗死区域随后扩大。
在西方工业化国家，心血管疾病是主要死因。在美国，每年有约1百万患者死亡，其中近50％的患者突然发病并发生在医院外(Zheng等，Circulation 2001；104：2158-2163)。每年100,000居民中的40-90位尝试心肺复苏(CPR)，这些患者中的25-50％得以自主循环恢复(ROSC)。然而，成功ROSC后的出院率仅为2-10％(Bottiger等，Heart 1999；82：674-679)。因此，每年美国的绝大多数心脏停搏受害者并未成功地医治。成功的CPR后的低存活率，即，对停博后住院死亡率的主要原因，是持续性脑损伤。心循环停止后的脑损伤既涉及对低氧应激的短期耐受性，又涉及特定的再灌注障碍(Safar，Circulation 1986；74：UV138-153，Hossmann，Resuscitation 1993；26：225-235)。最初，心循环停止后，可在血液动力学上稳定较大量的患者；然而，他们中的许多人死于中枢神经系统损伤。心脏停搏后脑损伤的个人、社会和经济后果是毁灭性的。因此，心脏停搏和复苏(″全身缺血和再灌注″)研究中最重要的问题之一是大脑复苏和停博后大创伤性脑损伤(Safar，Circulation 1986；74：UV138-153，Safar等，Crit Care Med 2002；30：140-144)。目前，用停博后任何治疗措施减少因心脏停搏期间的缺氧造成的神经元原发性损伤是不可能的。主要的病理生理学问题包括缺氧和随后的坏死、伴随着自由基形成和细胞的钙流入的再灌注损伤、兴奋性氨基酸的释放、脑微循环再灌注障碍和程序化神经元死亡或细胞凋亡(Safar，Circulation 1986；74：UV138-153，Safar等，Crit Care Med2002；30：140-144)。
肌萎缩性侧索硬化(ALS；洛盖赫里格病(Lou-Gehrig′s disease)；夏科氏病(Charcot′s disease))是每100.000人群0.4-1.76人的年发病率的神经退行性疾病(Adams等，神经病学原理，6.sup.th ed.，New York，1090-1095页)。具有泛化性肌束震颤、进行性萎缩和骨骼肌衰弱、痉挛和锥体束体征、构音障碍、吞咽困难和呼吸困难的典型表现的运动神经元病是最常见的。病理学主要由脊髓前角和低位脑干运动核中的神经细胞的损失组成，但也可包括皮层中的一级运动神经元。这种毁灭性疾病的发病机制在很大程度上仍然未知，尽管已经相当好地解答超氧化物歧化酶(SOD1)突变体在家族病例中的作用，它援引了氧化应激假说。迄今为止，已经描述SOD1蛋白中可产生ALS的超过90个突变体(Cleveland&Rothstein，Nat Rev Neurosci.2001；2：806-819)。还显示了在该疾病中神经丝蛋白的作用。兴奋毒性(一种过量谷氨酸刺激引起的机制)也是重要的因素，可通过利鲁唑对人患者的有益作用举例说明。SOD1突变体中所示的最令人信服的是，胱天蛋白酶(caspases)的激活和细胞凋亡似乎是ALS中的普通的最终途径(Ishigaki等，JNeurochem.2002；82：576-584.，Li等，Science 2000；288：335-339)。因此，ALS似乎也落入其它神经退行性疾病和中风中也起作用的相同的普通致病模式中，即谷氨酸参与、氧化应激和细胞程序性死亡。
在美国，青光眼是可预防性失明的首要原因。青光眼是一组病症，其中的视神经(视觉神经)被损坏，通常是因为升高的眼内压，但青光眼也可在正常或甚至低于正常眼压下发生。视乳头(ONH)的筛板(LC)区域是受伤的青光眼视神经病变中的主要部位。视觉的部分损失是永久的，但如果足够早的检测出来并开始治疗可使病症的发展最小化。然而，如果不予治疗，青光眼可能最终导致失明。在年长人群中，青光眼是最常见的眼疾之一。估计全世界有约66.8百万人患有青光眼带来的视觉损害，其中的6.7百万患有失明。
有多种不同类型的青光眼。最常见的形式是：原发性开角型青光眼；正常眼压型青光眼；闭角型青光眼；急性青光眼；色素性青光眼；剥脱综合征或与创伤有关的青光眼。
可用眼药水、药丸、激光手术、眼手术或多种方法的组合治疗青光眼。治疗的全部目的是预防视力进一步丧失。这是必要的，因为由于青光眼而丧失视力是不可逆转的。始终控制IOP是预防因青光眼所致视力丧失的关键。近来的开发强调为治疗青光眼需要神经保护作用和神经再生(Levin，Ophthalmol Clin North Am.2005；18：585-596，vii；Schwartz等，J Glaucoma.1996；5：427-432)。
阿尔茨海默氏病(AD)是以伴有日常生活活动下降和神经精神性症状或行为改变的进行性认知功能退化为特征的神经退行性疾病。它是最常见类型的痴呆。最显著的早期症状是失忆，这通常表现为轻微的健忘，随着疾病的发展，健忘不断地变得更加显著，而相对保存着更老的记忆。病理学过程主要由，与对淀粉样斑块和神经原纤维缠结的沉积的炎症反应一起的主要在颞顶皮质但也在额叶皮质的神经元损失或萎缩组成。未知该病的根本原因。有三种主要的竞争假说解释该病的原因。目前最有效的药物治疗理论所基于的最老的假说称为″胆碱能假说″，且认为AD是由于神经递质乙酰胆碱的生物合成减少。AD患者的脑组织中的乙酰胆碱水平降低，而谷氨酸水平通常升高。治疗乙酰胆碱缺乏的药物只用来治疗疾病的症状，既不能停止也不能逆转它(Walker&Rosen，Age Ageing 2006；35：332-335)。2000年后的研究包括集中于错折叠和聚集蛋白、β和τ淀粉样蛋白的作用的假说。两种假说的区别在于，一种提出τ蛋白异常引发疾病系列(cascade)，而另一种假说认为β淀粉样蛋白沉积是该疾病的致病因素(Mudher&Lovestone，Trends Neurosci.2002；25：22-26)。
目前无法治愈AD。当前可用的药物提供给一些患者相对少的对症治疗益处，却不能减缓疾病发展。它对记忆有少许帮助(Lyketsos等，Am J Geriatr Psychiatry.2006；14：561-572)。乙酰胆碱脂酶(AChE)抑制作用被认为是重要的，因为降低了胆碱能神经元的活性。乙酰胆碱脂酶抑制剂似乎适度地缓解症状但不改变根本的痴呆进展的过程。关于胆碱脂酶抑制剂的有效性存在显著的疑问。已在AD中得到验证的天然提取物之一是银杏(银杏白果)。美国正在进行大规模的、随机临床研究，并检验银杏预防痴呆的作用(DeKosky等，Contemp Clin Trials2006，27：238-253)。谷氨酸能神经元兴奋毒性引起AD所涉及的最近证据导致美卢君(一种新的NMDA受体拮抗剂)的开发和引入，其已经显示在临床上是适度有效的(Areosa-Sastre等，Cochrane Database SystRev.2004；18：CD003154)。近来对神经形成过程中的研究和内生神经前体(progenitors)的广泛存在的观察带来了希望，即这些细胞的潜力可被利用来恢复神经退行性疾病，诸如AD(Elder等，Mt Sinai J Med.2006；73：931-940；Brinton&Wang，Curr Alzheimer Res.2006；3：185-190；Kelleher-Andersson，Curr Alzheimer Res.2006；3：55-62；Greenberg&Jin，Curr Alzheimer Res.2006；3：25-8)。
一组神经退行性疾病以三核苷酸的扩增为特征。这些神经退行性三核苷酸重复障碍是慢性和进行性的，其特征为在运动、感觉或认知系统中神经元是选择性和对称性损失。症状往往是共济失调、痴呆或运动功能障碍。最著名的三核苷酸重复障碍是亨廷顿氏舞蹈病，其它是脊髓和延髓性肌萎缩(肯尼迪氏病(Kennedy disease)、常染色体显性脊髓小脑共济失调病：1型SCA1、2型SCA2、3型(马-约病)SCA3/MJD、6型SCA6、7型SCA7、8型SCA8、弗里德赖希共济失调(Friedreich Ataxis)和齿状核红核苍白球路易氏体(Dentatorubral pallidoluysian)萎缩症DRPLA/Haw-River综合征(Hardy&Gwinn-Hardy，Science 1998；282：1075-1079；Martin，NEngl JMed.1999；340：1970-1980；Schols等，AnnNeurol.1997；42：924-932)。
亨廷顿氏舞蹈病(HD)是常染色体显性遗传性神经精神性疾病，它引起进行性运动、认知和行为症状。HD的过程的特征是四肢、躯干和脸部的抽搐失控运动(舞蹈病)；心理能力的进行性损失；和精神问题的发展。HD发展而不缓解超过10-25年且通常出现在中年(30-50岁)。青少年HD(也称为Westphal变异或运动不能-强直HD)在20岁前发展，快速加重并造成肌肉强直，患者极少运动，甚或根本不能运动(运动不能)。估计每10,000人中有1人-在美国有近30,000人-患有HD。全部病例中的约16％为青少年HD。其核心病理学涉及基底神经节特别是尾核(caudate)和壳核(putamen)的变性，并由三核苷酸CAG的不稳定扩增、在染色体4上的单一常染色体基因IT-15中对谷氨酰胺的编码、对亨廷顿蛋白的突变形式的编码引起。不完全清楚基因IT-15突变如何改变该蛋白的功能。
HD的治疗致力于减少症状、预防并发症和为患者提供支持和帮助。目前有几种可利用的治疗舞蹈病的物质。可治疗其它神经病学症状，诸如肌张力障碍，但治疗与高风险的不利事件有关。另一方面，精神病症状往往可接受治疗，这些症状的缓解可提供生活质量的显著改善(Bonelli&Hofmann，Expert Opin Pharmacother.2004；5：767-776)。用来治疗HD症状的大部分药物都有副作用，诸如疲劳、躁动或兴奋过度。对于患HD基因突变的小鼠，胱胺(＝脱羧胱氨酸)缓解震颤并延长生命。药物似乎通过增加保护神经细胞或神经元免于变性的蛋白的活性起作用。研究表明，类似治疗或神经再生治疗总有一天可用于患有HD和相关障碍的人(Karpuj等，Nat Med.2002；8：143-149)。
溶酶体贮积病(LSD)是一组约有40种的不同疾病，各自的特点是在多个组织中的特定溶酶体酶缺乏。它们在5,000例活产中共出现约1例，并显示相当大的临床和生物化学异质性。尽管有两种(Hunter病和Fabry病)是X-连锁的(1inker)，它们大多数仍作为常染色体退行性疾病而遗传。它们包括Tay-Sachs病、神经节苷脂沉积症和Gaucher′s病和Niemann-Pick’s病，它们是脂质沉积障碍。大部分这些疾病影响脑且是致命的(Brooks等，Proc Natl AcadSci USA 2002；99：6216-6221)。
仅在治疗这些疾病的症状方面取得有限的成功。将正常基因放入体内的一个途径是替换酶，这可通过骨髓或干细胞移植或基因疗法产生酶。骨髓移植(BMT)已经在几种LSDs中成功并带来很少严重症状的长期存活。已可利用酶替代疗法(ERT)用于Gaucher病患者超过10年并产生巨大的益处。然而，在许多情况下，即使挨着细胞放置时，神经元也不能有效接受大型酶，所以治疗仍然无效。希望刺激神经再生和保护神经元免于细胞凋亡至少可缓解神经元症状和这类溶酶体贮积病的发展或具有预防作用。
多发性硬化(MS)是中枢神经系统的原型炎性自身性免疫障碍，有400分之一的生命危险，是青壮年神经病学残疾潜在的最常见的病因。全世界有约2-5百万的该病患者(Compston&Coles，Lancet 2002；359：1221-1231)。与所有复杂特质一样，该障碍由至今还无法识别的环境因素和易感基因之间的相互作用引起。这些因素一起引发一连串事件，包括免疫系统的衔接、轴突和神经胶质的急性炎性损伤、功能和结构修复的复原、发炎后神经胶质瘤和神经变性。这些过程相继涉及引起以恢复性发作、导致持久缺失的发作和继发性发展为特征的临床过程。治疗的目标是减少复发的次数、限制复发的持续作用、缓解症状、预防因病情发展引起的残疾和促进组织修复。
近来，神经保护作用已经被宣布为MS疗法的重要目标。扩展神经保护作用范围的基础是证明神经元和轴突损伤是MS损伤的关键特征。轴突丧失最可能支配进行性MS中的持续的神经学缺陷。近来的研究指出，轴突损伤出现在疾病的早期和损害的发展期间。轴突变性以两个不同阶段为特征，第一阶段出现在活性髓鞘质损坏期间，而第二个阶段出现在裸露的轴突似乎更易受到进一步损伤的慢性脱髓鞘斑中。然而，与退行性和缺血性中枢神经系统损伤相比，MS中的神经变性似乎由炎症、假定的自身免疫过程引起。因此，对MS中神经保护作用的挑战大于退行性和缺血性疾病中的挑战，因为MS需要神经保护作用疗法和有效免疫调节的组合。然而，轴索变性的确切机制和效应分子仍未确定，轴突保护疗法仍未建立（Bruck&Stadelmann，Neurol Sci.2003；24：S265-S267；Hohlfeld，Int MS J 2003；10：103-105)。
当损伤事件导致脊髓内的细胞损伤或切断传递脊髓上下信号的神经束时，就出现脊髓损伤(SCI)。SCI的最常见的类型包括挫伤(擦伤脊髓)和挤压(对脊髓施压引起)。其它类型的损伤包括裂伤(切割或撕开某些神经纤维，诸如枪伤引起的损伤)和中央索综合征(central cord)(对脊髓颈区域的皮质脊髓束的特定伤害)。严重的SCI往往引起麻痹(不能控制随意运动和身体肌肉)和受伤点以下的感觉和反射能力，包括自主活动，诸如呼吸和其它活动，诸如肠和膀胱控制的丧失。其它症状，诸如疼痛或对刺激的敏感性、肌肉痉挛和性功能障碍可能随时间的推移而出现。SCI患者还易于发生继发性的医学问题，诸如膀胱感染、肺感染和褥疮。尽管近来在紧急救护和康复方面的进展令许多SCI患者幸存，但减少损伤程度和恢复功能的方法仍然有限。急性SCI的即刻治疗包括缓解束压力、迅速(在受伤的8小时内)采用皮质类固醇，诸如，甲泼尼龙的药物疗法异最大限度地减少细胞损伤，和稳定脊椎骨以避免进一步损伤。SCI相关的残疾的类型的变化在很大程度上取决于损伤的严重性、发生损伤脊髓节和哪些神经纤维受伤。长期以来认为，成年哺乳动物中枢神经系统在SCI后不会再生。然而，近来已经在灵长类动物脊髓中观察到作为有助于神经修复的广泛的天然补偿性响应的细胞替换，这种替换是治疗强化的潜在目标(Yang等，JNeurosci.2006；26：2157-2166)。干细胞生物学包括鉴别神经干细胞领域的进展已经为开发新的治疗策略提供了新见解，这些策略针对介导受损中枢神经系统的再生，即激活这些内源性神经干细胞(Okano，Ernst Schering Res Found Workshop.2006；60：215-228)。
