CN101805801B - 检测禽流感病毒的含有糖脂组合探针的光敏囊泡及其制法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于具有糖脂探针的聚联乙炔囊泡生物传感器领域，特别涉及检测禽流感病毒的含有糖脂组合探针的光敏囊泡及其制法。作为组合探针的具有识别禽流感病毒功能的单糖头糖脂识别分子利用疏水力嵌入到光敏囊泡的聚联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中，内水相被聚联乙炔-磷脂双分子层包裹在其中而形成光敏囊泡；聚联乙炔-磷脂双分子层由联乙炔的类脂单体和磷脂单体聚合而成；嵌入到磷脂区域中的单糖头糖脂是乳糖糖脂或葡萄糖糖脂和唾液酸糖脂；本发明的将两种单糖头糖脂组装后对识别禽流感病毒的能力，比使用单一功能性唾液酸糖头或唾液酸-半乳糖天然糖头对禽流感病毒的检测能力有显著的提高，且光敏囊泡变色响应时间更加短暂。
Description
技术领域
本发明属于具有糖脂探针的聚联乙炔(PCDA)囊泡生物传感器领域，特别涉及用于检测禽流感病毒的含有糖脂组合探针的光敏囊泡，以及该检测禽流感病毒的含有糖脂组合探针的光敏囊泡的制备方法。
背景技术
禽流感(Avian Influenza，AI)是由正粘病毒科/流感病毒属/A型流感病毒引起的禽类感染或疾病综合征，被国际兽疫局确定为A类传染病。低致病性禽流感(Low Pathogenic Avian Influenza，LAPI)主要表现从无症状感染到中轻度的呼吸系统疾病、产蛋下降，而高致病性禽流感(High Pathogenic AvianInfluenza，HAPI)则主要表现为高致病率和高死亡率的全身感染。该病毒血清型极多，变异性极强，严重威胁世界各地的家禽养殖业，常常造成巨大的经济损失，尤其是H5和H7亚型病毒引起的高致病性禽流感是目前家禽养殖业的一种灾难性的传染病。而近年来随着病毒的不断变异，宿主范围已经由禽类扩大到很多哺乳动物甚至人类，给人的生命安全造成了极大的威胁，1997年香港高致病性禽流感H5N1不经过中间宿主而直接从鸡传染给人，导致18人感染，6人死亡，打破了传统上所认为的禽流感病毒需要在中间宿主体内与人流感病毒重组之后才能传染人的观点。WHO发表声明表示，尽管到目前为止，仍然没有足够的科学依据来证明已经形成了人传人的传播链，但是临床数据、科学家积累的研究资料和非常有限的病例个案已经显示，H5N1禽流感病毒很有可能在人与人之间传播，从而有可能在今后某个时期在人群中爆发大规模的禽流感。这些证据更加凸显了禽流感研究在公共卫生学中的重大意义，引起越来越多科学家的高度重视。
禽流感病毒一般是具有八个基因区段的RNA病毒，病毒的外鞘膜上由血球凝集素(hemagglutinin)H蛋白与神经氨酸苷酶(唾液酸苷酶)(neuraminidase)N蛋白组成，分别在入侵寄主细胞及释放子代病毒时扮演 着关键的角色，其中H蛋白是禽流感病毒的吸附蛋白。动物细胞膜的受体部分含有细胞膜糖蛋白上的唾液酸糖头和/或糖脂末端上的唾液酸糖头，吸附阶段决定了病毒感染的开始和病毒感染的特异性。因此对禽流感H5N1的检测主要是针对H蛋白进行检测，H蛋白和唾液酸糖头之间的相互作用就成为了检测禽流感H5N1最为重要的可靠手段。
所述的唾液酸-半乳糖糖头具有以下结构：
由于天然糖脂或天然糖蛋白具有多个唾液酸-半乳糖糖头，如果根据检测需要进行人工合成天然糖脂时，就会遇到大量复杂的合成问题，难以推广。
专利号为CN98103306.7的专利提供了一种具有识别病菌、病毒功能的光敏泡囊及其制法，该专利提供的技术方案可简便、快速用于检测病菌、病毒及蛋白质。
本发明结合前述专利的技术方案，提供一种基于简单物理插入方法，利用光敏囊泡的球形结构，使各种单糖头糖脂在光敏囊泡表面组合形成有效的空间结构直接对禽流感病毒进行检测。此方法具有制备简单，成本低，灵敏度高等优点，并可根据各种不同单糖头糖脂的组合，模拟出各种对应的多糖头糖脂，为将来利用组合单糖筛选出比天然唾液酸-半乳糖有更强与禽流感蛋白结合能力作用的多糖提供方法。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测禽流感病毒的含有糖脂组合探针的光敏囊泡，而糖脂组合探针是由简单的单糖头糖脂通过物理力组装而成。
