CN101802601A - 基质浓度的测定方法和其装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供测定基质浓度的方法和用于其的装置，该方法是将生物体催化剂与识别该生物体催化剂的基质反应的结果所产生的能量蓄积至一定水平，该蓄积速度依赖于基质浓度，以此为指标进行测定的方法。特别地，提供通过蓄积在电容器中的能量达到一定水平以上而释放之际的一定时间内的能量释放频率来测定蓄积速度的方法和其装置。

Description

基质浓度的测定方法和其装置
技术领域
本发明涉及测定基质浓度的方法和用于其的装置(生物传感器)。
背景技术
生物传感器是将下述装置作为变换器(transducer)来测定基质的传感器，所述装置通过生物体催化剂利用生物体催化剂的反应而与作为基质的化合物反应，由此可以检测生物体催化剂反应的结果所产生的产物、减少的基质、与产物反应而生成的化学物质。或者，是指将可检测生物体催化剂反应的结果所产生的光、色调变化、荧光等物理信号的装置作为变换器来测定该基质的传感器。生物体催化剂可以列举酶、细胞器、细胞、微生物等。
即，生物传感器是指下述那样的传感器，即，使用生物体催化剂作为分子识别元件，通过使其信号与电化学装置、光装置、热检测装置等的变换器组合，将生物体催化剂的反应变换为电子仪器可检测的信号，从而能够分析生物体催化剂可识别的基质。代表性的生物传感器之一是以酶作为生物体催化剂的酶传感器。例如为了测定葡萄糖(glucose)，开发了葡萄糖传感器，其以下述为指标，即，氧化葡萄糖的酶固定在氧电极、过氧化氢电极等电极表面上，电化学地测定由葡萄糖氧化反应消耗的氧量，同时测定生成的过氧化氢量。
目前多使用的酶传感器以使用了氧化还原酶的传感器为主流，其主要原理基于下述方法，即，利用电流计或者利用在阴极还原时阳极与阴极之间产生的电位差来测定下述那样产生的电子，所述电子是从外部对于由阳极的酶反应生成的还原物质施加电位，将其再氧化时所产生的电子。
另外，作为在简易血糖诊断装置等中使用的方法，也可以采用按照常规方法使由酶反应产生的过氧化氢或还原型人工电子受体等还原物质生色，并通过光学传感器判断其色彩的方法。
作为其它特殊酶的例子，就采用萤火虫等发光生物来源的酶、荧光素酶作为酶的酶传感器而言，还报道了以下述为特色的酶传感器：对荧光素酶的基质反应时由酶反应产生的光进行检测。但是，对于该方法，受限于作为荧光素酶基质的物质、例如ATP的检测，或者受限于可采用下述原理等的应用例使用荧光素酶的情况，所述原理是在检测抗体反应时通过用荧光素酶标记抗体而间接地用光信号进行检测的原理。
非专利文献1：Katz et al.，J.Am.Chem.Soc.2001，123，10752-10753
发明内容
在以上现有的生物传感器中，使用了酶传感器等生物传感器的测定仪器(以下称作为酶传感器系统)由基于生物传感器的测定部和接收测定信号并对其进行处理的监控部而构成，主流是将它们一体化，或者如可见于个体血糖诊断装置那样的使相当于测定部的部分可分离以便用完即扔的类型。并且，检测基质浓度的测定部和检测生物传感器信号的监控部存在下述那样的问题，即，必须与生物体催化剂反应的场所直接接触、或连线，或者必须另外准备起动特殊发送器的电路和用于其的电源。
另一方面，迄今为止虽报道了以酶燃料电池的电动势为指标的酶传感器，但该燃料电池单体的电动势小于1V，因此不能直接利用燃料电池的电动势使传感用装置运转。当以燃料电池型酶传感器的电动势作为指标测定基质浓度时，需要将该电动势直接与电压计连接，通过测定电压来测定基质浓度，或者需要连接测定该电动势的电压计，将电压计的应答值通过由外部电源起动的无线装置发射到外部接收机上。(参考“A Novel Wireless Glucose Sensor Employing DirectElectron Transfer Principle Based Enzyme Fuel Cell”Noriko Kakehi，Tomohiko Yamazaki，Wakako Tsugawa and Koji Sode Biosensors&Bioelectronics Epub 2006 Dec.11)