痴呆是由于大创伤性脑损伤或疾病而超出正常衰老可能预计的认知功能的进行性衰退。特别受影响的方面可能是记忆、注意力、语言和问题解决。尤其在疾病的后期，受影响的人可能对时间、方位和人无判断力。对大多数痴呆亚型而言，无治疗这种疾病的方法，尽管科学家们正在制备可减缓该进程的一类药物。胆碱脂酶抑制剂往往用于该疾病过程的早期。认知和行为干预也可能是适当的。称为N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)阻断剂的类别中的美卢君已经FDA批准用来治疗中度至重度痴呆。受损的神经发生在痴呆期间对认知功能，例如记忆的衰退起重要作用。已经表明，神经元细胞生成的恢复与获取痕量记忆的能力有关。结果表明，成人新生成的神经元参与海马依赖的记忆的形成(Shors等，Nature 2001；410：372-376)。神经科学已经表明，存在认知生物学和神经形成和细胞凋亡在大脑中长期对抗。目前的药理学目标针对神经元和认知能力的衰减(Allain等，PsycholNeuropsychiatr Vieil.2003；1：151-156)。
精神分裂症是最常见的精神疾病之一。每100人中约1(1％人群)受精神分裂症影响。全世界的所有种族和有文化的人中都发现这种障碍。精神分裂症以相同的数量影响男性和女性，尽管平均起来，男性似乎比女性更早发生精神分裂症。一般说来，男性在其中年的20年(mid20s)表现出精神分裂症的最初的体征，而女性在其老年的20年中表现出最初的体征。精神分裂症给社会带来巨大的代价，估计美国每年为$325亿。精神分裂症的特点有如下数种症状：妄想、幻觉、混乱思维和语言、消极症状(社交退缩、情感和表达缺失、减少的能量、动力和活动)、紧张症。精神分裂症的主要疗法基于神经松驰剂，诸如氯丙嗪、氟哌啶醇、奥氮平、氯氮平、甲硫哒嗪及其它。然而，安定(neuroleptic)治疗通常不会减轻精神分裂症的所有症状。而且，抗精神病药治疗可能具有严重的副作用，诸如迟发性运动障碍。精神分裂症的病因学仍不清楚，尽管似乎有强烈的遗传影响。最近，已经明确，精神分裂症具有至少神经退行性疾病的某些方面。特别地，MR研究已经显示精神分裂症患者的快速皮质灰质缺失(Thompson等，Proc Natl Acad SciUSA 2001；98：11650-11655；Cannon等，Proc Natl Acad Sci USA 2002；99：3228-3233)。因此，用神经保护作用和/或神经再生药物治疗精神分裂症是可靠的。
周围神经病变是神经系统的原发性损伤或功能障碍引发或引起的疼痛。存在许多分类系统，但它典型地分为中央(即丘脑痛、中风后痛)和外周传入神经阻滞痛(即感觉异常性股痛)。神经病可影响仅一根神经(单神经病)或几根神经(多神经病)。它们是异常性疼痛、痛觉过敏和感觉迟钝。常见症状包括灼烧、刀割所致剧烈而突然的疼痛(stabbing)、电击或深度痛感。神经痛的起因包括糖尿病神经病、三叉神经神经痛、复杂区域疼痛综合征和带状疱疹后神经痛、尿毒症、AIDS或营养缺乏。其它原因包括机械压迫，诸如挤压或受压性损害(entrapment)、直接伤害、穿透性损伤、挫伤、骨折或骨脱臼；涉及表皮神经的压迫(尺骨、桡骨或腓骨)，其可因长时间使用拐杖或保持一种姿势太久所引起，或因肿瘤；神经内出血；暴露于寒冷或辐射或(罕见)某些药品或毒性物质；和血管或胶原疾病，诸如动脉粥样硬化、系统性红斑狼疮、硬皮病、类肉瘤病、类风湿关节炎和结节性多动脉炎。受压性神经病的常见例子是腕管综合征，其由于计算机应用的增加已经变得更加常见。尽管周围神经病的起因不同，但它们都出现常见的症状，包括手臂、手、腿部和/或脚部的虚弱、麻木、感觉异常(异常感觉，诸如灼烧、发痒、刺痛或麻刺感)和疼痛。大量起因具有未知的原因。
治疗基础病症可缓解周围神经病的某些起因。在其它情况下，治疗可集中于止痛。周围神经病变的疗法根据病因而有所不同。例如，由糖尿病引起的周围神经病变的疗法涉及对糖尿病的控制。在肿瘤或破裂的椎间盘是病因的病例中，疗法可能涉及手术去除肿瘤或修复破裂的椎间盘。在挤压性损害或压迫性神经病中，治疗可由用夹板或手术对尺骨或中间神经减压构成。腓骨和桡骨压迫性神经病可能需要避开压迫。理疗和/或夹板可用于预防挛缩。外周神经本身有显著的再生能力，采用神经生长因子或基因疗法的新治疗可能提供未来甚至更好的康复机会。因此，这种用神经再生药物再生外周神经的强化是可靠的。
在人类中，需要增加认知能力和提高智力的方法。在现代理解中，″智力″并不限于纯逻辑学或语义学的能力。例如，Howard Gardner的多元智力(multiple intelligences)理论从进化和人类学的视角评价智力，并产生包括运动、音乐、艺术和移情作用能力以及更通常地与智力有关并由IQ测试测定的语言学/逻辑学能力的更广阔的视野。这种广义的智力还扩展到创造力领域。此外，还有称为ARML(与年龄有关的失忆)或MCI(轻度认知损伤)或ARCD(与年龄有关的认知功能减退)的人的非病理学疾病，其通常开始于约40岁并不同于阿尔茨海默氏病的早期体征。
整个成年期都存在神经细胞的生理学损失，估计每天多达100,000个神经元。整个成年期，脑重量和体积逐渐减少。这种衰退每十年约2％。与先前持有的观点相反，50岁后的衰退不会加速，而是以与早期成年期开始的大致相同的速度继续衰退。直到晚年，这种积聚作用通常不受到关注。
尽管大脑确实在尺寸上收缩了，但它收缩得并不均一。某些构造更易于收缩。例如，涉及记忆的两种构造海马和额叶往往变得更小。这部分是由于神经元的损失和部分地由于某些神经元的萎缩。其它许多大脑构造并未在大小上受到损失。心智处理的减慢可能由神经元的退化引起，不管它们是损失、收缩还是失去连接。充分起作用的神经元的这种缺失使得补充额外的神经元网络达成并不简单或无意识的智力目标成为必需。因此，该过程变得缓慢。
一部分额叶，称为额叶前部皮质，涉及监测和控制思想和行动。出现在该大脑区域的萎缩可解释许多较年长的成人经历过的词汇查找困难。它也能解释忘记车钥匙放在何处或一般的心不在焉。认为额叶和海马两者的收缩是记忆困难的原因。因此，还仍然需要改善或提高个体的认知能力。这可通过促进脑的神经保护作用和/或神经再生过程实现。
鉴于上述，有治疗神经学和/或精神病学疾病，诸如涉及神经系统中塑性增强和功能恢复或细胞死亡的神经病的需求。特别地，有通过尤其在急性神经疾病期间对神经细胞提供神经保护作用，或者介导神经形成以从神经元丢失中恢复，尤其是为在中风、脊髓创伤或脊髓损伤后恢复来治疗神经病的需求。
因此，基于本发明的技术难题可能被看作治疗、改善和/或预防由神经变性或损害或不充分的神经发生引起的神经学和/或精神病学疾病的手段和方法的前提。通过权利要求书和下文中描述的实施方案的特征解决所述技术难题。
因此，本发明涉及具有通式(I)的化合物在制备治疗和/或预防神经元疾病的药用组合物方面的用途
Figure GPA00001040231500131
其中
n＝0、1或2，前提是
当n＝0时，R2和R3表示氢原子或共同表示或者呈E或者呈Z几何构型的碳-碳双键；
当n＝1或2时，R2和R3表示氢原子或共同表示或者呈E或者呈Z几何构型的碳碳双键，及R4和R5表示氢原子或共同表示或者呈E或者呈Z几何构型的碳-碳双键；
m＝0、1、2或3，前提是
当m＝1时，R1表示具有1-3个碳原子的烷氧基、羟基或卤原子
当m＝2时，各R1独立表示具有1-3个碳原子的烷氧基，或两个R1共同表示3’，4’-亚甲二氧基、3’，4’-亚乙二氧基或3’，4’-亚丙二氧基；
当m＝3时，两个R1共同表示3’，4’-亚甲二氧基、3’，4’-亚乙二氧基或3’，4’-亚丙二氧基和其它R1表示具有1-3个碳原子的烷氧基、羟基或卤原子；
R6表示吡咯烷-1-基(pyrrolidino)、哌啶子基(piperidino)、氮杂环庚烷-1-基(azepano)、4-甲基哌啶子基、吗啉代、4，5-二氢-2-噻唑氨基、2-四氢化糠基氨基、2-四氢呋喃基氨基、4-6个碳原子的N-单烷基氨基、4-8个碳原子的N-单环烷基氨基、双环[2.2.1]庚基氨基、3’，4’-亚甲二氧基取代的苄基氨基、2-苯乙基氨基或具有1-6个碳原子的烷氧基。
上述卤原子优选为氯原子。
本发明的优选化合物具有通式(II)
Figure GPA00001040231500141
其中
n是0或1和R6具有如上所述的意义，和
m＝0、1、2或3，前提是
当m＝1时，R1表示具有1-3个碳原子的烷氧基或卤原子；
当m＝2时，各R1独立表示具有1-3个碳原子的烷氧基，或两个R1共同表示3’，4’-亚甲二氧基、3’，4’-亚乙二氧基或3’，4’-亚丙二氧基；
当m＝3时，两个R1共同表示3’，4’-亚甲二氧基、3’，4’-亚乙二氧基或3’，4’-亚丙二氧基和其它R1表示具有1-3个碳原子的烷氧基或卤原子。
上述卤原子优选为氯原子。
优选地，R6表示吡咯烷-1-基、哌啶子基、氮杂环庚烷-1-基、4-甲基哌啶子基、吗啉代、4，5-二氢-2-噻唑氨基、2-四氢化糠基氨基、2-四氢呋喃基氨基、4-6个碳原子的N-单烷基氨基、4-8个碳原子的N-单环烷基氨基、双环[2.2.1]庚基氨基、3’，4’-亚甲二氧基取代的苄基氨基、2-苯乙基氨基。
进一步地，本发明化合物优选具有通式(III)
其中
R6表示吡咯烷-1-基、哌啶子基、氮杂环庚烷-1-基、4-甲基哌啶子基、吗啉代、4，5-二氢-2-噻唑氨基、2-四氢化糠基氨基、2-四氢呋喃基氨基、4-6个碳原子的N-单烷基氨基、4-8个碳原子的N-单环烷基氨基、双环[2.2.1]庚基氨基、3’，4’-亚甲二氧基取代的苄基氨基、2-苯乙基氨基，和
m＝0、1、2或3，前提是
当m＝1时，R1表示具有1-3个碳原子的烷氧基或卤原子；
当m＝2时，各R1独立表示具有1-3个碳原子的烷氧基，或两个R1共同表示3’，4’-亚甲二氧基、3’，4’-亚乙二氧基或3’，4’-亚丙二氧基；
当m＝3时，两个R1共同表示3’，4’-亚甲二氧基、3’，4’-亚乙二氧基或3’，4’-亚丙二氧基和其它R1表示具有1-3个碳原子的烷氧基或卤原子。
上述卤原子优选为氯原子。
优选地，R6表示氮杂环庚烷-1-基、4，5-二氢-2-噻唑氨基、2-四氢化糠基氨基、2-四氢呋喃基氨基、4-6个碳原子的N-单烷基氨基、4-8个碳原子的N-单环烷基氨基或双环[2.2.1]庚基氨基。
通式I和II表示胡椒碱及其衍生物。通式III表示胡椒碱的衍生物。
更优选地，本发明化合物是胡椒碱、三中脉酰胺(Trichostachine)、荜拔宁酰胺、5-E，E-胡椒酰(piperinoyl)甲胺、5-E，E-胡椒酰乙胺、5-E，E-胡椒酰异丙胺、5-E，E-胡椒酰环己胺、5-E，E-胡椒酰丁胺、去哌啶基(Despiperidyl)-甲氧基哌啶、5-E，E-胡椒酰吗啉、5-E，E-胡椒酰己胺、5-E，E-胡椒酰胡椒酰胺(piperinoylamine)、5-E，E-胡椒酸乙酯、5-E，E-胡椒酸异丙酯、5-E，E-胡椒酸丙酯、5-E，E-胡椒酸丁基酯、抗痫灵(Antiepliepsirine)、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环己胺、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环庚胺、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环戊胺、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)吡咯烷、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)吗啉、3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酸甲酯、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-环辛基丙烯酰胺、1-[3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰]-4-甲基哌啶、3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-N-(4，5-二氢-噻唑-2-基)-丙烯酰胺、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-(四氢-2-呋喃基甲基)丙烯酰胺、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-双环[2.2.1]庚-2-基丙烯酰胺、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(8-氯-2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-6-基)-丙烯酮(propenone)、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英(dioxepin)-7-基)-丙烯酮、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(9-氯-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮、3-(氯-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)N-环己基-丙烯酰胺、N-环辛基-3-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺、3-(4-乙氧基苯基)-N-(四氢-2-呋喃基)丙烯酰胺、N-环己基-3-(4-乙氧基苯基)丙烯酰胺、N-环戊基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺、N-环庚基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺、1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]哌啶、1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]氮杂环庚烷、(2E)-3-(4-氯苯基)-1-哌啶基丙-2-烯-1-酮、胡椒亭、香豆酰哌啶(Coumaperine)、4’-甲氧基异香豆酰哌啶、Wisanine、1-(4-甲氧基-肉桂酰)哌啶、1-(3-甲氧基-肉桂酰)哌啶、1-(2-甲氧基-肉桂酰)哌啶、1-肉桂酰-哌啶、1-(3，4-二甲氧基-肉桂酰)哌啶、3-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙酸胡椒酯、1，2，3，4-四氢胡椒碱、胡椒新碱(Piperanine)、胡椒脂碱、异胡椒碱(Isopiperine)或异胡椒脂碱(Isochavicine)。
特别地，本发明化合物是胡椒碱。
这些化合物为本领域所知并列于下表1中，表明化学名称、式(I)参数的定义和所引用的化合物的参考文献。