本发明的再一目的是提供一种用于检测禽流感病毒的含有糖脂组合探针的光敏囊泡的制备方法。
本发明是一种基于光敏囊泡的疏水作用，将各种单糖头糖脂识别分子用物理方法插入到聚联乙炔-磷脂双分子层中作为组合探针，组装形成能有效检 测禽流感病毒的含有单糖头糖脂组合探针的变色囊泡。所述的单糖头糖脂由不同单糖头、缩合乙醛亲水刚性结构和长链烷基疏水长链组成；在用旋蒸法制备检测禽流感病毒的含有单糖头糖脂组合探针的光敏囊泡过程中，单糖头糖脂的疏水长链插入到联乙炔-磷脂囊泡双分子层的磷脂区域，亲水刚性结构帮助单糖头糖脂在联乙炔-磷脂囊泡表面直立舒展，当加入单糖头糖脂的比例、种类发生变化时，也相应形成数目不同，结构不一的有效检测禽流感病毒的空间受体。当使用本发明的光敏囊泡检测禽流感病毒时，光敏囊泡经过紫外光照射聚合后，一旦空间受体与溶液中的禽流感病毒蛋白结合，单糖头糖脂的疏水长链就会通过挤压磷脂区域诱导联乙炔共轭二烯的长链骨架(联乙炔经过紫外光照射聚合，会形成联乙炔共轭二烯的长链骨架)发生扰动，使变色囊泡由蓝色逐渐依次变成紫色、紫色变成紫红色、紫红色变成红色，从而形成新颖，直观的生物变色传感器，并通过观察变色囊泡的颜色变化实现检测禽流感病毒。
本发明的检测禽流感病毒的含有单糖头糖脂组合探针的光敏囊泡，包括内水相、聚联乙炔-磷脂双分子层以及作为组合探针的具有识别禽流感病毒功能的单糖头糖脂识别分子；具有识别禽流感病毒功能的单糖头糖脂识别分子利用疏水力嵌入到光敏囊泡的聚联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中，内水相被聚联乙炔-磷脂双分子层包裹在其中而形成光敏囊泡；所述的单糖头糖脂识别分子与形成光敏囊泡双分子层结构的联乙炔的类脂单体和磷脂单体总的摩尔比为1∶100～4∶5，聚联乙炔-磷脂双分子层由联乙炔的类脂单体和磷脂单体聚合而成，联乙炔的类脂单体与磷脂单体的摩尔比为1∶1～4∶1。
所述的单糖头糖脂识别分子具由单糖头R1和R2、缩合乙醛亲水刚性结构和长链烷基疏水长链。
所述的单糖头糖脂识别分子为唾液酸糖脂和乳糖糖脂或葡萄糖糖脂，其中嵌入到光敏囊泡的聚联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中的唾液酸糖脂与乳糖糖脂或葡萄糖糖脂的摩尔比为1∶9～9∶1；
所述的唾液酸糖脂具有以下结构：
R1-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R1为唾液酸；X为氧或碳；m＝1～2，n＝8～14；
所述的乳糖糖脂或葡萄糖糖脂具有以下结构：
R2-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R2为乳糖或葡萄糖；X为氧或碳；m＝1～2，n＝8～14。
所述的联乙炔结构的类脂单体具有以下结构：
CH3-(CH2)n-C≡C-C≡C-(CH2)m-COOH，其中：m＝0～10，n＝17～30。
所述的磷脂具有以下结构：
其中：R1和R2均为10～26个碳的脂肪链。
所述的内水相为去离子水或pH在6～8之间的缓冲溶液等。
所述的缓冲溶液是磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液或巴比妥钠-盐酸缓冲液等中的一种。
本发明的检测禽流感病毒的含有糖脂组合探针的光敏囊泡的制备方法：将单糖头糖脂识别分子、磷脂单体、联乙炔的类脂单体混溶于有机溶剂中，其中，单糖头糖脂识别分子与形成联乙炔-磷脂光敏囊泡双分子层结构的联乙炔的类脂单体和磷脂单体总的摩尔比为1∶100～1∶5，联乙炔的类脂单体与磷脂单体的摩尔比为1∶1～4∶1；旋蒸除去有机溶剂，加入水相溶液使联乙炔的类脂单体和磷脂单体在水相溶液中的总浓度为0.01～200mmol/L，使单糖头糖脂利用疏水力嵌入到光敏囊泡的联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中；在温度为30～90℃下，超声水合10～180分钟，使内水相被联乙炔-磷脂双分子层包裹，得到非聚合的囊泡溶液；静置于4℃冰箱中陈化2～48小时，再将此囊泡溶液用波长为200～360nm的紫外灯照射10～600秒使联乙炔的类脂单体聚合，最终得到蓝色的具有识别禽流感病毒功能的含有糖脂组合探针的光敏囊泡。
