CN101776546A - 一种在有机玻璃上固定蛋白质分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在有机玻璃上固定蛋白质分子的方法。是用丙酮和铬酸液处理后的有机玻璃作为固定蛋白质分子的载体，然后才用于固定蛋白质分子。具体制作步骤是：1)有机玻璃的预处理，2)有机玻璃的处理，3)蛋白质分子的固定和4)蛋白质分子活性判断。本发明为蛋白质芯片的制备提供了新的可塑性强、处理简便、来源容易、经济的载体材料。

Description

一种在有机玻璃上固定蛋白质分子的方法
技术领域
本发明属于蛋白芯片及其制作方法领域。具体是一种在有机玻璃上固定蛋白质分子的方法。
背景技术
蛋白质芯片技术是一种高通量、高灵敏度、微型化、自动化的蛋白质分析技术，可用于蛋白质表达谱分析、抗原抗体筛选、药物靶标筛选、蛋白质与蛋白质相互作用、蛋白与小分子之间的相互作用等许多领域。蛋白质芯片技术都包括样品制备、芯片制作、生物学反应、信号的检测与分析4大技术环节，其中蛋白质芯片的制备是最基础的起始环节，而蛋白质芯片的制作主要在于基片载体的选择和修饰，将靶标分子通过物理吸附或化学方法固定在某种固体基片材料上是制备生物芯片或生物传感器的核心步骤，是制备高质量蛋白质芯片的关键问题。目前制作蛋白芯片的固相支持物即基片载体有多种材料，如玻片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等，但这些材料均需要特殊处理，从而使它们的使用往往受到一定程度的限制，因此寻找一些新的更有效和简便的材料和方法仍然是开发高质量蛋白质芯片的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种在有机玻璃上固定蛋白质分子的方法，它是一种新的基片材料和固定蛋白质分子的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：
一种在有机玻璃上固定蛋白质分子的方法，是用丙酮和铬酸液处理后的有机玻璃作为固定蛋白质分子的载体，然后才用于固定蛋白质分子，具体制作步骤如下：
1)有机玻璃的预处理
将有机玻片切裁至玻璃载玻片大小，先用市售洗洁精清洗，然后浸泡入5g/L碳酸钠、25g/L碳酸氢钠混合溶液清洗，蒸馏水洗干净后置于50℃烘箱内烘干；
2)有机玻璃的处理
(1)烘干后的有机玻璃基片置于丙酮液浸泡作用5秒至15分钟。
(2)用1～5g重铬酸钾加2～20ml蒸馏水，加热溶解，取18～180ml重量百分浓度为98％的浓硫酸，将硫酸缓缓加入，并搅拌配制成新铬酸液，盛于玻璃器皿中，将经步骤(1)处理后的有机玻璃基片在新铬酸液中浸泡0.5～10小时取出，用蒸馏水洗3次，室温干燥。
3)蛋白质分子的固定
(1)用加样器将蛋白质分子在处理好的有机玻璃基片上点样，4℃放置0.5～12小时；
(2)第二天用pH7.4磷酸缓冲液清洗基片3次，滤纸吸干表面水分。
(3)滴加封闭液，如用pH7.4磷酸缓冲液配制10％的脱脂奶粉液，封闭1小时；用pH7.4磷酸缓冲液加0.2％的吐温液清洗3次，最后用pH7.4磷酸缓冲液清洗1次，滤纸吸干表面水分。
4)蛋白质分子活性判断
滴加反应底物进行分子反应，用显色剂或检测仪器分析蛋白质分子与底物的反应性质或状态，从而作出检验检测判断。
本发明的主要特点是：使用一种廉价、来源广泛易得到的材料有机玻璃作为蛋白质芯片制备中关键的基片载体，这种材料只需要经过简单的处理就具有固定蛋白质分子，并保持蛋白质分子生物活性的特点；这种新的制备生物芯片的材料与传统的材料如玻片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等相比，除了具有上述所说的廉价、来源易得到外，还具有柔性和可塑性强可以通过切割、粘合、溶化等加工加工手段很方便的将其加工成不同形状和结构。有机玻璃的这些特性不仅对制备蛋白质芯片而且对设计和研制各种生物传感器或各种微型生物反应室、实验室都是一种不可多得的独特的材料，从而为蛋白质芯片的制备和其他新的检测方法的开发提供新的更有效的材料。
具体实施方式
本发明以有机玻璃作为制作生物芯片的基片载体材料来固定蛋白质分子。有机玻璃经过预处理后，用丙酮以及铬酸液处理后，即可用于固定蛋白质分子，并保持蛋白质分子的活性，从而可以完成各种生物反应，达到检测分析的目的。
下面结合实施例对本发明方法作进一步描述。但需要说明的是，实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。
实施例1
在有机玻璃上固定蛋白质分子的方法步骤如下：
(1)有机玻璃的预处理
将有机玻片切裁至玻璃载玻片大小，先用市售洗洁精清洗，然后浸泡入5g/L碳酸钠、25g/L碳酸氢钠混合溶液清洗，蒸馏水洗干净后置于50℃烘箱内烘干。
(2)有机玻璃的处理
烘干后的有机玻璃基片置于丙酮中浸泡作用3分钟。再置于新配制的铬酸液(5g重铬酸钾加10ml蒸馏水，加热溶解，取90ml浓硫酸，将硫酸缓缓加入，并搅拌，盛于玻璃器皿中)浸泡作用5小时，取出蒸馏水洗3次。室温干燥。
(3)蛋白分子固定及其活性测定
本实例用淀粉酶作为准备固定的蛋白质分子，以淀粉作为反应底物。在上述处理好的有机玻璃基片上贴上打孔的阵列塑料标标签纸，用加样器在有机玻璃基片上点制浓度为10.0g/L淀粉酶液7μL/孔，对照组加等量pH7.4的磷酸缓冲液，4℃放置过夜；用pH7.4的PBS清洗基片3次，滤纸吸干表面水分；每孔滴加10％的脱脂奶粉(溶于pH7.4的PBS)封闭液7μL，封闭1小时；用PBST(在PBS加0.2％的Twen-20)洗涤液清洗3次，最后用PBS清洗1次，滤纸吸干表面水分；每孔滴加0.25％淀粉溶液5μL，置于湿盒内37℃摄氏度下作用。
(4)蛋白质分子活性判断
在上述的操作中，如果如果淀粉酶分子被固定在有机玻璃基片上并有活性的话，滴加的淀粉液中的淀粉将固定在基片上的淀粉酶被分解，加碘液后将不显蓝色。因此可以根据加碘液后样点有无显蓝色以及蓝色的深浅可直观快速的对基片固定蛋白分子的活性作出快速的判断。方法：在湿盒内作用2.0小时后取出有机玻片基片，在样点上滴加稀碘液(碘液作为显色剂，稀碘液配置方法：先配制原碘液：称取碘11克，碘化钾22克，加水溶解，稀释至500毫升得原碘液；稀碘液：取碘原液2毫升，加碘化钾20克，稀释至500毫升，此试剂随配随用)，样点不显蓝色，而对照基片，即没有处理过的有机玻璃基片上的样点呈蓝色。
实施例2
在有机玻璃上固定蛋白质分子的方法步骤如下：
(1)有机玻璃的预处理同例1。
(2)有机玻璃的处理同例1。
(3)蛋白分子固定及其活性测定
本实施例用兔IgG(即兔免疫球蛋白G)作为准备固定的蛋白质分子，以异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG作为反应底物。如果能将兔IgG固定在处理过的有机玻璃基片上，并且固定的兔IgG保持活性，那么则固定的蛋白质分子兔IgG与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG出现结合反应，这种反应的结果可以通过仪器(如GeneTACTM1000芯片扫描仪)来检测标记的荧光素发出的荧光进行判断。
用加样器以阵列方式将浓度为1.0g/L兔IgG(用pH7.4磷酸缓冲液配制)点制到处理过的有机玻璃表面，4℃放置过夜；用pH7.4的PBS清洗基片3次，滤纸吸干表面水分；每孔滴加10％的脱脂奶粉(溶于pH7.4的PBS)封闭液7μL，封闭1小时；再用PBST(在pH7.4磷酸缓冲液加0.2％的吐温-20)洗涤液清洗3次，最后用PBS清洗1次。把羊抗兔IgG-FITC溶液加到蛋白芯片阵列表面(用PBS制成浓度为1mg/L的羊抗兔IgG-FITC溶液)，在室温下作用1小时，用pH7.4的PBST缓冲液清洗有机玻片3次，最后用蒸馏水清洗1次。用GeneTACTM1000芯片扫描仪可检测到有机玻璃基片上样点阵列的荧光。根据扫描的荧光强度数据即可判断有机玻璃上结合的蛋白质分子的量和反应活性。