表1
Figure GPA00001040231500181
表I-续
Figure GPA00001040231500191
Figure GPA00001040231500201
表I-续
Figure GPA00001040231500211
表I-续
如通过本文所述的体外试验所测定的那样，要应用于本发明的用途和方法的上述化合物优选保留胡椒碱的至少10％，更优选50％的神经再生和/或神经保护活性。
胡椒碱为天然发现于属于胡椒科(Piperaceae)的植物，诸如胡椒(Piper nigrum)(通常称为黑胡椒)和荜茇(Piper longum)(通常称为荜拨)中的生物碱。胡椒碱是这些植物中主要的辛辣物质并分离自黑胡椒和荜拨植物的果实。术语黑胡椒既用于植物胡椒，也用于主要在植物果实中的香料。
胡椒碱是基本溶解于水的固体物质。它是起初无味却留下强烈灼烧感(burning)回味的弱碱。胡椒碱属于香草酸(vanilloid)家族，一个还包括辣椒素(辣椒(hot chili peppers)中的辛辣物质的家族的化合物。它的分子式是C17H19NO3，和其分子量是285.34道尔顿。胡椒碱是1-胡椒酰哌啶的反-反立体异构体。它也被称为(E，E)-1-胡椒酰哌啶和(E，E)1-[5-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-1-氧代-2，4-戊二烯基]哌啶。它由以下化学结构表示：
Figure GPA00001040231500241
胡椒碱首先由哥本哈根的Oersted于1819年获得，他认为它是有机碱。它可经多种方法分离。根据Cazeneuve和Caillol(Jahresb.derPharm.，1877，68页)，将粉末辣椒与石灰乳混合，混合物经水浴蒸发至干，并用醚萃取。该溶剂一蒸发就留下呈不纯晶体形式的胡椒碱，它最好从丙酮中结晶纯化(Flückiger，1891)。苏门答腊胡椒平均产出8.10％，新加坡白胡椒平均产生9.15％胡椒碱。Stevenson自50g胡椒与甲醇制备萃取物，再通过碳酸钾溶出树脂部分(Stevenson，Amer.Jour.Pharm.，1885，p.513)。残余的胡椒碱经水洗涤并从醇中再结晶。
美国专利号5,744,161描述从得自胡椒科的果实或植物的适用油性树脂原料分离胡椒碱。异脲、脲或脲衍生物可用来从油性树脂除去除胡椒碱外的有机物质，从而得到高纯度胡椒碱(US6,054,585)。采用水溶助剂水溶液萃取胡椒碱描述于美国专利号6,365,601中。
黑胡椒和荜拔已经用于印度草药(Ayurvedic medicine)以治疗多种疾病。一种这类制剂被称为梵文名称trikatu，并由黑胡椒、荜拔和姜组成。称为梵文名称pippali的另一种制剂由荜拔组成。认为胡椒碱是这些印度草药的主要生物活性物质之一。
胡椒碱增加生热作用并依次对代谢的营养需要产生需求。
它具有公认的抗炎活性并可能具有促进消化过程的活性。
胡椒碱的公认的抗炎活性的机制可由胡椒碱的可能的抗氧化活性而部分地作出解释。
胡椒碱对角叉菜胶介导的大鼠爪子水肿和炎症的某些其它实验模型显示出显著的抗炎活性。在一个动物研究中，胡椒碱减少由角叉菜胶介导的肝脏脂质过氧化、酸性磷酸酶和水肿(Dhuley等，Indian JExp Biol.1993；31：443-445；Mujumdar等，Jpn J Med Sci Biol.1990；433：95-100)。
在大鼠肠模型中，据称胡椒碱提供保护免于由大量化学致癌物介导的氧化变化(Khajuria等，Mol Cell Biochem.1998；189：113-118)。
动物和人的体外研究表明，胡椒碱可显著地提高许多药物和某些营养补充剂的生物利用率(Atal等，J Pharmacol Exp Ther.1985；232：258-262；Badmaev等Nutr Res.1999；19：381-388；Badmaev等JNutr Biochem.2000；11：109-113；Bano等，Eur J Clin Pharmacol.1991；41：615-617；Pattanaik等，Phytother Res.2006；20：683-686；US5616593；US 5,972,382；US6,017,932；EP0650728；EP1494749)。据报道，已经表明，除其它的之外，它还起到某些抗菌剂、抗原虫药、驱蠕虫药、抗组胺剂、非类固醇抗炎药、肌肉松弛药和抗癌药的作用。它还提高辅酶Q10、姜黄素(curcumin)、β-胡罗卜素、心得安(propanolol)和茶碱的生物利用率。
该机制被认为是通过抑制受影响药物的生物转化所涉及的某些酶。已经发现胡椒碱是药物和异物(xenobiotic)代谢的非特异性抑制剂。它似乎抑制许多不同的细胞色素P450同工型以及UDP-葡糖醛酸基转移酶和肝芳烃羟化酶和涉及药物和异物代谢的其它酶。然而，仍不可能根据理论依据预测胡椒碱将对任何选定的食物或药物产生的作用。
除了其对生物利用率的作用外，胡椒碱还对身体具有大量不同的其它作用，诸如刺激β内啡肽、5-羟色胺、肾上腺素、黑色素和消化酶的生成，缓解哮喘症状和疼痛，及减少溃疡和产生胃酸。
已经表明，如通式I表示的胡椒碱及其衍生物刺激黑素细胞的增殖。因此，建议将这些化合物的药物制剂用于治疗皮肤色素沉着障碍(EP1094813)。
黑胡椒也已经用于传统中药以治疗癫痫症。已经对具有某些抗惊厥活性的胡椒碱及其衍生物(诸如抗痫灵)提出了要求，并因此已经在中国用来治疗某些形式的癫痫(Pei，Epilepsia 1983；24：177-182；Liu等，Biochemical药理学1984；33：3883-3886)。
在小鼠中，经腹膜内注射的胡椒碱抑制由海人草酸盐(kainate)介导的阵挛性惊厥。它不显著阻断L-谷氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸或琥珀酸胍(quanidinosuccinate)介导的的癫痫活性(D′Hooge等，Arzneimittelforschung.1996；46：557-560)。
仍不完全了解胡椒碱在人中的药物动力学。在大鼠中，胡椒碱在消化后被吸收，并已经鉴别出某些代谢物：在尿中发现胡椒基酸、胡椒基醇，胡椒醛和香草酸。胆汁中发现一种代谢物胡椒酸。从消化道快速并完全地吸收胡椒碱。对其它物质吸收的影响在给药后约15分钟时开始并持续1-2小时。给药后约1-2小时出现血液水平峰值，但对代谢酶的影响可持续更久。需要进一步的人药物动力学研究。
胡椒碱在结构上与辣椒素和姜油酮有关，它们也是分别发现于干辣椒和姜中的天然的刺激味化合物。共同具有香草基部分的这些化合物能激动可被辣椒平抑制的香草酸类(vanilloid)受体(Liu&Simon等，JNeurophysiol.1996；76：1858-1869)。已经发现胡椒碱显著激活可被物质SB-366791选择性并有效抑制的香草酸类受体亚型TRPV1(McNamara等，Br J pharmacology 2005；144：781-790；Varga等，Neurosci Lett.2005；385：137-142；Gunthrope等，Neuropharmacology2004；46：133-146)。
包含变化较少的结构式的胡椒碱衍生物通常表示出基本不变的生物学效应。因此，它们可作为胡椒碱的选择。通过文献知道共享其功能活性及其合成和特性的胡椒碱的各种衍生物(EP1094813；Pei，Epilepsia 1983；24：177-182；Liu等，Biochemicalpharmacology 1984；33：3883-3886)。
通过文献知道根据本发明采用的化合物的分离和/或合成方法(US5,744,161；US6,054,585；US6,365,601；EP1094813；US6,346,539；Pei，Epilepsia 1983；24：177-182；Liu等，Biochemicalpharmacology 1984；33：3883-3886)。胡椒碱的较少的化学变化可潜在地改善物理和/或生物性质，诸如稳定性、溶解性、透过血脑屏障而不消除胡椒碱的神经再生和/或神经保护作用的能力。对本领域技术人员而言，例如，为改善药物动力学或不利的副作用的模式而修饰最初的药理学活性化合物的方法已成熟地确立。本文所述的体外和体内试验适于测试这类经修饰化合物的神经再生和神经保护作用。
胡椒碱以及共同具有香草基部分的结构相关的化合物辣椒素和姜油酮是TRPV1受体的已知激动剂(Liu&Simon等，J Neurophysiol.1996；76：1858-1869)。然而，根据本发明，已经发现胡椒碱的神经再生和神经保护作用不被该受体的激动作用介导。在本文所述的体外试验中，未能检测出辣椒素的神经再生和神经保护作用。而且，在本文所述的体外试验中，胡椒碱的神经再生和神经保护作用未因特异性TRPV1受体抑制剂SB366791而减少。
实施例6中给出这些发现的更加详尽的说明。
如本文所用的术语“神经发生”原则上指自干细胞形成神经元，优选地，指自成人神经干细胞形成神经元。最近，已经认识到为治疗神经病形成新的神经细胞(神经发生)的重要性。与其它许多组织不同，成熟大脑具有有限的再生能力，其细胞特殊化的罕有程度限制了残余健康组织可承担的受损大脑功能的程度。然而，脑神经元衍生自存留在成人脑中的母体细胞，从而对成人脑中内生神经母体的刺激可能具有治疗可能性。
神经发生基于神经干细胞分化为新的神经元。它发生在成人脑中的离散区域，包括侧脑室室下区吻侧(SVZ)和齿状回(DG)的颗粒下层(SGZ)。尤其在特定神经学范例---例如，大脑缺血之后，成年动物出现神经发生(Jin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001；98：4710-4715；Jiang等，Stroke 2001；32：1201-1207；Kee等，Exp.Brain.Res.2001；136：313-320；Perfilieva等，J.Cereb.Blood Flow Metab.2001；21：211-217)。人也己显示出神经发生(Eriksson等，Nat Med.1998；4：1313-1317)，并的确产生功能性神经元(van Praag等，Nature 2002；415：1030-1034)。特别地，齿状回和门的颗粒下层有可能由成人神经干细胞生成新的神经元(Gage等，J Neurobiol 1998；36：249-266)。
成人神经干细胞不像胚胎干细胞那样具有分化成有机体的所有细胞类型的能力(全能性)，但它们有可能分化成脑组织的各种细胞类型(多能性t)。在分化期间，它们经历重要的形态和功能变化(van Praag等，Nature 2002；415：1030-1034)。神经元细胞的再生(神经再生)取决于神经发生的机制并可恢复神经再生过程。具有介导神经发生的能力的化合物可潜在地用于不止一种疾病，因为神经组织再生的必要性(在急性障碍和慢性神经退行性疾病两者中)是类似的。
术语“神经保护作用”意指神经系统内保护神经元免于，例如，在创伤性脑损伤后或作为慢性神经退行性疾病的结果的细胞凋亡或变性的机制。神经保护作用的目的是限制CNS损伤后的神经元功能障碍/死亡并试图维持大脑中细胞相互作用的最大可能的完整性，使神经功能不受干扰。有很多种类的神经保护制品正在研究中(例如，自由基清除剂、细胞凋亡抑制剂、神经营养因子、金属离子螯合剂和抗兴奋性毒性剂(anti-excitotoxic agents))。神经保护制品能有效地用于不止一种疾病，因为导致神经组织损伤的许多基本机制(在急性障碍和慢性神经退行性疾病两者中)是类似的。
有利地，甚至在进行性神经元丢失后的晚期，神经再生活性化合物，诸如胡椒碱及其衍生物能治疗神经疾病。本领域一般认为，通过血块溶解的人急性中风治疗的机会窗限于数小时内。对于重组TPA，中风发生后认可的时间窗是3小时，然而，至多4.5h治疗可能是有效的(Davalos，Cerebrovasc Dis 2005；20 Suppl 2：135-139)。认为鉴定脑组织可被神经保护作用挽救的患者的概念是扩散/灌注错配概念。患者出现错配的比例和错配体积的程度随时间下降，但是这已经提示某些患者在24h可被检测出来，其根据错配理论可表示神经保护作用的治疗时间窗的终点(Baron&Moseley.J Stroke CerebrovascDis 2000；9：15-20)。假定，恢复血液循环，从而除去缺血和缺氧情况或神经保护作用仅在中风发作后至多4、5h或最迟不超过24h内有效。仅仅通过神经保护作用机制起作用的化合物只可被用来停止或减轻继续进行的神经元死亡过程。相比之下，神经再生化合物能够逆转已经发生的神经元丢失并有可能不仅停止或减轻，而且还逆转急性神经病，诸如中风或还有慢性神经病的作用。神经再生化合物可有效治疗中风，即使治疗迟于中风发作后4、5h或甚至迟于24h。
具体说来，已经出乎意料地发现，根据本发明所提及的化合物具有神经保护作用和神经再生作用。因此，这些化合物可单独或联合用来治疗需要神经保护作用和/或神经再生的神经学病症或疾病。
因此，本发明还构思一种治疗患有神经疾病患者的方法，其包括给予患有所述神经疾病的患者治疗有效量的如上定义的化合物。要治疗的优选神经学病症或疾病是本说明书中其它地方明确提及的那些。
已经表明，根据本发明的化合物具有促进神经发生的能力，从而，例如，改善缺血损伤后的行为结果。神经发生是基于能导致神经网络塑性增强并能取代神经元的逐渐丢失的机制。因此，本发明的一个实施方案是，通过根据本文用药讨论，给予个体本文所述的一种或多种组合物，提供给患有表现出和/或被认为有一定程度的认知功能缺损的个体提高、改善或增加的认知能力。在供选择的实施方案中，认知功能增强甚至也可使处于非病理学状况下的个体，例如，不存在认知功能缺损的那些个体受益。
除神经再生活性外，还已经发现化合物对神经元细胞起到抗凋亡作用，从而它们可增强神经元的活力。因此，依据本发明所提出的化合物可被当作神经保护作用化合物。术语“神经保护作用化合物”指对体外(细胞培养系统)或体内(缺血、缺氧和/或神经退行性疾病，诸如中风、ALS或亨廷顿氏舞蹈病的动物模型)或人患者的神经细胞和/或脑组织共同具有保护作用的物质。