所述的单糖头糖脂识别分子为唾液酸糖脂和乳糖糖脂或葡萄糖糖脂，其中嵌入到光敏囊泡的聚联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中的唾液酸糖脂与乳糖糖脂或葡萄糖糖脂的摩尔比为1∶9～9∶1；
所述的唾液酸糖脂具有以下结构：
R1-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R1为唾液酸；X为氧或碳；m＝1～2，n＝8～14；
所述的乳糖糖脂或葡萄糖糖脂具有以下结构：
R2-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R2为乳糖或葡萄糖；X为氧或碳；m＝1～2，n＝8～14。
所述的联乙炔结构的类脂单体具有以下结构：
CH3-(CH2)n-C≡C-C≡C-(CH2)m-COOH，其中：m＝0～10，n＝17～30。
所述的磷脂具有以下结构：
其中：R1和R2均为10～26个碳的脂肪链。
所述的有机溶剂为丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇等中的一种或大于一种以上的混合物。
所述的水相溶液为去离子水或pH在6～8之间的缓冲溶液等。
所述的缓冲溶液是磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液或巴比妥钠-盐酸缓冲液等中的一种。
所述的超声是探针超声或水浴超声。
在本发明中，当识别分子与形成光敏囊泡双分子层结构的联乙炔的类脂单体和磷脂单体的摩尔比为0.2，同时识别分子为唾液酸糖脂与乳糖糖脂，且两者摩尔比为1∶1，而联乙炔的类脂单体与磷脂单体的摩尔比为3∶2时，所制备得到的变色光敏囊泡效果最好。另外紫外光波长优选为240～260nm，照射时间优选为15～60秒，而探针超声6分钟，超声温度为90℃所得到的光敏囊泡更为均一、透明。
本发明中的变色光敏囊泡具有制备简单、成本低等优点。具有识别功能的两种单糖头糖脂易于合成，原料易得，价格低廉，并可灵活多变组合；本发明的将两种单糖头糖脂组装后对识别禽流感病毒的能力，比使用单一功能性唾液酸糖头或唾液酸-半乳糖天然糖头对禽流感病毒的检测能力有显著的提高，且光敏囊泡变色响应时间更加短暂。
附图说明
图1.本发明实施例3基于疏水作用将单糖头糖脂物理插入聚联乙炔-磷脂双分子层中组装形成能有效检测禽流感的光敏囊泡结构示意图。
具体实施方式
实施例1
将单糖头糖脂识别分子、磷脂单体、联乙炔的类脂单体混溶于丙酮中，其中，单糖头糖脂识别分子与形成联乙炔-磷脂光敏囊泡双分子层结构的联乙 炔的类脂单体和磷脂单体总的摩尔比为1∶100，联乙炔的类脂单体与磷脂单体的摩尔比为4∶1；旋蒸除去丙酮，加入去离子水，使联乙炔的类脂单体和磷脂单体在去离子水中的总浓度为0.01mmol/L，使单糖头糖脂利用疏水力嵌入到光敏囊泡的联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中；在温度为90℃下，探针超声水合10分钟，使去离子水被联乙炔-磷脂双分子层包裹，得到非聚合的囊泡溶液；静置于4℃冰箱中陈化2小时，再将此囊泡溶液用波长为360nm的紫外灯照射600秒使联乙炔的类脂单体聚合，最终得到蓝色的具有识别禽流感H5N1病毒功能的含有糖脂组合探针的光敏囊泡。
所述的单糖头糖脂识别分子为唾液酸糖脂和乳糖糖脂，其中嵌入到光敏囊泡的聚联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中的唾液酸糖脂与乳糖糖脂的摩尔比为1∶9。
所述的唾液酸糖脂具有以下结构：
R1-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R1为唾液酸；X为氧；m＝1，n＝8；
所述的乳糖糖脂具有以下结构：
