CN101801403A - 用于防止、治疗葡萄糖耐受不良相关病症的人epo受体激动剂、组合物、方法及应用 - Google Patents

用于防止、治疗葡萄糖耐受不良相关病症的人epo受体激动剂、组合物、方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及至少一种人EPO受体激动方法用于防止或治疗葡萄糖耐受不良和/或肾病相关贫血，包括治疗组合物、方法和装置。

Description

用于防止、治疗葡萄糖耐受不良相关病症的人EPO受体激动剂、组合物、方法及应用
发明背景
发明领域
本发明涉及至少一种人EPO受体激动方法用于预防或治疗葡萄糖耐受不良(glucose intolerance)和/或肾病相关贫血，包括治疗组合物、方法和装置。
相关技术
某些疾病状态包括异常的红细胞生成。在许多国家中，重组人EPO(rHuEPO)正在临床上使用。在美国，美国食品及药物管理局(FDA)已经批准了rHuEPO在治疗与晚期肾病相关的贫血中的应用。经历血液透析以治疗该疾病的患者通常会患严重的贫血，这是由于因为透析处理的红细胞破裂和未成熟死亡而造成的。EPO还可以用于治疗其他类型的贫血。可以使用EPO治疗例如化疗诱导的贫血、与脊髓发育不良相关的贫血、与各种先天性紊乱相关的贫血、AIDS相关的贫血和早熟相关贫血。此外，EPO在其他领域发挥了作用，例如帮助快速在骨髓移植患者中、在准备自体同源输血的患者中、以及患有铁负荷过多紊乱的患者中恢复正常的血球密度。
促红细胞生成素(EPO)是糖蛋白激素，其由165个氨基酸和四条烃链构成，其通过结合到红细胞前体细胞表面上的特异性受体而作为红细胞生成的主要调节剂。这种结合发出信号使他们增殖并分化成成熟血红细胞。促红细胞生成素受体是对促红细胞生成素具有高亲和力的484个氨基酸的糖蛋白。对于促红细胞生成素受体，配体诱导的同型二聚化可以是管理激活的关键事件之一。
促红细胞生成素具有相对短的半衰期。静脉给药的促红细胞生成素以与一级动力学一致的速度被除去，其中循环半衰期在CRF患者中在大约3～4小时之间。在治疗剂量范围内，血浆促红细胞生成素的可检测水平呗维持至少24小时。在皮下给药促红细胞生成素后，在5～24小时内达到了峰值血清水平，并之后缓慢下降。
贫血治疗市场的主导是红细胞生成刺激剂(ESA)，其将受体靶向生长因子促红细胞生成素(EPO)，这刺激了血红细胞的产生。重组EPO依泊丁(epoetin)-α(Epogen；Amgen and Procrit/Eprex；Johnson &Johnson)和依泊丁-β(NeoRecormon/Eprex；Roche)已经上市许多年了。
Amgen的darbepoetin(Aranesp)是EPO的高糖基化变体(来自两个氨基酸置换)，并且与依泊丁相比具有较长的半衰期，这实现了使得darbepoetin能够通过较低频率的给药而保持靶血红蛋白水平(每3～4周一次，而依泊丁为一周一次)。Roche的糖基化依泊丁CERA(连续红细胞生成受体激活剂)正经历临床实验，并且也具有比EPO长的半衰期。Hematide包含在序列上与原始或上市的EPO无关的二聚肽，其结合EPO受体并刺激红细胞生成。
许多团体已经通过对随机噬菌体展示库进行筛选与促红细胞生成素受体的亲和力鉴定了促红细胞生成素的小分子肽模拟物(peptidomimetics)。这些序列与促红细胞生成素没有同源性。在功能检验中，这些肽中的一些显示了活性，但仅有重组促红细胞生成素的1/100,000。尽管已经进行了许多努力来通过制备肽模拟物的共价二聚体或多聚体提高这些肽的能力，但这些化合物在摩尔基础上活性可以是促红细胞生成素的1/10,000～1/1,000，并且具有非常短的半衰期，这使得它们不适于用作治疗剂。
目前正在开发许多用于贫血、CHF和其他适应症的EPO受体激动剂：
药物                               公司        适应症                         阶段
促红细胞生成素
Darbepoetin-α(Aranesp)              Amgen     癌症相关贫血                   III期
                                               充血性心力衰竭                 II期
CERA(连续促红细胞生成素受体激活剂)   Roche     CKD                            BLA提交
                                               CIA                            III期
NE-180(GlycoPEG-促红细胞生成素)      Neose     CKD，CIA                       I期
EPO-Fc                               Syntonix  CKD，CIA                       I期
AMG 114(darbepoetin的高糖基化类似物) Amgen     CIA                            I期
合成的促红细胞生成素受体激动剂
Hematide                             Affymax/Takeda*CKD，CIA，PRCA患者中的贫血II期
促红细胞生成素替代品
FG-2216                              FibroGen    CKD，CIA                     II期
FG-4592                              FibroGen    由于铁处理缺陷的贫血         I期
(CIA，化疗诱导的贫血；CKD，慢性肾病；PEG，聚乙二醇；PRCA，单纯红细胞再生障碍)
然而，需要提供新型的EPO受体激动剂的应用，这克服了现有技术中已知的这些和其他问题的一个或多个，并发现新的适应症和治疗。
发明概述
正如本文所描述和/或实现的结合本领域已知的，本发明提供了人EPOR激动剂，包括小分子激动剂、肽或蛋白质激动剂、激动剂抗体或经修饰的免疫球蛋白、切割产物和它们的其他特定部分和变体；以及编码它们的核酸、载体和宿主细胞；以及制备它们和使用它们用于防止或治疗葡萄糖耐受不良和相关症状和/或肾病相关贫血的EPOR激动剂组合物、制剂、联合治疗等、编码或互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、制剂、装置和方法。
本发明还提供了用于防止或治疗葡萄糖耐受不良和/或肾病相关贫血的组合物、方法和装置，其使用至少一种本发明所描述和/或本领域已知的分离的EPO受体(EPOR)激动剂或特定部分或变体。
EPOR激动剂是本领域中公知的，包括但不限于EPO或EPOR激动剂(或者具有激活EPOR效果的激动剂，例如HIF)，肽、蛋白质、化学化合物或小分子等，以及编码这些肽或蛋白质的核酸、载体和宿主细胞，例如但不限于EPO、经修饰的EPO、EPO蛋白和小分子模拟物、EPO或EPOR激动剂抗体或它们的片段或融合物。
本发明还提供了至少一种用于防止或治疗葡萄糖耐受不良和/或肾病相关贫血的组合物，其包括(a)至少一种分离的EPOR激动剂；和(b)适当的载体或稀释剂。任选地，根据已知的方法，所述载体或稀释剂可以是药物上可以接受的。任选地，所述组合物还包含至少一种其他的化合物、蛋白质或组合物。
本发明在方法或组合物中还提供了至少一种EPOR激动剂、特定的部分或变体，其在以治疗上有效的量给药时，用于调节、用于治疗或减轻至少一种葡萄糖耐受不良和/或肾病相关贫血的症状。(参见，例如The Merck Manual，第17版，Merck Research Laboratories，Merck andCo.，Whitehouse Station，NJ(1999)，通过参照将其全部并入本文)，正如本领域中已知的，根据在许多情况中所需要的，例如但不限于在相关疾病或治疗病症之前、之后或过程中。
根据本发明，本发明还提供了至少一种组合物、装置和/或方法递送治疗或预防有效量的至少一种EPOR激动剂或特定部分或变体，用于防止或治疗葡萄糖耐受不良和/或肾病相关贫血。
本发明还提供了至少一种组合物，其包括(a)本文所述的编码分离的EPOR激动剂的核酸和/或EPOR激动剂；和(b)适当的载体或稀释剂，用于防止或治疗葡萄糖耐受不良和/或肾病相关贫血。任选地，根据已知的载体或稀释剂，所述载体或稀释剂可以任选地是药物上可以接受的。任选地，组合物还包含至少一种其他的化合物、蛋白质或组合物。
还提供了一种组合物，其包含至少一种分离的人EPO模拟铰链核心模拟抗体(mimetibody)以及至少一种药物上可以接受的载体或稀释剂。该组合物任选地可以包含有效量的至少一种选自下列的化合物或蛋白质：可检测标记或受体、抗感染药物、葡萄糖耐受不良相关药物、肾缺血相关药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、流体或电解质平衡的药物、血液病药物、TNFα拮抗剂、肌肉松弛药、镇静剂、非甾体抗炎药(NTHE)、止痛剂、麻醉剂、镇静药、局部麻醉药、神经肌肉阻断剂、抗菌剂、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成甾类(anabolicsteroid)、葡萄糖调节剂、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁剂、安定药、兴奋剂、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
还提供了一种方法用于诊断、防止或治疗细胞、组织、器官或动物中的葡萄糖耐受不良和/或肾病相关贫血，其包括：
(a)将包含有效量的至少一种EPOR激动剂的组合物与细胞、组织、器官或动物接触，或者为所述细胞、组织、器官或动物给药包含有效量的至少一种EPOR激动剂的组合物。该方法任选地可以还包括为细胞、组织、器官或动物使用有效量0.00001-500mg/千克。该方法任选地可以还包括通过选自下列的至少一种模式进行接触或给药：肠胃外的、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内(intracerebroventricular)、大肠内、颈管内、胃内的、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速浓注、阴道、直肠、经颊、舌下、鼻内或者透皮途径。
本发明还提供了本文所描述的任何发明。
附图说明
图1A-B.糖尿病小鼠(db/db)被静脉给药CNTO 530(0.3mg/kg)或阴性对照MMB(缺少肽)。A.在给药后10分钟进行IPGTT。B.在给药7天后进行IPGTT。
图2A-B.糖尿病小鼠(DIO)被静脉给药CNTO 530(0.3mg/kg)或阴性对照MMB(缺少肽).A.在给药后10分钟进行IPGTT。B.在给药7天后进行IPGTT。
图3.糖尿病小鼠(DIO)被静脉给药CNTO 530(0.3mg/kg)或阴性对照MMB(缺少肽)。给药七天后，处死动物并取血样。
图4A-F.糖尿病小鼠(DIO)被静脉给药CNTO 530(0.3mg/kg)或PBS。在10分钟后(A)、7天后(B)、14天后(C)、21天后(D)、28天后(E)、35天后(F)进行IPGTT。
图5A-C.糖尿病小鼠(DIO)被静脉给药CNTO 530(0.3mg/kg)或PBS。在各种时间后处死动物，并收集血液进行血液学测量。显示给药后A.21天，B.28天和C.35天的血红蛋白水平。
图6A-C.糖尿病小鼠(DIO)被静脉给药CNTO 530(0.3mg/kg)或PBS。在各种时间后处死动物，并收集血液进行胰岛素测量。还显示了给药后A.21天，B.28天和C.35天的循环胰岛素水平。
图7A-B.糖尿病小鼠(DIO)被静脉给药EPO(0.03、0.1、0.3mg/kg)或PBS。五天后进行IPGTT。(A)整个IPGTT的葡萄糖水平，(B)来自A的曲线以下的面积。
图8A-B.糖尿病小鼠(DIO)被静脉给药EPO(0.03、0.1、0.3mg/kg)或PBS。5天后测量(A)血红蛋白水平和(B)网织红细胞。
图9A-B.糖尿病小鼠(DIO)被静脉给药Darbepoetin(0.01、0.03、0.1mg/kg)或PBS。7天后进行IPGTT。(A)整个IPGTT的葡萄糖水平，(B)来自A的曲线以下的面积。
图10.糖尿病小鼠(DIO)被静脉给药Darbepoetin(0.01，0.03，0.1mg/kg)或PBS。7天后测量空腹血糖。
图11A-B.糖尿病小鼠(DIO)被静脉给药Darbepoetin(0.03，0.1，0.3mg/kg)或PBS。7天后测量(A)血红蛋白和(B)网织红细胞。
图12.野生型(C57Bl6小鼠)或过表达人EPO的转基因小鼠(杂合子或纯合子)的空腹血糖。
图13.野生型(C57Bl6小鼠)或过表达人EPO的转基因小鼠(杂合子或纯合子)的GTT。
图14A-B.糖尿病小鼠(DIO)被静脉给药CNTO 530(0.3mg/kg)或PBS。在断食过夜和葡萄糖活化(challenge)20分钟后测量葡萄糖(A)和胰岛素水平(B)。
图15.图14中所显示的空腹葡萄弹和胰岛素水平被用于计算HOMA。
图16.在基线HbA1C水平超过6.0的患者中EPO给药对血红蛋白的影响。
图17.在基线HbA1C水平超过6.0的患者中EPO给药对血红蛋白A1C的影响。
图18.在基线HbA1C水平超过6.0的患者中EPO给药对对空腹血糖的影响。
图19：在基线HbA1C水平超过6.0的患者中EPO给药对HbA1C水平的影响。
图20：EPO给药和基线HbA1C水平对1～2和4～6月HbA1C水平的影响(纵向数据)。
图21：在基线(EPO给药前2个月)以及在后续时间段(1～3个月和4～6个月)，在可得到数据的患者中EPO对1～2和4～6月空腹血糖水平的影响。
发明描述
本发明涉及至少一种人EPO受体激动方法用于防止或治疗葡萄糖耐受不良和/或肾病相关贫血，包括治疗组合物、方法和装置。
EPOR激动剂是本领域中公知的，并且包括但不限于EPO或EPOR激动剂(或具有激活E POR效果的激动剂，例如HIF)：肽、蛋白质、化学化合物或小分子等，例如但不限于EPO、经修饰的EPO、EPO蛋白质和小分子模拟物、EPO或EPOR激动剂抗体或它们的片段或融合物。
在下表中相关的所列举PCT公开中提供了如何制备和使用EPOR拮抗剂的非限制性例子，通过参照将这些公开全部并入本文，因为他们显示了如何制备和使用用于本发明的方法和治疗的EPO受体的现有技术状态。本领域中已知的EPO受体激动剂的非限制性例子包括EPO、它们的活性片段和模拟物和化学EPO受体激动剂，其也被公开在下列公开中，通过参照将这些公开并入本文：
PCT公开标题
WO9818926A1循环变换的促红细胞生成素受体激动剂
WO06017772A1促红细胞生成素受体激动剂的稳定悬浮液制剂
WO06017773A1促红细胞生成素受体激动剂的稳定颗粒制剂
WO05025606A1保持内源性促红细胞生成素组织保护活性的长效促红细胞生成素
WO04022577A2保持内源性促红细胞生成素组织保护活性的长效促红细胞生成素
WO02062843A2免疫原性降低的经修饰促红细胞生成素(Epo)
WO9533057A1用于造血刺激的分子式Gm-Csf-L-Epo或Epo-L-Gm-Csf的杂交分子
WO04033651A2促红细胞生成素：促红细胞生成素的重建和糖基化缀合
WO03053997A2提高内源性促红细胞生成素(Epo)的方法
WO0243572A2促红细胞生成素和促红细胞生成素受体在人类癌症中的表达
WO9928346A1高特异性活性的促红细胞生成素
WO06055412A1治疗促红细胞生成素-抗性的方法
WO06014466A2新型氨甲酰基化EPO和其制备方法
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目前正在开发许多用于贫血、CHF和其他适应症的EPO受体激动剂，其可以用作本发明方法的中的EPO受体激动剂：
药物                                 公司       适应症                        阶段
促红细胞生成素
Darbepoetin-α(Aranesp)              Amgen      癌症相关贫血                  III期
                                                充血性心力衰竭                II期
CERA(连续促红细胞生成素受体激活剂)   Roche      CKD                           BLA提交
                                                CIA                           III期
NE-180(GlycoPEG-促红细胞生成素)      Neose      CKD，CIA                      I期
EPO-Fc                               Syntonix   CKD，CIA                      I期
AMG 114(darbepoetin的高糖基化类似物) Amgen      CIA                           I期
合成的促红细胞生成素受体激动剂
Hematide                             Affymax/Takeda*CKD，CIA，PRCA患者中的贫血II期
促红细胞生成素替代品
FG-2216                              FibroGen   CKD，CIA                      II期
FG-4592                              FibroGen   由于铁处理缺陷的贫血          I期
本发明的其他EPO受体拮抗剂包括融合蛋白，其含有任何可以根据本发明使用的EPO受体激动剂肽。非限制性例子包括EPO模拟抗体，例如在美国专利申请nos.10/609,783(2003年6月30日提交)和10/935,005(2004年9月3日提交)中所公开的EPO模拟抗体，均通过参照全部并入本文中。可以用于本发明方法的EPOR激动剂的另一个非限制性例子，本发明还提供了至少一种本文所描述和/或本领域已知的分离的EPO模拟铰链核心模拟抗体或特定的部分或变体。任选地，EPO模拟铰链核心模拟抗体可以含有至少一个CH3区，所述CH3区与至少一个CH2区直接连接，所述CH2区与至少一个铰链区或其片段(H)直接连接，所述铰链区或其片段(H)与任选的接头序列(L)直接连接，所述接头序列直接连接到至少一个治疗肽(P)，所述治疗肽任选地进一步与至少一个可变(V)抗体序列的至少一部分直接连接。
在优选的实施方式中，EPO模拟铰链核心模拟抗体包含式(I)：
((V(m)-P(n)-L(o)-H(p)-CH2(q)-CH3(r))(s)，
其中V是至少一部分免疫球蛋白可变区的N-末端，P是至少一种生物活性肽，L是通过使模拟抗体具有可选择方向以及结合性质而提供结构柔性的多肽，H是至少一部分免疫球蛋白可变铰链区，CH2是至少一部分免疫球蛋白CH2恒定区，CH3是至少一部分免疫球蛋白CH3恒定区，m、n、o、p、q、r和s可以独立地是0、1或2与10之间的整数，模拟不同类型的免疫球蛋白分子，例如但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD、IgE等或其组合。m＝1的单体可以通过缔合或共价键连接到其他单体，例如但不限于Cys-Cys二硫键或其他免疫球蛋白分子。本发明的EPO模拟铰链核心模拟抗体模拟抗体结构具有其固有性质和功能，同时提供一种治疗肽和其固有或获得的体外、体内或原位性质或活性。本发明抗体的各种部分和至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体的治疗肽部分可以根据本文所述结合本领域中已知的而变化。
本文所使用的“EPO模拟铰链核心模拟抗体”“EPO模拟铰链核心模拟抗体部分”或“EPO模拟铰链核心模拟抗体片段”和/或“EPO模拟铰链核心模拟抗体变体”等模拟物在体外、原位和/或优选体内具有或刺激至少一种配体结合或至少一部分的至少一种生物学活性，例如配体结合或活性，例如但不限于SEQ ID NOS：1-30的至少一种。例如，本发明适当的EPO模拟铰链核心模拟抗体、特定的部分或变体能够结合至少一种蛋白质配体并且包含至少一种蛋白质配体、受体、可溶受体等。适当的EPO模拟铰链核心模拟抗体、特定的部分或变体还能够调节、提高、激活至少一种蛋白质受体信号或其他可测量或可检测活性。
可以用于本发明的方法和组合物的模拟抗体的特征在于与蛋白质配体或受体结合的适当亲和力，并任选地且优选具有低毒性。特别的，在本发明中可以使用EPO模拟铰链核心模拟抗体，其中单独的组分例如一部分可变区、恒定区(没有CH1区)和框架或者他们的任何部分(例如重链和轻链可变区的J、D或V区的一部分；至少一个铰链区的至少一部分、重链和轻链恒定区等)单独地和/或全体任选地并优选具有低免疫原性。任选地，可以用于本发明的模拟抗体的特征在于它们长期治疗患者的能力，其能够良好至优异地缓解症状和低毒性。低免疫原性和/或高亲和力以及其他未确定的性质可以有助于所获得的治疗结果。“低免疫原性”在本文中被定义为在低于大约75％或优选低于大约50、45、40、35、30、35、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2和/或1％所治疗的患者中产生显著的HAMA、HACA或HAHA应答，和/或在所治疗的患者中产生低滴度(使用双抗原酶免疫检验测量为低于大约300，优选低于大约100)(参见例如Elliott等人，Lancet 344：1125-1127(1994))。
实用性
本发明的分离的核酸可以用于生产至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体、它们的片段或特定的变体，其(或者其编码DNA)可以用于在细胞、组织、器官或动物(包括哺乳动物和人)中实现对选自但不限于至少一种葡萄糖耐受不良和/或肾病相关贫血以及其他抑制或特定的蛋白质相关病症的至少一种病症的症状的调节、治疗、缓解、辅助防止发生或减轻。