即，尽管燃料电池型酶传感器是小型的且具有高性能传感能力的传感器，但若欲以无线方式将其信号埋入或组装在生物体中，用无线检测时，如果不使用新的电源，则不能读出燃料电池型酶传感器的数据。因此，为了增加酶燃料电池的电动势，可考虑串联连接酶燃料电池，由此使电动势对应于电池数目而增加，但当以生物体内的发电或生物体内监控为目标时，在生物体内配置串联接接的酶燃料电池的方式，作为装置是复杂的，另外，还存在有电极变得大型化的问题，不能实用。
因此，在本发明中，提出了将酶等生物体催化剂反应的结果所生成的能量进行蓄积，以该蓄积的速度、或者暂时蓄积的能量释放时的频率作为指标来进行测定的方案。即，在本发明中，着眼于由依赖于基质浓度的生物体催化剂的反应生产一定的能量时，其生产速度依赖于基质浓度的事实，对下列事实进行了利用：将蓄积的能量规定在一定水平，如果在该能量蓄积到一定水平时释放该能量，则其释放频率依赖于生物体催化剂的基质浓度。本发明提出了通过测定该释放频率来测定生物体催化剂的基质浓度的方案。
特别地，通过使酶等的生物体催化剂与装备了下述那样电路的装置组合而可提供基质浓度的测定方法和用于其的装置，所述电路是利用放电的电量而产生信号的电路，所述放电是将作为生物体催化剂反应的结果所产生的能量的电能在电容器中蓄积至一定水平而进行的放电。
另外，通过与由蓄积于电容器中的电能而产生光、声波、电磁波等的电路进行组合，由传感器产生的信号可以容易地利用非接触的监控部侧的信号检测装置接收，因而可使监控部与测定部分离。这样，由于测定部与监控部的分离变得可能，故测定侧能够进一步的小型化，对于移动或体内安装·嵌入型传感器极为有利。
进而，在本发明的其它侧面，提供将由酶反应产生的电能蓄积在电容器中，利用其电动势起动无线装置而可将其信号发射至外部接收机的新型无线酶传感器的电路。即，提供可用酶燃料电池的电动势以无线的方式发射同传感器(セン一)信号的、不需要电源的自动式无线酶传感器。另外，对于本发明的装置，与目前的电位测定等不同，在超过无线发射装置的起动电位时，无线信号可以在接收侧检测，基于此，可以提供以无线发射装置的起动频率为指标来测定所述基质浓度的装置。
本发明的构成如下所示。
(1)测定基质浓度的方法，其特征在于，将生物体催化剂与识别该生物体催化剂的基质反应的结果所产生的能量蓄积至一定水平，该蓄积速度依赖于基质浓度，以此为指标进行测定。
(2)根据上述(1)所述的方法，其特征在于，前述指标通过前述能量达到一定水平以上而释放之际的一定时间内的能量释放频率来进行测定。
(3)根据上述(1)或(2)所述的方法，其特征在于，前述生物体催化剂是酶、细胞器、微生物、细胞。
(4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的方法，其特征在于，前述生物体催化剂催化的反应是氧化反应。
(5)根据上述(3)所述的方法，其特征在于，前述生物体催化剂是酶。
(6)根据上述(5)所述的方法，其特征在于，前述酶是氧化还原酶。
(7)根据上述(1)～(6)中任一项所述的方法，其特征在于，将蓄积的能量作为电荷蓄积到电容器中。
(8)测定基质浓度的装置，其是具有燃料电池、电容器和测定器的装置，所述燃料电池具有设置了生物体催化剂的基质的阳极和设置了外部电子受体的阴极，所述电容器串联连接于前述燃料电池，所述测定器以前述电容器的充电速度为指标进行测定，该装置的特征在于，通过将由前述基质与生物体催化剂反应而产生的电子转移至前述阴极的前述外部电子受体而生成电动势，将该电动势充电至前述电容器，利用前述测定器测定其充电速度。
(9)根据上述(8)所述的装置，其特征在于，前述测定器是充电至前述电容器的电位达到一定水平以上时将该蓄积的电位放电，从而测定前述放电的频率的装置。
