CN101781652B - 一种高温诱导型启动子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高温诱导型启动子。本发明提供的启动子为如下1)或2)或3)的DNA分子：1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明公开了草坪草PenA4的高温诱导型基因的启动子序列。本发明的启动子可被高温诱导表达，能用于植物源的诱导型表达载体，在生物工程中具有很好的应用前景。

Description

一种高温诱导型启动子

技术领域

本发明涉及一种高温诱导型启动子。

背景技术

植物在进化的过程中，具备了适应不同环境的能力。在逆境如高温的胁迫下，植物通过一定的机制，诱发一些基因的表达，这些基因蛋白通过调节细胞的生理生化功能，应对逆境的压力，维持细胞的正常活性。

基因的诱导表达通常与基因的启动子序列有关。许多研究已经证实，基因启动子区域有许多调控基因转录的特殊序列，如TATA盒为RNA聚合酶的结合位点，CAAT盒以及GC盒等也都与基因转录的效率有关，另外还有一些激素的作用元件、转录因子结合区等顺式或反式元件位点等，通过各种作用方式调控基因的转录。

目前，研究逆境下的基因表达调控，是植物分子生物学研究中的热门领域。杜娟以小麦基因组DNA为模板，克隆了逆境诱导表达启动子mwcs120。瞬时表达实验表明，在单子叶和双子叶植物中，mwcs120启动子均受低温和高盐逆境诱导，使GUS基因的表达增强。在高温胁迫研究方面，裴华丽从拟南芥的基因组DNA中扩增出热激蛋白AtHSP70b基因的启动子，并将其与gus基因连接，通过农杆菌转化技术导入烟草中获得再生植株，GUS组织化学法检测证明该启动子在烟草中具有高温诱导表达的能力，但在常温下也有不同程度的表达。文春描从拟南芥中克隆了热激蛋白基因HSP18.2的启动子，并构建了由HSP18.2启动子引导的GUS融合基因，经农杆菌介导导入籼稻愈伤组织中。对热激和常温条件下转基因籼稻愈伤组织中GUS活性的比较测定表明，HSP18.2启动子在热激条件下可驱动GUS报告基因在转基因愈伤组织中高效表达，而常温条件下GUS活性在检测水平以下，证明HSP18.2启动子在籼稻中对基因的调控十分灵敏。伊淑莹从番茄中克隆了LeMTshsp基因上游1915bp的调控区，并构建了该启动子与GUS基因的融合载体，利用农杆菌介导的叶圆盘法转化番茄，GUS组织化学染色结果表明LeMTshsp启动子对热激、低温、外源ABA及重金属胁迫都有应答。

非生物逆境严重影响植物的正常生长发育。近年来，多种抗逆基因被克隆，并转入抗逆性较差的物种，显著提高了作物对非生物逆境的抵抗能力。但是，在植物抗逆基因工程中，多采用组成型强启动子启动抗逆基因过量表达，虽然使转基因植物的抗逆性得以提高，但对植物的一些生理代谢活动却有抑制作用。据Kasuga等报道，组成型启动子CaMV35S启动DREB基因在拟南芥中表达，虽提高了抗逆性，但植株矮化、生长畸形、籽粒数减少；而由诱导型启动子rd29A启动的DREB基因在拟南芥中的表达，不仅提高了植株的抗逆性，而且避免了对生长的负面影响。因此鉴定和克隆诱导型启动子，对于植物抗逆基因工程的研究是必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种高温诱导型启动子。

本发明提供的DNA分子(启动子)，来源于草坪草(品种PenA4)，为如下1)或2)或3)：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％ SDS和1×SSC，0.1％ SDS各洗膜一次。

含有所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为在pCAMBIA 1301的多克隆位点插入所述DNA片段得到重组质粒。所述重组载体具体可为将序列1所示DNA分子插入pCAMBIA 1301的SalI和NcoI酶切识别位点间得到的重组质粒。

扩增所述DNA分子的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述DNA分子可应用于启动目的基因表达。所述启动可受高温诱导。所述高温可为35-45℃，如40℃。所述目的基因具体可为GUS基因。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是在出发植物中用所述DNA分子启动目的基因的表达，得到高温诱导表达所述目的基因的转基因植物。所述出发植物可为水稻，如水稻品种kasalatha。所述高温可为35-45℃，如40℃。所述目的基因具体可为GUS基因；所述方法具体可为将所述重组载体导入所述出发植物，从而得到用所述DNA分子启动GUS基因表达的转基因植物。

本发明公开了草坪草PenA4的高温诱导型基因的启动子(pAS)序列。本发明的启动子可被高温诱导表达，能作为植物源的诱导型表达载体，在生物工程中具有很好的应用前景。