该方法可以包括为需要该调节、治疗、缓解、防止或减轻症状、效果或机制的细胞、组织、器官、动物或患者给药有效量的包含至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或特定部分或变体的组合物或药物组合物。根据如本文所述或相关领域中已知方法所进行并测定的，有效量可以包括每单次给药或多次给药大约0.0001～500mg/kg的量，或者达到血清浓度为每单次给药或多次给药大约0.0001-5000μg/ml血清浓度的量，或者其中的任何有效的范围或数值。
引用
本文所提到的全部出版物或专利都通过参照全部并入本文，因为他们显示了本发明申请时的技术状态并且/或者提供对本发明的描述和实现本发明。出版物是指任何科学或专利出版物，或者任何以任何模式获得的其他信息，包括所有记录的、电子的或印刷模式的。通过参照将下列参考文献整体并入本文：Ausubel，等人，ed.，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NY，NY(1987-2006)；Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow and Lane，Antibodies，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan，等人，eds.，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，NY(1994-2006)；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science，JohnWiley & Sons，NY，NY，(1997-2006)。
本发明的模拟抗体或EPO受体激动剂
EPO模拟铰链核心模拟抗体可以任选地包含至少一个CH3区，所述CH3区与至少一个CH2区直接连接，所述CH2区与包含至少一个核心铰链区的至少一个铰链区片段(H)直接连接，所述铰链区片段(H)与任选的接头序列(L)直接连接，所述接头序列直接连接到至少一个治疗肽(P)，所述治疗肽任选地进一步与至少一个可变抗体序列(V)的至少一部分直接连接。在优选的实施方式中，一对CH3-CH2-H-L-V，其通过缔合键或共价键连接在一起。因此，本发明的EPO模拟铰链核心模拟抗体模拟抗体结构，具有其固有性质和功能，同时提供一种治疗肽和其固有或获得的体外、体内或原位性质或活性。根据本文所述以及结合本领域中已知的，至少一种本发明的EPO模拟铰链核心模拟抗体的抗体和治疗肽部分的各种部分可以变化。
因此，本发明的模拟抗体与已知蛋白质相比提供了至少一种适当的性质，例如但不限于提高的半衰期、提高的活性、更特异性的活性、提高的亲合力、提高的或降低的消耗速度(off rate)、选定的或更适当的活性子集(subset)、较低的免疫原性、提高的质量或至少一种期望治疗效果的持续时间、较少的副作用等的至少一种。
可以通过本领域中已知的和/或本文所描述的酶切、合成或重组技术生产根据式(I)的模拟抗体的片段。也可以使用在天然终止位点上游引入一个或多个终止密码子的抗体基因，生产各种截断形式的模拟抗体。可以通过传统技术利用化学手段将模拟抗体的各个部分连接在一起，或者可以使用遗传工程技术将模拟抗体的各个部分制备为连续的蛋白质。例如，可以将表达至少一个人抗体恒定区的核酸进行表达以产生用于本发明模拟抗体的连续蛋白质。参见例如关于单链抗体的Ladner等人，美国专利No.4,946,778以及Bird，R.E.等人，Science，242：423-426(1988)。
本文所使用的术语“人模拟抗体”是指一种抗体，其中基本上蛋白质的每个部分(例如EPO模拟肽、框架、CL、CH结构域(例如CH2，CH3)、铰链、(VL，VH))都被预计在人类中以非常小的序列改变或变化而基本上没有免疫原性。任选地并优选这些改变或变化相对于本发明未修饰的人抗体或模拟抗体保持或降低在人类中的免疫原性。因此，人抗体和相应的本发明的EPO模拟铰链核心模拟抗体与嵌合抗体或人源化抗体不同。需要指出，可以由能够表达人免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因的非人动物或细胞生产人抗体和EPO模拟铰链核心模拟抗体。
在优选的实施方式中，本发明至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定的部分或变体是由至少一种细胞系、混合细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群体和/或培养细胞所产生的。可以使用适当的方法产生永生化的产生蛋白质的细胞。优选，至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定的部分或变体是通过下列产生的：提供包含DNA的核酸或载体，该包含DNA来自至少一个被功能性重排的人免疫球蛋白基因座或与该人免疫球蛋白基因座具有基本相似的序列，其中所述核酸或载体可以经历功能性重排，并且正如本领域已知的，其进一步包含本文所描述的模拟抗体结构，例如但不限于式(I)，其中C-末端和N-末端可变区部分可以用于V、铰链区用于H、CH2用于CH2以及CH3用于CH3。
核酸分子
使用本文所提供的信息以及本领域已知的信息，例如可以使用本文所描述的方法或本领域中已知的方法获得编码各种EPO R肽或蛋白质激动剂的核苷酸序列，本发明编码至少一种EPO R激动剂的核酸分子。
本发明的核酸分子可以是RNA形式的，例如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式，或者是DNA形式的包括但不限于通过克隆或合成生成的cDNA以及基因组DNA，或任何它们的组合。DNA可以是三链的、双链的或单链的或者任何它们的组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分都可以是编码链，也被称作有义链，或者其可以使非编码链，也被称作反义链。
本发明的分离的核酸分子可以包括核酸分子，其包含任选地具有一个或者多个内含子的开放阅读框(ORF)，包含EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体编码序列的核酸分子；以及核酸分子，其包含与上述基本上不同的核苷酸序列，但由于遗传密码子的简并性，其仍能够编码本文所述和/或本领域中已知的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂。当然，遗传密码是本领域中公知的。因此，对于本领域技术人员产生这些编码本发明具体EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的简并核酸变体是常规的。参见例如Ausubel，等人，同上，并且这些核酸变体也包括在本发明中。
正如本文所述，本发明的包含编码EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的核酸的核酸分子可以包括但不限于自身编码EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂片段的氨基酸序列的那些；整个EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或其一部分的编码序列；EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂，片段或一部分的编码序列，以及其他序列，例如至少一个信号导肽(signal leader)或融合蛋白的编码序列，具有或不具有前述的其他编码序列，例如至少一个内含子，连同其他的非编码序列，包括但不限于非编码5’和3’序列，例如转录的非翻译序列，其在转录、mRNA处理中发挥作用，包括剪接和多聚腺苷酸化信号(例如-mRNA的核糖体结合和稳定性)；其他的编码序列，其编码其他的氨基酸，例如提供额外功能的那些。因此，编码EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的序列可以与标记序列融合，例如编码辅助纯化融合的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的肽的序列，其中所述融合的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体包含EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂片段或其一部分。
与本文所述多核苷酸选择性杂交的多核苷酸
本发明提供了分离的核酸，其在选择性杂交条件下与本文所公开的或其他本文公开的多核苷酸杂交，包括他们的特定的变体或部分。因此，该实施方式的多核苷酸可以用于分离、检测和/或定量包含这些多核苷酸的核酸。
低或中等严格的杂交条件通常但不唯一地用于相对于互补序列具有低序列同一性的序列。中等和高严格条件可以任选地用于较高同一性的序列。低严格条件允许具有大约40～99％序列同一性的序列的选择性杂交，并且可以用于鉴定直向同源或共生同源序列。
任选地，本发明的多核苷酸会编码至少一部分本文所述多核苷酸所编码的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体。本发明的多核苷酸包括核酸序列，其可以用于与编码本发明EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的选择性杂交的核酸序列。参见例如Ausubel，同上；Colligan，同上，均通过参照全部并入本文。
核酸的构建
正如本领域公知的，可以使用(a)重组方法、(b)合成技术、(c)纯化技术或它们的组合制备本发明的分离的核酸。
除了本发明的多核苷酸外，核酸还可以便利地包含其他序列。例如，包含一个或者多个核酸内切酶位点的多克隆位点可以被插入到核酸中以辅助分离所述多核苷酸。同样，可以插入可翻译序列以辅助分离所翻译的本发明的多核苷酸。例如，六聚组氨酸标记序列提供了纯化本发明蛋白质的便利手段。本发明的核酸-不包括编码序列-任选地是载体、连接物或接头用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸。
可以将其他的序列添加到这些克隆和/或表达序列以优化它们在克隆和/或表达中的功能，辅助分离多核苷酸，或改善将多核苷酸引入到细胞中。克隆载体、表达载体、连接物和接头的使用是本领域中公知的。参见例如Ausubel，同上；或Sambrook，同上。
构建核酸的重组方法
可以使用本领域技术人员已知的任何克隆方法从生物来源获得本发明的分离的核酸组合物例如RNA、cDNA、基因组DNA，或者任何它们的组合。在某些实施方式中，将在适当的严格条件下与本发明的多核苷酸杂交的寡核苷酸探针用于鉴定cDNA或基因组DNA库中的期望序列。RNA的分离、cDNA和基因组库的构建是本领域技术人员公知的。(参见例如Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。
构建核酸的合成方法
也可以通过已知的方法利用直接化学合成制备本发明的分离的核酸(参见例如Ausubel，等人，同上)。化学合成通常产生单链寡核苷酸，其可以通过与互补序列杂交而被转化成双链DNA，或者使用单链作为模板利用DNA聚合酶进行聚合而转化成双链DNA。本领域技术人员能够认识到DNA的化学合成可以被限制为大约100或更多碱基的序列，通过连接较短的序列可以获得较长的序列。
重组表达盒
本发明进一步提供了包含本发明核酸的重组表达盒。本发明的核酸序列例如编码本发明EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的序列的cDNA或基因组可以用于构建重组表达盒，其可以被引入到至少一种期望的宿主细胞中。重组表达盒通常包括本发明的多核苷酸，其可操作地连接到转录起始调控序列，这将指导多核苷酸在期望宿主细胞中的直接转录。可以采用异源和非异源(即内源)启动子以指导本发明核酸的表达。
在某些实施方式中，可以将作为启动子、增强子或其他元件的分离的核酸引入到本发明多核苷酸非异源形式的适当位置中(内含子的上游、下游)，以上调或下调本发明多核苷酸的表达。例如，正如本领域中已知的，可以通过突变、缺失和/或置换在体内或体外改变内源性启动子。如果期望，可以以有义方向或者反义方向表达本发明的多核苷酸。能够理解，以有义方向或者反义方向控制基因表达都能够对可观察的特征造成直接的影响。另一种抑制方法是有义抑制。在有义方向上引入设定的核酸已经显示是一种阻断靶基因转录的的有效手段。
载体和宿主细胞
本发明还涉及包含本发明的分离的核酸分子的载体，、被重组载体遗传改造的宿主细胞以及通过本领域公知的重组技术生产至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体。参见例如Sambrook，等人，同上；Ausubel，等人，同上，均通过参照全部并入本文。
多核苷酸能够任选地被连接到含有可选择标记的载体用于在宿主中传代。通常，使用适当的已知方法，将质粒载体引入到细胞中，例如电穿孔法等，其他已知的方法包括以沉淀使用载体例如磷酸钙沉淀，或者以与带电荷的脂类的复合物。如果载体是病毒，则其可以在体外使用适当的包装细胞系，接着转导到宿主细胞中。
DNA插入物应该被可操作地连接到适当的启动子。表达构建体(construct)将进一步在转录区域中包含任选地用于转录起始、终止至少之一的位点，以及用于翻译的核糖体结合位点。构建体所表达的成熟转录子的编码部分将优选地在起点包括翻译起始密码子，终止密码子(例如UAA、UGA或UAG)适当地位于被翻译的mRNA的末端，其中对于哺乳动物或真核细胞表达UAA和UAG是优选的。
表达载体将优选但任选地包含至少一个选择标记。这些标记包括但不限于甲氨蝶呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR，美国专利Nos.4,399,216；4,634,665；4,656,134；4,956,288；5,149,636；5,179,017)、氨苄青霉素，新霉素(G418)，霉酚酸，或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利Nos.5,122,464；5,770,359；5,827,739)抗性用于真核细胞培养，以及四环素或氨苄青霉素抗性基因用于在大肠杆菌(E.coli)或其他细菌或原核细胞培养(通过参照将上述专利全部并入本文)。上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域中已知的。适当的载体对于本领域技术人员将是容易明显的。可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂类介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他已知方法实现将载体构建体引入到宿主细胞中。这些方法被描述在现有技术中，例如Sambrook，同上，Chapters 1-4和16-18；Ausubel，同上，Chapters 1，9，13，15，16。
可以以经修饰的形式表达本发明的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体，例如融合蛋白，并且可以不仅包括分泌信号，还有其他的异源功能区。例如，额外的氨基酸区，特别是带电荷的氨基酸，能够被加入到EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的N-末端，以提高纯化过程中或后续处理和储存过程中宿主细胞的稳定性和持续。同样，肽模拟物可以被添加到本发明的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体，以辅助纯化。这些区域可以在最后制备EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或它们的至少一种片段之前被除去。这些方法被描述在许多标准实验室手册中，例如Sambrook，(2003)同上，Chapters 17.29-17.42和18.1-18.74；Ausubel(2003)，同上，Chapters 16，17和18。
本领域技术人员能够知道许多表达载体可以用于表达编码本发明蛋白质的核酸。
可以用于生产模拟抗体、其特定部分或变体的细胞培养的例子是哺乳细胞。哺乳细胞系统通常是以单层细胞的形式，尽管也可以使用哺乳细胞悬浮液或生物反应器。现有技术中已经开发了许多适当的能够表达完整(intact)糖基化蛋白质的宿主细胞系，并且包括COS-1(例如，ATCC CRL 1650)，COS-7(例如，ATCC CRL-1651)，HEK，HEK293，BHK21(例如，ATCC CRL-10)，CHO(例如，ATCC CRL 1610，DG-44)和BSC-1(例如，ATCC CRL-26)细胞系，hepG2细胞，P3X63Ag8.653，SP2/0-Ag14，293细胞，HeLa细胞等，其容易从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，Va获得。优选的宿主细胞包括淋巴来源的细胞，例如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC索取号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC索取号CRL-1851)。
这些细胞的表达载体可以包括下列表达控制序列的一种或者多种，例如但不限于复制的起点；启动子(例如，晚期或早期SV40启动子，CMV启动子(例如，美国专利Nos.5,168,062；5,385,839)，和HSV tk启动子，pgk(磷酸甘油酯激酶)启动子，EF-1α启动子(例如，美国专利No.5,266,491)，至少一种人免疫球蛋白启动子；增强子，和/或处理信息位点，例如核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷酸化位点(例如，SV40大T Ag多聚A添加位点)，和转录终止子序列。参见例如Ausubel等人，同上；Sambrook，等人，同上。其他可以用于生产本发明核酸或蛋白质的细胞是已知和/或可得到的，例如来自美国典型培养物保藏中心的细胞系和杂交瘤目录(American Type CultureCollection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas)(www.atcc.org)或其他已知或商业来源。
如果采用真核宿主细胞，则通常将多聚腺苷酸或转录终止子序列加入到载体中。终止子序列的例子是来自牛生长激素基因的多聚腺苷酸序列。还包括用于精确剪接转录子的序列。剪接序列的例子是来自SV40的VP1内含子(Sprague，等人，J.Virol.45：773-781(1983))。另外，正如本领域中已知的，在宿主细胞中控制转录的基因序列可以被加入到载体中。
EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或其特定部分或变体的纯化
可以通过公知方法从重组细胞培养物回收和纯化EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体，包括但不限于蛋白质A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和植物凝集素层析。也可以采用高效液相层析(“HPLC”)进行层析。参见例如Colligan，Current Protocols in Immunology，或CurrentProtocols in protein Science，John Wiley & Sons，NY，NY，(1997-2006)，例如，Chapters 1，4，6，8，9，10，均通过参照并入本文。
本发明的模拟抗体或特定部分或变体包括天然纯化的产品、化学合成程序的产品和重组技术从真核宿主包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞产生的产品。根据在重组生产程序中所采用的宿主，本发明的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体可以被糖基化，或者是非糖基化的，其中优选糖基化。这些方法被描述在许多标准实验室手册中，例如Sambrook，同上，Sections17.37-17.42；Ausubel，同上，Chapters 10，12，13，16，18和20，Colligan，protein Science，同上，Chapters 12-14，均通过参照全部并入本文。
模拟抗体、特定片段和/或变体
本发明的分离的模拟抗体包括由本文充分讨论的本发明的任何一种多核苷酸编码的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体，或者任何分离的或制备的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或其特定部分或变体。
优选，EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或配体结合部分或变体结合至少一种EPO蛋白质配体或受体，并进而提供了相应蛋白质或其片段的至少一种EPO生物学活性。不同的治疗或诊断显著蛋白质是本领域中公知的，并且这些蛋白质的适当检验或生物学活性也是本领域中公知的。
下表1中提供了本发明适当EPO模拟肽的非限制性例子。可以通过本文所公开的和/或本领域中已知的方法制备这些肽。大多数情况中使用单字母氨基酸缩写。这些序列中(以及本说明书中，除非特别说明)X的意思是可以存在任何20种天然存在或已知氨基酸残基或已知衍生物的，或者任何其经修饰的氨基酸。任何这些肽都可以串联连接(即连续地)，具有或不具有接头，在表中提供了一些串联连接的例子。接头被以“Δ”列出，并且可以使本文所述的任何接头。为了清楚，虚线分别显示串联重复和接头。所有含有半胱氨酸残基的肽都可以任选地与含有Cys的肽交联，其中所述Cys之一或两个Cys都被连接到媒介上。在表中提供了一些交联的例子。任何具有多个Cys残基的肽也可以形成肽内二硫键；参见，例如表1中的EPO-模拟肽。表中详细说明了一些肽内二硫键肽的例子。根据本文所属，所有这些肽都可以被衍生化，表中提供了一些衍生的例子。对于，羧基末端可以被氨基加帽(capped)，其中加帽氨基被显示为-NH2。对于，氨基酸残基被氨基酸残基以外的部(moiety)取代的衍生物，取代被表示为，其代表任何本领域中已知的部，例如，在Bhatnagar等人(1996)，J.Med.Chem.39：3814-9和Cuthbertson等人(1997)，J.Med.Chem.40：2876-82中所述的，通过参照将其并入本文。J取代基和Z取代基(Z5，Z6，..Z40)是在美国专利Nos.5,608,035，5,786,331和5,880,096中所定义的，通过参照将其全部并入本文。对于EPO-模拟序列(表1)，取代基X2～X11以及整数”n”是在WO 96/40772中所限定的，通过参照将其全部并入本文。黑体表示的残基是D-氨基酸，但可以任选地为L-氨基酸。除非明确说明，所有肽都是通过肽键连接的。在本说明书的最后列举了缩写。在”SEQ ID NO.”列中，”NR”的意思是对于给定序列，不需要序列表。