R2-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R2为乳糖；X为氧；m＝1，n＝8。
所述的联乙炔的类脂单体具有以下结构：
CH3-(CH2)n-C≡C-C≡C-(CH2)m-COOH，其中m＝0，n＝17。
所述的磷脂单体具有以下结构：
将4μL浓度为10mg/mL的禽流感病毒HA1蛋白溶液加入到2mL上述蓝色的光敏囊泡中，在30℃水浴中恒温5分钟后，光敏囊泡溶液由蓝色变成紫色。而相应的未加入禽流感病毒HA1蛋白溶液的蓝色光敏囊泡溶液则未发生颜色变化。
实施例2
将单糖头糖脂识别分子、磷脂单体、联乙炔的类脂单体混溶于二氯甲烷中，其中，单糖头糖脂识别分子与形成联乙炔-磷脂光敏囊泡双分子层结构的联乙炔的类脂单体和磷脂单体总的摩尔比为1∶100，联乙炔的类脂单体与磷脂单体的摩尔比为1∶1；旋蒸除去二氯甲烷，加入pH为6.0的磷酸二氢钾- 氢氧化钠缓冲液，使联乙炔的类脂单体和磷脂单体在磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中的总浓度为200mmol/L，使单糖头糖脂利用疏水力嵌入到光敏囊泡的联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中；在温度为30℃下，水浴超声水合180分钟，使pH为6.0的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液被联乙炔-磷脂双分子层包裹，得到非聚合的囊泡溶液；静置于4℃冰箱中陈化48小时，再将此囊泡溶液用波长为360nm的紫外灯照射600秒使联乙炔的类脂单体聚合，最终得到蓝色的具有识别禽流感H5N1病毒功能的含有糖脂组合探针的光敏囊泡。
所述的单糖头糖脂识别分子为唾液酸糖脂和乳糖糖脂，其中嵌入到光敏囊泡的聚联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中的唾液酸糖脂与乳糖糖脂的摩尔比为9∶1。
所述的唾液酸糖脂具有以下结构：
R1-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R1为唾液酸；X为碳；m＝2，n＝14；
所述的乳糖糖脂具有以下结构：
R2-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R2为乳糖；X为碳；m＝2，n＝14。
所述的联乙炔的类脂单体具有以下结构：
CH3-(CH2)n-C≡C-C≡C-(CH2)m-COOH，其中m＝10，n＝30。
所述的磷脂单体具有以下结构：
将4μL浓度为10mg/mL的禽流感病毒HA1蛋白溶液加入到2mL上述蓝色的光敏囊泡中，在30℃水浴中恒温5分钟后，光敏囊泡溶液由蓝色变成紫红色。而相应的未加入禽流感病毒HA1蛋白溶液的蓝色光敏囊泡溶液则未发生颜色变化。
实施例3
将单糖头糖脂识别分子、磷脂单体、联乙炔的类脂单体混溶于氯仿中，其中，单糖头糖脂识别分子与形成联乙炔-磷脂光敏囊泡双分子层结构的联乙炔的类脂单体和磷脂单体总的摩尔比为1∶5，联乙炔的类脂单体与磷脂单体的摩尔比为3∶2；旋蒸除去氯仿，加入pH为6.9的磷酸盐缓冲溶液，使联乙炔的类脂单体和磷脂单体在磷酸盐缓冲溶液中的总浓度为2mmol/L，使单糖 头糖脂利用疏水力嵌入到光敏囊泡的联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中；在温度为90℃下，探针超声水合20分钟，使pH为6.9的磷酸盐缓冲溶液被联乙炔-磷脂双分子层包裹，得到非聚合的囊泡溶液；静置于4℃冰箱中陈化12小时，再将此囊泡溶液用波长为264nm的紫外灯照射30秒使联乙炔的类脂单体聚合，最终得到蓝色的具有识别禽流感H5N1病毒功能的含有糖脂组合探针的光敏囊泡。单糖头糖脂物理插入聚联乙炔-磷脂双分子层中组装形成能有效检测禽流感的光敏囊泡结构如图1所示；其中：(1)代表联乙炔单体的聚合结构，(2)代表磷脂单体，(3)代表唾液酸糖脂，(4)代表乳糖糖脂。
