CN101787349B - 用于筛选蛋白酶生产菌的培养基的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属微生物领域，具体涉及一种用于筛选蛋白酶生产菌的培养基的制备方法。本发明是这样来实现的：是将一种在水溶液中形成分散体系、不透明的氮源以及其他能在水溶液中溶解的营养成分采用分别灭菌、无菌混合的方法加以制备；本发明所使用的混合温度在50℃-70℃之间，在此温度下混合，琼脂糖溶液尚未凝固，而且其他营养成分中的不可知因素不会与脱脂奶粉发生相互作用，不会导致发生沉淀、变色等不利情况，影响培养基的鉴定效果。
Description
技术领域：
本发明属微生物领域，具体涉及一种用于筛选蛋白酶生产菌的培养基的制备方法。
背景技术：
蛋白酶是催化分解蛋白质肽键的一群酶的总称。它作用于蛋白质，将其分解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸，广泛应用于洗涤剂、食品、制药、制革等行业。
由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。出于对于生产菌复壮的需要，以及随着各种行业对于蛋白酶的需求越来越多样化，因此需要对蛋白酶生产菌加以筛选。
Raja Noor Zaliha Raja Abd Rahman等(J Ind Microbiol Biotechnol(2007)34：509-517)使用脱脂奶粉琼脂糖培养基作为筛选蛋白酶生产菌的培养基。由于脱脂奶粉在溶解后形成不透明的分散体系，该培养基将脱脂奶粉作为一种氮源，微生物分泌蛋白酶后会将脱脂奶粉水解，在培养基上能形成一个明显的透明圈，透明圈的大小就显示了微生物的产酶能力。
但由于脱脂奶粉的加入，带来了一些灭菌问题：按传统的灭菌方法，难以掌握控制灭菌温度和灭菌时间，灭菌温度稍高或灭菌时间稍长，会造成脱脂奶粉沉淀。灭菌温度稍低或灭菌时间稍短，会造成灭菌不彻底。
发明内容：
本发明的目的是提供一种用于筛选蛋白酶生产菌的培养基的制备方法，解决传统的灭菌方法所带来的脱脂奶粉沉淀或灭菌不彻底的问题。
本发明是这样来实现的：是将一种在水溶液中形成不透明分散体系的氮源以及其他营养成分(能溶于水但不形成不透明分散体系)采用分别灭菌、无菌混合的方法加以制备；所述的氮源具有以下特点：在溶解后形成稳定的乳状分散体系，不透明，可在琼脂的作用下，溶液冷却后能形成不透明乳状固定培养基；在蛋白酶的作用下会水解成透明状，可以用来鉴定细菌的产酶情况。
一般地本发明所述在水溶液中形成不透明分散体系的氮源为脱脂奶粉，采用高压蒸汽灭菌法单独灭菌；其他营养成分的混合液中加入琼脂进行灭菌，琼脂加入量为12-20克/升，而脱脂奶粉的水溶液中不加入琼脂，其他营养成分中的不可知因素不会与脱脂奶粉发生相互作用，导致发生沉淀、变色的不利情况，影响培养基的鉴定效果。
所述的灭菌温度为(115℃-126℃)，优选121℃灭菌，时间为15-20分钟。无菌混合时温度在50℃-70℃之间。分开灭菌、无菌混合后，在无菌条件下倒平板、冷却凝固。
本发明方法克服了现有技术灭菌过程中脱脂奶粉沉淀或灭菌不彻底弊端，具有以下特点：
第一：在高压蒸汽灭菌过程中(高温下)，其他营养成分中的不可知因素不会与脱脂奶粉接触，不会发生相互作用，导致发生沉淀、变色等不利情况，影响培养基的鉴定效果。
第二：灭菌结束后，等培养基冷却后，在无菌环境中将上述两个部分进行混合。
本发明所使用的混合温度在50℃-70℃之间，在此温度下混合，琼脂糖溶液尚未凝固，而且其他营养成分中的不可知因素不会与脱脂奶粉发生相互作用，导致发生沉淀、变色等不利情况，影响培养基的鉴定效果。
具体实施方式：：
以下通过实施实例对本发明作进一步说明，但其并不限制本发明的保护范围。
实施例：
培养基(g/L)配方：蛋白胨，4.0；酵母粉，3.0；脱脂奶粉，12.0；琼脂，18.0；pH＝7.5，
制备过程：取蛋白胨，2g；酵母粉，1.25g；琼脂，9.0g加入250ml自来水，调pH至7.5，置于1L三角瓶中。另取脱脂奶粉6.0g，加250ml自来水，调节pH至7.5，置于1L三角瓶中。将两个三角瓶置于灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件：121℃，20分钟。灭菌结束后，将两个三角瓶置于50℃烘箱3小时左右，在超净工作台中近火焰无菌条件中，将上述两瓶溶液进行混合后立即倒平板，在室温、无菌条件下静置、冷却、凝固后即可得到脱脂奶粉分布均匀，且灭菌彻底的筛选蛋白酶生产菌的培养基平板。将平板置于37℃培养箱中，48小时内不会出现菌落。
对比实施例(一)：
培养基(g/L)配方：蛋白胨，4.0；酵母粉，3.0；脱脂奶粉，12.0；琼脂，18.0；pH＝7.5，
制备过程：取蛋白胨，2g；酵母粉，1.25g；琼脂，9.0g，脱脂奶粉6.0g加入500ml自来水，调pH至7.5，置于1L三角瓶中。将三角瓶置于灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件：115℃，15分钟。
灭菌结束后，将三角瓶置于50℃烘箱3小时左右，在超净工作台中近火焰无菌条件中，将上述溶液倒平板在室温、无菌条件下静置、冷却、凝固后可得到脱脂奶粉分布均匀的筛选蛋白酶生产菌的培养基平板。将平板置于37℃培养箱中，24-48小时内会出现菌落，表明灭菌不彻底。
对比实施例(二)：
培养基(g/L)配方：蛋白胨，4.0；酵母粉，3.0；脱脂奶粉，12.0；琼脂，18.0；pH＝7.5，
制备过程：取蛋白胨，2g；酵母粉，1.25g；琼脂，9.0g，脱脂奶粉6.0g加入500ml自来水，调pH至7.5，置于1L三角瓶中。将三角瓶置于灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件：126℃，15-20分钟。
灭菌结束后，溶液中出现淡黄色絮状沉淀，脱脂奶粉未能在培养基中均匀分散。
Claims (1)
1.一种用于筛选蛋白酶生产菌的培养基的制备方法，其特征是将脱脂奶粉作为氮源，蛋白胨、酵母粉作为营养成分，营养成分的混合液中加入琼脂，琼脂加入量为15-20克/升；氮源与营养成分采用分开灭菌、无菌混合的方法加以制备；灭菌温度为115℃-126℃，灭菌时间为15-20分钟，无菌混合时温度在50℃-70℃之间；分开灭菌、无菌混合后，在无菌条件下倒平板、冷却凝固后即可得到脱脂奶粉分布均匀，且灭菌彻底的筛选蛋白酶生产菌的培养基。
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| 代玉梅，等.沙蚕消化道产蛋白酶菌D2株的筛选及其酶学性质.《中国生物制品杂志》.2007,第20卷(第7期),493－496. * |
| 高卜渝,等.产分泌蛋白酶酵母菌株的筛选.《复旦学报(自然科学版)》.1999,第38卷(第5期),537-539. * |
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