表1-EPO-模拟肽序列
Figure G2007800437952D00251
Figure G2007800437952D00261
EPO生物学活性是本领域中公知的。参见例如Anagnostou A等人，促红细胞生成素对于内皮细胞具有致有丝分裂和正趋化作用.Proceedings of the National Academy of Science(USA)87：5978-82(1990)；Fandrey J和Jelkman WE，白介素-1和肿瘤坏死因子-α抑制促红细胞生成素体外生成.Annals of the New York Academy of Science628：250-5(1991)；Geissler K等人，重组人促红细胞生成素：体内和体外多潜能造血生长因子.Contrib.Nephrol.87：1-10(1990)；GregoryCJ，造血系统中作为分化标记的促红细胞生成素敏感性.培养物中三个促红细胞生成集落反应的研究.Journal of Cellular Physiology 89：289-301(1976)；Jelkman W等人，在人肝癌培养物和分离的灌注大鼠肾中抑制促红细胞生成素生成的单核因子Life Sci.50：301-8(1992)；Kimata H等人，人重组促红细胞生成素直接刺激无血清培养基中B细胞免疫球蛋白生成和增殖.Clinical and Experimental Immunology 85：151-6(1991)；Kimata H等人，促红细胞生成素在无血清培养基中增强免疫球蛋白生成和通过人浆细胞的增殖.Clin.ImmunologyImmunopathol.59：495-501(1991)；Kimata H等人，重组人促红细胞生成素对于体外人IgE生成的影响，Clinical and Experimental Immunology83：483-7(1991)；Koury MJ和Bondurant MC，在红细胞祖细胞中促红细胞生成素延迟DNA断裂并且阻止程序化细胞死亡.Science 248：378-81(1990)；Lim VS等人，重组人促红细胞生成素对于人肾功能的影响.Kidney International 37：131-6(1990)；Mitjavila MT等人，促红细胞生成素的自分泌刺激以及人红细胞白血病细胞在体外的自发生长.Journal of Clinical Investigation 88：789-97(1991)；Andre M等人，促红细胞生成素的免疫放射分析性能以及对于取自贫血和红细胞增多症患者的样品的结果.Clinical Chemistry 38：758-63(1992)；Hankins WD等人，促红细胞生成素依赖性和促红细胞生成素产生性细胞系.研究以及白血病治疗的涉及.Annals of the New York Academy of Science 554：21-8(1989)；Kendall RGT等人，促红细胞生成素放射免疫分析样本的贮存和制备.Clin.Lab.Haematology 13：189-96(1991)；Krumvieh D等人，测定生物活性促红细胞生成素的相关生物测定的比较.Dev.Biol.Stand.69：15-22(1988)；Ma DD等人，测定人血清促红细胞生成素的评估以与RIA和体外生物测定比较.British Journal of Haematology 80：431-6(1992)；Noe G等人，用于测定人血清中促红细胞生成素的敏感性夹心ELISA.British Journal of Haematology 80：285-92(1992)；PaulyJU等人，用于抗血清中人白介素3(IL3)和人促红细胞生成素(EPO)的抗体的高特异性和高敏感性酶免疫测定.Behring Institut Mitteilungen 90：112-25(1991)；Sakata S和Enoki Y，基于CFU-E集落形成的用于血浆促红细胞生成素的改善的微生物测定.Ann.Hematology 64：224-30(1992)；Sanengen T等人，得自高输血新生和成年小鼠的血浆中的免疫反应性促红细胞生成素和红细胞生成刺激因子.用关于促红细胞生成素的放射免疫分析和细胞培养分析进行的研究.Acta Physiol.Scand.135：11-6(1989)；Widness JA等人，敏感性和特异性促红细胞生成素免疫沉淀测定：应用于药动学试验.Journal of Lab.Clin.Med.119：285-94(1992)；关于进一步信息，还可以参见在每个生物检验中所使用的单独的细胞系。上述参考文献均通过参照全部并入本文。可以通过采用对该因子应答的细胞系例如HCD57，NFS-60，TF-1和UT-7对EPO进行检验。还可以在集落形成检验中获取EPO活性，其通过从骨髓细胞测定CFU-E的数目。或者和完全不同的检测方法是细胞因子的RT-PCR定量。
部分并优选基本上提供蛋白质或片段的至少至少一种生物学活性的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或其特定的部分或变体能够结合蛋白质或片段配体，进而提供了至少一种活性，而这是通过蛋白质结合至少一种蛋白质配体或受体而介导的，或者通过其他蛋白质依赖性或蛋白质介导机制而介导的。本文所使用的，术语“EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂活性”是指EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂，根据检验，其能够调节或造成至少一种蛋白质依赖性活性至少大约60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000％或更多。
EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体提供至少一种蛋白质依赖性活性的能力优选是通过本文所述和/或本领域中已知的至少一种适当的蛋白质生物学检验所评估的。本发明的人EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体可以类似于任何类别(IgG、IgA、IgM等)或同功型，并且可以包括至少一部分κ或λ轻链。在一个实施方式中，人EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体包含IgG重链可变片段，铰链区，CH2和CH3，例如同功型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的至少一种。
本发明的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体结合对至少一种蛋白质、亚基、片段、部分或它们的组合特异性的至少一种特定的配体。本发明至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂、特定部分或变体的至少一种EPO模拟肽能够任选地结合配体的至少一种特定的配体表位。结合表位可以包含至少一种至少1～3个氨基酸的氨基酸序列至选自蛋白质配体例如EPO受体或其部分的序列连续氨基酸的整个特定部分的任意组合。
可以使用已知的技术通过将EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂的式(I)的各个部分连接在一起，使用已知的重组DNA技术的技术通过制备和表达至少一种(即一种或多种)编码EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂的核酸分子，或者通过使用任何适当的方法例如化学合成，而制备这些模拟抗体。
正如本领域中已知的和/或本文所述的，可以使用适当的方法制备结合人EPO配体或受体并且包含至少一部分特定重链和轻链可变区的模拟抗体，例如噬菌体展示(Katsube，Y.，等人，Int J Mol.Med，1(5)：863-868(1998))或者采用转基因动物的方法。可以使用编码核酸或其部分在适当的宿主细胞中表达EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂。
优选，这些模拟抗体或配体结合片段可以以高亲和力(例如低于或等于大约10-7M的KD)结合人EPO配体或受体。与本文所述序列基本相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸取代以及氨基酸缺失和和/或插入的的序列。保守氨基酸取代是指第一氨基酸被具有与第一氨基酸相似的化学和/或物理性质(例如电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)的第二氨基酸所替代。保守取代包括一个氨基酸被另一个下列组中的氨基酸所替代：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F、W和Y；C、S和T。
氨基酸代码
正如本领域公知的，构成本发明模拟抗体或特定部分或变体的氨基酸通常被简写。可以为氨基酸指派其单字母代码、其三字母代码、命名或三核苷酸密码子而描述氨基酸名称(参见Alberts，B.，等人，Molecular Biology of The Cell，第三版，Garland Publishing，Inc.，NewYork，1994)，如下表所示：
表2
  单字母代码   三字母代码   命名   三核苷酸密码子
  A   Ala   丙氨酸   GCA，GCC，GCG，GCU
  C   Cys   半胱氨酸   UGC，UGU
  D   Asp   天冬氨酸   GAC，GAU
  E   Glu   谷氨酸   GAA，GAG
  F   Phe   苯丙氨酸   UUC，UUU
  单字母代码   三字母代码   命名   三核苷酸密码子
  G   Gly   甘氨酸   GGA，GGC，GGG，GGU
  H   His   组氨酸   CAC，CAU
  I   Ile   异亮氨酸   AUA，AUC，AUU
  K   Lys   赖氨酸   AAA，AAG
  L   Leu   亮氨酸   UUA，UUG，CUA，CUC，CUG，CUU
  M   Met   甲硫氨酸   AUG
  N   Asn   天冬酰胺   AAC，AAU
  P   Pro   脯氨酸   CCA，CCC，CCG，CCU
  Q   Gln   谷氨酰胺   CAA，CAG
  R   Arg   精氨酸   AGA，AGG，CGA，CGC，CGG，CGU
  S   Ser   丝氨酸   AGC，AGU，UCA，UCC，UCG，UCU
  T   Thr   苏氨酸   ACA，ACC，ACG，ACU
  V   Val   缬氨酸   GUA，GUC，GUG，GUU
  W   Trp   色氨酸   UGG
  Y   Tyr   酪氨酸   UAC，UAU
本发明EPO模拟铰链核心模拟体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体可包括一个或多个氨基酸取代、缺失或添加，是来自突然突变或如本文所述的人工操作。可用于本发明的这样的序列或其他序列包括但不限于在表3中列出的那些，如2003年9月30日提交的美国临时申请60/507,349的图1-42中进一步描述，该申请全文引入本文以供参考，相当于2004年6月17日提交的PCT申请US04/19783的图1-41，该申请全文引入本文以供参考，其具有相应的SEQ ID NOS：31-72。这些参考的图1-42(SEQ ID NOS：31-72)或PCT US04/19783的图1-41显示了重/轻链可变/恒定区序列、框架/亚域和取代及其可用于本发明Ig衍生蛋白的部分。
表3：
Figure G2007800437952D00321
当然，本领域技术人员会根据许多因素包括上面所描述的得到氨基酸取代的数目。通常而言，如本文所述，对于至少一种模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂的氨基酸取代、插入或缺失的数目将不超过40、30、20，19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸，例如1-30或任何其中的范围或数值。
下面对本发明的EPO铰链核心模拟抗体的组分的描述是基于使用本发明的式I，
((V(m)-P(n)-L(o)-H(p)-CH2(q)-CH3(r))(s)，
其中V是至少一部分免疫球蛋白可变区的N-末端，P是至少一种生物活性肽，L是至少一种接头多肽，H是至少一种免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是至少一部分免疫球蛋白CH2恒定区，CH3是至少一部分免疫球蛋白CH3恒定区，m、n、o、p、q、r和s可以独立地是0、1或2与10之间的整数，模拟不同类型的免疫球蛋白分子，例如但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD、IgE等或任何它们的亚类或任何它们的组合。
在本发明的铰链核心模拟抗体中，任选的N-末端V部分可以包含至少一种重链可变区框架1(FR1)区的1～20个氨基酸，例如在2003年9月30日提交的美国临时申请60/507,349(通过参照全部并入本文)的图10～30中所提供的(SEQ ID NOS：40-61)，这对应2004年6月17日提交的PCT申请No.US04/1978的图1～41(通过参照全部并入本文)，如在这些图中所提供的，其包含取代、缺失或插入，其中图5、6和8是优选的。同样优选的是包含序列Q-X-Q的可变区序列。
P部分可以包含至少一种本领域中已知的或本文所述的任何治疗肽，例如但不限于在表1、EQ ID NOS：1-30中所提供的，或者本领域中已知的，或者任何它们的组合或连续序列，或任何它们的融合蛋白。
任选的接头序列可以是任何本领域中已知的适当肽接头。优选的序列包括G和S的任何组合，例如X1-X2-X3-X4-Xn，其中X可以是G或S，n可以是5-30。非限制性例子包括GS、GGGS、GSGGGS、GSGGGSGG等。
在本发明中，不使用CH1部分，并且铰链区N-末端的不同数目氨基酸被缺失，例如参照2003年9月30日提交的美国临时申请60/507,349(通过参照全部并入本文)的图1～42，对应2004年6月17日提交的PCT申请No.US04/19783(通过参照全部并入本文)的图1～41，以及表3。用于本发明模拟抗体的铰链核心部分的氨基酸的不同数目包括但不限于至少一种铰链区的N-末端氨基酸的任何下列缺失：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或1-3、2-5、2-7、2-8、3-9、4-10、5-9、5-10、5-15、10-20、2-30、20-40、10-50或其中的任何范围或数值，例如2003年9月30日提交的美国临时申请60/507,349(通过参照全部并入本文)的图32～40中所提供的，这对应2004年6月17日提交的PCT申请No.US04/19783(通过参照全部并入本文)的图1～41，或者上面的表3，例如但不限于缺失任何至全部2003年9月30日提交的美国临时申请60/507,349(通过参照全部并入本文)的图32～40中的氨基酸99-105、99-108、99-111、99-112、99-113、99-114、99-115、99-119、99-125、99-128、99-134、99-140、99-143、99-149、99-155和99-158的氨基酸99-101～105-157，其对应2004年6月17日提交的PCT申请No.US04/19783(通过参照全部并入本文)的图1-41，对应SEQ ID NOS：62-70，其包含2003年9月30日提交的美国临时申请60/507,349(通过参照全部并入本文)的图32-40中所描述的取代、插入或缺失，这对应2004年6月17日提交的PCT申请No.US04/19783(通过参照全部并入本文)的图1～41。在优选的实施方式中，本发明的铰链核心区包括铰链区N-末端的缺失以提供包括缺失最高达到但不包括Cys或者最高达到但不包括序列Cys-Pro-Xaa-Cys的铰链核心区。在进一步优选的实施方式中，在本发明的铰链核心模拟抗体中使用的这些铰链核心序列包括氨基酸109-113或者112-113(SEQ ID NO：66)(IgG1)；105-110或者109-110(SEQ ID NO：67)(IgG2)；111-160、114-160、120-160、126-160、129-160、135-160、141-160、144-160、150-160、156-160和159-160(SEQ ID NO：68)(IgG3)；或者106-110或者109-110(SEQ ID NO：69)(IgG4)。
CH2、CH3和任选的CH4序列可以是任何适当的人或人兼容的序列，例如2003年9月30日提交的美国临时申请60/507,349(通过参照全部并入本文)的图1-42中提供的，这对应2004年6月17日提交的PCT申请No.US04/19783(通过参照全部并入本文)的图1～42，以及表3，或者本领域中已知的，或任何它们的组合或连续序列，或它们的任何融合蛋白。
可以通过本领域中已知的方法鉴定本发明EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体中对于功能重要的氨基酸，例如定点突变或丙氨酸扫描突变(例如，Ausubel，同上，Chapters 8，15；Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085(1989))。后一方法在分子中的每个残基引入了单个丙氨酸突变。接着根据本文所述或本领域中已知的对所得到的突变分子测试生物学活性，例如但不限于至少一种蛋白质相关活性。也可以通过结构分析鉴定对于EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体结合关键的位点，例如结晶、核磁共振或光亲和标记(Smith，等人，J.Mol.Biol.224：899-904(1992)和de Vos，等人，Science 255：306-312(1992))。
本发明的模拟抗体或特定部分或变体可以包含选自SEQ ID NOS：1-30至少一种的3个或全部的至少一部分、序列或组合作为式(I)的P部分。可以增强或保持至少一种所列活性的非限制性变体包括但不限于任何上述多核苷酸，其进一步包含至少一个突变，这对应于至少一个取代、插入或缺失，其不会显著影响所述EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂的适当生物学活性。
EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体可以任选地进一步包含至少一种多肽的至少一个功能部分作为式(I)的P部分，SEQ ID NOS：1-30之一的至少90％。EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂可以任选地进一步包含选自SEQ ID NOS：1-30之一或更多的氨基酸序列作为式(I)的P部分。
在一个实施方式中，P氨基酸序列或其部分与SEQ ID NOS：1-30至少之一的相应部分的相应氨基酸序列具有大约90-100％的同一性(即：90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中的任何范围或数值)。优选，使用本领域中已知的适当的计算机算法测定90-100％的氨基酸同一性即：90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中的任何范围或数值)。
本发明的抗体或特定部分或变体可以包含来自本发明EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动或特定部分或变体的任意数目连续氨基酸，其中该数目选自EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂中连续残基数目的10～100％的整数。任选地，该连续氨基酸的子序列长度为至少大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或更多个氨基酸，或者其中的任何范围或数值。进一步，这些子序列的数目可以是选自1～20的任何整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。
正如本领域技术人员能够理解的，本发明包括至少一种本发明的生物学活性EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定的部分或变体。生物学活性的模拟抗体或特定部分或变体具有原始(非合成)内源性或相关和已知被插入或融合蛋白或特定部分或变体的特异性活性的至少20％、30％或40％，优选至少50％、60％或70％，最优选至少80％、90％或95％-1000％。检验和定量测量酶活性和底物特异性的方法是本领域技术人员公知的。
在另一个方面中，本发明涉及人模拟抗体和配体结合片段，正如本文所述的，其通过共价结合有机部而被修饰。这类修饰可以产生具有改进的药物动力学特征(例如提高的体内血清半衰期)的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或配体结合片段。有机部可以是直链或直链亲水聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在特定的实施方式中，亲水聚合物基团可以具有大约800～大约120,000道尔顿的分子量，并且可以是聚烷二醇(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、糖类聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯基吡咯烷酮和脂肪酸或脂肪酸酯基团可以包含大约8～大约40个碳原子。