所述的单糖头糖脂识别分子为唾液酸糖脂和乳糖糖脂，其中嵌入到光敏囊泡的聚联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中的唾液酸糖脂与乳糖糖脂的摩尔比为1∶1。
所述的唾液酸糖脂具有以下结构：
R1-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R1为唾液酸；X为氧；m＝1，n＝11；
所述的乳糖糖脂具有以下结构：
R2-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R2为乳糖；X为氧；m＝1，n＝11。
所述的联乙炔的类脂单体具有以下结构：
CH3-(CH2)n-C≡C-C≡C-(CH2)m-COOH，其中m＝9，n＝11。
所述的磷脂单体具有以下结构：
将3μL浓度为10mg/mL的禽流感病毒HA1蛋白溶液加入到2mL上述蓝色的光敏囊泡中，在30℃水浴中恒温5分钟后，光敏囊泡溶液由蓝色变成红色。而相应的未加入禽流感病毒HA1蛋白溶液的蓝色光敏囊泡溶液则未发生颜色变化。
实施例4
将单糖头糖脂识别分子、磷脂单体、联乙炔的类脂单体混溶于乙酸乙酯中，其中，单糖头糖脂识别分子与形成联乙炔-磷脂光敏囊泡双分子层结构的联乙炔的类脂单体和磷脂单体总的摩尔比为1∶100，联乙炔的类脂单体与磷脂单体的摩尔比为3∶2；旋蒸除去乙酸乙酯，加入pH为8.0的Tris-盐酸缓冲 溶液，使联乙炔的类脂单体和磷脂单体在Tris-盐酸缓冲溶液中的总浓度为200mmol/L，使单糖头糖脂利用疏水力嵌入到光敏囊泡的联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中；在温度为30℃下，水浴超声水合180分钟，使pH为8.0的Tris-盐酸缓冲溶液被联乙炔-磷脂双分子层包裹，得到非聚合的囊泡溶液；静置于4℃冰箱中陈化48小时，再将此囊泡溶液用波长为200nm的紫外灯照射10秒使联乙炔的类脂单体聚合，最终得到蓝色的具有识别禽流感H5N1病毒功能的含有糖脂组合探针的光敏囊泡。
所述的单糖头糖脂识别分子为唾液酸糖脂和乳糖糖脂，其中嵌入到光敏囊泡的聚联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中的唾液酸糖脂与乳糖糖脂的摩尔比为7∶3。
所述的唾液酸糖脂具有以下结构：
R1-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R1为唾液酸；X为氧；m＝2，n＝14；
所述的乳糖糖脂具有以下结构：
R2-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R2为乳糖；X为氧；m＝2，n＝14。
所述的联乙炔的类脂单体具有以下结构：
CH3-(CH2)n-C≡C-C≡C-(CH2)m-COOH，其中m＝10，n＝30；
所述的磷脂单体具有以下结构：
将4μL浓度为10mg/mL的禽流感病毒HA1蛋白溶液加入到2mL上述蓝色的光敏囊泡中，在30℃水浴中恒温5分钟后，光敏囊泡溶液由蓝色变成红紫色。而相应的未加入禽流感病毒HA1蛋白溶液的蓝色光敏囊泡溶液则未发生颜色变化。
实施例5
将单糖头糖脂识别分子、磷脂单体、联乙炔的类脂单体混溶于甲醇中，其中，单糖头糖脂识别分子与形成联乙炔-磷脂光敏囊泡双分子层结构的联乙炔的类脂单体和磷脂单体总的摩尔比为1∶100，联乙炔的类脂单体与磷脂单体的摩尔比为3∶2；旋蒸除去甲醇，加入pH8.0巴比妥钠-盐酸缓冲液，使联乙炔的类脂单体和磷脂单体在巴比妥钠-盐酸缓冲液中的总浓度为 200mmol/L，使单糖头糖脂利用疏水力嵌入到光敏囊泡的联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中；在温度为30℃下，水浴超声水合180分钟，使pH8.0巴比妥钠-盐酸缓冲液被联乙炔-磷脂双分子层包裹，得到非聚合的囊泡溶液；静置于4℃冰箱中陈化2小时，再将此囊泡溶液用波长为360nm的紫外灯照射600秒使联乙炔的类脂单体聚合，最终得到蓝色的具有识别禽流感H5N1病毒功能的含有糖脂组合探针的光敏囊泡。