(10)根据上述(8)或(9)所述的装置，其特征在于，进一步具有电荷泵，该电荷泵用于在向前述电容器充电时，升高基于前述生物体催化剂反应的电动势，而向前述电容器充电。
(11)根据上述(9)或(10)所述的装置，其特征在于，前述测定器是具有利用来自电容器的放电而产生信号的信号发生电路，并测定前述信号的频率的测定器。
(12)根据上述(11)所述的装置，其特征在于，前述信号发生电路是无线发射装置。
(13)根据上述(11)或(12)所述的装置，其特征在于，前述测定器测定前述信号发生电路工作时产生的物理信号和/或化学信号。
(14)根据上述(13)所述的装置，其特征在于，前述物理信号和/或化学信号是声波、光或电磁波。
(15)根据上述(11)～(14)中任一项所述的装置，其特征在于，前述测定器进一步具有接收机，所述接收机用于接收前述电容器由充电而超过前述无线发射机的起动电压时，因前述电容器的放电而产生的信号。
(16)根据上述(8)～(15)中任一项所述的装置，其特征在于，设置于前述阳极的生物体催化剂是酶。
(17)根据上述(16)所述的装置，其特征在于，前述酶是氧化还原酶。
(18)根据上述(16)所述的装置，其特征在于，前述酶是催化葡萄糖氧化的酶。
可以使用酶、细胞器、细胞、微生物等作为本发明中使用的生物体催化剂，另外，其催化的反应期望是测定对象的氧化还原反应。酶可以使用各种氧化还原酶，可以列举例如以FAD为辅酶的醇、葡萄糖、胆固醇、果糖胺(fructosyl amine)、甘油、尿酸的氧化酶；以FAD为辅酶的醇、葡萄糖、甘油的脱氢酶；以PQQ为辅酶的醇、葡萄糖、甘油的脱氢酶等。特别地，当以葡萄糖为测定对象时，期望葡萄糖氧化酶或以FAD或PQQ为辅酶的葡萄糖脱氢酶。其可以是从产生该酶的微生物、细胞分离精制而成的酶，也可以是大肠菌等中重组生产的酶。
另外，本发明中使用的生物体催化剂即使不是酶单体，但如果可在阳极氧化基质，并将其电子传输至适当的电子受体或直接传输至电极，则也可以是含有酶的膜、含有酶的细胞器、含有酶的细胞，只要通过这些酶反应以及与其共轭的多个酶的反应结果可以实现上述基质的氧化反应，就可以使用。
作为使用本发明的酶来产生电能的方法，可以采用酶燃料电池。即下述酶燃料电池，其特征在于将氧化酶或脱氢酶固定在阳极上。
此时，当使用胆红素氧化酶那样还原氧的酶作为阴极时，或者可以使用组合了适当的电子受体的电极。或者，可以使用铂或含有铂的无机催化剂等具有氧还原能力的催化剂。
另外，阳极可以认为是同时含有酶和电子受体的构成。即，可以使用下述那样的构成：将由酶反应得到的电子传递给人工电子受体，使其在电极上氧化。或者，在阳极，电子传递亚单元上具有细胞色素的酶等、与电极直接进行电子转移的脱氢酶等可以不添加人工电子受体而构成阻极。阻极和阴极的电极材料可以使用填充或涂布了碳粒子的电极、碳电极、金电极、铂电极等。
阳极或阴极的人工电子受体没有特别地限定，可以使用锇配位化合物、钌配位化合物、吩嗪硫酸甲酯和其衍生物、醌系化合物等。
阴极用酶没有特别地限定，可以应用胆红素氧化酶或漆酶。阴极的人工电子受体没有特别地限定，可以使用铁氰化钾、ABTS等。
阳极用酶可以使用各种氧化酶或脱氢酶。特别是以葡萄糖作为测定对象时，可以使用葡萄糖氧化酶、以PQQ或FAD为辅酶的葡萄糖脱氢酶。
在本发明中，作为将酶安装在电极上的方法，可以将其直接与碳糊等的电极材料混合来使用。或者可以使用一般的酶固定化方法调制成固定化酶后安装在电极上。可以列举例如在将两者混合后用戊二醛等的二交联性试剂进行交联处理的方法，和在光交联性聚合物、导电性聚合物或氧化还原聚合物等合成聚合物或天然高分子基质中进行包埋固定的方法。将下述那样的混合物安装在由碳或金、或铂等构成的电极上，所述混合物是在将上述调制的混合蛋白质与碳粒子混合、或者与由碳粒子构成且以易于与酶交合的方式存在的碳糊进行混合后，进而通过交联处理来调制的。碳粒子可以使用比表面积从10m2/g左右至500m2/g以上、更优选800m2/g以上的碳粒子。例如，前者可以列举作为市售品的バルカン，后者可以列举科琴黑等。