本发明经修饰的模拟抗体和配体结合片段可以包含一种或多种有机部分，其直接或间接共价键合到EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体。键合到本发明EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或配体结合片段的的每个有机部都可以独立地是亲水聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。本文所使用的，术语“脂肪酸”包括单羧酸和二羧酸。本文所使用的术语“亲水聚合物基团”是指有机聚合物，其在水中的溶解度比在辛烷中高。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中的溶解度高。因此，本发明包括了通过共价结合聚赖氨酸而被修饰的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂。适于修饰本发明模拟抗体的亲水聚合物可以是直链或支链的，包括例如聚烷二醇(例如PEG、单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、糖类(例如葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等)、亲水氨基酸的聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚烷基氧化物(polyalkaneoxide)(例如聚氧化乙烯、聚氧化丙烯等)聚乙烯基吡咯烷酮。优选修饰本发明EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂的亲水聚合物作为独立的分子实体的分子量为大约800～大约150,000道尔顿。例如可以使用PEG2500，PEG5000，PEG7500，PEG9000，PEG10000，PEG12500，PEG15000和PEG20,000，其中下标是以道尔顿为单位的平均分子量。
亲水聚合物基团可以被1～大约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。可以使用适当的方法制备被脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水聚合物。例如含有氨基的聚合物可以连接到脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸上，并且脂肪酸或脂肪酸酯上激活的羧酸(例如被N，N-羰基二咪唑激活)可以连接到聚合物上的羟基基团。
适于修饰本发明模拟抗体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，或者可以含有一个或者多个不饱和单元。适于修饰本发明模拟抗体的脂肪酸包括例如正十二酸酯(C12，月桂酸酯)、正十四酸酯(C14，豆蔻酸酯)、正十八酸酯(C18，硬脂酸酯)、正二十酸酯(C20，花生酸酯(arachidate))、正二十二酸酯(C22，山嵛酸酯)、正三十酸酯(C30)、正四十酸酯(C40)、顺式-9-十八碳烯酸酯(C18，油酸酯)、所有顺式-Δ5，8，11，14-二十碳四烯酸酯(C20，花生四烯酸酯)、辛二酸、十四碳二元酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。适当的脂肪酸酯包括二羧酸的单酯，其包含直链或直链低级烷基。低级烷基可以包含1～大约12个优选1～大约6个碳原子。
可以使用适当的方法制备经修饰的人模拟抗体和配体结合片段，例如通过与一种或多种修饰剂反应。本文所使用的术语“修饰剂”是指适当的有机基团(例如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，其包含激活基团。“激活基团”是一种化学部或功能团，其在适当的条件下能够与第二基团反应，进而在修饰剂和第二化学基团之间形成共价键。例如胺反应性激活基团包括亲电子基团例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可以与硫醇反应的激活基团包括例如马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯醇基(acrylolyl)、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛功能团可以连接到含有氨基或酰肼的分子上，并且叠氮基可以与三价磷基团反应形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺键。将激活基团引入到分子中的适当方法是本领域中已知的(参见，例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996))。激活基团可以直接键合到有机基团(例如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，或者通过接头部，例如二价C1-C12基团，其中一个或者更多个碳原子可以被杂原子替换例如氧、氮或硫。适当的接头部包括例如四甘醇、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。可以例如通过将单-Boc-烷基二胺(例如单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸在存在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)时反应以在自由胺和脂肪酸羧酸酯之间形成酰胺键而制备包含接头部的修饰剂。可以通过使用三氟乙酸(TFA)处理除去Boc保护基团，以暴露伯胺，其可以被连接到所述的另一个羧酸酯上，或者可以与马来酸酐反应，并且所得到的产物进行循环以产生脂肪酸的激活的马来酰亚胺(maleimido)衍生物(参见例如Thompson，等人，WO 92/16221，将其全部教导通过参照并入本文)。
可以通过将人EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或配体结合片段与修饰剂反应而制备本发明经修饰的模拟抗体。例如，可以以非位点特异性模式而将有机部键合到EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂，其通过采用胺反应性修饰剂，例如PEG的NHS酯。也可以通过还原EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或配体结合片段的二硫键(例如链内二硫键)而制备经修饰的人模拟抗体或配体结合片段。接着可以将经还原的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或配体结合片段与硫醇反应性修饰剂反应以产生本发明经修饰的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂。可以使用适当的方法制备经修饰的人模拟抗体和配体结合片段，其含有键合到本发明EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的有机部，例如反向蛋白质水解(Fisch等人，Bioconjugate Chem.，3：147-153(1992)；Werlen等人，BioconjugateChem.，5：411-417(1994)；Kumaran等人，Protein Sci.6(10)：2233-2241(1997)；Itoh等人，Bioorg.Chem.，24(1)：59-68(1996)；Capellas等人，Biotechnol.Bioeng.，56(4)：456-463(1997))以及描述在Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996)中的方法。
EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂组合物
本发明还提供了至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物，其包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多本文所述和/或本领域中已知的模拟抗体或它们的特定部分或变体，其是以非天然组合物、混合物或形式提供的。根据本领域中已知的或本文所述的，这些组合物的百分比是以重量、体积、浓度、摩尔或重量摩尔浓度、作为液体或干溶液、混合物、悬浮液、乳化液或胶体的。
根据本领域中已知的或本文所述的，这些组合物可以含有0.00001-99.9999％按照重量、体积、浓度、摩尔或重量摩尔浓度作为液体、气体或干溶液、混合物、悬浮液或胶体，以及其中的任何范围或数值，例如但不限于0.00001、0.00003、0.00005、0.00009、0.0001、0.0003、0.0005、0.0009、0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4.、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9％。因此，本发明的这些组合物包括但不限于0.00001-100mg/ml和/或0.00001-100mg/g。
任选地，该组合物还可以包含有效量的至少一种化合物或蛋白质，其选自至少一种抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、流体或电解质平衡的药物、血液学药物、抗癌药物、免疫调节药物、眼用药物、耳用药物或鼻用药物、局部用药物、营养性药物等。这些药物是本领域中公知的，其中包括制剂、适应症、剂量给药和给药均在本文中被提供(参见例如，Nursing 2001 Handbook of Drugs，第21版，Springhouse Corp.，Springhouse，PA，2001；Health Professional’sDrug Guide 2001，ed.，Shannon，Wilson，Stang，Prentice-Hall，Inc，Upper Saddle River，NJ；Pharmcotherapy Handbook，Wells等人，ed.，Appleton & Lange，Stamford，CT，均通过参照全部并入本文)。
本发明的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物还可以包含至少一种任何适当的辅助物，例如但不限于稀释剂、粘结剂、稳定剂、缓冲液、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等。优选药物上可以接受的辅助物。制备这些无菌溶液的非限制性例子和方法是本领域中公知的，例如但不限于Gennaro，Ed.，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.(Easton，PA)1990。可以常规地选择药物上可以接受的载体，其适于本领域中公知的本文所述EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂组合物的给药模式、溶解度和/或稳定性。
可以用于本发明的药物赋形剂和添加剂包括但不限于蛋白质、肽和糖类(例如糖包括单糖、双糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖例如醛醇、醛糖酸、酯化糖等；多糖或糖聚合物)，其可以分别提供，或者组合提供，包括单独的或以1-99.99重量或体积％的组合。示范性的蛋白质赋形剂包括血清白蛋白例如人血清白蛋白(HSA)、重组人血清白蛋白(rHA)、凝胶、酪蛋白等。也可以发挥缓冲能力的代表性氨基酸/EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯等。优选的氨基酸是甘氨酸。
适于用于本发明的糖类赋形剂包括例如单糖例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；双糖例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及醛醇例如甘露醇、木糖醇、乳糖春、山梨醇(葡萄糖醇)、肌醇等。用于本发明的优选糖类赋形剂是甘露醇、海藻糖和棉子糖。
EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂组合物还可以含有缓冲液或pH调节剂；通常，缓冲液是从有机酸或碱制备的盐。代表性的缓冲液包括有机酸盐例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、醋酸或邻苯二甲酸的盐；Tris、三羧甲基氨甲烷盐酸盐或磷酸盐缓冲液。用于本发明的优选缓冲液是有机酸盐例如柠檬酸盐。
此外，本发明的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物可以包括聚合物赋形剂/添加剂例如聚乙烯基吡咯烷酮、水溶性聚蔗糖(ficoll)(聚合物糖)、葡萄糖结合剂(dextrate)(例如，环糊精例如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗菌剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨醇酯如“吐温20”和“吐温80”)、脂类(例如磷酸脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如，EDTA)。
适用于本发明EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂组合物的这些和其他已知药物赋形剂和/或添加剂是本领域中已知的，例如，在“Remington：The Science & Practice of Pharmacy”，19th ed.，Williams & Williams，(1995)中以及在“Physician’s Desk Reference”，52nd ed.，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)中列举的，其公开内容被通过参照全部并入本文。优选的载体或赋形剂材料是糖类(例如糖和醛醇)和缓冲液(例如柠檬酸盐)或聚合试剂。
制剂
如上所述，本发明提供了稳定制剂，其优选包含适当的缓冲液以及盐水或选择的盐，以及任选地储存的溶液和含有防腐剂的制剂，以及适用于药物或兽医用途的多用途储存的制剂，其在药物上可以接受的制剂中包含至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体。储存的制剂含有至少一种已知的防腐剂或任选地选自至少一种苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、苯汞基亚硝酸盐、苯氧乙醇、甲醛、氯代丁醇、氯化镁(例如六水合物)、尼泊金烷基酯类(alkylparaben)(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、脱氢醋酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠或者其在水稀释液中的混合物。可以使用本领域中已知的任何适当的浓度或混合物，例如0.001-5％，或其中的任何范围或数值，例如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4.、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或其中的任何范围或数值。非限制性例子包括没有防腐剂、0.1-2％间甲酚(例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)、0.1-3％苯甲醇(例如0.5、0.9、1.1.、1.5、1.9、2.0、2.5％)、0.001 0.5％乙基汞硫代水杨酸钠(例如0.005、0.01)、0.001-2.0％苯酚例如0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％烷基尼泊金酯类(alkylparaben)(例如0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01，0.020.050.0750.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等。
如上所述.发明提供一种制品，其包含包装材料和至少一个小瓶，小瓶中包含至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的溶液以及指定的缓冲液和/或防腐剂，任选地在水稀释液中，其中所述包装材料包括标签，其表明了这类溶液可以被保持1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72个小时或更长。本发明还提供了一种制品，其包含包装材料、第一小瓶和第二小瓶，其中第一小瓶含有冻干的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体，第二小瓶含有指定的缓冲液和/或防腐剂的水稀释液，其中所述包装材料包括标签，其指导患者在水稀释液中重建至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体以形成可以被保持24小时以上或更长时间的溶液。
如本文所述或本领域中已知的，可以通过重组手段制备本发明所使用的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体，包括从哺乳动物细胞或转基因制剂或可以从其他生物来源纯化。
在本发明的产品中至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的量的范围包括如果在湿/干系统中在重建之后产生了大约1.0μg/ml～大约1000mg/ml浓度的量，尽管也可以使用更低或更高的浓度，并且依赖期望的递送载体，例如溶液制剂会与透皮贴剂、肺部、跨粘膜或渗透性或微型泵方法不同。
优选，水稀释液任选地还包含药物上可以接受的防腐剂。优选的防腐剂包括选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、尼泊金烷基酯类(alkylparaben)(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、脱氢醋酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠活或他们的混合物的那些。在制剂中所使用的防腐剂的浓度是足以产生抗菌效果的浓度。这些浓度依赖于所选择的防腐剂并且容易被本领域技术人员所确定。
其他的赋形剂例如等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、防腐剂增强剂可以任选地并优选地被加到稀释液中。通常以已知的浓度使用等渗剂例如甘油。生理学忍耐的缓冲液优选地被加入以提供改善的pH控制。制剂可以覆盖各类的pH，例如大约pH 4到大约pH 10，并优选在大约pH5到大约pH 9的范围内，最优选的范围是大约6.0到大约8.0的范围。优选地本的制剂具有大约6.8和大约7.8之间的pH。优选的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，最优选磷酸钠，特别是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
其他的添加剂如药物上可以接受的增溶剂如吐温20(聚氧化乙烯20)单月桂酸山梨聚糖)、吐温40(聚氧乙烯(20)单棕榈酸山梨聚糖)、吐温80(聚氧乙烯(20)单油酸山梨聚糖)、普卢兰尼克F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇或者非离子型表面活性剂例如吐温20或者80或者泊洛沙姆184或者188、Pluronic polyls、其他的嵌段共聚物)和螯合剂例如EDTA和EGTA可以任选地被加入到制剂或组合物中以减少聚集。
可以通过一种方法制备本发明的制剂，其包括将至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体与选自石炭酸、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、烷基尼泊金酯类(甲基、乙基、丙基、丁基等等)、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、脱氢醋酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠或者它们混合物的防腐剂在水稀释液中混合。使用传统的溶解和混合程序进行将至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体与防腐剂在水稀释剂中混合。为了制备适当的制剂，例如将缓冲溶液中经测量量的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体与缓冲液中期望的防腐剂混合，其量足以提供期望浓度的蛋白质和防腐剂。本领域技术人员能够理解该方法的变化。例如，组分加入的顺序，是否使用其他的添加剂、制备制剂的温度都是可以根据所使用的浓度和给药手段进行优化的因素。
可以将所要求保护的制剂作为清澈的溶液或者作为两个小瓶提供给患者，其中在所述两个小瓶之一含有冻干的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体，其被第二小瓶重建，所述第二小瓶中含有水、在水稀释剂中的防腐剂和/或赋形剂，优选磷酸盐缓冲液和/或盐水和所选择的盐。单一溶液或者需要重建的两个小瓶都可以被重复使用多次，并且能够满足单次或多次治疗患者，因此能够提供比目前可利用的便利的治疗方案。