所述的单糖头糖脂识别分子为唾液酸糖脂和乳糖糖脂，其中嵌入到光敏囊泡的聚联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中的唾液酸糖脂与乳糖糖脂的摩尔比为3∶7。
所述的唾液酸糖脂具有以下结构：
R1-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R1为唾液酸；X为氧；m＝1，n＝8；
所述的乳糖糖脂具有以下结构：
R2-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R2为乳糖；X为氧；m＝1，n＝8。
所述的联乙炔的类脂单体具有以下结构：
CH3-(CH2)n-C≡C-C≡C-(CH2)m-COOH，其中m＝0，n＝17。
所述的磷脂单体具有以下结构：
将4μL浓度为10mg/mL的禽流感病毒HA1蛋白溶液加入到2mL上述蓝色的光敏囊泡中，在30℃水浴中恒温5分钟后，光敏囊泡溶液由蓝色变成紫红色。而相应的未加入禽流感病毒HA1蛋白溶液的蓝色光敏囊泡溶液则未发生颜色变化。
实施例6
将单糖头糖脂识别分子、磷脂单体、联乙炔的类脂单体混溶于甲醇与氯仿的混合溶剂中，其中，单糖头糖脂识别分子与形成联乙炔-磷脂光敏囊泡双分子层结构的联乙炔的类脂单体和磷脂单体总的摩尔比为1∶5，联乙炔的类脂单体与磷脂单体的摩尔比为3∶2；旋蒸除去甲醇与氯仿的混合溶剂，加入pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液，使联乙炔的类脂单体和磷脂单体在磷酸盐缓冲溶液中的总浓度为200mmol/L，使单糖头糖脂利用疏水力嵌入到光敏囊泡的 联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中；在温度为90℃下，探针超声水合10分钟，使pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液被联乙炔-磷脂双分子层包裹，得到非聚合的囊泡溶液；静置于4℃冰箱中陈化12小时，再将此囊泡溶液用波长为264nm的紫外灯照射30秒使联乙炔的类脂单体聚合，最终得到蓝色的具有识别禽流感H5N1病毒功能的含有糖脂组合探针的光敏囊泡。
所述的单糖头糖脂识别分子为唾液酸糖脂和葡萄糖糖脂，其中嵌入到光敏囊泡的聚联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中的唾液酸糖脂与葡萄糖糖脂的摩尔比为1∶1。
所述的唾液酸糖脂具有以下结构：
R1-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R1为唾液酸；X为氧；m＝1，n＝11；
所述的葡萄糖糖脂具有以下结构：
R2-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R2为乳糖；X为氧；m＝1，n＝11。
所述的联乙炔的类脂单体具有以下结构：
CH3-(CH2)n-C≡C-C≡C-(CH2)m-COOH，其中m＝10，n＝10。
所述的磷脂单体具有以下结构：
将6μL浓度为10mg/mL的禽流感病毒HA1蛋白溶液加入到2mL上述蓝色的光敏囊泡中，在30℃水浴中恒温5分钟后，光敏囊泡溶液由蓝色变成红色。而相应的未加入禽流感病毒HA1蛋白溶液的蓝色光敏囊泡溶液则未发生颜色变化。
Claims (10)
1.一种检测禽流感病毒的含有单糖头糖脂组合探针的光敏囊泡，包括内水相、聚联乙炔-磷脂双分子层以及作为组合探针的具有识别禽流感病毒功能的单糖头糖脂识别分子；其特征是：具有识别禽流感病毒功能的单糖头糖脂识别分子利用疏水力嵌入到光敏囊泡的聚联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中，内水相被聚联乙炔-磷脂双分子层包裹在其中而形成光敏囊泡；所述的单糖头糖脂识别分子与形成光敏囊泡双分子层结构的联乙炔的类脂单体和磷脂单体总的摩尔比为1∶100～1∶5，聚联乙炔-磷脂双分子层由联乙炔的类脂单体和磷脂单体聚合而成，联乙炔的类脂单体与磷脂单体的摩尔比为1∶1～4∶1；