进而，当如此在电极上安装酶时，也可以同时固定人工电子受体。典型地，将以FAD为辅酶的葡萄糖脱氢酶、FADGDH和甲氧基吩嗪硫酸甲酯(mPMS)混合，并将其进而与碳糊混合后进行冷冻干燥。将其安装在碳电极上，在该状态下浸入戊二醛水溶液，将蛋白质交联，制成酶电极。
对于酶燃料电池，在阳极电极上固定以测定对象为基质的氧化或脱氢酶。在阴极上固定氧还原酶。将这样制成的电极作为阳极和阴极用电极，阳极可以例如以m-PMS为人工电子受体，而阴极例如能够以ABTS为人工电子受体。
通过将这样制成的利用酶反应产生电能的部分连接在电容器上，可以将该电能蓄电。即，基于由酶反应得到的电动势，图2所示的连接在电路中的电容器蓄电，直至电容器的容量得到填充。因此，当利用相同基质浓度的溶液进行酶反应时，如果使用容量大的电容器，则在充电结束前有较长的时间，相反如果使用容量小的电容器，则直到充电结束的时间变短。或者当使用相同容量的电容器时，如果酶的基质浓度低，则电能每单位时间的生成量少，因此直到充电结束的时间变长，如果基质浓度高，则相反直到充电结束的时间变短。即，通过使电容器为一定的容量，充电所需要的时间根据酶的基质浓度而变化，因此通过以充电所需要的时间(充电速度)为指标，可以测定基质浓度。即，预先记录观测到的充电所需时间(充电速度)与基质浓度的相关性，以此为基础制成校正曲线，可以由观测的充电所需要的时间来测定未知试样的基质浓度。
进而，在电容器上连接适当的电路，在充电结束时可以引发放电，从而测定每单位时间的充电放电的频率，由此也可以同样地测定基质浓度。即，预先记录观测到的每单位时间放电的频率与基质浓度的相关性，以此为基础制成校正曲线，由观测的放电频率可以测定未知试样的基质浓度。
进而，如果利用连接在其上电路产生光、声波或电磁波，则通过观测该光、声波或电磁波，可以测定每单位时间观测到的频率、或观测到的间隔，由此来测定基质的浓度。即，预先记录观测的光、声波或电磁发生所需要的时间或单位时间的频率与基质浓度的相关性，以此为基础制成校正曲线，可以由观测的光、声波或电磁发生所需要的时间或单位时间的频率来测定未知试样的基质浓度。
另外，根据起动的电路，也可以适当地设定电容器的电位。即，通过使酶燃料电池的电动势与升压电路组合，可以升高向电容器中充电的电压，所述酶燃料电池使由酶反应产生的电能作为电动势而产生。对于该升压，可以使用市售的电荷泵、或其IC电路。根据组合的电荷泵的种类以及其数量，可以调节在电容器中蓄电的电压，根据起动的信号发生电路，可以设定电容器的电压。
电容器充电·放电的频率如前述那样依赖于电容器的容量以及基质的浓度。即，只要基质浓度一定，则电容器容量越小，充放电的频率越高，而如果电容器容量变大，则充放电的频率变低。另外，如果电容器容量一定，则充放电的频率根据基质浓度而变化，基质浓度低，则充放电的频率变低，基质浓度越高，则充放电的频率变高。
例如，在电容器的两端连接电压系统，对其进行观测，则如图3所示。在该方式下，使用葡萄糖浓度一定的试样作为基质，采用催化葡萄糖脱氢化的酶作为酶，介由电荷泵将由酶燃料电池产生的电动势从酶燃料电池的0.3V升压至1.8V，而对电容器进行充电。如图3所示，电容器的电压以一定的间隔达到1.8V，由酶反应产生的电能进行蓄电，可以观察其释放的情形。此时，连接的、电容器的容量从0.47μF改变至1μF时所观测到的充放电的间隔发生变化。即，在电容器容量为0.47μF时，其间隔为0.2秒(充放电频率5次/秒5Hz)，相对于此，在电容器容量为1μF时，为2.4Hz，在10μF时，变化为0.27Hz，在100μF时，变化为0.028Hz。
进而，对使用10μF的电容器、使葡萄糖浓度变化并向电容器充电的状态进行观察时，则葡萄糖浓度低时充放电间隔长，葡萄糖浓度高时充放电间隔短(参考图4)。相反，作为充放电频率对其进行观测时，则葡萄糖浓度低时充放电频率低，葡萄糖浓度高时充放电频率高。