本发明要求保护的制品可以用于经过一段时间给药，从立即到24小时或更长。因此，本发明要求保护的制品提供了对患者的显著优点。本发明的制剂可以任选地被保存在大约2～大约40℃的温度下，并长时间保持蛋白质的生物学活性，因此包装标签标示溶液可以被保持和/或使用6、12、18、24、36、48、72或96小时或更长。如果使用储存的稀释剂，则标签可以包括使用最高达到至少1～12个月、半年、一年半和/或两年的至少之一。
本发明中至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的溶液可以通过一种方法制备，该方法包括在水稀释剂中将至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体进行混合。使用传统的溶解和混合程序进行混合。为了制备适当的稀释剂，例如将水或缓冲液中的测量量的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体以足以提供期望浓度的蛋白质和任选地防腐剂或缓冲液的量进行组合。本领域技术人员能够理解该方法的变化。例如，组分加入的顺序，是否使用其他的添加剂、制备制剂的温度都是可以根据所使用的浓度和给药手段进行优化的因素。
可以将所要求保护的制剂作为清澈的溶液或者作为两个小瓶提供给患者，其中在所述两个小瓶之一含有冻干的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体，其被第二小瓶重建，所述第二小瓶中含有水稀释剂。单一溶液或者需要重建的两个小瓶都可以被重复使用多次，并且能够满足单次或多次治疗患者，因此能够提供比目前可利用的便利的治疗方案。
可以通过提供给药店、门诊部或其他这类机构和机关而间接地为患者提供所要求保护的产品，作为清澈的溶液或两个小瓶，其中在所述两个小瓶之一含有冻干的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体，其被第二小瓶重建，所述第二小瓶中含有水稀释剂。在这种情况中，清澈的溶液体积最高可以达到1升，提供了大储藏器(reservoir)，从该大储藏器可以一次或者多次取出较小部分的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体溶液用于转移到较小的小瓶中，并由药店或门诊部提供给他们的消费者和/或患者。
包括这些单个小瓶系统的公认装置包括单或双小瓶笔式注射器(pen-injector)装置，用于递送用于本发明的药物溶液，并且任选地进一步包括双小瓶系统(dual vial system)包括那些笔式注射器系统用于在筒中重建冻干的药物以递送药物溶液，这正如本领域中公知的，例如在美国专利No.6,203,530、5,026,349、5,567,160、5,954,738、5,879,327、5,599,302、6,015,438、6,461,333、6,517,517、6,077,247、6,099,504、6,428,528、6,387,078、5,868,711、5,960,797、5,176,643、5,271,744、5,405,362、5,451,210、5,137,516、5,176,643、5,300,030、5,295,965、5,425,715、5,478,316、5,575,777、5,599,309、5,681,291、5,709,662、5,779,677、5,913,843、5,843,036、5,957,897、6,428,528、6,086,562、6,099,503、6,221,044、6,270,479、6,258,068、6,391,003、6,280,421、6,045,534、6,371,939、6,090,078、5,267,963、5,487,732、5,425,715、6,575,939、6,565,540、6,159,181、6,179,812、6,544,234、6,572,581、6,676,630、6,083,197、6,203,530、6,270,479、6,371,939、5,575,777、6,090,078、6,743,199、6,589,210、6,689,093、6,783,509、6,645,170、6,641,554、6,796,967、6,645,181、6,641,565、6,575,939、6,569,115、6,673,049、6,641,560、6,569,124、6,699,220、6,638,256、6,607,508、6,607,510、6,776,777、6,767,336、6,595,962、6,740,062、6,565,553、6,746,429、6,569,123、6,595,957、6,770,056中所公开的，均被通过参照并入本文。
本发明要求保护的产品包括包装材料。除了管理机构所要求的信息外，包装材料还提供了产品可以使用的情况。本发明的包装材料为患者提供了在水稀释液中重建至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的指导，对于双小瓶、湿/干产品，以形成溶液，并使用该溶液经过2～24小时或更长的时间。对于单小瓶，溶液产品，标签表明这些溶液可以使用经过2-24小时或更长时间。本本发明要求保护的产品可以用于人类药物产品应用。
可以通过一种方法制备本发明的知己，该方法包括将至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体和所选择的缓冲液优选含有盐水或所选择盐的磷酸盐缓冲液进行混合。使用传统的溶解和混合程序进行在水稀释剂中混合至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体和缓冲液。为了制备适当的制剂，例如将水或缓冲溶液中经测量量的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体与水中期望的缓冲剂混合，其量足以提供期望浓度的蛋白质和缓冲液。本领域技术人员能够理解该方法的变化。例如，组分加入的顺序，是否使用其他的添加剂、制备制剂的温度都是可以根据所使用的浓度和给药手段进行优化的因素。
可以将要求保护的稳定或储藏的制剂提供给患者，作为清澈的溶液或者作为两个小瓶提供给患者，其中在所述两个小瓶之一含有冻干的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体，其被第二小瓶重建，所述第二小瓶中含有水、在水稀释剂中的防腐剂和/或赋形剂。单一溶液或者需要重建的两个小瓶都可以被重复使用多次，并且能够满足单次或多次治疗患者，因此能够提供比目前可利用的便利的治疗方案。
如本文所述，在稳定或储藏的知己或溶液中的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体可以根据本发明通过各种递送方法为患者给药，包括SC或IM注射；透皮、肺部、跨粘膜、植入、渗透压泵、药筒(cartridge)、微型泵或其他本领域技术人员已知的以及本领域公知的手段。
治疗应用
对于模拟抗体，本发明还提供了用于在细胞、组织、器官、动物或患者中调节或治疗葡萄糖耐受不良相关紊乱和/或肾病相关贫血的方法。
发明还提供了用于在细胞、组织、器官、动物或患者中调节或治疗葡萄糖耐受不良相关紊乱和/或肾病相关贫血或血细胞相关病症的方法，其中所述贫血或血细胞相关病症与至少一种包括但不限于下列的相关：至少一种免疫相关疾病、心血管疾病、感染、恶性肿瘤和/或神经性疾病。这类方法可以任选地包括为需要这类调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者给药至少一种组合物或药物组合物，其包含至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体。
本发明的所有方法都可以包括为需要这类调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者给药有效量的组合物或药物组合物，其包含至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体。这类方法可以任选地还包括共给药或联合治疗用于治疗这些免疫疾病，其中给药所述至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂、它们特定的部分或变体还包括在之前、同时和/或之后给药至少一种选自至少一种TNF拮抗剂(例如但不限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或片段、抗癌蛋白质、其融合蛋白或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿药、肌肉松弛药、麻醉药、非类固醇抗炎药药(NSAID)、止痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉药、神经肌肉阻断剂、抗菌剂(例如氨基糖苷类、抗真菌剂、抗寄生物药、、抗病毒剂、卡巴盘尼姆(carbapenem)、头孢菌素、flurorquinolone、大环内酯、青霉素、磺胺药、四环素、其他抗菌剂)、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成甾类、糖尿病相关药物、矿物、营养性甲状腺药物、维生素、钙相关激素、止泻药、止咳药、止吐药、抗溃疡药、缓泻药、抗凝血剂、促红细胞生成素(erythropieitin)例如epoetinα)非格司亭(filgrastim)例如G-CSF，Neupogen)、沙格司亭(sargramostim)(GM-CSF，Leukine)、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如basiliximab、cyclosporine、daclizumab)、生长激素、激素替换药、雌激素受体调节剂、散瞳药、睫状肌麻痹药、烷化剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、防辐射药物、抗抑郁剂、抗躁狂药、安定药、抗焦虑药、安眠剂、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐(Donepezil)、塔克林(tacrine)、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、白细胞三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、cromolyn、肾上腺素或类似物链球菌DNA酶α(pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。适当的配药是本领域中公知的。参见例如Wells等人，eds.，Pharmacotherapy Handbook，第2版，Appleton and Lange，Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon PocketPharmacopoeia 2000，Deluxe Edition，Tarascon Publishing，Loma Linda，CA(2000)，均被通过参照全部并入本文。
本文所使用的“肿瘤坏死因子抗体”、“TNF抗体”、“TNFα抗体”或片段等体外、原位和/或优选体内降低、阻断、抑制、取消(abrogate)和/或干扰TNFα活性。例如，本发明适当的TNF人抗体可以结合TNF并包括抗TNF抗体、其抗原结合片段、其特异性结合TNFα的特定突变体或结构域。适当的TNF抗体片段还降低、阻断、取消(abrogate)、干扰、防止和/或抑制TNF RNA、DNA或蛋白质合成、TNF释放、TNF受体信号传递、膜TNF切割、TNF活性、TNF产生和/或合成。
典型地，治疗病例状态是通过给药有效量或剂量的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂组合物而实现的，其总共平均含有每剂量至少大约0.001～500毫克的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体/千克患者，优选每单次给药或多次给药至少大约0.01～100毫克EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体/千克患者，这依赖于组合物中所含有的具体活性。或者，有效的血清浓度可以包含每单次给药或多次给药0.001-5000μg/ml血清浓度。适当的用量是执业医生已知的，并且当然依赖于特定的疾病状态、被给药的组合物的具体活性以及经历治疗的特定患者。在某些情况中，为了达到期望的治疗量，可能必须提供重复给药，即重复的单独给药特定的监控或测量的剂量，其中重复单次给药知道达到期望的每日剂量或效果。
优选的剂量任选地包括0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、009、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29，和/或30mg/kg/给药或任何其中的范围或数值，或者以达到每单次或多次给药血清浓度为0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、4.9、5.0、5.5.、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或5000μg/ml血清浓度，或其中的任何范围、数值或部分。
或者，所给药的剂量可以根据已知的因素改变，例如特定药物的药物动力学特征、其给药路线；受体的年龄、健康和体重；症状的性质和程度、同时治疗的类型、治疗的频率以及期望的效果。通常，活性成分的剂量可以为大约0.1～100毫克/千克体重。通常，以持续释放形式的0.1～50，优选0.1～10毫克/千克体重能有效获得期望结果。
作为非限制性例子，治疗人或动物可以被提供为一次或周期给药至少一种本发明的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体0.01～100mg/kg例如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg/天，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39.或40天之一，或或者，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周之一，或者任何它们的组合，其使用单次、灌输或重复给药。
适于内部给药的剂型(组合物)通常每单位或容器含有大约0.0001毫克～大约500毫克的活性成分。在这些药物组合物中，活性成分将通常以基于组合物总重量的大约0.5-95重量％的量存在。
对于肠胃外给药，可以将EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体配置为溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末，其与药物上可以接受的肠胃外载体结合或分别提供。这些载体的例子是水、盐水、林格溶液(Ringer′s solution)、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。还可以使用脂质体和非水载体例如不挥发性油。载体或冻干粉末可以含有维持等渗性(例如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如缓冲液和防腐剂)的添加剂。通过已知的或适当的技术对制剂进行灭菌。
适当的药物载体被描述在最近版本的Remington′s PharmaceuticalSciences，A.Osol中，这是该领域的标准参考文献。
治疗给药
根据本发明可以使用许多已知的和先进的模式用于给药药物上有效量的本发明的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体。尽管在下面的描述中采用肺部给药，但根据本发明也可以使用其他给药模式得到适当的结果。
可以在载体中递送本发明的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂，作为溶液、乳液、交替或悬浮液或作为粉末，其使用任何适于通过吸入或其他本文所描述或本领域已知的给药的装置和方法。
肠胃外制剂和给药
用于肠胃外给药的制剂可以含有作为常用赋形剂的无菌水或盐水、聚烷二醇例如聚乙二醇、植物来源的油，氢化萘等。可以通过使用适当的乳化剂或增湿剂和悬浮剂根据已知的方法制备用于注射的水悬浮液或油悬浮液。用于注射的试剂可以是无毒、非口服给药的稀释剂例如水溶液或无菌可注射溶液或溶剂中的悬浮液。作为可以使用的载体或溶剂，可以使用水、林格溶液、等渗盐水等；作为常用的溶剂或悬浮溶剂，可以使用无菌不挥发油。对于这些目的，可以使用任何类型的不挥发油和脂肪酸，包括天然或合成的或半合成脂肪油或脂肪酸；天然或合成的或半合成单-或二-或三-甘油酯。肠胃外给药是本领域中已知的，并且包括但不限于注射、气压无针注射装置的手段如在美国专利No.5,851,198中所描述的，以及激光穿孔装置如在美国专利No.5,839,446中所描述的，通过参照全部并入本文。
另外的递送
本发明进一步涉及给药至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体，其通过肠胃外、皮下、肌内、静脉内、快速浓注、阴道、直肠、经颊、舌下、鼻内或透皮手段。EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物可以被制备为用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)给药，特别是以液体溶液或悬浮液的形式；用于阴道或直肠给药中，特别是以半固体形式例如霜剂和栓剂；用于口腔或舌下给药，特别是以片剂或胶囊的形式；或鼻内，特别是以粉末、鼻滴剂或气溶胶或某些试剂的形式；或透皮给药，特别是以凝胶、药膏、洗剂、悬浮液或贴剂递送系统，其具有化学增强剂例如二甲基亚砜以修饰皮肤结构或者提高透皮贴片中的药物浓度(Junginger，等人In″Drug Permeation Enhancement″；Hsieh，D.S.，Eds.，pp.59-90(Marcel Dekker，Inc.New York 1994，通过参照全部并入本文)，或者具有氧化剂其能够将含有蛋白质和肽的制剂应用到皮肤上(WO 98/53847)，或者应用电场以形成暂时的运输途径例如电穿孔，或者提高带电药物通过皮肤的移动性例如离子电渗疗法，或者应用超声波例如超声疗法(sonophoresis)(美国专利Nos.4,309,989和4,767,402)(通过参照将上述公开和专利全部并入本文)。
肺部/经鼻给药
为了肺部给药，优选至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物被以有效达到肺部或鼻窦的粒度进行递送。根据本发明，可以通过任何本领域中已知的吸入或经鼻装置递送至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体，用于通过吸入给药治疗剂。能够在患者鼻腔或肺胞中沉积烟雾化制剂的装置包括计量式吸入器(metered doseinhaler)、喷雾器、干粉发生器、喷射器(sprayer)等。适于引导肺部或经鼻给药EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的其他装置也是本领域中已知的。所有这些装置可以使用适于以气溶胶给药以分配EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的制剂。这些气溶胶可以包括溶液(水溶液和非水溶液)或固体颗粒。计量式吸入器如
Figure G2007800437952D00511
计量式吸入器，通常使用推进气体并在吸入的过程中需要驱动(参见例如WO94/16970，WO 98/35888)。干粉吸入器如Inhale Therapeutics销售的装置TurbuhalerTM(Astra)、
Figure G2007800437952D00521
(Glaxo)、
Figure G2007800437952D00522
(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)，以及粉末吸入器(Fisons)，使用呼吸驱动混合的粉末(US 4668218 Astra，EP 237507 Astra，WO 97/25086 Glaxo，WO94/08552 Dura，US 5458135 Inhale，WO 94/06498 Fisons，通过参照全部并入本文)。喷雾器如AERxTM Aradigm、
Figure G2007800437952D00524
喷雾器(Mallinckrodt)和Acorn
Figure G2007800437952D00525
喷雾器(Marquest Medical Products)(US5404871 Aradigm，WO 97/22376)(通过参照将上述参考文献全部并入本文)，从溶液产生气溶胶，而计量式吸入器、干粉吸入器等则产生小颗粒气溶胶。商业上可以利用的吸入装置的具体例子被认为是适于实施本发明的具体装置的代表，并且不被认为限制本发明的范围。优选，含有至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的组合物是通过干粉吸入器或喷射器而递送的。用于给药本发明至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的吸入装置存在许多期望的特征。例如，有利地，通过吸入装置递送是可靠的、可再生的和精确的。任选地，吸入装置可以递送小的干颗粒例如低于大约10μm，优选大约1-5μm，达到良好的适合呼吸。
作为喷剂给药EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物
可以通过将至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的悬浮液或溶液施压在压力下通过喷嘴而产生包括EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质的喷剂。可以对喷嘴尺寸和形状以及所施加的压力和液体供给速度进行选择以达到期望的输出和粒度。例如可以通过电场结合毛细管或喷嘴供给产生电喷射。有利地，通过喷射器产生至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质的颗粒，其粒度低于大约10μm，优选在大约1μm～大约5μm的范围内，最优选大约2μm～大约3μm。