附图说明

图1为启动子(pAS)的发现过程。

图2为启动子和部分基因的序列。

图3为启动子的功能验证。

图4为启动子的高温诱导活性验证。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

草坪草(剪股颖“PenA4”)：购买自“北京中种草业有限公司”，产品目录号为：M65-5-A-4-2。

水稻kasalatha：北京林业大学；参考文献：Lin SY，Sasaki T，Yano M.Mappingquantitative trait loci controlling seed dormancy and heading date in rice，Oryzasativa L.using backcross inbred lines.Theor Appl Genet，1998，96(8)：997-1003。

pCAMBIA 1301：北京林业大学；参考文献：翟文学，李晓兵，田文忠，周永力，潘学彪，曹守云，赵显峰，赵彬，章琦，朱立煌。由农杆菌介导将白叶枯抗性基因Xa2i转入我国的5个水稻品种。中国科学(C辑)，2000，30(2)：200-206。

农杆菌LBA4404：北京林业大学；参考文献：闫双勇，智庆文，刘欣洁，张红伟，谭振波，李仕贵。水稻T-DNA插入突变体库的构建及突变类型的分析。遗传学报，2004，31(12)：1388-1394。

实施例1、启动子(pAS)的发现

提取草坪草(品种PenA4)的基因组DNA，利用限制性内切酶PSTI酶切半小时，然后97℃高温处理以终止反应，获得部分酶切的基因组片段。

设计PSTI酶切位点的接头(#96：5’-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3’和#97：3’-CATCTGACGCATGT-5’)并与部分酶切的基因组片段连接。

设计特异引物(U1：5’-CGTGCAAGGAAGCAGAAGGCG-3’)。利用引物组合U1和#96扩增上述连接产物，将片段回收、克隆后进行DNA测序，获得一个775bp的DNA片段U1。进一步在片段U1的5’端设计特异引物U2(5’-ACGGATGGGCATATATCACG-3’)，利用引物组合U2和#96扩增连接产物，将片段回收、克隆后进行DNA测序，获得一个417bp的DNA片段U2。

将U1和U2的序列进行比对和拼接，对拼接的调控区序列进行分析，鉴定出基因的起始密码子ATG，去除结构基因的部分。获得基因的5’端的调控区序列(U1、U2和5’端的调控区的发现流程见图1，5’端的调控区和部分基因见图2)。

在拼接的启动子序列两端设计特异引物组合：U3F/U3R(U3F：5’-AATCACCGGAGAAGCTCTCG-3’；U3R：5’-TGCAGAGAGGGAAGCTAGCT-3’)。利用PenA4的基因组DNA为模版，利用高保真的TAG酶，用U3F/U3R进行PCR扩增，将PCR产物连接到质粒pMD18-T(宝生物工程有限公司，D103A)上，并进行测序验证。结果表明，PCR产物长度为962bp，如序列表的序列1所示。将序列1所示的核苷酸命名为pAS。其中TATA盒位于-132～-127区，与CAAT盒形似功能的AGGA盒位于-152～-147区。另外有大量的激素调控元件分布于启动子区段，如与ABA相关的DRE2元件“ACCGAC”位于-139区，DPBF-1and-2元件“ACACNNG”位于-438区，MYBRS元件“CANNTG”位于-417等。将pAS与pMD18-T连接得到的重组质粒命名为pMD18-T：pAS。

实施例2、启动子的高温诱导活性验证

一、重组表达载体的构建

1、用限制性内切酶Sal I和Nco I酶切实施例1制备的pMD18-T：pAS，回收酶切产物(pAS)；

2、用限制性内切酶Sal I和Nco I酶切双元载体pCAMBIA 1301，获得去除CaMV35S启动子的pCAMBIA 1301载体骨架；

3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒，进行测序验证，测序结果表明，得到了目的质粒pAS-GUS(用序列1所示的pAS取代pCAMBIA 1301的SalI和Nco I酶切识别位点间的小片段)。

二、转化愈伤组织

将pAS-GUS转化农杆菌菌株LBA4404，在AB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，利福平10mg/L，卡那霉素50mg/L，pH7.4)(Agrobacteriumtumefaciens DNA and Ps8 bacteriophage DNA not detected in crown gall tumors。PNAs，1974，71：3672-3676)上培养两天后，将获得的转化克隆在NB/AS培养基(Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of boundaries of the T-DNA.Plant J.1994，6，271-282)(NB培养基+乙酰丁香酮10-20mg/L)上培养至OD600＝0.2-0.4。将水稻kasalatha的愈伤组织于上述菌液中浸泡30分钟，然后转移至NB/AS培养基上，25℃暗培养2天后，转移至NB/HC培养基(NB培养基+50mg/L潮霉素B+250mg/L cefotaxime，pH5.8)上继代培养2个月。

将pCAMBIA 1301通过农杆菌LBA4404转化水稻kasalatha的愈伤组织，方法同上，得到转空载体对照愈伤组织。

三、启动子的功能验证

启动子的活性检测通过GUS染色实验进行，实验方法如下：将步骤二得到的愈伤组织(转pAS-GUS愈伤组织或转pCAMBIA 1301愈伤组织)切割后放入一个eppendorf管中，加入X-Gluc染色液，37℃培养箱暗处过夜。第二天观察愈伤的染色。染色结果见图3。图3A显示，转pAS-GUS愈伤组织呈现大片的蓝色，显示GUS基因已经大量表达。图3B显示，转pCAMBIA 1301愈伤组织也呈现大片的蓝色，显示GUS基因已经大量表达。结果表明，pAS和CaMV35S启动子一样具有启动基因转录的活性。