同样，通过在该电路上连接根据电容器的充放电而产生信号的电路，可以观测由其产生的光、声波或电磁波，由此同样能够测定基质浓度。例如，当连接发光二极管时，通过观察发光二极管发光的间隔或发光的频率，可以测定基质浓度。
如图5所示，显示葡萄糖浓度低时发光的间隔长，而葡萄糖浓度高时发光的间隔短。相反，如果作为发光的频率对其进行观测，则显示葡萄糖浓度低时发光频率低，葡萄糖浓度高时发光频率高。
另外，同样在该电路中连接发生电磁波的共振电路时，通过观察电磁波发射的间隔或频率，可以测定基质浓度。该情况下，葡萄糖浓度低时发射的电磁波间隔长，而葡萄糖浓度高时间隔短。如果作为电磁波的发射频率对其进行观测，则葡萄糖浓度低时发射频率低，而葡萄糖浓度高时发信频率高。
由这种形式可知，当连接利用电容器的电容量以及电压而起动的信号发射电路时，不论由其发出的信号的种类、即光、声波或电磁波，均可通过观察其间隔和频率来测定酶反应的基质浓度。另外，显然该酶不限于这里所示的以葡萄糖为基质的脱氢酶，可以使用各种氧化酶、脱氢酶。例如可以列举以FAD为辅酶的醇、葡萄糖、胆固醇、果糖胺、甘油、尿酸的氧化酶、以FAD为辅酶的醇、葡萄糖、甘油的脱氢酶、以PQQ为辅酶的醇、葡萄糖、甘油的脱氢酶等。另外，观看迄今为止使用了各种催化氧化还原反应的生物体催化剂的生物传感器的研究案例即可清楚地知道：即使不是酶单体，但只要可在阳极氧化基质并将其电子传送至适当的电子受体或直接传送至电极，则也可以是含有酶的膜、细胞器、细胞、微生物，只要利用这些生物体催化剂反应的结果可以实现前述基质的氧化反应，就能够使用。
另外，作为其它的方式，可以使用在无线通信中使用的发射电路作为连接在电容器上的信号发射电路。对于这些发射电路，为了启动其电路，需要达到一定的电压以上，当电动势低于其时，电路停止，从而发射停止。另外在一定的电压以下不能起动。即，在电容器上连接以1.5V起动的无线发射电路，当对远离该发射信号的接收系统进行观察时，可以观察到与电容器的充放电相应的无线的发射。即，无线发射电路依赖于酶反应的基质浓度而起动，信号被发射，酶基质浓度越低，其间隔越长，越高，其间隔越短，另外酶基质浓度越低，信号的发射频率越低，酶基质浓度越高，信号的发射频率越高。因此，通过观察接收的发射记录，可以测定酶的基质浓度。
这样的无线发射电路可以使用共振电路。另外该共振电路内的电容器还可以使用容量可变的电容器。
附图说明
[图1]是表示本发明的基质测定方法和其装置的模式图。
[图2]是表示本发明中使用的电容器的电路图。
[图3]表示本发明装置的电容器的、由充电·放电的反复导致的电压变化。
[图4]表示电容器的充电频率与葡萄糖浓度的关系。
[图5]表示发光二极管相对于葡萄糖浓度变化的发光间隔(时间)。
[图6A]表示电容器的充电所需要的时间(电阻100kΩ)。
[图6B]表示电容器的充电所需要的时间(电阻500kΩ)。
[图6C]表示电容器的充电所需要的时间(电阻500kΩ)。
[图7A]表示相对于葡萄糖浓度变化的、电容器充电所需要的时间(10kΩ)。
[图7B]表示相对于葡萄糖浓度变化的、电容器充电所需要的时间(500kΩ)。
[图8A]表示利用了酶燃料电池的电容器的电压相对于时间的变化(0.47μF)。
[图8B]表示利用了酶燃料电池的电容器的电压相对于时间的变化(1μF)。
[图8C]表示利用了酶燃料电池的电容器的电压相对于时间的变化(10μF)。
[图8D]表示利用了酶燃料电池的电容器的电压相对于时间的变化(100μF)。
[图9]表示葡萄糖浓度变化时的信号频率。
[图10]表示相对于葡萄糖浓度变化的、电容器达到1.8V时的时间的变化。
[图11]电容器每单位时间达到1.8V的频率相对于葡萄糖浓度变化的相关性。
[图12]表示无线传感器中观察到的信号频率与葡萄糖浓度的相关性(1.8V升压)。