适于利用喷射器使用的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质的制剂通常包括在水溶液中的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质，其浓度为每毫升溶液大约1mg～大约20mg至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质。制剂可以包含试剂例如赋形剂、缓冲液、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，以及优选锌。该制剂还可以包含赋形剂或者用于稳定EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质的试剂，例如缓冲液、还原剂、本体蛋白质(bulk protein)或糖类。可以用于配制EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物的本体蛋白质包括白蛋白、精蛋白等。可以用于配制EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质的典型糖类包括蔗糖、甘露糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质制剂还可以包括表面活性剂，其能够减低或防止由于形成气溶胶中溶液雾化所造成的表面诱导的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质的聚集。可以采用各种传统的表面活性剂例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇以及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。量通常在制剂的0.001～14重量％之间。对于本发明的目的，特别优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯、山梨聚糖80、山梨聚糖20等。在制剂中还可以包括其他本领域中已知的配制蛋白质的其他试剂例如模拟抗体或特定部分或变体。
通过喷雾器给药EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物
可以通过喷雾器给药EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质，例如喷气式喷雾器或超声喷雾器。典型地，在喷气式喷雾器中，压缩空气源被用于通过孔形成高速气流。当气体膨胀超过喷嘴时，形成低压区，这拉动EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质溶液通过与液体储藏器连接的毛细管。来自毛细管的液体流在其离开管时，被剪切成不稳定的细流和液滴，这形成了气溶胶。可以采用多种结构、流速和隔板类型以从给定的喷雾器达到期望的性能特征。在超声喷雾器中，使用高频电能形成震动、机械能，典型地采用压电式换能器。将该能量直接或通过连接流体传递给EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质制剂，这形成了含有EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质的气溶胶。有利地，通过气雾剂递送的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质的粒度低于大约10μm，优选在大约1μm～大约5μm的范围内，最优选大约2μm～大约3μm。
适于使用喷雾器(喷气式或超声)的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的制剂典型地包括水溶液中的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质，其浓度为每毫升溶液大约1mg～大约20mg至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质。制剂可以包含试剂例如赋形剂、缓冲液、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，以及优选锌。该制剂还可以包含赋形剂或者用于稳定EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质的试剂，例如缓冲液、还原剂、本体蛋白质(bulk protein)或糖类。可以用于配制EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物的本体蛋白质包括白蛋白、精蛋白等。可以用于配制EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质的典型糖类包括蔗糖、甘露糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质制剂还可以包括表面活性剂，其能够减低或防止由于形成气溶胶中溶液雾化所造成的表面诱导的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质的聚集。可以采用各种传统的表面活性剂例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇以及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。量通常在制剂的0.001～4重量％之间。对于本发明的目的，特别优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯、山梨聚糖80、山梨聚糖20等。在制剂中还可以包括其他本领域中已知的配制蛋白质的其他试剂例如模拟抗体或特定部分或变体。
通过计量式吸入器给药EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物
在计量式吸入器(MDI)中，在筒中含有作为混合物的推进剂、至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体和任何赋形剂或其他添加剂包括液化的压缩气体。驱动计量阀释放作为气溶胶的混合物，优选含有粒度在低于大约10μm，优选在大约1μm～大约5μm的范围内，最优选大约2μm～大约3μm范围内的颗粒。通过采用本领域技术人员已知的各种方法所产生的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物蛋白质的知己，可以获得期望的气溶胶粒度，包括喷气研磨(jet-milling)、喷射干燥、临界点冷凝等。优选的计量式吸入器包括3M或Glaxo制造的采用氟代烃推进剂的那些。
用于计量式吸入器装置的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的制剂通常包括精细分开的粉末，其含有在非水介质中作为悬浮液的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体，悬浮在借助表面活性剂的推进剂中。推进剂可以是任何为此目的的传统材料，例如氯氟烃、氟代烃或烃包括三氯氟代甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、HFA-134a(氢氟烷-134a)、HFA-227(氢氟烷-227)等。优选，推进剂是氟代烃。可以选择表面活性剂以稳定推进剂中作为悬浮液的至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体以保护活性剂免于化学降解等。适当的表面活性剂包括山梨聚糖三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。在某些情况中，优选使用溶剂如乙醇的溶液气溶胶。制剂中海可以包含本领域中已知用于配体蛋白质的其他试剂如蛋白质。
本领域技术人员能够理解可以利用本文没有描述的装置通过肺部给药至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体组合物而实现本发明的方法。
粘膜制剂和给药
为了通过粘膜表面吸收，给药至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的组合物和方法包括含有许多亚微米颗粒的乳液、粘膜吸附大分子、生物活性肽和水连续相，其促进通过达到粘膜吸附粘膜颗粒而通过粘膜表面吸附(美国专利No.5,514,670)。适于施用本发明乳液的粘膜表面包括角膜、角膜的、结膜的、口腔的、舌下的、经鼻、阴道的、肺部的、胃的、肠的和直肠的给药途径。用于阴道的或者直肠给药的制剂例如栓剂可以含作为赋形剂的例如聚烷二醇、凡士林、可可脂等。用于鼻内给药的制剂可以是固体的并含作为赋形剂的例如乳糖，或者可以是鼻滴剂的含水的或者油溶液。用于口腔给药的赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预凝胶化(pregelinatined)淀粉等(美国专利No.5,849,695)。
口腔制剂和给药
用于口腔的制剂依赖共同给药助剂(例如间苯二酚和非离子型表面活性剂例如聚氧乙烯油烯基醚和正六乙酰基聚乙烯醚以人工地人为地提高肠壁的渗透性，以及共同给药酶抑制剂例如胰腺胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(DFF)和抑肽酶)以抑制酶催降解。用于口服给药的固体型剂型的活性组分化合物可以与至少一种添加剂混合，包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露糖醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、精氨酸盐(arginate)、壳多糖、脱乙酰壳多糖、果胶、黄蓍树胶、阿拉伯树胶、凝胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或者半合成的聚合物和甘油酯。这些剂型还可以含其他类型的添加剂例如惰性的稀释剂，润滑剂例如硬脂酸镁、对羟苯甲酸酯(paraben)，防腐剂例如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚，抗氧化剂例如半胱氨酸，崩解剂(disintegrator)，粘合剂，增稠剂，缓冲剂，脱硫剂，增香剂，芳香剂，等等。
片剂和丸剂可以被进一步加工为肠溶(enteric-coated)制品。用于口服给药的液体药剂液体药剂液体药剂包括允许用于医学应用的乳液、糖浆、酏剂、悬浮液和溶液制品。最近，人造混合氨基酸(类蛋白)的聚合体的微球体已经用于递送药物(美国专利No.4,925,673)。而且，在美国专利No.5,879,681和美国专利No.5,871,753中描述的载体化合物被用于口服递送本领域中已知的生物活性剂。
透皮制剂和给药
对于透皮给药，至少一种EPO模拟铰链核心模拟抗体或者其他EPO受体激动剂或者特定部分或者变体被封装在递送装置中例如脂质体或者聚合物纳米颗粒、微粒、微胶囊或者微球体(除非另有说明，被统称为微粒)。许多适当的装置是已知的，其包括合成聚合物制成的微粒例如聚羟基酸例如聚乳酸、聚羟基乙酸和其共聚物、聚原酸酯、聚酐、和聚磷腈、和天然的天然聚合物例如胶原、聚氨基酸、白蛋白及其他蛋白质、藻酸盐及其他多糖和其组合(美国专利Nos.5,814,599)。
延长给药和制剂
有时，期望将本发明的化合物通过单次给药而长时间递送到对象，例如持续一周到一年。可以利用各种缓释、贮库(depot)或插入剂型。例如剂型可以包含在体内具有低溶解度的化合物的药物上可以接受的无毒盐，例如(a)与多元酸的酸加成盐例如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、鞣酸、双羟萘酸、藻酸、聚谷氨酸、萘单或者二磺酸、多聚半乳糖醛酸等；(b)具有多价金属阳离子的盐例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等，或者与具有有机阳离子的由例如N，N’-二苄基-乙二胺或者乙二胺形成的盐；或者(c)(a)和(b)的组合例如丹宁酸锌盐。另外，本发明的化合物优选相对不溶性盐例如刚描述的那些可以被配制在适于注射的凝胶中，例如具有例如芝麻油的单硬脂酸铝凝胶。特别优选的盐是锌盐、丹宁酸锌盐、双羟萘酸盐等。另一个用于注射的缓释储存制剂将包含封装在缓慢降解、无毒、非抗原性聚合物中的化合物或者分散的盐，例如聚乳酸/聚羟基乙酸聚合物例如在美国专利No.3,773,919中所描述的。化合物或者优选相对不溶性盐例如上面描述的那些还可以被配置在胆固醇基质硅橡胶小球中，特别是用于动物中。其他缓释、储存或者插入制剂例如气体或者液体脂质体是文献中已知的。(美国专利Nos.5,770,222和“Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems”，J.R.Robinson ed.，Marcel Dekker，Inc.，N.Y.，1978)。
已经整体上对本发明进行了描述，通过参考下面的实施例也能够容易对本发明进行理解，其中实施例是通过说明的方式提供的，并不是为了限制。
实施例1：在哺乳动物细胞中克隆和表达EPO模拟铰链核心模拟抗体或者其他EPO受体激动剂
典型的哺乳动物表达载体包含至少一种启动子元件，其介导mRNA、EPO模拟铰链核心模拟抗体或者其他EPO受体激动剂或者特定部分或者变体编码序列的转录起始，以及转录子的转录和聚腺苷酸化终止所需的信号。其他元件包括增强子、Kozak序列和内含子序列，其两侧带有用于RNA剪接的供体和受体位点。可以使用来自SV40的早期和晚期启动子，来自反转录病毒例如RSV、HTLVI、HIVI的长末端重复(LTRS)，以及细胞巨化病毒(CMV)的早期启动子来达到高效转录。然而，也可以使用细胞元件(例如，人肌动蛋白启动子)。用于实施本发明的适当表达载体包括例如载体如pIRES1neo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN或pLNCX(Clonetech Labs，Palo Alto，CA)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC 67109)。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela 293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、Cos 1、Cos 7和CV 1、鹌鹑(quail)QC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
或者，可以在含有整合到基因组的基因的稳定细胞系中表达基因。共转染选择标记例如dhfr、gpt、新霉素或潮霉素能够鉴定和分离被转染的细胞。
还可以对被转染的基因进行扩增仪表达大量的所编码的EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记可以用于产生携带几百个或者甚至几千个基因拷贝的细胞系。另一种可以使用的选择标记是酶谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy，等人，Biochem.J.227：277-279(1991)；Bebbington，等人，Bio/Technology 10：169-175(1992))。使用这些标记，哺乳动物细胞可以生长在选择培养基中，并选择具有最高抗性的细胞。这些细胞含有整合到染色体的经扩增的基因。中国仓鼠卵巢(CHO)和NSO细胞通常用于生产EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体。
表达载体pC1和pC4含有劳氏肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen，等人，Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985))加上CMV-增强子的片段(Boshart，等人，Cell 41：521-530(1985))。多克隆位点例如具有限制性酶切割位点BamHI、XbaI和Asp718辅助克隆感兴趣的基因。除了3’内含子外，载体还含有多聚腺苷酸化信号和大鼠前胰岛素原基因的终止信号。
在CHO细胞中克隆和表达
载体pC4用于表达EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr(ATCC索取号No.37146)的衍生物。该质粒含有小鼠DHFR基因，其受到SV40早期启动子的控制。可以通过在选择培养基(例如，α-MEM，Life Technologies，Gaithersburg，MD)中培养细胞而选择被转染这些质粒的中国仓鼠卵巢细胞或缺少二氢叶酸活性的其他细胞，其中所述选择培养基中补充了化疗药物甲氨蝶呤。细胞中扩增对甲氨蝶呤(MTX)有抗性的DHFR基因已经被充分证明(参见例如F.W.Alt，等人，J.Biol.Chem.253：1357-1370(1978)；J.L.Hamlin and C.Ma，Biochem.et Biophys.Acta1097：107-143(1990)；和M.J.Page and M.A.Sydenham，Biotechnology9：64-68(1991))。在不断提高浓度的MTX中培养细胞产生了对药物的抗性，其通过过表达靶酶DHFR，作为扩增DHFR基因的结果。如果将第二基因连接到DHFR基因，则通常会共扩增和过表达。本领域中已知该方法可以用于产生细胞系，其携带超过1,000个扩增基因的拷贝。这样，当撤走氨甲喋呤时，所获得的细胞系含有整合到宿主细胞的一个或者多个染色体中的扩增的基因。
质粒pC4含有用于表达感兴趣基因的劳氏肉瘤病毒长末端重复(LTR)的强启动子(Cullen，等人，Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985))加上从人细胞巨化病毒(CMV)直接早期基因的增强子分离的片段(CMV)(Boshart，等人，Cell 41：521-530(1985))。启动子的下游是BamHI、XbaI和Asp718限制性酶切位点，其允许基因的整合。在这些克隆位点的后面，质粒含有3′内含子和大鼠前胰岛素原基因的多聚腺苷酸化位点。还可以使用其他高效启动子进行表达例如，人b-肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或来自其他反转录病毒例如HIV和HTLVI的长末端重复。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表达系统或类似的系统可以用于以调控的方式在哺乳动物细胞中表达(M.Gossen和H.Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(1992))。对于mRNA，还可以使用其他信号的多聚腺苷酸化，例如来自人生长激素或球蛋白基因。也可也在与选择标记例如gpt、G418或潮霉素共转染后对携带整合到染色中的感兴趣基因的稳定细胞系进行选择。有利的是，在一开始使用多种选择标记，例如G418加氨甲喋呤。
使用限制性酶消化质粒pC4，接着使用牛肠内磷酸酶通过本领域已知的程序进行去磷酸化。接着从1％的琼脂糖凝胶分离载体。
根据已知的步骤，使用编码完整EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂或特定部分或变体的DNA序列，其对应本发明EPO模拟铰链核心模拟抗体或其他EPO受体激动剂的HC和LC可变区。在该构建体(construct)中还使用编码适当人恒定区(即HC和LC区)的分离的核酸。
接着使用T4 DNA连接酶连接分离的编码可变区和恒定区的DNA以及去磷酸化的载体。接着转化大肠杆菌(E.coli)HB101或XL-1 Blue细胞，并使用例如限制性酶分析鉴定含有插入到质粒pC4中的片段的细菌。
使用缺少活性DHFR基因的人仓鼠卵巢(CHO)细胞用于转染。使用阳离子脂质体(lipofectin)，将5μg表达质粒pC4与0.5μg质粒pSV2-neo共转染。质粒pSV2neo含有主导的选择标记，来自Tn5的neo基因，其编码一种酶提供了对一组包括G418的抗生素的抗性。浆细胞接种在补充1μg/ml G418的α-MEM中。2天后，使用胰蛋白酶处理细胞，并接种在杂交瘤克隆平板中(Greiner，Germany)在补充10、25或50ng/ml甲氨蝶呤加1μg/ml G418的α-MEM中。在大约10～14天后，对单克隆进行胰蛋白酶处理，并借着接种在6-孔皮氏培养皿(petri dish)中或10ml培养瓶中，其使用不同浓度的甲氨蝶呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)。接着将在最高浓度甲氨蝶呤下生长的克隆转移到新的6孔平板中，其含有更高浓度的甲氨蝶呤(1mM、2mM、5mM、10mM、20mM)。重复相同的程序，直到获得了在100～200mM浓度下生长的细胞。对期望基因产物的表达进行分析，例如通过SDS-PAGEand Western印迹或反向HPLC分析。
实施例2：本发明EPO模拟铰链核心模拟抗体的非限制性例子
