CN101766686A - 一种治疗脑卒中的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
一种治疗脑卒中的药物组合物及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种治疗脑卒中的药物组合物，它是由下述重量配比的原料药制备而成：黄芪总皂苷1-50份、丹参醇提物1-50份、川芎油0.5-30份。本发明还提供了由黄芪总皂苷、丹参醇提取物、川芎油为活性成份配伍制备而成的药剂。本发明药物采用局灶性脑缺血标准动物模型(MCAO模型)，运用现代组织病理技术、流式细胞技术和分子生物学的方法，观察本发明药物减少脑梗死体积、保护神经细胞、抑制脑缺血后细胞凋亡及阻断梗死缺血区炎性反应的作用。试验证明，本发明药物中三味原料配伍使用，发挥了明显协同增效的作用，药效明确，且质量可控，为临床提供了一种治疗脑卒中的药物新选择。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗脑卒中的药物组合物，属于药物领域。
背景技术
脑血管疾病是当今世界严重危害人类生命健康的主要疾病之一，是我国的常见病、多发病。脑卒中是多种脑血管疾病的严重表现形式，具有极高的致残率和较高的致死率，脑卒中一直是中国人群死亡的主要原因。25～74岁年龄组人群急性脑卒中事件的平均年龄标化发病率男性为270/10万，女性为161/10万，平均年龄标化死亡率男性为89/10万，女性为61/10万，平均年龄标化病死率男性为33％，女性为38％。它不仅严重威胁病人的生命，影响其生活质量，还给家庭和社会带来沉重的负担。目前脑血管疾病的致死率仍然很高，有大约75％的卒中患者会留下神经功能或认知功能异常的后遗症。在脑血管病中，急性缺血性脑血管病约占75％-85％。因此，进一步探索急性脑血管病特别是缺血性脑血管病的有效防治方法十分必要。
人们很早就发现脑梗死伴发炎性反应。早在20世纪50年代，人们就发现动物的缺血损伤区域内有不复流(no re-flow)现象，这种现象的出现与血管内皮细胞水肿和白细胞粘附、浸润密切相关。近年来，随着对脑梗死的深入研究，研究人员提出了脑缺血损伤的病理生理机制新理论——损伤级联反应，即脑缺血后组织损伤的兴奋性毒性、梗死周围去极化、炎症、程序性细胞死亡等机制。根据级联反应的机制有时间选择地采取干预措施，使半暗带向正常组织转化或稳定半暗带，以便赢得进一步治疗时间，这对脑梗死的治疗非常重要。近年来大量的动物实验和临床研究均支持炎性反应参与缺血性脑损伤。不少学者认为，减少炎性细胞在缺血区浸润、聚集，可减轻脑缺血后的炎性反应，进而减少梗死体积和神经的功能缺损。在我国，中医治疗中风有悠久的历史，活血化瘀治疗已被公认治疗缺血性脑卒中有效，然而其作用机理尚不十分清楚。
黄芪为豆科(Leguminosae)植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao和膜荚黄芪A.membranaceus(Fisch.)Bunge的根，产于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地。黄芪甘、微温。归脾、肺经。功效：补气升阳，益卫固表，利水消肿，托疮生肌。黄芪中主要含有甙类、多糖、氨基酸及微量元素等；具有增强机体免疫功能、利尿、抗衰老、保肝、降压作用；能消除实验性肾炎尿蛋白，增强心肌收缩力，还有促雌激素样作用和较广泛的抗菌作用。其中膜荚黄芪皂甙甲具有降压、稳定红细胞膜、提高血浆组织内c-AMP的含量、增强免疫功能、促进再生肝DNA合成等多种作用。黄芪多糖具有提高小鼠应激能力、增强免疫功能、调节血糖含量、保护心血管系统、加速遭受放射线损伤机体的修复等作用。