[图13]表示无线传感器中观察到的信号频率与葡萄糖浓度的相关性(2.4V升压)。
[图14]表示使用作为信号发射电路的共振电路作为发射机的计测·发射电路的例子。
[图15]表示记录使用图14所示的发射电路而观测到的电磁波的例子。
[图16]表示使用共振电路作为发射机的计测·发射电路的例子，所述共振电路使用变容二极管作为信号发射电路。
[图17]记述了对使用图16所示的发射电路而观测到的电磁波的频率和试样葡萄糖浓度进行计测的例子。
具体实施方式
以下，基于实施例来详细地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
实施例1
阳极的制作：
将科琴黑油墨10mL、100mM PPB(pH7.0)10mL和FADGDH复合物溶液40mL(1.2U/mL)进行混合，将其中50mL均匀涂布在1cm2的碳织物上，在4℃风干3小时。通过将其在室温下在1％戊二醛溶液(10ml)中浸渍30分钟，进行交联处理。接着，通过将该碳织物在10mM Tris-HCl(10ml)中浸渍20分钟来除去未反应的戊二醛后，浸渍在100mM PPB(pH7.0)(10ml)中进行1小时的平衡化，制作阳极。
阴极的制作：
将担载了铂的碳墨10mL和100mM PPB(pH7.0)50mL混合，将其50mL均匀涂布在碳织物上，在4℃风干3小时。在其中滴加50mL由乙醇稀释的3％(w/v)聚二甲基硅氧烷(PDMS)，风干一晚，将由此得到的物质作为阴极。
电池和电路的构建：
使用制作的阳极、阴极，以含有20mM葡萄糖的100mM PPB(pH7.0)作为反应溶液来构建电池。将电池、可变电阻器、电容器、开关全部串联连接来制作电路。
对于这样制成的电路，研究电容器充电时间。即，使用二种电容器(0.1mF、1mF)，在20mM的葡萄糖浓度下进行充电，对电容器所带电压和开关与电阻连接时流过电路的电流进行测定，进行电容器的充电时间的研究。
此时，电容器使用1mF的电容器且电阻为100kΩ，500kW、1000kΩ时的结果示于图6。开关打开的同时电流流过。另外，随着时间经过电流减少，电容器所带电压增加。另外，当改变电阻值，并减少或增加电流值时，与之相伴电容器的充电时间增加、减少。对于任何的电阻，当由流过电路的电流值计算充电至电容器的电荷量时，与电容器的容量都大致一致。另外，在使用0.1mF的电容器时，也可以得到同样的结果，但与1mF相比，充电时间短。即使使用酶燃料电池作为电源时，电容器也表现出充分的功能。
使用同样制成的电路来评价电容器充电时间的葡萄糖浓度依赖性。使用1mF的电容，使电阻为10kW或500kW，测定电容器所带电压。此时，缓慢添加葡萄糖试样使反应溶液的葡萄糖浓度增加，研究各个葡萄糖浓度下的充电时间。
其结果示于图7。对于10kW、500kW，充电时间都伴随着葡萄糖浓度的增加而减少。对于500kW，在6mM左右的浓度下不能观察到充电时间的减少，相对于此，对于10kW，直至11mM的浓度可以观察到电流值的增加。由此可知，以向电容器充电的时间为指标，可以测定酶的基质浓度。
实施例2
阳极的制作：
将科琴黑油墨10mL、100mM PPB(pH7.0)10mL和FADGDH复合物溶液40mL(4.2U/mL)进行混合，将其中300mL均匀涂布在6cm2的碳织物上，在4℃风干3小时。通过将其在室温下在1％戊二醛溶液(10ml)中浸渍30分钟，进行交联处理。接着，通过将该碳织物在10mM Tris-HCl(10ml)中浸渍20分钟来除去未反应的戊二醛后，浸渍在100mM PPB(pH7.0)(10ml)中进行1小时的平衡化，制作阳极。
阴极的制作：
将担载了铂的碳墨60mL和100mM PPB(pH7.0)300mL混合，将其中300mL均匀涂布在碳织物6cm2上，在4℃风干3小时。在其中滴加300mL由乙醇稀释的3％(w/v)聚二甲基硅氧烷(PDMS)，风干一晚，将由此得到的物质作为阴极。
电池和电路的构建：