背景：EMP-1(EPO模拟肽-1)是20氨基酸的肽，其与人促红细胞生成素(HuEPO)没有序列同源性，但具有激活EPO受体的能力(作为二聚体)(Wrighton等人，1996，Science，vol.273，458-463)。然而具有相对低活性(HuEPO的1/10,000～1/100,000)以及短半衰期(离体(ex-vivo)半衰期为在50％血清中8小时，体内半衰期未知)破坏了其作为治疗剂的实用性。因此，需要一种方法为该肽提供较长的半衰期，而不会破坏并且可能还会改善其效力。为此，已经进行了许多常识以提高EMP-1的活性，其通过稳定肽的二句话，或者通过将肽掺入到较大的结构中以提高半衰期。Wrighten等人.(1997，Nature Biotechnology，vol.15，1261-65)将生物素标记的EMP-1与链霉素结合以稳定二聚化。它们观察到在体外细胞增殖检验中活性提高了100倍。他们还是用抗生物素抗体来稳定肽二聚体，然而仅观察到活性提高了10倍。该作者制备了EMP-1的化学限定二聚体形式。在该情况中，体内观察到活性提高了100倍。另一组寻求通过共价连接聚乙二醇(PEG)而改善EMP-1的活性(PEG)(Johnson等人，1997，Chem.& Bio.，vol.4(12)，939-50)。它们报道能力提高了最高达到1000倍，然而该构建体被发现在小鼠中是免疫原性的(抗体针对该肽)(Dana Johnson，Personal communications).Kuai等人.(2000，J.肽Res.，vol.56，59-62)将EMP-1肽插入到血纤维蛋白溶酶原，激活剂抑制剂-1(PAI-1)的序列中。被认为，将EMP-1插入到该框架中会稳定二聚体并且提高半衰期。在体内检验中，该构建体的能力被观察到比单独EMP-1显著地高，例如超过2500倍。需要注意，在这些研究中使用不同的体外检验和体内模型，并且所报道的能力不能相互比较，或者比不上本文所提供的结果。
实施例3：本发明的EPO模拟铰链核心模拟抗体
本发明的具体非限制性例子是EMP-铰链核心模拟抗体构建体，其中V是第一天然存在的HC或LC抗体的多个N-末端氨基酸，P是单拷贝的生物活性EMP-1肽，L是Gly-Ser或Gly-Gly-Gly-Ser柔性接头的串联重复，H是铰链核心区，CH2 & CH3是IgG1或IgG4同种型亚类的。认为该结构能够约束EMP-1肽，但允许充分的柔性，以便肽作为组装均二聚体一部分的二聚化被稳定化。作为这一点的支持，在体外细胞增殖检验中EMP-铰链核心模拟抗体的活性是EMP-1肽的500倍，并且基本上与重组HuEPO(rHuEPO)相似。此外，预料到该构建体的半衰期是rHuEPO或单独EMP-1肽的几倍，与IgG类似。一致的是，与使用rHuEPO处理的小鼠相比，在提供相同的活性单位时，使用EMP-铰链核心模拟抗体处理的正常小鼠获得了显著高的最大血细胞密度，并且高水平维持了更长的时间。该结构能有效地从细胞分泌，并且似乎被正确折叠；这克服了与第一代模拟抗体相关的问题。
除了上述的基本结构外，对具有可能有利生物学特征的变体进行描述。这些包括具有自联合倾向降低、降低效应子功能或降低免疫原性的倾向的构建体。预计了其他提供期望特征的修饰，例如改善的生活活性肽的构型，以及转运通过血脑屏障。所提出的这些变体和修饰可以以任何方式组合以产生具有期望活性的构建体。
使用重组DNA法，将EMP-1肽插入到免疫球蛋白信号肽和人J序列之间的中间载体中。这是使用互补的合成寡核甘酸进行的，其末端与载体中出现的限制性位点兼容。这些寡核苷酸包括信号肽酶共有位点(QIQ)的编码序列，EMP-1肽(SEQ ID NO：2)，和GS或GGGS构成的柔性接头。接着将含有上述功能元件的限制性片段转入到表达载体内。该载体含有抗-CD4免疫球蛋白启动子和增强子，以及人IgG1铰链核心序列的编码序列，一部分IgG1铰链核心区，CPPCP(SEQ IDNO：66的109-113，如图36C所示)，HC恒定区2(CH2)恒定区3(CH3)以及在细菌中质粒复制和选择以及用于在哺乳动物细胞中选择稳定表达所必要的元件。
将该质粒线性化，并通过电穿孔引入到NSO小鼠骨髓瘤细胞系中。选择抗性细胞，并通过对培养物上清进行ELISA检验而鉴定EMP-铰链核心模拟抗体的高表达。通过标准的蛋白质A亲和层析完成从细胞培养物上清纯化构建体。在变性和还原条件下将纯化的产物通过含有SDS聚丙烯酰胺凝胶确认了所纯化产物的期望大小。通过质谱和N-末端测序确认所纯化蛋白质的身份。
下面显示了EMP-铰链核心模拟抗体的氨基酸序列。功能结构域是上面所注解的肽编码序列。三个氨基酸信号肽共有序列对应天然存在免疫球蛋白的最先3个氨基酸。这些氨基酸被认为有助于有效地在内质网中被信号肽酶除去信号肽。该序列之后立即是EMP-1编码序列。EMP-1序列的两个C-末端氨基酸与接下来的6个氨基酸形成特征为Gly-Gly-Gly-Ser重复的柔性接头。之后是人结合(J)区序列。认为J序列会提供更高的柔性以允许EMP-1二聚体呈现正确的构型，并允许二聚体从免疫球蛋白的球状结构突出并探入到两个EPO之间的凹陷(cleft)内。在构建体中还包括HC铰链区，其直接在J区之后。在IgG1铰链区(高亮的)中存在3个半胱氨酸。第一个会与免疫球蛋白轻链(LC)正常配对，另外两个参与两个HC之间的链内键。序列的其余部分是CH2 & CH3区，其构成了蛋白质的本体(bulk)。免疫球蛋白被认为具有长血清半衰期的原因之一是他们结合FcRn的能力，其通过将胞饮的免疫球蛋白返回到细胞外空间而延长了血清半衰期。FcRn的结合位点与CH2和CH3区的的结合处重叠(Sheilds等人，2001，J.Biol.Chem.，vol.276(9)，6591-6604)。
EMP-铰链核心模拟抗体的肽序列，其显示了重要的功能结构域。
  V    EMP-1肽    接头铰链 IgG1 CH2
1 QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GS    CPPCP APELLGGP
  IgG1 CH2-----------------------------------------------------
61SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
                   ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~IgG1CH3
     122TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL
                                    IgG1 CH3
183TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
                         IgG1 CH3
241               QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK         (SEQ ID NO：82)
 V    EMP-1肽    接头铰链 IgG1 CH2
1 QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GGGS  CPPCP APELLGGP
  IgG1 CH2-----------------------------------------------------
61SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
                  ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~IgG1CH3
     122TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL
                                   IgG1 CH3
183TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
                           IgG1 CH3
241                 QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK    (SEQ ID NO：83)
V    EMP-1肽    接头铰链 IgG1 CH2
1 QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GSGGGS CPPCP APELLGGP
  IgG1 CH2-----------------------------------------------------
61SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
                   ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~    IgG1 CH3
     122TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL
                                   IgG1 CH3
183TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
                         IgG1 CH3
241              QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK          (SEQ ID NO：84)
 V    EMP-1肽    接头铰链 IgG1 CH2
1 QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GS    CPPCP APEAAGGP
  IgG1 CH2------------------------------------------------------
61SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
                   ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~    IgG1 CH3
     122TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL
                                    IgG1 CH3
183TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
                         IgG1 CH3
241              QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK         (SEQ ID NO：85)
V    EMP-1肽    接头铰链 IgG1 CH2
1 QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GGGS    CPPCP APEAAGGP
  IgG1 CH2-----------------------------------------------------
61SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
                   ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~    IgG1 CH3
     122TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL
                                    IgG1 CH3
    183TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
                             IgG1 CH3
    241               QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK        (SEQ ID NO：86)
      V    EMP-1肽    接头铰链 IgG4 CH2
    1 QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GS    CPPCP APEFLGGP
                         IgG 4 CH2---------------------------------------
    61 SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS
                        ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~    IgG4 CH3
    121 TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM
                                    IgG4 CH3
183 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ
                             IgG4 CH3
241           EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK         (SEQ ID NO：87)
       V   EMP-1肽    接头铰链 IgG4 CH2
     1 QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GS    CPPCP APEAAGGP
                           IgG 4 CH2---------------------------------------
     61 SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS
                         ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~    IgG4 CH3
     121 TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM
                                         IgG4 CH3
183 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ
                              IgG4 CH3
241           EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK          (SEQ ID NO：88)
       V  EMP-1 肽    接头铰链 IgG4 CH2
     1 QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GGGS    CPPCP APEAAGGP
                           IgG4 CH2------------------------------------
     61 SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS
                         ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~    IgG4 CH3
     121 TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM
                                          IgG4 CH3
183 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ
                           IgG4 CH3
241  EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK         (SEQ ID NO：89)
公知两条IgG重链在细胞代谢处理的过程中通过半胱氨酸之间的二硫键被组合在一起以形成同源二聚体，其中所述半胱氨酸位于绞链区。预计这也会发生在经修饰的肽之间以形成组装EMP-铰链核心模拟抗体构造体。另外，预计EMP-1肽中两个半胱氨酸之间的链内二硫键也会形成。预期的EMP-铰链核心模拟抗体结构包含两个EMP-1肽。N-末端的肽空间排列空间排列连同邻接序列邻接柔性将允许肽形成生物活性二聚体。
首先在体外生物活性检验中测试EMP-铰链核心模拟抗体的活性。对于该检验，使用来自患有急性成巨核细胞白细胞患者的EPO依赖性UT-7/EPO细胞系(Komatsu等人，1993，Blood，Vol.82(2)，456-464)。在从补充rHuEPO的培养基撤回后48～72小时，这些细胞经历程序式细胞死亡。如果使用rHuEPO或EPOR激动剂处理，则已经在不存在rHuEPO时进行孵育24小时的细胞能够存活。将EMP-铰链核心模拟抗体加入到不使用rHuEPO饥饿的细胞，并在处理后48小时使用四唑化合物MTS(CellTiter 96 Aqueous One Solution，Promega)测定细胞活力，其中MTS被活细胞代谢以产生能够被测量吸光度的产品。典型检验的结果显示EMP-铰链核心模拟抗体的效力在摩尔基础上时EMP-1肽的500倍，是rHuEPO的1/5。此外，使用EMP-铰链核心模拟抗体刺激这些细胞，并通过将细胞裂解液通过聚丙烯酰胺凝胶而观察酪氨酸磷酸化特征。EMP-铰链核心模拟抗体所表现的特征与rHuEPO类似，这说明EMP-铰链核心模拟抗体对这些细胞发挥作用的机制与rHuEPO类似。
在正常小鼠中进行体内研究以比较EMP-铰链核心模拟抗体和rHuEPO的半衰期，并比较它们对红细胞生成的影响。如果小鼠的剂量相同，则EMP-铰链核心模拟抗体提供了较高的最大应答，并且与rHuEPO相比，其应答被延长。
通过ELISA测量rHuEPO和EMP-铰链核心模拟抗体二者的血清浓度。EMP铰链核心模拟抗体的大概半衰期是rHuEPO的至少几倍。
已经显示IgG1较低铰链区中的两个赖氨酸残基(L)L234 & L235突变成丙氨酸(A)会破坏免疫球蛋白介导补体依赖性细胞毒性(CDC)以及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力(Hezereh等人，2001，J.Virol.，vol.75(24)，12161-68)。初步研究已经显示EMP-铰链核心模拟抗体不会介导表达EPO受体的补体裂解。这可能是由于在红细胞类祖细胞(erythriod progenitor)上发现了少数量的受体。此外，正如证据证明的，红细胞类祖细胞的体内扩展显著提高了血球密度，这支持了免疫效应子功能可能的功能无关性。然而，尽管没有观察到效应子功能相关的效果，但仍对将这些突变引入作为预防步骤存在兴趣。
会导致介导免疫效应子功能降低的另一种修饰是出去糖基化附着位点。这可以通过将297位的天冬酰胺(N297)突变成谷氨酰胺(Q)达到这一点。其他的变化可以任选地包括将苏氨酸(T)替换为或者氨基酸以降低或修饰O-糖基化，例如T34或T47替换为A，IgG1亚类的糖基化版本已知是免疫效应子功能差的介导子(Jefferis等人1998，Immol.Rev.，vol.163，50-76)。
优点：上面所描述的新型构建体EMP-铰链核心模拟抗体提供了展示生物活性肽EMP-1的可替换方式。该构建体的活性在rHuEPO的范围内，并且体内半衰期与IgG类似。此外，除了EMP-铰链核心模拟抗体的新特征之外，并结合EMP-铰链核心模拟抗体的新特征，所提出的修饰会增强EMP-铰链核心模拟抗体构建体的实用性。
实施例4：支持缺少铰链的EPO模拟抗体在治疗葡萄糖耐受不良和/或肾病相关贫血中应用的数据
优点：上面所描述的新型构建体EMP-NfusCG1提供了展示生物活性肽EMP-1的可替换方式。该构建体的活性的活性和体内半衰期与IgG类似。此外，除了EMP-NfusCG1的新特征外并结合EMP-NfusCG1的新特征，所提出的修饰增强了EMP-NfusCG 1构建体的实用性。
背景：许多临床研究显示晚期肾病的患者通常会有胰岛素抗性(Mak.，1996；Spaia等人，2000；Tuzcu等人，2004)，这可能引起尿毒症毒素、贫血或继发性甲状旁腺机能亢进(Spaia等人，2000)。有意思的是，在这些患者人群中使用EPO进行治疗已经显示会提高胰岛素抗体，并伴随血液甘油三酯、总胆固醇和LDL水平的提高(Mak.，1996；Spaia等人，2000)。一个研究组暗示胰岛素灵敏度的提高可能会促进EPO自身，而不是矫正贫血(Spaia等人，2000)。
最近，Thomas等人，(2005)公开了一项研究，其中对722名患者筛选糖尿病并发症和他们的EPO水平。在这些患者中，大约23％患有贫血。作者总结针对血红蛋白水平降低的不能产生EPO是患有糖尿病的患者中贫血的共同原因。它们还得出结论缺少EPO产生可能引起糖尿病性肾病。
CNTO 530是一种EPO模拟物，其将EPO-模拟肽(EMP-1)引入到包含抗体Fc部分的结构域中。EMP-1与EPO没有序列同源性，但其与125I-标记的EPO竞争与EPO受体的结合。CNTO 530还会诱导EPO应答细胞的增，并且刺激与EPO相同的胞内磷酸化特征。CNTO 530与亲代分子CNTO 528不同，其中EMP-1肽被嫁接到IgG4框架(而不是IgG1)上。相对于CNTO 528，该框架缺少V-结构域，并且具有显著短的铰链和接头区。CNTO 530的铰链引入了3个在亲代分子中不存在的点突变(Ala/Ala和S228P)。这些改变的各自作用是减少效应子功能可以预见的问题，以及稳定该分子。所得到的分子在啮齿动物和猴子中与CNTO528相比具有显著改善的药物药物动力学和药效。因此，所保持的CNTO 530体内活性提供了与EPO和其他EPO类似物相比性质改善的潜力。
文献的数据暗示利用EPO的干涉会有利于大部分肾功能衰退的糖尿病患者。本文所提供的数据显示长效EPO模拟物例如CNTO 530还可以对肾功能衰退的糖尿病患者有利。然而，CNTO 530具有长半衰期以外的附加性质。一月一次给药CNTO 530将是治疗患有贫血的糖尿病患者的新型方式。
参考文献
Mak RH，等人，J.Pediatrics，129：97-104，1996.