可通过测定所述化合物对神经干细胞的分化的刺激作用，体外测定依据本发明的化合物的神经再生作用。因此，必须分离成人神经干细胞并随后将其于合适的培养基中培养。在体外传代几次后，干细胞必须被DNA构件编码共转染为两个可分辨的报道基因蛋白，其中之一在组成型启动子的控制下，而另一个在β-III-微管蛋白启动子的控制下。在神经干细胞分化过程期间，介导β-III-微管蛋白启动子；因此，在该启动子控制下的报道基因蛋白用作这样的体外双重报道基因试验中的干细胞分化的标记(Schneider等，J Clin Investigation2005；115：2083-2098)。本领域技术人员知道几种适用的组成型启动子，诸如SV40-启动子、TK-启动子或CMV-启动子。作为这样的双重报道基因试验的可分辩的报道基因蛋白，人们可采用可辨别的荧光素酶，诸如萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶。用试验化合物孵化转染细胞，并用阳性和阴性对照物进行标准化和本底校正。作为阳性对照化合物，可使用视黄酸(Guan等，Cell Tissue Res.2001；305：171-176；Jacobs等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2006；103：3902-3907)，适用的阴性对照是细胞的假处理。试验化合物的神经再生活性被测定为β-III-微管蛋白启动子控制的报道基因蛋白的信号与组成性表达的报道基因蛋白信号之比，并被表示为对照物的倍数。该试验适用于评价胡椒碱及其衍生物的神经再生活性，而且还可用来筛选其它潜在的神经再生化合物。这样的筛选可优选用来测试已经知道在其毒理学、生物利用率、溶解性、稳定性等方面适于作为药物的化合物。
实施例1和2中给出评价神经再生作用的这类体外试验的更详细的说明。
本发明人还可论证胡椒碱的体内神经原性作用。可用BrdU/NeuN双重染色法分析因给予胡椒碱对成人脑的新生成神经元的刺激作用(Bagley等BMC Neurosci 2007；8：92)。该结果明显表明，胡椒碱及其衍生物神经原性作用的体外基评价可作为体内情况的前兆。
实施例10中给出神经原性作用的体内分析的更详细说明。
通过抑制受影响神经元的细胞凋亡实现神经保护作用。可通过测定胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7活性，体外评价胡椒碱及其衍生物的抗凋亡作用。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(胱天蛋白酶)家族的这些成员在哺乳动物细胞的细胞凋亡中起到关键效应子(effector)作用。必须分离皮质神经元并随后培养于合适的培养基中。在细胞凋亡物质诸如星性孢菌素的存在下，细胞必须与试验化合物一起培养。对细胞采用单独星性孢菌素和假处理的平行途径用作阴性和阳性对照。该试验评价试验化合物是否可完全，抑或是部分补偿星性孢菌素的细胞凋亡作用。该试验不仅适于评价胡椒碱及其衍生物的神经保护作用活性，而且还可用来筛选其它潜在的神经保护作用化合物。这样的筛选可优选用来测试已知在其毒理学、生物利用率、溶解性、稳定性等方面适于作为药物的化合物。
而且，可以表明，胡椒碱及其衍生物也能对运动神经元细胞系起到神经保护作用。既然运动神经元在ALS中受影响，这明确表明根据本发明的化合物适于治疗慢性神经退行性疾病，即ALS。
实施例3、4和10中给出评价对神经元或运动神经元的抗凋亡作用的这类体外试验的更加详细的说明。
生存力试验允许就其对细胞，诸如神经元的作用进一步评价试验化合物。因此，用报道基因构件(例如，荧光素酶构件)稳定转染的细胞系(例如，SH-SY5Y细胞)必需与试验化合物一起培养，并与阳性和阴性对照(例如，分别是星性孢菌素和假处理)平行进行。随后，报道基因构件产生的信号充当在试验化合物存在下的细胞生存力的读数。该试验能评价试验化合物本身的潜在神经毒性作用。在该试验中，本发明人发现胡椒碱及其衍生物没有细胞毒作用。
实施例5中给出评价对神经元活力的作用的这样的体外试验的更加详细的说明。
用于某些神经学病症和疾病的动物模型可用来进一步评价试验化合物的体内作用。大鼠MCAO模型(大脑中动脉闭塞；肌丝模型(filament model))是中风的动物模型，其中广泛种类的不同神经元类型因缺血/缺氧而损伤。各种神经疾病的其它动物模型为本领域技术人员所熟知。这类动物模型有，例如，但不限于针对肌萎缩性侧索硬化的SOD1G93A-转基因小鼠(Almer等，J Neurochem 1999；72：2415-2425)、用于阿尔茨海默氏病的APP-转基因小鼠(Janus&Westaway，Physiol Behav 2001；73：873-886)、用于亨廷顿氏舞蹈病的外显子-1-huntingtin-转基因小鼠(Sathasivam等，Philos Trans R SocLond B Biol Sci.1999；354：963-969)和用于弗里德赖希共济失调的FRDA-转基因小鼠(Al-Mahdawi Genomics 2006：88：580-590)。需要使经试验化合物治疗的动物与假治疗动物作比较。本发明人发现，与假治疗相比，大鼠MCAO模型动物经胡椒碱治疗导致显然减少的梗死体积。该分析表明，胡椒碱对神经疾病，诸如中风表现出体内神经保护作用和/或神经再生活性。它也可用来评价胡椒碱衍生物的神经保护和/或神经再生活性。
类似地，本发明人发现，与假治疗相比，用胡椒碱治疗患实验性SCI的小鼠导致明显改善的结果，这在体内进一步证明胡椒碱的神经保护和/或神经再生活性。
实施例7和8中给出对中风和SCI动物模型的胡椒碱分析的更加详尽的说明。
依据本发明所提出的化合物，单独、相互组合和/或与一种或多种其它因子组合可用来治疗需要神经保护作用和神经再生的神经疾病。这些神经疾病包括大脑缺血(诸如中风、创伤性脑损伤或由于心循环停止的大脑缺血)、肌萎缩性侧索硬化、青光眼、阿尔茨海默氏病、神经退行性三核苷酸重复障碍(诸如亨廷顿氏舞蹈病)、神经退行性溶酶体贮积症、多发性硬化、脊髓损伤、脊髓创伤、痴呆、精神分裂症和周围神经病变。另外，所述化合物，单独、相互组合和/或与一种或多种其它因子组合可用来提高例如，在非病理学状况，诸如与年龄有关的失忆、轻度认知障碍或与年龄有关的认知功能障碍的情况下的学习和记忆力力。
在本发明的用途和方法的优选实施方案中，如本文所定义的化合物是药用组合物中包含的仅有的神经原性和/或神经保护作用化合物。因此，药用组合物优选不包含其它神经原性和/或神经保护作用化合物。然而，应理解，所述的药用组合物可能包括如本文所定义的化合物，和因此包含胡椒碱衍生物的组合。同样，药用组合物，尤其是为治疗患有缺血性脑中风的患者而制备的药用组合物可包含溶栓和/或抗凝血酶原的化合物，尤其是诸如组织纤溶酶原激活剂(TPA)和阿司匹林(乙酰水杨酸)的化合物。同样，药用组合物优选为给予如本文所定义患者的仅有的活性神经原性和/或神经保护作用化合物。
在本发明的用途和方法的优选实施方案中，如本文所定义的化合物，单独、相互组合和/或与一种或多种其它非神经原性和非神经保护因子的组合，可通过为患有疾病的这些患者提供保护和再生神经元细胞，用来治疗基于神经组织缺血和/或缺氧，诸如大脑缺血(例如，中风、创伤性脑损伤或由于心循环停止所致的大脑缺血)、青光眼、脊髓损伤或脊髓创伤的神经疾病。普通病理学和在这些神经疾病中起作用的保护过程表明，依据本发明的化合物的治疗将是相当有效的。
″治疗″指缓解、中断、阻止或停止疾病或病症的发展，并非必然地需要完全消除所有疾病症状和体征。而且，术语“治疗”还指改善患有如本文所提到的神经疾病或障碍的患者的病情。而且，如本领域那些技术人员将理解的那样，这类治疗通常不指望对要治疗的患者100％有效。然而，该术语需要，可有效治疗统计上有意义部分的患者，即可改善症状和临床体征。采用各种熟知的统计学评价工具，例如，确定置信区间、p-值确定、Student’s t-检验、Mann-Whitney检验等，本领域技术人员可毫不费力地确定份额在统计学上是否有意义。优选的置信区间是至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p-值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。
可根据疾病的遗传标记或家族性累积，确定对某些神经病(例如，肌萎缩性侧索硬化和亨廷顿氏舞蹈病)的易感受性。对于其它神经疾病(例如，大脑缺血诸如中风)，各种风险因子，诸如吸烟、营养不良或某些血水平为本领域技术人员所知。当甚至在临床症状发作前开始很早时，这样的神经疾病的治疗是最有希望的(Ludolph，JNeurol 2000；247：VI/13-VI/18)。在疾病的那个阶段，分子和细胞损伤已经开始。显然，当假定细胞损伤(即神经元损失)刚开始时，尽早给予神经再生和/或神经保护作用化合物，可最有效地预防神经学病症或疾病。
根据本发明，要采用的化合物(诸如胡椒碱，其即使长期应用也是可很好地耐受的)可用作预防剂，以治疗处于发展这样的神经学病症或疾病的风险中的那些患者。预防性用药应该以刺激神经发生和针对神经保护作用的有效量建立持续水平的化合物的方式给予。
″预防″旨在包括预防神经疾病或病症，其中要理解″预防″是任何程度地抑制疾病或病症的体征或症状的发作次数或严重性，包括，但不限于，完全预防疾病或病症。而且，如本领域那些技术人员所理解的，这样的预防通常不期望对要经受医治的100％患者有效。然而，该术语需要统计学上有意义的部分的患者可有效地防止在将来发展本文所提及的疾病或病症。本领域技术人员采用如本说明书其它部分所述的各种熟知的统计评价工具，可毫不费力地确定某部分是否具统计学意义。
根据本发明所提及的化合物及其组合，可以各种剂型给予，所述剂型包括，但不限于，液体溶液剂或混悬剂、片剂、丸剂、粉末剂、栓剂、聚合物微囊剂或微泡剂(microvesicles)、脂质体和可注射或难溶性溶液剂。优选剂型取决于给药方式和治疗用途。
给药途径可包括典型途径，包括，例如，口服、皮下、透皮、皮内、直肠、阴道、肌内、静脉内、动脉内、直接注射到大脑和胃肠外。药物制剂也可适于局部用途。此外，在某些情况下，可经肺部给药，例如，肺喷雾剂和其它可呼吸形式。
对神经学/精神病学疾病，除肺喷雾外，鼻内(IN)递药(例如，经鼻喷雾剂)也是传递本发明组合物的优选应用方式。鼻内递药完全适合用作蛋白和肽的用药模式，且使用非常方便，尤其是对长期治疗。施加肽或蛋白至脑的鼻内递药(鼻喷雾)的应用实例可发现于：(Lyritis&Trovas，Bone 2002；30：71S-74S，Dhillo&Bloom，Curr Opin Pharmacol2001；1：651-655，Thorne&Frey，Clin Pharmacokinet 2001；40：907-946，Tirucherai等，Expert Opin Biol Ther 2001；1：49-66，Jin等，Ann Neurol2003；53：405-409，Lemere等，Neurobiol Aging 2002；23：991-1000，Lawrence，Lancet 2002；359：1674，Liu等，Neurosci Lett 2001；308：91-94)。对于鼻内应用，本文所述化合物可与促进渗透鼻上皮或传递进血管的溶剂、去污剂和物质，诸如使鼻血管张开、增加灌注等的药物组合。
针对医学用途，可根据本领域可利用的标准程序，例如，可加入药学上可接受的载体(或赋形剂)，配制根据本发明的上述物质。载体或赋形剂可为可用作活性成分的溶媒或介质的固体、半固体或液体原料。可根据所选择的产物的具体特性、要治疗的疾病或病症、疾病或病症的阶段和其它相关情况，选择合适的给药剂型和方式(Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(1990))。通过所选择的物质的溶解性和化学性质、所选定的给药途径和标准制药实践，确定药学上可接受的载体或赋形剂的比例和性质。局部制剂还可含有渗透促进剂，诸如油酸、丙二醇、乙醇、脲、月桂基二乙醇酰胺或氮酮、二甲亚砜、癸基甲基亚砜或吡咯烷酮衍生物。也可采用脂质体递药系统。
本发明的用途和方法中要治疗的患者优选为哺乳动物，更优选豚鼠、狗、猫、大鼠、小鼠、马、牛、羊、猴或黑猩猩，最优选人。
当单独或组合采用因子时，应该以产生神经保护和/或神经再生作用的量采用治疗有效量的治疗神经疾病的化合物。可用本文所述的试验评价这样的作用。每种化合物或作为组合的用量优选介于约0.01-约10mg/kg体重范围内，并可根据年龄、种族、性别、给药方式和基于个体患者的其它因素确定。根据所治疗的神经疾病和根据给药途径，可作为单一大剂量给予或例如作为日剂量重复给予化合物。当组合给予化合物时，它们可在给药前预混合、同时给药或连续单独给药。在如本文所述治疗神经疾病，特别是治疗急性神经疾病，诸如中风、SCI或TBI的某些实施方案中，较高剂量的本文所述化合物可能是特别有用的，例如，可采用至少10mg/kg体重、至少50mg/kg体重或至少200mg/kg体重。优选地，在治疗急性神经疾病的1-10天，优选1-5天的时间期内，以2-200mg/kg体重，更优选5-50mg/kg体重的剂量给予本文所述化合物，尤其是胡椒碱。由于胡椒碱的神经再生作用，随后长时期的低剂量治疗是明智的。本发明人已经表明，10mg/kg体重(静脉大剂量注射)的剂量是治疗大鼠中风模型的有效量(实施例7)。而且，本发明人表明，为刺激神经发生，在5天期间的5-50mg/kg体重的剂量是有效量(实施例9)。
在50mg/kg大剂量的静脉注射后，已经在大鼠脑组织中发现最大浓度约4μg/ml的胡椒碱(Sunkara等.，Pharmazie 2001；56：640-642)。本领域技术人员知道从动物模型推断人剂量的方法(Boxenbaum&DiLea，J Clin Pharmacol 1995；35：957-966)。已经报道，为提高共同给予的药物的生物利用率，以每日约5-20mg的量的胡椒碱口服给予人患者(US5616593；US 5536506；Pattanaik等，Phytother Res.2006；20：683-686)。这个剂量的胡椒碱似乎完全可以耐受。
在慢性神经退行性过程，诸如ALS和痴呆的病例中，治疗将更可能每日一次地进行，或优选采用缓释制剂。
在另一实施方案中，本发明还提供特别适于缓释和稳定的长期应用的装置，它可为植入的微型泵，优选皮下植入(例如，如在EdithMathiowitz；(Ed.)，控制递药的百科全书(Encyclopedia of ControlledDrug Delevery)，John Wiley&Sons 1999；2：896-920中所述)。已知这类泵在胰岛素疗法中有用。这类泵的实例包括通过Animas、DanaDiabecare、Deltec Cozm、Disetronic Switzerland、Medtronic和NiproAmigo所制备/分布的那些，以及例如在美国专利号5,474,552；6,558,345；6,122,536；5,492,534；和6,551,276中所述的那些，其相关内容通过引用结合于本文。
在一个实施方案中，药物可进一步包括一种或多种其它因子。根据本发明的″其它因子″是进一步支持药物的有益作用的任何物质。这种支持可以或者为累积的，或者为协同的。适用的其它因子有例如，带炎症调节因子的因子。向静脉应用的任何制剂中加入缓激肽或类似物质将支持其传递至大脑或脊髓(Emerich等，Clin Pharmacokinet2001；40：105-123；Siegal等，Clin Pharmacokinet 2002；41：171-186)。也可采用有利于通过血脑屏障的药物。本领域的技术人员熟悉有利于个体疾病治疗的其它因子。