使用制作的阳极、阴极，以100mM PPB(pH7.0)作为反应溶液构建电池。将该燃料电池与可从0.3V升压至1.8V的电荷泵(升压IC；S-882Z18セィコ一ィンスッル社制)组合，来构建如图1所示的电路。另外连接橙色发光二极管作为信号发生电路，进而连接0.47～100mF的各种电容器。测定电容器所带电压以及发光二极管的发光间隔和频率，进行充放电循环的评价。
使用升压IC的电路的构建和基于电容器容量的信号频率的评价
本电路用酶燃料电池起动，对此以发光二极管的闪烁、或电容器电压的经时变化来评价。另外，对将电容器更换为0.47～100mF时所得的信号频率的不同进行评价。反应溶液的葡萄糖浓度定为20mM。
此时的电容器的电压经时变化示于图8。在使用0.47mF的电容器时，以每一秒5次的频率(5/s)观测到脉冲(スパィク)上的信号。另外，以同样的周期观察到二极管的闪烁。改变电容器的容量，结果信号的频率变化，周期分别是：1mF为2.4/s，10mF为0.27/s，100mF为0.028/s。通过使电容器的容量变小，可以增加信号的频率。
电容器充放电循环的葡萄糖浓度依存性
作为使作为酶基质的葡萄糖的浓度变化，用发光二极管的闪烁、或电容器电压的经时变化来评价此时得到的信号频率的电容器，使用容量为10mF的电容器。其结果示于图9。随着葡萄糖浓度增高，电容器达到最大电压的时间变短，另外可以观察到每单位时间达到峰电压的频率增加。以该结果为基础，可以得到葡萄糖浓度和LED的闪烁、即电容器达到1.8V的时间(图10)和每单位时间的LED的闪烁次数、即电容器每单位时间达到1.8V的频率(图11)。如这些曲线所示，由所得的曲线可知LED的闪烁、即电容器达到1.8V的时间和每单位时间的LED的闪烁次数、即电容器每单位时间达到1.8V的频率存在葡萄糖浓度依赖性。由此可知，通过以信号频率作为指标，可以测定葡萄糖浓度，能够构建利用了电容器的充放电的新型生物传感器。
基于升压的酶燃料电池的无线系统的起动
使用制作的阳极、阴极，以100mM PPB(pH7.0)作为反应溶液构建电池。将该燃料电池与可从0.3V升压至1.8V的电荷泵(升压IC；S-882Z18セィコ一ィンスッル社制)或可从0.3V升压至2.4V的电荷泵(升压IC；S-882Z24セィコ一ィンスッル社制)组合，来构建如图1所示的电路，形成信号发生电路，并连接无线系统发射机(红外线发射)。即，将无线发射机的电源部分连接在图1的信号发生电路上，利用在电容器充电时放电的电压起动无线发射系统，以此为指标构建生物传感器。反应溶液的葡萄糖浓度定为0～25mM。
其结果是在葡萄糖的存在下，起动无线系统发射机，以一定的间隔向接收机发送信号。
图12表示在1.8V升压中观察到的信号频率与葡萄糖浓度的相关性，图13表示在2.4V升压中观察到的信号频率与葡萄糖浓度的相关性。这样，对于任意的升压，信号的接收频率都与葡萄糖浓度相关，通过监控该频率可以计测葡萄糖浓度。在任何情况下，可计测的葡萄糖浓度都涵盖了足够的范围，以计测从0.5mM至20mM这样的糖尿病的血糖值，能够充分地应用到以连续血糖诊断装置为代表的血糖诊断装置中。
由此可知，通过使用充电至电容器中的酶反应的结果所蓄积的电动势，可以起动无线系统。因此，在本新型生物传感器中，可以应用无线发射机作为信号发射电路。
使用共振电路作为发射机的计测·发射电路的构建
构建与实施例1同样制作的燃料电池，并在其中组合10μF电容器、从0.3升压至1.8V的升压IC，构建生物电容器，将生物电容器的输出连接在两端作为电源，制作哈脱莱(Hartley)型发射电路。使用这种发射机，也可以通过接收电路测定电磁波的接收频率。其结果是在葡萄糖的存在下，如图15所记述的那样，观测到以一定的间隔接收到电磁波。该电磁波的接收频率依赖于葡萄糖浓度，这可以从以上记述中清楚地知道。
将使用变容二极管的共振电路用作发射机的计测·发射电路的构建