Spaia S，等人，Nephron，84：320-325，2000.
Thomas MC，等人，Arch，Int.Med.，165：466-469，2005.
Tuzcu A，等人，Horm.Metab.Res.，36：716-720，2004.
实施例5：EPO模拟抗体CNTO 530提高db/db小鼠中给药7天后提高葡萄糖耐受
将小鼠(db/db；n＝7)禁食过夜，并测量空腹血糖(FBG)。根据FBG对动物进行任意排列。为小鼠静脉给药CNTO 530(0.3mg/kg)，并在10分钟后，腹膜内提供葡萄糖(0.5mg/g)。在各种时间测量血糖(提供葡萄糖后10、20、30、60、90、120、150、180分钟)。7天后，如上所述重复IPGTT。
图1中所示的数据暗示CNTO 530在研究的第一天对血糖耐受几乎没有影响，但在单次给药后7天具有非常显著的影响。
实施例6.在DIO小鼠中给药7天后，CNTO 530提高葡萄糖耐受。
在DIO(饮食诱导肥胖)小鼠中在给药CNTO 530(0.3mg/kg)之后重复实施例1中所描述的实验。该鼠模型被认为是人类疾病非常好的代表，因为这些小鼠在喂养高脂肪饮食后变成了糖尿病(Purina TestDiet#58126，包括60.9％千卡脂肪和20.8％千卡糖类)。正如在实施例1中所描述的，在给药时和给药7天后，进行IPGTT。IPGTT过程中的时间点为葡萄糖活化(challenge)后15、30、60、90、120、150、和180分钟。在第7天，完成IPGTT后，处死小鼠，并通过心脏穿刺收集全血(在EDTA中)进行血液学研究。图2显示给药后7天，CNTO 530提高了葡萄糖耐受，而不是在给药后立刻(10分钟)。图3说明使用CNTO530处理的小鼠相对于对照动物具有高水平血红蛋白。
详细描述：
实施例7单次给药CNTO 530在给药后7、14、21和28天提高了葡萄糖耐受
将小鼠(DIO；n＝7)禁食过夜，并测量空腹血糖(FBG)。根据FBG对动物进行任意排列。为小鼠静脉给药CNTO 530(0.3mg/kg)，并在10分钟后，腹膜内提供葡萄糖(0.5mg/g)。在各种时间测量血糖(提供葡萄糖后10、20、30、60、90、120、150、180分钟)。在起始单次给药后7、14、21和28天重复IPGTT。在IPGTT之后处死，被处理21、28和35天组中的动物，并收集全血进行血液学测量。血液学研究后，将血液离心，并收集血浆进行胰岛素测量。
在使用CNTO 530处理的动物中在14、21和28天后存在相对于对照动物，血糖清除的显著减少(图7)。在处理的动物中21天和28天后(早期未检测到)，血红蛋白水平得到提高。令人感兴趣的是，在处理的动物中21天后，胰岛素水平显著降低。因为在给药21天后，葡萄糖水平低得多，因此胰岛素水平较低也并不惊奇。然而，这说明所观察到的现象是真实的，而不是葡萄糖测量的假象。
实施例8.单次给药EPO在给药后5天提高了葡萄糖耐受
将小鼠(DIO；n＝7)禁食过夜，并测量空腹血糖(FBG)。根据FBG对动物进行任意排列，并静脉给药EPO(0.03，0.1，0.3mg/kg)。在给药后5天进行IPGTT(如上所述)。在IPGTT之后处死动物，并收集全血进行血液学测量。
在被给药0.03和0.3mg/kg EPO的动物中有最轻微葡萄糖耐受的提高(图7)，尽管没有观察到空腹血糖的统计上显著的降低。图8显示血红蛋白未被显著提高，但网织红细胞以剂量依赖性模式被显著提高。实施例9.单次给药Darbepoetin在给药7天后提高了葡萄糖耐受
将小鼠(DIO；n＝7)禁食过夜，并测量空腹血糖(FBG)。根据FBG对动物进行任意排列，并静脉给药darbepoetin(0.01，0.03，0.1mg/kg)。在给药后7天进行IPGTT(如上所述)。在IPGTT之后处死动物，并收集全血进行血液学测量。
在被给药darbe的动物中存在剂量依赖性葡萄糖耐受的提高(图9)，并且观察到空腹血糖的统计学上显著的降低(图10)。图11显示血红蛋白和网织红细胞都被显著提高。
实施例10.转基因小鼠中的IPGTT
将表达人EPO的转基因小鼠(杂合子或纯合子)和C57Bl6小鼠(年龄与转基因小鼠匹配)禁食过夜。第2天早上测量空腹血糖，并腹膜内为小鼠提供葡萄糖(1.0mg/g)。在各种时间测量血糖(提供葡萄糖后10、20和30分钟)。图12显示，相对于对照，转基因小鼠中空腹血糖显著地低。此外，在转基因动物中，在葡萄糖耐受测试过程中，曲线下的面积被显著提高(图13)。
实施例11.单次给药CNTO 530提高胰岛素灵敏度
将小鼠(DIO；n＝7)禁食过夜，并测量空腹血糖(FBG)。根据FBG对动物进行任意排列，并静脉给药CNTO 530(0.3mg/kg)。给药14天后，将小鼠禁食过夜，并收集血液进行葡萄糖和胰岛素测量。为动物腹膜内提供葡萄糖，并在20分钟后收集血液进行葡萄糖和胰岛素测量。
图14显示在禁食之后即刻，以及在葡萄糖活化20分钟后，葡萄糖和胰岛素水平的显著降低。使用HOMA分析，并且所处理的动物显示了HOMA降低10倍以上，这暗示提高了胰岛素灵敏度(图15)。
实施例12.临床数据分析
概述：
GE Healthcare’s Clinical Data Services数据库含有去身份(de-identified)、标准化、纵向(longitudinal)、患者水平电子医学记录数据，其来自在门诊(ambulatory setting)行医的使用GE CentricityEMR系统的大约4,000名美国医生。该数据库含有关于＞4.7M活患者的数据。平均随访时间为大约3年。该数据库含有关于患者人口统计学、医学历史、访问类型、临床观察(包括诊断代码)、实验室测试结果和所处方药物的信息。JNJ已经购买了对该数据库的许可，并对其进行分析以寻找关于被处方EPO用于贫血的患者中的糖尿病参数。
开始的分析工作显示CDS数据库含有总共4,700,156名患者，其中4,331,836名被分类为活跃患者(active patient)。根据下列感兴趣的变量，对人群进一步进行过滤以鉴定具有前EPO测量随后有后EPO测量的患者：
-血糖，禁食
-血红蛋白A1c占总血红蛋白的百分比
-血红蛋白，血液
-血球密度，血液
考虑对具有至少1次前-(最高达到之前60天)和1次后-(最高达到之后6个月)EPO治疗测量的患者进行分析。符合该标准的数目会随着不同变量的数目和时间区域而变化。进行EPO治疗并且HbA1c数值为6.0或更高的患者被认为是糖尿病。
图16显示EPO对患者血红蛋白水平的影响。正如所预料的，血红蛋白水平在开始给药EPO后达到稳定状态之前的3个月内稳定提高。
图17显示EPO对患者HbA1C水平的影响。在给药EPO后的第一个月，HbA1C水平平均降低0.5％，并且在恢复成最初状态之前在随后的两个月内保持低水平。比较图16和17，似乎EPO对HbA1C的影响依赖于其对整体血红蛋白水平的影响，因为图16仅显示在开始给药EPO后的第一个月内血红蛋白的非常微弱的提高。
图18显示在起始EPO给药达到最大值后在恢复到最初状态之前的4各月内，空腹血糖浓度降低了大约30mg.dL。空腹血糖的降低似乎比图17中所显示的HbA1C的降低更持续和持续地更长。
图19显示EPO对作为基线糖尿病严重程度函数的HbA1C水平的影响。在4种基线HbA1C水平上对数据库中的糖尿病人群进行分级：6-7％、7-8％、8-9％和＞9％。该图显示EPO的抗糖尿病效果(定义为HbA1C水平下降的幅度)似乎在最高疾病严重程度的人群(即基线HbA1C＞9％)中最大，其在第一个月中达到了导致大约降低1.69％(10.18％至8.49％)。相反，从较温和的疾病水平开始(即基线HbA1C＝8％-9％和7％-8％)，抗糖尿病效果也是较低，分别为0.84％(8.35％至7.51％)以及0.39％(7.38％至6.99％)。在基线水平最低的人群(6.0％-7.0％)中没有观察到降低。
EMR数据的缺点之一可能是沿着时间过程的观察缺少/不完整。为了确保，我们实际上观察了更长期的糖尿病中的治疗效果，我们进一步分析了数据库以仅分离那些被EPO治疗的病人，其在开始EPO给药之前2各月中具有基线HbA1C数值，并且其在后续时间段中具有HbA1C数值(1-3个月和4～6个月)。使用该纵向数据组获得的结果确认了图19中所观察到的结果。对于基线HBA1C数值＞8，在EPO给药后的最初3个月内，HbA1C下降幅度为0.95％(9.41％至8.46％)。在后面的3个月内，效果达到平稳，而没有观察到进一步的下降。在较低基线HbA1C数值(7-8％)时，最初3个月内下降的量为0.46％(7.47％至7.01％)，随后在后面的3各月内没有显著的进一步变化。
重复使用纵向患者的分析在起始EPO给药后的空腹血糖数据。图21显示对基线水平高于或低于126mg/dL(根据American DiabetesAssociation(ADA)的建议，基线空腹血糖水平126mg/dL用作诊断糖尿病患者的标准)的患者的空腹血糖水平的影响。结果显示对于糖尿病患者(FBG＞126mg/dL)，空腹血糖数值整个时间过程中稳定的降低为平均28mg/dL(173mg/dL至145mg/dL)。基线数值低于126mg/dL的患者没有显示任何PBG水平的降低。而是，在时间过程的最后显示出等于5mg/dL(102mg/dL至107mg/dL)的稍稍提高。
所提供的数据暗示能够使用EPO受体激动剂治疗糖尿病患者以提高他们的空腹血糖和胰岛素灵敏度。图7和8以及图16～18中所显示的数据暗示血红蛋白的提高可能不是必须的，以提高葡萄糖耐受，这暗示可能使用低剂量的ERA来治疗糖尿病而不提高血红蛋白水平。这是重要的，因为已知ERA会在显著提高血红蛋白的水平上提高血栓的风险。临床数据也暗示这是可能的。临床数据显示能够允许最轻微提高血红蛋白(＜1％)的EPO剂量会显著提高空腹血糖和HbA1c。
优点：使用ERA作为治疗剂治疗糖尿病患者中的葡萄糖耐受能够提供许多优点。
·该治疗可以提供新型的作用机理用于治疗糖尿病。
·该治疗会引起双重治疗贫血和糖尿病。
·由于胰岛素灵敏度的提高，ERA还可能达到脂类的提高(HDL，LDL，TG)。
·对高血糖正的持续效果可能导致HbA1c的显著提高，以及糖尿病患者中胰岛b细胞损失的延迟。
目前对II型糖尿病的治疗需要至少每日给药。使用ERA治疗该患者人群可以允许较低频率的给药，因此提高了顺从性(compliance)。
使用半衰期长的EPO受体激动剂例如CNTO 530作为治疗剂治疗肾病患者中的贫血和葡萄糖耐受能够提供许多相对于其他EPO受体激动剂(ERA)的优点。该治疗被认为可以用于双重治疗贫血和糖尿病。与其他ERA相比，半衰期长的EPO受体激动剂如CNTO 530的半衰期可以用于治疗糖尿病肾功能障碍患者中的高血糖症。对高血糖症的持续效果被认为可以用于治疗胰岛β细胞损失，其通过延迟或降低该过程。CNTO 530的长半衰期导致了与其他ERA相比较低频率的给药。CNTO 530与EPO之间同源性的缺少降低了在该患者人员中PRCA的可能性。葡萄糖耐受效果能够使得该患者组对其他糖尿病药物的需求最小化。
清楚的是，可以以与前面说明书和实施例中所特别描述不同的方式实施本发明。
根据上述教导，可以对本发明进行许多修改和变化，因此仍在本发明的范围内。

Claims (18)

1.治疗细胞、组织、器官或动物中葡萄糖耐受不良的方法，所述方法包括将所述细胞、组织、器官或动物与至少一种促红细胞生成素(EPO)受体激动剂接触，或为所述所述细胞、组织、器官或动物给药至少一种促红细胞生成素(EPO)受体激动剂。
2.根据权利要求1的方法，其中所述EPO受体激动剂选自EPO受体激动剂生物剂和EPO受体激动剂小分子化合物。
3.根据权利要求2的方法，其中所述EPO受体激动剂生物剂选自多肽、抗体和抗体融合多肽。
4.根据权利要求3的方法，其中所述多肽是EPO或天然存在的变体。
5.根据权利要求3的方法，其中所述多肽还包含至少一个聚乙二醇分子。
6.根据权利要求3的方法，其中所述多肽是非天然存在的EPO变体。
7.根据权利要求5的方法，其中所述非天然存在的EPO变体是darbepoetin-α。
8.根据权利要求3的方法，其中所述抗体是针对EPO受体或EPO的激动剂抗体。
9.根据权利要求3的方法，其中所述多肽是EPO的功能模拟物。
10.根据权利要求9的方法，其中所述EPO的功能模拟物是选自SEQ ID NOS：1-39的至少一种。
11.根据权利要求3的方法，其中所述多肽是hematide。
12.根据权利要求3的方法，其中所述抗体融合多肽包括重链抗体序列的至少一部分和至少一种EPO受体激动剂多肽。
13.根据权利要求12的方法，其中所述多肽是EPO的功能模拟物。
14.根据权利要求2的方法，其中所述小分子是化学化合物，其为EPO受体激动剂。
15.根据权利要求14的方法，其中所述小分子选自FG-2216和FG-4592。
16.根据权利要求1至15任一项的方法，其中0.001-50mg所述EPO受体激动剂的所述有效量是0.000001-500mg。
17.根据权利要求1至15任一项的方法，其中所述接触或所述给药是通过选自下列的至少一种途径进行的：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内(intracerebroventricular)、大肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速浓注、阴道、直肠、经颊、舌下、鼻内或者透皮途径。
18.根据权利要求1至15任一项的方法，所述方法进一步包括在所述(a)接触或给药之前、同时或之后，给药至少一种包含有效量的至少一种化合物或多肽的组合物，所述至少一种化合物或多肽选自至少一种可检测标记或报告分子、TNF拮抗剂、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、流体或电解质平衡的药物、血液学药物、抗癌药物、免疫调节药物、眼用药物、耳用药物或鼻用药物、局部用药物、营养性药物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
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