四、启动子的高温诱导活性验证

依据GUS基因的序列，设计特异扩增引物GUSP1和GUSP2，利用Actin基因作为待检测基因转录产物的对照。

GUSP1：5′-CTGCGACGCTCACACCGATACC-3′；

GUSP2：5′-TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3′。

ActinF：5’-AGCAACTGGGATGATATGGA-3’；

ActinR：5’-CAGGGCGATGTAGGAAAGC-3’。

将步骤二得到的愈伤组织(转pAS-GUS愈伤组织或转pCAMBIA 1301愈伤组织)各分为两份，分别于常温(20℃)和高温(40℃)下处理1小时。分别提取总RNA，并逆转录生成cDNA。利用上述引物对不同温度处理下的cDNA样品进行real time-PCR检测(ABI PRISM 5700 Sequence Detector)。以转pCAMBIA 1301愈伤组织在20℃下处理1小时的GUS基因表达量为1，将两种愈伤组织在不同温度下GUS基因的表达量绘制柱形图，见图4。结果显示：在常温下的转pAS-GUS愈伤组织，GUS基因的表达量很少(相对表达量为0.15)，而高温处理后的转化愈伤组织有大量的GUS基因转录产物(相对表达量为1.11)，差异量达到近10倍；在常温下的转pCAMBIA 1301愈伤组织，GUS基因的表达相对量为1.04，而高温处理后的转化愈伤组织，GUS基因的表达相对量为1.09，均与高温处理后的转pAS-GUS愈伤组织的GUS基因表达量相仿，差异量不显著。结果表明，pAS具有高温诱导特征。

实施例2的实验重复进行三次，都得到的同样的结果。

序列表

<110>北京林业大学

<120>一种高温诱导型启动子

<130>CCGNARY102090

<160>1

<210>1

<211>962

<212>DNA

<213>草坪草PenA4

<400>1

aatcacggag aagctctcgc caccggtgga aagggaaagg catccaggaa catgcttcac     60

actctggctc gatcggttgt catgttattc tcccaccttt ctcgtttctc atactactct    120

acgtgcaact tgatcgacca tcactaaaca agtggatcac ctttcgaatt tcaaattccg    180

tggcatcaaa tcaactgtct cgcgcgcctt tgacattctt ccggtgattt cctgcccctg    240

gcacttgcag taaaaaaatc gcatgaatgg catgctgcag gtaatacgtg aattgccaga    300

cgacccatgc cgcggccatc cacgacgaga acatgcctgc atgctcctag atgtgccgcg    360

tgcaaataat tcattagcag ctgcatcctg atttaatcgt gatatatgcc catccgtcat    420

gcgtcaggtt cacaccctca catggttaat ttatggttct caatcaatcg agaaggccta    480

taattttttc cttccctcac ataagtgcga aattggtggc ctagagctcg tgagtgccat    540

gtgggcatgc agggccaagc ttaatctgcc gattaattgg accctgtcct gtacacacac    600

gcgcacgcac acggccagtt gctgtcgctc atttcgcgca gcgtcgatcc gacgagcacc    660

tgcatgtgcg cccgattcgt atgtgctaac cgccgtcgtg gctcgtcgtg gtcggcggtg    720

ggtcgggata cgcagtcccc acattgcttc tcccgctttt gtcccttttt tctctgccct    780

tccgcaaagt taataacgat tccaacggcc aggagcgctg acgcctcgcc tataagtaca    840

tcgccgggaa cacaactctc ttcacagcca agcaaccatc ggttcctgag caagtcggtc    900

cctttatcta gcaagctaga aagacacaca accacagcag gcagctagct tccctctctg    960

ca                                                                   962

Claims (11)

1.一种DNA分子，为序列表中序列1所示的DNA分子。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pCAMBIA 1301的多克隆位点插入权利要求1所述DNA分子得到重组质粒。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将序列1所示DNA分子插入pCAMBIA 1301的Sal I和Nco I酶切识别位点间得到的重组质粒。

5.权利要求1所述DNA片段在启动目的基因表达中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述启动受高温诱导。

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述目的基因为GUS基因。

8.一种培育转基因植物的方法，是在出发植物中用权利要求1所述DNA分子启动目的基因的表达，得到所述目的基因的表达受高温诱导的转基因植物；所述出发植物为水稻。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述水稻为水稻品种kassalatha；所述高温为35-45℃。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述高温为40℃。

11.如权利要求8或9或10所述的方法，其特征在于：所述目的基因为GUS基因；所述方法为将权利要求4所述重组载体导入所述出发植物，从而得到用权利要求1所述DNA分子启动GUS基因表达的转基因植物。

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