还优选根据本发明的药物的修饰剂或药用制剂，它们能增加其通过血脑屏障的能力，或向脑组织移动分配系数。
如大鼠中风模型(实施例7)所示，单次给予大剂量的如在本发明上下文定义的化合物特别有利于治疗伴有神经学症状突然发作的急性神经疾病，特别用于治疗中风、脊髓损伤(SCI)、脊髓创伤和创伤性脑损伤(TBI)。
因此，本发明特别涉及如本文定义的化合物在制备治疗选自中风、SCI、脊髓损伤和TBI的急性神经疾病的药用组合物中的用途，其中所述化合物，优选胡椒碱在所述的急性神经疾病发作后的1-10天，优选1-5天时间期间段，以2-200mg/kg体重，更优选地，5-50mg/kg体重的量(剂量)提供。所述的量优选可作为全部(大剂量)、部分或连续地提供。更优选地，以优选至少10mg/kg体重的大剂量的所述化合物，提供所述化合物，优选胡椒碱。
上述药用组合物特别有利于患有急性神经疾病并从而患有功能性神经元进行性丧失的患者的急救措施。术语“中风”优选指出血性中风，和更优选指缺血性脑中风。
如本文所定义的化合物的给予显著减少急性事件的影响，从而，显著减少因所述的急性事件丧失功能的神经元的数量。单一大剂量的胡椒碱化合物的给药特别有利。
如本文所用的术语“大剂量”优选指作为单一剂量给予的化合物。
如本文所用的术语“至少10mg/kg体重”涉及10mg/kg体重或超过10mg/kg体重。术语优选涉及至少15mg/kg体重、至少20mg/kg体重、至少30mg/kg体重、至少40mg/kg体重或至少50mg/kg体重。在上述本发明用途的上下文中特别考虑给予每kg体重10mg如本文定义的化合物。应理解，要给予患者的量不应对所述患者有任何毒性作用，或者只能对所述患者有适度的毒性作用。如何确定化合物的毒性作用为本领域所熟知。因此，对要给予的化合物的量而言，优选的上限是作为大剂量的50mg/kg。因此，根据本发明，已经确定针对急性神经疾病的应用本发明化合物的最佳剂量范围。
如上所述，本发明上下文中定义的化合物令人吃惊地具有神经原性作用。因此，包含如本文定义的化合物的药用组合物特别有利于导致功能性神经元损失的急性神经疾病的病后护理。
因此，本发明尤其涉及如上定义的化合物在制备用于促进表现出神经元损失的患者的神经发生的药用组合物方面的用途。
表现出神经元损失的患者特别是有先前神经元损失的患者。所述患者更优选因如本文所提及的神经疾病引起的功能性神经元数量下降的患者。本文别处描述了优选的神经疾病。所述的神经元损失优选由选自肌萎缩性侧索硬化、青光眼、阿尔茨海默氏病、神经退行性三核苷酸重复障碍(诸如亨廷顿氏舞蹈病)、神经退行性溶酶体贮积症、多发性硬化、痴呆、精神分裂症和周围神经病变的神经退行性疾病引起。所述的神经元损失更优选由选自中风、TBI、因心循环停止引起的大脑缺血、SCI和脊髓损伤的先前的急性神经疾病引起。所述的神经元损失最优选由选自中风、SCI、脊髓损伤和TBI的先前的急性神经疾病引起。
而且，如本文定义的化合物的用途特别有利于治疗伴有晚期神经疾病的神经元丢失的疾病的药物的制备。优选所述晚期神经疾病是晚期的中风、脊髓损伤、脊髓损伤或创伤性脑损伤。应用使血块溶解的溶栓药物治疗急性神经疾病晚期的患者可能是不充分的(参见，例如，Davalos，Cerebrovasc Dis 2005；20 Suppl 2：135-139)，因为该阶段的血块溶解不能逆转尤其是缺血对神经元细胞的影响。如本发明上下文中定义的化合物能治疗伴有晚期急性事件的神经元丢失，并因而，如果用药的话，对所述患者的结果和康复是有益的。
如果急性神经疾病是急性中风，优选地，术语“晚期”优选指中风发生后3-72小时，更优选4.5-72小时，更优选4.5-24小时，和最优选24-72小时的时间间隔。如果急性神经疾病是脊髓损伤，优选地，术语“晚期”优选指所述的脊髓损伤已经发生后的3-72小时，更优选4.5-72小时，更优选4.5-24小时，和最优选24-72小时的时间间隔。如果急性神经疾病是创伤性脑损伤，优选地，术语“晚期”优选指在所述的创伤性脑损伤已经发生后的3-72小时，更优选4.5-72小时，更优选4.5-24小时，和最优选24-72小时。
在患者患有神经疾病，且尤其是本说明书中其它地方特别指明的那些神经疾病后，为了基本恢复或至少增强神经学功能，通常需要康复措施。而且，已经在构成本发明基础的本研究中发现，给予本发明化合物适于作为康复措施，因为它能诱发神经原性作用。因此，在一个实施方案中，要用本发明化合物治疗的神经元疾病也包括从急性神经疾病，特别是中风、脊髓损伤或创伤性脑损伤中康复。优选地，采用本发明化合物的康复要在发生神经疾病后进行至少一周，至少两周，至少一个月，至少三个月，至少六个月，至少一年。要理解，那时的患者实际不会再患有急性神经疾病。
特别设计了如本发明上下文定义的化合物用于制备使已经在过去患有任何上述急性神经疾病，优选患有中风、SCI、脊髓损伤或TBI的患者康复的药物。
已经在本说明书(见上文)的别处描述术语“神经发生”。如别处所述的那样，如本发明上下文定义的化合物优选能促进自成人神经干细胞形成神经元，从而改善已经患有神经元损失的患者的病症。当在给予如本发明上下文定义的化合物的患者中自神经干细胞形成神经元细胞时，促进了神经发生，与未给予所述化合物的患者的自神经干细胞形成神经元相比，优选显著增加。更优选地，神经元细胞的形成的增加是有统计学意义的增加。
本领域的技术人员已知术语″有意义″和″有统计学意义″。因此，本领域技术人员可采用各种熟知的统计评价工具，可毫不费力地确定增加是否有意义或有统计学意义。
根据本发明，自神经干细胞形成神经元的增加为至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％和更优选至少100％才被认为是有意义的。
应理解，神经发生的促进优选取决于所给予的化合物的量和/或取决于用药持续时间。
为了使神经发生，优选在超过的时间段，按常规基础给予如本发明上下文定义的化合物。特别构思了每月一次、每月两次、每周一次、每周两次或甚至更经常地，优选按日给予所述化合物。有规律用药优选持续至少三个月、六个月和更优选至少一年。
为使神经发生，如本文别处所述给予如本发明上下文定义的化合物。
对于每日给予如本文定义的化合物，优选胡椒碱，所给予的量优选为治疗有效量。
本发明还涉及治疗表现出神经元损失的方法，其包括给予所述患者治疗有效量的如本文定义的化合物。
在本申请书中，表明上述化合物引发神经干细胞向细胞神经元表型分化。神经发生的重要性推理出用依据本发明的化合物治疗所有方面的神经退行性疾病和其中神经元死亡的所有疾病的适用性和有效性。与对大脑中内生干细胞起作用治疗神经疾病相比，胡椒碱或其衍生物可用来体外控制干细胞，例如，分化和增殖。
因此，在本发明的另一实施方案中，例如，化合物可用来促进干细胞，诸如神经干细胞的培养。在该方法中，化合物可加至培养基中或在加到细胞之前预混合，或者可加入细胞在其中培养的培养基中。
因此，而且，本发明涉及干细胞的体外分化的方法，包括至少用如上定义的化合物接触干细胞。该方法中所用的干细胞优选神经干细胞。
经上述方法得到的分化的干细胞可用于制备治疗如本说明书中别处特别指定的神经元疾病的药用组合物。
因此，在本发明的一个实施方案中，涉及采用上述根据本发明的化合物刺激神经干细胞的生长和分化，或者在移植进哺乳动物之前预处理神经干细胞。本方法的其它实施方案是在治疗如本文所述的神经疾病的方法中，优选在当给予所述个体神经干细胞时提供神经保护作用的方法中利用这些神经干细胞。
可经静脉注射或动脉注射给予干细胞。例如，在大脑缺血或创伤性脑损伤中已经表明，静脉注射骨髓基质细胞使其到达脑中的靶区域(Mahmood等，Neurosurgery 2001；49：1196-1204；Lu等，J Neurotrauma2001；18；813-819；Lu等，Cell Transplant 2002；11：275-281；Li等，Neurology 2002；59：514-523)。因此，可用胡椒碱或其衍生物体外处理干细胞，然后经不同的途径注入患有本文所述任何疾病的患者中。
最后，针对体外分化神经干细胞和衍生自神经干细胞的其它细胞，本发明囊括呈适用制剂的、包含依据本发明所提出的化合物的药剂盒。
图的简述
图1：
胡椒碱以剂量依赖的方式显著刺激神经干细胞分化为神经元。
通过相对介导βIII微管蛋白启动子控制的萤火虫荧光素酶活性相对于组成性表达的Renilla荧光素酶活性，测定神经干细胞向神经元的分化。与经假处理细胞相比和与经1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比，显示出介于0.2μM-100μM范围内的胡椒碱的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图2a：
1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环己胺以剂量依赖的方式显著刺激神经干细胞分化为神经元。
类似于图1，与假处理的细胞和与1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比，显示出介于0.2μM-100μM范围内的1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环己胺(图11a)的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图2b：
1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环庚胺以剂量依赖的方式显著刺激神经干细胞分化为神经元。
类似于图1，与假处理的细胞和与1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比，显示出介于0.2μM-100μM范围内的1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环庚胺(图11b)的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图2c：
1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环戊胺以剂量依赖的方式显著刺激神经干细胞分化为神经元。
类似于图1，与假处理的细胞和与1μM视黄酸(RA)处理过的细胞相比，显示出介于0.2μM-100μM的1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环戊胺(图11c)的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图2d：
1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)吡咯烷以剂量依赖的方式显著刺激神经干细胞分化为神经元。
类似于图1，与假处理的细胞和与1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比，显示出介于0.2μM-100μM范围内的1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)吡咯烷(图11d)的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图2e：
3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-环辛基丙烯酰胺以剂量依赖的方式显著刺激神经干细胞分化为神经元。
类似于图1，与假处理的细胞和与1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比，显示出介于0.2μM-50μM范围内的3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-环辛基丙烯酰胺(图11e)的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图2f：
1-[3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰]-4-甲基哌啶以剂量依赖的方式显著刺激神经干细胞分化为神经元。
类似于图1，与假处理的细胞和与1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比，显示出介于0.2μM-50μM范围内的1-[3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰]-4-甲基哌啶(图11f)的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图2g：
3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-N-(4，5-二氢-噻唑-2-基)-丙烯酰胺以剂量依赖的方式显著刺激神经干细胞分化为神经元。
类似于图1，与假处理的细胞和与1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比，显示出介于0.2μM-25μM范围内的3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-N-(4，5-二氢-噻唑-2-基)-丙烯酰胺(图11g)的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图2h：
1-氮杂环庚烷-1-基-3-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮以剂量依赖的方式显著刺激神经干细胞分化为神经元。
类似于图1，与假处理的细胞和与1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比，显示出介于0.2μM-25μM范围内的1-氮杂环庚烷-1-基-3-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮(图11k)的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图2i：
N-环辛基-3-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺以剂量依赖的方式显著刺激神经干细胞分化为神经元。