Claims (1)

1.一种在有机玻璃上固定蛋白质分子的方法，其特征在于，是用丙酮和铬酸液处理后的有机玻璃作为固定蛋白质分子的载体，然后才用于固定蛋白质分子，具体制作步骤如下：
1)有机玻璃的预处理
将有机玻片切裁至玻璃载玻片大小，先用市售洗洁精清洗，然后浸泡入5g/L碳酸钠、25g/L碳酸氢钠混合溶液清洗，蒸馏水洗干净后置于50℃烘箱内烘干；
2)有机玻璃的处理
(1)烘干后的有机玻璃基片置于丙酮液浸泡作用5秒至15分钟；
(2)用1～5g重铬酸钾加2～20ml蒸馏水，加热溶解，取18～180ml重量百分浓度为98％的浓硫酸，将硫酸缓缓加入，并搅拌配制成新铬酸液，盛于玻璃器皿中，将经步骤(1)处理后的有机玻璃基片在铬酸液中浸泡0.5～10小时取出，用蒸馏水洗3次，室温干燥；
3)蛋白质分子的固定
(1)用加样器将蛋白质分子在处理好的有机玻璃基片上点样，4℃放置0.5～12小时；
(2)第二天用pH7.4磷酸缓冲液清洗基片3次，滤纸吸干表面水分；
(3)滴加封闭液，如用pH7.4磷酸缓冲液配制10％的脱脂奶粉液，封闭1小时；用pH7.4的磷酸缓冲液加0.2％的吐温液清洗3次，最后用pH7.4的磷酸缓冲液清洗1次，滤纸吸干表面水分；
4)蛋白质分子活性判断
滴加反应底物进行分子反应，用显色剂或检测仪器分析蛋白质分子与底物的反应性质或状态，从而作出检验检测判断。
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