构建与实施例1同样制作的燃料电池，并在其中组合0.47μF电容器、从0.3升压至1.8V的升压IC，构建生物电容器，将生物电容器的输出连接在变容二极管(lsV149)的两端作为电源，制作哈脱莱型发射电路。使用这种发射机，也可以通过接收电路测定电磁波的接收频率。图17记述了使用该发射电路来计测观测到的电磁波频率和试样葡萄糖浓度的例子。如此可以使用本电路来测定葡萄糖浓度。

Claims (19)

1.测定基质浓度的方法，其特征在于，将生物体催化剂与识别该生物体催化剂的基质的反应结果所产生的能量蓄积至一定水平，该蓄积速度依赖于基质浓度，以此为指标进行测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，前述指标通过前述能量达到一定水平以上而释放之际的一定时间内的能量释放频率来进行测定。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，前述生物体催化剂是酶、细胞器、微生物、细胞。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，前述生物体催化剂催化的反应是氧化反应。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，前述生物体催化剂是酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，前述酶是氧化还原酶。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，将蓄积的能量作为电荷蓄积到电容器中。
8.测定基质浓度的装置，其是具有燃料电池、电容器和测定器的装置，所述燃料电池具有设置了生物体催化剂的基质的阳极和设置了外部电子受体的阴极，所述电容器串联连接于前述燃料电池，所述测定器以前述电容器的充电速度为指标进行测定，该装置的特征在于，通过将由前述基质与生物体催化剂反应而产生的电子转移至前述阴极的前述外部电子受体而生成电动势，将该电动势充电至前述电容器，利用前述测定器测定其充电速度。
9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，前述测定器是充电至前述电容器的电位达到一定水平以上时将该蓄积的电位放电，从而测定前述放电的频率的装置。
10.根据权利要求8或9所述的装置，其特征在于，进一步具有电荷泵，该电荷泵用于在向前述电容器充电时，升高基于前述生物体催化剂反应的电动势，而向前述电容器充电。
11.根据权利要求9或10所述的装置，其特征在于，前述测定器是具有利用来自电容器的放电而产生信号的信号发生电路，并测定前述信号的频率的测定器。
12.根据权利要求11所述的装置，其特征在于，前述信号发生电路是无线发射装置。
13.根据权利要求11或12所述的装置，其特征在于，前述测定器测定前述信号发生电路工作时产生的物理信号和/或化学信号。
14.根据权利要求13所述的装置，其特征在于，前述物理信号和/或化学信号是声波、光或电磁波。
15.根据权利要求14所述的装置，其中，前述物理信号是电磁波，前述电磁波的发射电路中使用变容二极管。
16.根据权利要求11～15中任一项所述的装置，其特征在于，前述测定器进一步具有接收机，所述接收机用于接收前述电容器因充电而超过前述无线发射机的起动电压时，由前述电容器的放电而产生的信号。
17.根据权利要求8～16中任一项所述的装置，其特征在于，设置于前述阳极的生物体催化剂是酶。
18.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，前述酶是氧化还原酶。
19.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，前述酶是催化葡萄糖氧化的酶。
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