类似于图1，与假处理的细胞和与1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比，显示出介于0.2μM-50μM范围内的N-环辛基-3-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(图11n)的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图2j：
N-环戊基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺以剂量依赖的方式显著刺激神经干细胞分化为神经元。
类似于图1，与假处理的细胞和与1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比，显示出介于0.2μM-50μM范围内的N-环戊基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺(图11q)的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图2k：
N-环庚基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺以剂量依赖的方式显著刺激神经干细胞分化为神经元。
类似于图1，与假处理的细胞和与1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比，显示出介于0.2μM-50μM范围内的N-环庚基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺(图11r)的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图2l：
1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]哌啶以剂量依赖的方式显著刺激神经干细胞分化为神经元。
类似于图1，与假处理的细胞和与1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比，显示出介于0.2μM-25μM范围内的1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]哌啶(图11s)的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图2m：
(2E)-3-(4-氯苯基)-1-哌啶基丙-2-烯-1-酮以剂量依赖的方式显著刺激神经干细胞分化为神经元。
类似于图1，与假处理的细胞和与1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比，显示出介于0.2μM-50μM范围内的(2E)-3-(4-氯苯基)-1-哌啶基丙-2-烯-1-酮(图11u)的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图3：
胡椒碱具有以剂量依赖的方式对神经元的显著抗凋亡作用。
在单独与星性孢菌素(0.1μM)或与胡椒碱(100pM-10μM)组合培养SH-SY5Y神经元细胞后，采用胱天蛋白酶-Glo 3/7试验试剂盒(Promega)测量随后的细胞凋亡。在以SEM作为误差棒的方法中给出试验的任意发光计量信号作为细胞凋亡的测定。显示作为阴性对照的经假处理的细胞的发光计量信号。
图4：
胡椒碱及其衍生物具有对神经元的显著抗凋亡作用。
在SH-SY5Y神经元细胞与胡椒碱(pip)及其衍生物(1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环己胺(A；图11a)、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环庚胺(B；图11b)、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环戊胺(C；图11c)、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)吡咯烷(D；图11d)、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-环辛基丙烯酰胺(E，图11e)、3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-N-(4，5-二氢-噻唑-2-基)-丙烯酰胺(G，图11g)、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮(K，图11k)、1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]哌啶(S，图11s)、(2E)-3-(4-氯苯基)-1-哌啶基丙-2-烯-1-酮(U，图11u))各1μM的浓度和星性孢菌素(SP；0.1μM)共培养(co-incubation)后，采用胱天蛋白酶-Glo 3/7试验试剂盒(Promega)测定随后的细胞凋亡。细胞凋亡的程度与单独由星性孢菌素(SP；0.1μM)介导的相比较。无星性孢菌素培养的假处理的细胞充当对照。胡椒碱和衍生物表现出显著减少星性孢菌素介导的细胞凋亡。
图5a：
胡椒碱不减弱神经元细胞的活力。
已经确定SH-SY5Y神经元细胞在与胡椒碱(最终浓度0.1nM-100μM)一起培养后的活力。用组成性表达的荧光素酶构件稳定转染试验细胞。然后将细胞与指定浓度的胡椒碱培养5h。在培养后，通过测量荧光素酶活性评价细胞活力。在以SEM作为误差棒的方法中给出试验的任意发光计量信号作为剩余活力的测定。分别表示出假处理和星性孢菌素(0,1μM)处理的细胞的发光计量信号作为阴性和阳性对照。
图5b：
胡椒碱的衍生物不减弱神经元细胞的活力。
已经测定在经胡椒碱的衍生物(最终浓度1μM)培养后的SH-SY5Y神经元细胞的活力。已经测试胡椒碱的各种衍生物(1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环庚胺(B；图11b)、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-环辛基丙烯酰胺(E，图11e)、3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-N-(4，5-二氢-噻唑-2-基)-丙烯酰胺(G，图11g)、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮(K，图11k)、1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]哌啶(S，图11s)、(2E)-3-(4-氯苯基)-1-哌啶基丙-2-烯-1-酮(U，图11u))。用组成性表达的荧光素酶构件稳定转染试验细胞。再用上述化合物培养细胞5h。在培养后，通过测量荧光素酶活性评价细胞活力。经假处理的细胞充当规范对照而经星性孢菌素(SP，1μM)处理的细胞充当阳性对照。作为剩余活力的测定的试验的任意发光计量信号已经被规范化为经假处理的细胞的百分比。在以SEM作为误差棒的8次重复(replicates)的方法中给出各值。
图6a：
TRPV1受体配体辣椒素不刺激神经干细胞分化为神经元。
类似于图1，显示出与1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比的，介于0.1nM-100μM的辣椒素的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图6b：
TRPV1受体配体辣椒素对神经元表现出比较弱的抗凋亡活性。
在SH-SY5Y神经元细胞或者单独与星性孢菌素(SP；0.1μM)，或者再与辣椒素(10μM)组合或与胡椒碱(10μM)组合培养后，采用胱天蛋白酶-Glo 3/7试验试剂盒(Promega)测定随后的细胞凋亡。在以SEM作为误差棒的方法中给出试验的任意发光计量信号作为星性孢菌素介导的细胞凋亡的测定。显示作为阴性对照的经假处理细胞的发光计量信号。
图6c：
TRPV1受体抑制剂SB366791不减少胡椒碱对神经干细胞分化为神经元的刺激作用。
类似于图1，与经假处理的细胞相比和与经1μM视黄酸(RA)处理的细胞相比，显示出10μM胡椒碱单独或与TRPV1受体抑制剂SB366791(10μM)组合的作用。在以SEM作为误差棒的方法中给出各比值。
图6d：
TRPV1受体抑制剂SB366791不减少胡椒碱对神经元细胞的抗凋亡作用。
在SH-SY5Y神经元细胞与单独的星性孢菌素(SP；0,1μM)，与胡椒碱(pip；10μM)组合或与胡椒碱(pip；10μM)加SB366791(10nM-100nM)一起培养后，类似于图3测出随后的细胞凋亡。在以SEM作为误差棒的方法中给出试验的任意发光计量信号作为细胞凋亡的测定。显示作为阴性对照的经假处理细胞的发光计量信号。
图7a：
当在缺血发生后30分钟施用时，胡椒碱减少大鼠MCAO模型的梗死体积。
经TTC-染色确定缺血发生后24h的梗死体积。经假处理和经胡椒碱处理动物的TTC-染色的脑的两个示例性截面被示出。未染色的区域表示梗死体积。
图7b：
当在缺血发生后30分钟施用时，胡椒碱减少大鼠MCAO模型的皮质和皮质下梗死体积。
显示出经假处理和胡椒碱处理的全部梗死的皮质和皮质下区域的水肿校正的梗死体积，其由缺血发生后24h经TTC-染色和测面积法确定。通过从对侧半球体积扣除非梗死的同侧半球体积，得到水肿校正的梗死体积。如以SEM作为误差棒的方法那样以mm3给出体积。
图8：
胡椒碱改善鼠SCI模型的后肢运动能力。
所表现的是在实验性SCI后的第一个5周期间经假和胡椒碱处理的BMS值。BMS值是对SCI后后肢运动能力的测量(Basso等JNeurotrauma 2006；23：635-659)。BMS值介于0(后肢无运动)和9(健康小鼠)之间。在实验性SCI后的1、7、14、21、28和35天，如用SEM作为误差棒的方法那样给出BMS值(n＝20用于假处理的对照组和n＝20用于胡椒碱处理组)。
图9：
胡椒碱刺激成年动物的神经发生。
在BrdU给药后数周，对BrdU和NeuN的脑切片进行共染色适于鉴别新生成的神经元(Bagley等BMC Neurosci.2007；8：92)。每块切片的这类神经元的量可用作对由于神经干细胞分化引起的神经发生的量度。显示每块切片的BrdU/NeuN-阳性细胞的平均数。对于分析前6周连续5天每天用1mg/kg和用10mg/kg胡椒碱处理的大鼠，该数量明显增加。
图10：
胡椒碱及其衍生物对受ALS影响的运动神经元有显著的抗凋亡作用。
用胡椒碱(pip)及其衍生物(1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环庚胺(B；图11b)、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-环辛基丙烯酰胺(E，图11e)、3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-N-(4，5-二氢-噻唑-2-基)-丙烯酰胺(G，图11g)、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮(K，图11k)、1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]哌啶(S，图11s)、(2E)-3-(4-氯苯基)-1-哌啶基丙-2-烯-1-酮(U，图11u))各1μM的浓度与星性孢菌素(SP；0.1μM)共培养NSC-34运动神经元细胞系后，采用胱天蛋白酶-Glo 3/7试验试剂盒(Promega)测定随后的细胞凋亡。将细胞凋亡的程度与单独用星性孢菌素(SP；0.1μM)介导的相比较。胡椒碱和衍生物显示出显著减少星性孢菌素介导的运动神经细胞系的细胞凋亡。
图11a：
1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环己胺的化学式(ChemBridge Corp.)
图11b：
1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环庚胺的化学式(ChemBridge Corp.)
图11c：
1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环戊胺的化学式(ChemBridge Corp.)
图11d：
1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)吡咯烷的化学式(ChemBridge Corp.)
图11e：
3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-环辛基丙烯酰胺的化学式(ChemBridge Corp.)
图11f：
1-[3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰]-4-甲基哌啶的化学式(ChemBridge Corp.)
图11g：
3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-N-(4，5-二氢-噻唑-2-基)-丙烯酰胺的化学式(Enamine Ltd.)
图11h：
3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-(四氢-2-呋喃基甲基)丙烯酰胺的化学式(ChemBridge Corp.)
图11i：
3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-双环[2.2.1]庚-2-基丙烯酰胺的化学式(ChemBridge Corp.)
图11j：
1-氮杂环庚烷-1-基-3-(8-氯-2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-6-基)-丙烯酮的化学式(Enamine Ltd.)
图11k：
1-氮杂环庚烷-1-基-3-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮的化学式(Enamine Ltd.)
图11l：
1-氮杂环庚烷-1-基-3-(9-氯-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮的化学式(Enamine Ltd.)
图11m：
3-(氯-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)N-环己基-丙烯酰胺的化学式(Enamine Ltd.)