所述的单糖头糖脂识别分子为唾液酸糖脂和乳糖糖脂或葡萄糖糖脂，其中唾液酸糖脂与乳糖糖脂或葡萄糖糖脂的摩尔比为1∶9～9∶1；
所述的唾液酸糖脂具有以下结构：
R1-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R1为唾液酸；X为氧或碳；m＝1～2，n＝8～14；
所述的乳糖糖脂或葡萄糖糖脂具有以下结构：
R2-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R2为乳糖或葡萄糖；X为氧或碳；m＝1～2，n＝8～14。
2.根据权利要求1所述的检测禽流感病毒的含有单糖头糖脂组合探针的光敏囊泡，其特征是：所述的联乙炔的类脂单体具有以下结构：
CH3-(CH2)n-C≡C-C≡C-(CH2)m-COOH，其中：m＝0～10，n＝17～30。
3.根据权利要求1所述的检测禽流感病毒的含有单糖头糖脂组合探针的光敏囊泡，其特征是：所述的磷脂具有以下结构：
其中：R1和R2均为10～26个碳的脂肪链。
4.根据权利要求1所述的检测禽流感病毒的含有单糖头糖脂组合探针的光敏囊泡，其特征是：所述的内水相为去离子水或pH在6～8之间的缓冲溶液。
5.根据权利要求4所述的检测禽流感病毒的含有单糖头糖脂组合探针的光敏囊泡，其特征是：所述的缓冲溶液是磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液或巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种。
6.一种根据权利要求1～5任意一项所述的检测禽流感病毒的含有糖脂组合探针的光敏囊泡的制备方法，其特征是：将单糖头糖脂识别分子、磷脂单体、联乙炔的类脂单体混溶于有机溶剂中，其中，单糖头糖脂识别分子与形成聚联乙炔-磷脂光敏囊泡双分子层结构的联乙炔的类脂单体和磷脂单体总的摩尔比为1∶100～1∶5，联乙炔的类脂单体与磷脂单体的摩尔比为1∶1～4∶1；旋蒸除去有机溶剂，加入水相溶液使联乙炔的类脂单体和磷脂单体在水相溶液中的总浓度为0.01～200mmol/L，使单糖头糖脂利用疏水力嵌入到光敏囊泡的联乙炔-磷脂双分子层的磷脂区域中；在温度为30～90℃下，超声水合10～180分钟，使内水相被联乙炔-磷脂双分子层包裹，得到非聚合的囊泡溶液；静置于4℃冰箱中陈化2～48小时，再将此囊泡溶液用波长为200～360nm的紫外灯照射10～600秒使联乙炔的类脂单体聚合，最终得到具有识别禽流感病毒功能的含有糖脂组合探针的光敏囊泡；
所述的单糖头糖脂识别分子为唾液酸糖脂和乳糖糖脂或葡萄糖糖脂，其中唾液酸糖脂与乳糖糖脂或葡萄糖糖脂的摩尔比为1∶9～9∶1；
所述的唾液酸糖脂具有以下结构：
R1-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R1为唾液酸；X为氧或碳；m＝1～2，n＝8～14；
所述的乳糖糖脂或葡萄糖糖脂具有以下结构：
R2-X-(C2H4O)2-(C2H4O)m-CH2-(CH2)n-CH3；
其中：R2为乳糖或葡萄糖；X为氧或碳；m＝1～2，n＝8～14。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是：所述的有机溶剂为丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇中的一种或大于一种以上的混合物。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是：所述的水相溶液为去离子水或pH在6～8之间的缓冲溶液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征是：所述的缓冲溶液是磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液或巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是：所述的超声是探针超声或水浴超声。
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