图11n：
N-环辛基-3-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺的化学式(ChemBridgeCorp.)
图11o：
3-(4-乙氧基苯基)-N-(四氢-2-呋喃基)丙烯酰胺的化学式(ChemBridge Corp.)
图11p：
N-环己基-3-(4-乙氧基苯基)丙烯酰胺的化学式(ChemBridgeCorp.)
图11q：
N-环戊基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺的化学式(ChemBridgeCorp.)
图11r：
N-环庚基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺的化学式(ChemBridgeCorp.)
图11s：
1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]哌啶的化学式(ChemBridge Corp.)
图11t：
1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]氮杂环庚烷的化学式(ChemBridgeCorp.)
图11u：
(2E)-3-(4-氯苯基)-1-哌啶基丙-2-烯-1-酮的化学式(TimTec Inc.)
实施例
本文所提供的以下实施例只用于说明的目的，并不打算作为限制，除非另有说明。
实施例1：
对成人神经干细胞用胡椒碱进行体外分化试验
如所述的那样，自4周大的雄性Wistar大鼠的脑室下区域分离神经干细胞(Maurer等，Proteome Sci.2003；1：4)。在补充有B27(Invitrogen)、2mM L-谷氨酰胺、100个单位/ml青霉素、100个单位/ml链霉素、20ng/ml内皮细胞生长因子(EGF)、20ng/ml成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)和2μg/ml肝素的神经基质培养基(Invitrogen)中培养细胞。神经干细胞每周传代一次，4周后进行体外实验。为DNA转染，分离细胞，并以50.000个细胞/孔的密度平铺到聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白涂布的96-孔培养皿。根据FuGene6转染方案(Roche)，用pGL3-p-βIII-微管蛋白载体(100ng/孔)和pRL SV40载体(100ng/孔)进行共转染。pRL SV40载体(Promega)用作内部对照载体。
为放大III类β-微管蛋白基因启动子(片断-450-+54)，用大鼠染色体DNA作为PCR模板(Dennis等，Gene 2002；294：269-277)。经放大片断被插入pGL3-基本的萤火虫荧光素酶报道载体(Promega)的MluI/Xho I位，生成pGL3-p-βIII-微管蛋白实验载体。
在培养过夜后，滗析培养皿，并给予含有胡椒碱(Sigma)或介质的8倍复制的新鲜培养基。作为体外分化的阳性对照，通过向缺乏有丝分裂原的培养基中加入1μM视黄酸(Sigma)，处理干细胞。
48小时后，按照生产商(Promega)的指示收获细胞，制备荧光素酶试验的细胞提取物。随着用萤火虫和Renilla荧光素酶共转染细胞，采用双重荧光素酶报告试验系统(Dual-Luciferase Reporter AssaySystem)(Promega)，用光度计(Berthold Technologies，Mithras LB 940)测量萤火虫荧光素酶介导的反应的荧光信号与荧光素酶介导的反应的那些的比值。采用来自组成性表达的Renilla荧光素酶的荧光信号使转染效率的变化正规化。
采用介于0.2-100μM最终浓度范围的胡椒碱。作为神经干细胞分化量度的III类β-微管蛋白基因启动子控制的荧光素酶信号的相对介导表示于图1。结果表明，胡椒碱显著刺激神经干细胞分化为神经元，因此，起到神经再生作用。
实施例2：
用胡椒碱衍生物对成人神经干细胞进行体外分化试验
类似于实施例1，已经测试胡椒碱及其各种衍生物(1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环己胺(图11a)、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环庚胺(图11b)、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环戊胺(图11c)、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)吡咯烷(图11d)、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-环辛基丙烯酰胺(图11e)、1-[3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰]-4-甲基哌啶(图11f)、3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-N-(4，5-二氢-噻唑-2-基)-丙烯酰胺(图11g)、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-(四氢-2-呋喃基甲基)丙烯酰胺(图11h)、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-双环[2.2.1]庚-2-基丙烯酰胺(图11i)、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(8-氯-2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-6-基)-丙烯酮(图11j)、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮(图11k)、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(9-氯-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮(图11l)、3-(氯-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)N-环己基-丙烯酰胺(图11m)、N-环辛基-3-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(图11n)、3-(4-乙氧基苯基)-N-(四氢-2-呋喃基)丙烯酰胺(图11o)、N-环己基-3-(4-乙氧基苯基)丙烯酰胺(图19p)、N-环戊基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺(图11q)、N-环庚基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺(图11r)、1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]哌啶(图11s)、1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]氮杂环庚烷(图11t)、(2E)-3-(4-氯苯基)-1-哌啶基丙-2-烯-1-酮(图11u))刺激神经干细胞分化为神经元的能力。采用最终浓度1μM的化合物。表2概述与假处理相比，因使用这些化合物处理而促进该神经干细胞分化的倍数。在刺激神经干细胞的这些试验中，用作阳性对照的视黄酸产生的倍数介于2-3范围内。
而且，仍类似于实施例1，已经分析胡椒碱的各种衍生物(1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环己胺(图11a)、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环庚胺(图11b)、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环戊胺(图11c)、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)吡咯烷(图11d)、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-环辛基丙烯酰胺(图11e)、1-[3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰]-4-甲基哌啶(图11f)、3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-N-(4，5-二氢-噻唑-2-基)-丙烯酰胺(图11g)、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮(图11k)、N-环辛基-3-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(图11n)、N-环戊基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺(图11q)、N-环庚基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺(图11r)、1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]哌啶(图11s)、(2E)-3-(4-氯苯基)-1-哌啶基丙-2-烯-1-酮(图11u))的刺激神经干细胞分化为神经元的剂量依赖活性。所用衍生物的最终浓度介于0.2-100μM范围内。图2a-m中分别表示作为这些胡椒碱衍生物的神经干细胞分化量度的III类β-微管蛋白基因启动子控制的荧光素酶信号的相对介导。结果表明，全部经测试的胡椒碱衍生物显著刺激神经干细胞分化为神经元，并因而起神经再生的作用。
表2：1μM最终化合物浓度对神经干细胞分化的刺激倍数。
  化合物   式   x-倍
  胡椒碱   2，1
  1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环己胺   图11a   2，1
  1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环庚胺   图11b   4，0
  1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环戊胺   图11c   1，4
  1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)吡咯烷   图11d   1，3
  3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-环辛基丙烯酰胺   图11e   5，0
  1-[3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰]-4-甲基哌啶   图11f   1，9
  3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-N-(4，5-二氢-噻唑-2-基)-丙烯酰胺   图11g   4，6
  3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-(四氢-2-呋喃基甲基)丙烯酰胺   图11h   1，5
  3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-双环[2.2.1]庚-2-基丙烯酰胺   图11i   1，7
  化合物   式   x-倍
  1-氮杂环庚烷-1-基-3-(8-氯-2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-6-基)-丙烯酮   图11j   1，8
  1-氮杂环庚烷-1-基-3-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮   图11k   6，1
  1-氮杂环庚烷-1-基-3-(9-氯-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮   图11l   2，2
  3-(氯-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)N-环己基-丙烯酰胺   图11m   1，7
  N-环辛基-3-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺   图11n   1，9
  3-(4-乙氧基苯基)-N-(四氢-2-呋喃基)丙烯酰胺   图11o   1，5
  N-环己基-3-(4-乙氧基苯基)丙烯酰胺   图11p   1，7
  N-环戊基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺   图11q   1，6
  N-环庚基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺   图11r   1，7
  1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]哌啶   图11s   4，0
  1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]氮杂环庚烷   图11t   2，3
  (2E)-3-(4-氯苯基)-1-哌啶基丙-2-烯-1-酮   图11u   4，4
实施例3：
用胡椒碱体外抗细胞凋亡试验
可通过测定胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7活性，对各化合物的神经保护作用进行体外检测。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(胱天蛋白酶)家族的这些成员在哺乳动物细胞凋亡中起到关键效应器作用。
用在补充有20％FBS的含大量葡萄糖的DMEM中维持的人神经线细胞瘤细胞系SH-SY5Y(美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection))进行细胞凋亡检验。作为选择，人们可分析可分离自E18大鼠和随后培养于合适培养基中的原代皮质神经元的细胞凋亡。将2.5x104个SH-SY5Y细胞接种于96-孔培养皿中，稍后在细胞凋亡介导化合物星性孢菌素(0.1μM，Calbiochem)的存在下，用胡椒碱或媒介物刺激24h。37℃下培养5h后，向细胞中加入含荧光素酶和产生发光的(luminogenic)底物的胱天蛋白酶-Glo 3/7试剂(Promega)。30min后用光度计(Berthold Technologies，Mithras LB 940)检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-7对底物的裂解。与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性的量成正比的荧光用作经处理的神经元的细胞凋亡的量度。以介于100pM-10μM范围内的最终浓度测试胡椒碱。经胡椒碱处理的细胞显示出星性孢菌素介导的细胞凋亡的显著减少(图3)。结果表明，胡椒碱表现出对神经元的显著抗细胞凋亡作用，并因而起到神经保护作用。
实施例4：
胡椒碱及其衍生物的体外抗细胞凋亡试验。
类似于实施例3，已经分析胡椒碱及其各种衍生物(1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环己胺(衍生物A，图11a)、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环庚胺(衍生物B，图11b)、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环戊胺(衍生物C，图11c)、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)吡咯烷(衍生物D，图11d)、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-环辛基丙烯酰胺(衍生物E，图11e)、3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-N-(4，5-二氢-噻唑-2-基)-丙烯酰胺(衍生物G，图11g)、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮(衍生物K，图11k)、1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]哌啶(衍生物S，图11s)、(2E)-3-(4-氯苯基)-1-哌啶基丙-2-烯-1-酮(衍生物U，图11u))的抗凋亡活性。在星性孢菌素(SP；0.1μM)的存在下，用这些化合物(1μM)培养SH-SY5Y细胞。单独用星性孢菌素(SP；0,1μM)培养用作阳性对照而用媒介物培养用作阴性对照。与星性孢菌素对照有关的细胞凋亡的程度表示于图4(媒介物(假)：6％；星性孢菌素(SP)：100％；胡椒碱加星性孢菌素：66％；衍生物A加星性孢菌素：70％；衍生物B加星性孢菌素：49％；衍生物C加星性孢菌素：77％；衍生物D加星性孢菌素：72％；衍生物E加星性孢菌素：77％；衍生物G加星性孢菌素：79％；衍生物K加星性孢菌素：83％；衍生物S加星性孢菌素：81％；衍生物U加星性孢菌素：60％)。经胡椒碱或其衍生物处理的细胞显示出星性孢菌素介导的细胞凋亡的显著减少(图4)。结果表明，胡椒碱及其衍生物对神经元表现出显著的抗凋亡作用，并因而起到神经保护作用。而且，胡椒碱或其衍生物本身都没表现出细胞凋亡作用。
实施例5：
胡椒碱及其衍生物的体外活力试验
可通过测定经组成型启动子控制下的报道基因构件转染的神经元细胞的存活，体外检测化合物对神经元细胞的活力的作用。
以每孔2.5x104个细胞的密度，将经SV40启动子控制下的Renilla荧光素酶构件稳定转染的SH-SY5Y神经元细胞接种于96-孔培养皿中。在培养过夜后，用含有胡椒碱或媒介物的培养基刺激细胞。星性孢菌素(0,1μM)用作阳性对照。5h后，采用光度计(BertholdTechnologies，Mithras LB 940)测定Renilla荧光素酶活性。以介于0.1nM-100μM范围内的最终浓度测试胡椒碱。经胡椒碱处理的细胞未对神经元细胞的活力显示出任何显著作用(图5a)。
因此，已经分析1μM浓度下的各种胡椒碱衍生物(1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环庚胺(图11b)、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-环辛基丙烯酰胺(图11e)、3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-N-(4，5-二氢-噻唑-2-基)-丙烯酰胺(图11g)、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮(图11k)、1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]哌啶(图11s)、(2E)-3-(4-氯苯基)-1-哌啶基丙-2-烯-1-酮(图11u))的活力。经处理的神经元细胞未显示出减少的活力(图5b)。
结果表明，胡椒碱或所测试的衍生物都未减少神经元细胞的活力。
实施例6：
胡椒碱的神经再生和神经保护作用不被TRPV1受体介导。
进行分析以查明胡椒碱的神经再生和/或神经保护作用是否经TRPV1受体介导，已知该受体被胡椒碱和带香草基部分的其它化合物如辣椒素(Sigma)激动。在类似于实施例1(但用辣椒素(0.1nM-100μM最终浓度)代替胡椒碱)的实验中，未能检测到对神经干细胞分化的刺激作用(图6a)。而且，采用如实施例3中所述的试验，与胡椒碱(10μM)相比，辣椒素(10μM)仅表现出微小的抗凋亡作用(图6b)。
而且，当分别在实施例1和3中共培养时，为TRPV1受体特异性抑制剂的化合物SB366791(Sigma)未产生胡椒碱的对神经退行性的任何抑制作用或神经保护作用(分别见图6c和图6d)。TRPV1受体激动剂辣椒素既不表现出可与胡椒碱相比的神经保护和/或神经再生作用，TRPV1受体抑制剂SB366791也不减弱胡椒碱的神经保护和/或神经再生作用。因此，本发明人推断胡椒碱的这种作用不经TRPV1受体介导。
实施例7：
胡椒碱改善中风动物模型的结果
由于胡椒碱对培养中的原始神经元表现出显著的抗凋亡和神经原性性质(实施例1和3)并通过整个血脑屏障，本发明人试图确定其体内神经保护作用活性。对于中风，本发明者选择大鼠MCAO(大脑中动脉闭塞；肌丝模型)模型，其中大量的不同神经元类型因缺血/缺氧受损。
使雄性Wistar大鼠吸入70％N2O、30％O2和1％氟烷进行麻醉。将导管插入右股静脉，用来传递药物。实验期间，监测体核温度，并保持在37℃。用硅涂布的(Provil Novo，Heraus Kulzer)4-0尼龙细丝(Ethicon)介导大脑中动脉闭塞(MCAO)，将尼龙细丝引入颈总动脉并前深入颈内动脉。用带定位于颞叶皮层MCA区域上的探针的Laser-Doppler血流计(Perimed 4000)证实成功的MCA闭塞。在90minMCAO后，抽出细丝，允许再灌注。闭塞发作之后30分钟，经20min，以2μl/min的速度静脉注射使动物接收10mg/kg胡椒碱(Sigma-Aldrich)或媒介物。60℃下，使胡椒碱溶解于100％Solutol-HS15(BASF)，并用蒸馏水(aqua dest)稀释到最终浓度20％Solutol-HS15，生成最终浓度5mg胡椒碱/ml的最终溶液。将溶液保持于室温下置于暗处直到需要时。在介导缺血后24h，经TTC染色确定梗死体积。用脑基质(Harvard Apparatus，Inc.)切下2mm切片，并于37℃用氯化2，3，5-三苯基四氮唑(TTC，Sigma-Aldrich)染色10min。图7a表示假治疗和胡椒碱治疗后的示例性TTC染色的脑切片。用彩色扫描仪在两侧扫描染色切片，并用ImageJ(http://rsb.info.nih.gov/ij)确定梗死面积。通过积分测出的梗死面积，得到“直接”梗死体积：通过从对侧半球扣除梗死半球的非梗死体积得到水肿校正的梗死体积。在揭盲(unblinding)前，将有蛛网膜下腔出血(脑室或蛛网膜下腔中柱体卷起(barrel-rolling)或出血)的任何迹象、因穿孔造成的任何皮质损伤和经TTC-染色无或极少梗死的动物从该分析中排除。所有实验都以完全随机和盲法进行。
经胡椒碱处理的动物表现出总水肿校正的梗死面积的显著减少(媒介物：210±20mm3，n＝37；胡椒碱：151±17mm3；n＝30；p＝0.031)。在皮质中观察到特别强的保护作用(媒介物：124±15mm3；胡椒碱：73±14mm3；p＝0.018)，而皮质下区域中的梗死减少不具统计学意义(媒介物：86±7mm3；胡椒碱：78±6mm3)。以平均加/减平均标准误差(SEM)给出体积，而n表示重复数和p表示Student’s的T检验(Student’s ttest)的p-值结果。结果表示于图7b。
作为本实施例的结论，在体内动物模型中，胡椒碱起到改善实验性中风的后果的作用。看来，治疗也完全可被动物耐受。
实施例8：
胡椒碱改善动物模型的脊髓损伤(SCI)的结果。
采用吸入麻醉剂(1％氟烷/30％N20/70％O2)麻醉2月龄的雌性小鼠。如先前所述的那样，在椎体节Th8/9处进行椎板切除术后，用细小虹膜切除术剪刀从背部横切脊髓到约80％，令腹组织桥完整(Demjen等Nat Med 2004；10：389-395)。用庆大霉素每天一次(腹膜注射，1mg/kg体重)对动物进行术后处理7天。手动清空膀胱，直到自主膀胱功能恢复。在治疗实验中，在手术期间(每次10mg/kg体重)和随后的2天(每次20mg/kg体重)，对C57BL/6野生型小鼠(n＝20)经腹膜内注射接受胡椒碱。此外，通过渗透压微泵(Alzet)，经2周的连续皮下应用，小鼠接受1mg/kg体重的日剂量。照此处理对照组(假，n＝20)，但只接受媒介物(20％Solutol-HS15)。如实施例7中所述，使胡椒碱溶解于20％Solutol-HS15。所有动物实验均被伦理机构认可。作为结果的测定，于手术后的1、7、14、21、28和35天确定Basso-Mouse-Score(BMS)(Basso等J Neurotrauma 2006；23：635-659)。BMS得分值介于0(后肢无运动)至9(健康鼠)。结果表示于图8。胡椒碱治疗显然改善体内动物模型的实验性SCI的结果。
实施例9：
胡椒碱体内刺激神经发生。
将雄性成年大鼠分为三组。每日一次用20％Solutol-HS15(BASF SE)作为媒介物(对照组，n＝11)、1mg/kg体重胡椒碱(胡椒碱I组，n＝14总剂量5mg/kg胡椒碱)或10mg/kg体重胡椒碱(胡椒碱II组，n＝13总剂量50mg/kg)经腹膜注射处理大鼠连续5天。如实施例7中所述，使胡椒碱溶解于20％Solutol-HS15。此外，在这些起初5天期间，所有动物每日两次接受BrdU(腹膜注射50mg/kg体重)。BrdU被分裂细胞稳定结合，并因而为标记在经实验确定的时间窗(即给予BrdU期间的时间，其在本实施例中对应于给予胡椒碱的期间的时间)内分裂的细胞的适用工具(Bagley et al BMC Neurosci.2007；8：92)。开始治疗后6周处死动物。快速取出大脑，用4％低聚甲醛固定，并贮存于4％低聚甲醛中，用于进一步免疫组织化学分析。生成10μm海马区切片并用羊-抗BrdU抗体(Abcam，1∶100)和鼠-抗-NeuN抗体(Chemicon，1∶500)染色。随后，抗-羊-生物素加链霉亲和素-Cy2和抗-鼠-Alexa555(Molecular Probes，Fisher)染色切片，用于荧光检测。由于NeuN是神经元标记物(Pechnick等Proc Natl Acad Sci USA 2008；105：1358-1363)，可经NeuN和BrdU共染色鉴别新生成的神经元。因此，这种共染色适于分析神经干细胞分化引起的神经发生的量。与对照组水平相比，两个胡椒碱处理动物组(总剂量5mg/kg和50mg/kg)表现出明显升高的神经发生水平(每片以NeuN/BrdU-阳性细胞测定)(图9)。胡椒碱治疗明显刺激体内动物模型的神经发生。
实施例10：
胡椒碱及其衍生物对培养的运动神经细胞系发挥抗凋亡作用。
类似于实施例3，已经分析胡椒碱及其各种衍生物(1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环庚胺(衍生物B，图11b)、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-环辛基丙烯酰胺(衍生物E，图11e)、3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-N-(4，5-二氢-噻唑-2-基)-丙烯酰胺(衍生物G，图11g)、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮(衍生物K，图11k)、1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]哌啶(衍生物S，图11s)、2E)-3-(4-氯苯基)-1-哌啶基丙-2-烯-1-酮(衍生物U，图11u))的抗凋亡活性。该分析用运动神经细胞系NSC-34代替实施例3和4中所用的SH-SY5Y细胞进行。由于运动神经元受到ALS疾病的影响，推测对这些细胞表现出抗凋亡作用的药物也适于治疗ALS(Weishaupt等J Pineal Res 2006；41：313-323)。在星性孢菌素(SP；0,1μM)的存在下，用这些胡椒碱或其衍生物(1μM)培养NSC-34细胞。单独用星性孢菌素(SP；0,1μM)培养用作阳性对照和用媒介物培养用作阴性对照。相对于星性孢菌素对照的细胞凋亡程度表示于图4(媒介物(假)：6％；星性孢菌素(SP)：100％；胡椒碱加星性孢菌素：70％；衍生物B加星性孢菌素：55％；衍生物E加星性孢菌素：75％；衍生物G加星性孢菌素：76％；衍生物K加星性孢菌素：83％；衍生物S加星性孢菌素：77％；衍生物U加星性孢菌素：71％)。经胡椒碱或其衍生物处理的细胞显示出星性孢菌素介导的经培养的运动神经元NSC-34细胞的凋亡的显著减少(图10)。结果表明，胡椒碱及其衍生物对运动神经元表现出显著的抗凋亡作用，并因而适用于ALS的神经保护性治疗。

Claims (13)

1.具有通式(III)的化合物在制备用于治疗和/或预防神经元疾病的药用组合物中的用途
Figure FPA00001040231400011
其中
R6表示吡咯烷-1-基、哌啶子基、氮杂环庚烷-1-基、4-甲基哌啶子基、吗啉代、4，5-二氢-2-噻唑氨基、2-四氢化糠基氨基、2-四氢呋喃基氨基、4-6个碳原子的N-单烷基氨基、4-8个碳原子的N-单环烷基氨基、双环[2.2.1]庚基氨基、3’，4’-亚甲二氧基取代的苄基氨基、2-苯乙基氨基，和
m＝0、1、2或3，前提是
当m＝1时，R1表示具有1-3个碳原子的烷氧基或卤原子；
当m＝2时，各R1独立表示具有1-3个碳原子的烷氧基，或两个R1共同表示3’，4’-亚甲二氧基、3’，4’-亚乙二氧基或3’，4’-亚丙二氧基；
当m＝3时，两个R1共同表示3’，4’-亚甲二氧基、3’，4’-亚乙二氧基或3’，4’-亚丙二氧基和其它R1表示具有1-3个碳原子的烷氧基或卤原子。
2.权利要求1的用途，其中的化合物选自：抗痫灵、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环己胺、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环庚胺、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)环戊胺、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)吡咯烷、1-(3-反式-苯并-1，3-间二氧杂环戊烯-5-基丙烯酰)吗啉、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-环辛基丙烯酰胺、1-[3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)丙烯酰]-4-甲基哌啶、3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-N-(4，5-二氢-噻唑-2-基)-丙烯酰胺、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-(四氢-2-呋喃基甲基)丙烯酰胺、3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-双环[2.2.1]庚-2-基丙烯酰胺、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(8-氯-2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-6-基)-丙烯酮、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮、1-氮杂环庚烷-1-基-3-(9-氯-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)-丙烯酮、3-(氯-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚英-7-基)N-环己基-丙烯酰胺、N-环辛基-3-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺、3-(4-乙氧基苯基)-N-(四氢-2-呋喃基)丙烯酰胺、N-环己基-3-(4-乙氧基苯基)丙烯酰胺、N-环戊基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺、N-环庚基-3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰胺、1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]哌啶、1-[3-(4-丙氧基苯基)丙烯酰]氮杂环庚烷、(2E)-3-(4-氯苯基)-1-哌啶基丙-2-烯-1-酮、1-(4-甲氧基-肉桂酰)哌啶、1-(3-甲氧基-肉桂酰)哌啶、1-(2-甲氧基-肉桂酰)哌啶、1-肉桂酰-哌啶、1-(3，4-二甲氧基-肉桂酰)哌啶。
3.权利要求1或2的用途，其中的神经疾病是选自大脑缺血、肌萎缩性侧索硬化、青光眼、阿尔茨海默氏病、神经退行性三核苷酸重复障碍、神经退行性溶酶体贮积症、多发性硬化、脊髓损伤、脊髓创伤、痴呆、精神分裂症和周围神经病变的至少一种疾病。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中的神经疾病是涉及缺血和/或缺氧的病理生理学机理的神经疾病，其选自中风、创伤性脑损伤、由于心循环停止的大脑缺血、青光眼、脊髓损伤和脊髓创伤。
5.权利要求1或2中所定义的化合物在制备用于增强学习和记忆力的药用组合物中的用途。
6.用作治疗和/或预防神经元疾病的药用组合物的权利要求1中所定义的化合物。
7.一种治疗和/或预防患有神经元疾病的患者的方法，其包括给予所述患者治疗有效量的如权利要求1中定义的化合物。
8.具有通式(I)的化合物在制备用于治疗和/或预防神经元疾病的药用组合物中的用途
其中
n＝0、1或2，前提是
当n＝0时，R2和R3表示氢原子或共同表示或者呈E或者呈Z几何构型的碳-碳双键；
当n＝1或2时，R2和R3表示氢原子或共同表示或者呈E或者呈Z几何构型的碳-碳双键，以及R4和R5表示氢原子或共同表示或者呈E或者呈Z几何构型的碳-碳双键；
m＝0、1、2或3，前提是
当m＝1时，R1表示具有1-3个碳原子的烷氧基、羟基或卤原子；
当m＝2时，各R1独立表示具有1-3个碳原子的烷氧基，或两个R1共同表示3’，4’-亚甲二氧基、3’，4’-亚乙二氧基或3’，4’-亚丙二氧基；
当m＝3时，两个R1共同表示3’，4’-亚甲二氧基、3’，4’-亚乙二氧基或3’，4’-亚丙二氧基和其它R1表示具有1-3个碳原子的烷氧基、羟基或卤原子；
R6表示吡咯烷-1-基、哌啶子基、氮杂环庚烷-1-基、4-甲基哌啶子基、吗啉代、4，5-二氢-2-噻唑氨基、2-四氢化糠基氨基、2-四氢呋喃基氨基、4-6个碳原子的N-单烷基氨基、4-8个碳原子的N-单环烷基氨基、双环[2.2.1]庚基氨基、3’，4’-亚甲二氧基取代的苄基氨基、2-苯乙基氨基或具有1-6个碳原子的烷氧基。
9.权利要求8的用途，其中所述化合物以2-200mg/kg体重的剂量提供。
10.权利要求8的用途，其中所述神经元疾病是伴有晚期急性神经疾病的神经元丧失。
11.权利要求8的用途，其中所述神经元疾病是从急性神经疾病中的恢复。
12.用作治疗和/或预防神经元疾病的药用组合物的如权利要求8中定义的化合物。
13.一种治疗和/或预防患有神经元疾病的患者的方法，其包括给予所述患者治疗有效量的如权利要求8中定义的化合物。
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