丹参为唇形科(Labiatae)植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，主产四川、山东、河南、山西等地。苦，微寒。归心、肝经；具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神。主治月经不调，经闭痛经，症瘕积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠；肝脾肿大，心绞痛。具体的药理作用有：(一)心血管系统的作用：①强心：加强心肌收缩力、改善心脏功能，不增加心肌耗氧量；②对血管作用：扩张冠脉，增加心肌血流量；扩张外周血管，血流增加；脑血流量下降；③抗血栓形成：提高纤溶酶活性；延长出、凝血时间；抑制血小板聚集(提高血小板内cAMP水平抑制TXA2合成)；改善血液流变学特性(血粘度降低、红细胞电泳时间缩短)；④改善微循环。(二)促进组织的修复与再生作用：①促进组织的修复与再生，治疗坏死心肌清除快；纤维母细胞分化、胶原纤维形成较明显；肉芽形成比较成熟。局部瘀血减轻、血液循环改善，愈合时间缩短。②抑制过度增生：对过度增生的纤维母细胞有抑制作用。(三)保肝、改善肝微循环。(四)抗菌：丹参中含有隐丹参酮、二氢丹参酮，对体外的葡萄球菌、大肠杆菌、变性杆菌有抑制作用。
川芎：为伞形科(Umbelliferae)植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，主产四川。辛，温。归肝、胆、心包经。功能与主治：活血行气，祛风止痛。用于安抚神经，正头风头痛，症瘕腹痛，胸胁刺痛，跌扑肿痛，头痛，风湿痹痛。其化学成分为：含挥发油、阿魏酸(ferulicacid)，以及4-羟基-3-丁基酽内酯(4-hydroxy-3-butylphthalide)、川芎酽内酯(senkyunolide)、藁本内酯(Li gustilide)、川芎嗪(tetramethylpyrazine)、川芎酚(chuanxiongol)、瑟丹酸(sedanicacid)等。
目前尚无文献报道将黄芪、丹参、川芎的有效部位配合使用治疗脑卒中。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种治疗脑卒中的药物组合物，本发明的另一技术方案是提供了该药物组合物的制备方法和用途。
本发明提供了一种治疗脑卒中的药物组合物，它是由黄芪总皂苷、丹参醇提取物、川芎油为活性组份，配伍制备而成的药剂，其重量配比为：
黄芪总皂苷1-50份、丹参醇提物1-50份、川芎油0.5-30份。
进一步优选地，黄芪总皂苷、丹参醇提取物、川芎油的重量配比为：黄芪总皂苷6-12份、丹参醇提物2.5-5份、川芎油1-3份。
更进一步优选地，黄芪总皂苷、丹参醇提取物、川芎油的重量配比为：黄芪总皂苷6份、丹参醇提物2.5份、川芎油3份。
所述的黄芪总皂苷中总皂苷的重量百分含量，以黄芪甲苷计为40～55％；所述的丹参醇提物中含有丹参总酚酸和丹参总酮，其中，丹参总酚酸中酚酸类成分的重量百分含量，以丹参酚酸B计为55～80％；丹参总酮中含丹参酮IIA的重量百分含量为40～80％；所述的川芎油中藁本内酯的重量百分含量为40～55％。
所述的药剂是片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液或滴丸。
本发明还提供了一种制备所述的药物组合物的方法，它包括如下步骤：
a、黄芪饮片用30～60％乙醇提取，滤液过大孔树脂柱，30～70％乙醇洗脱，回收乙醇，得黄芪总皂苷；
b、丹参醇提物的制备：丹参饮片用8～15倍水加热提取，提取液过大孔树脂柱，50～90％乙醇洗脱，回收乙醇，得丹参总酚酸；药渣用95％～100％乙醇回收提取，回收乙醇，得丹参总酮提取物，将丹参总酚酸和丹参总酮提取物混合，得丹参醇提物；
c、川芎饮片用80％～100％乙醇溶剂浸提，回收溶剂得川芎油；
d、将a、b、c步骤的黄芪总皂苷、丹参醇提取物、川芎油按下述重量配比，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的药剂：黄芪总皂苷1-50份、丹参醇提物1-50份、川芎油0.5-30份。
本发明还提供了该药物组合物在制备治疗脑卒中的药物中的用途。
其中，所述的药物是治疗缺血性脑卒中的药物。
其中，所述的药物是治疗脑梗死的药物。
本发明还提供了所述的药物组合物在制备具有缩小脑梗死体积、保护神经元、对脑缺血损伤保护作用；下调TNF-αmRNA的表达；降低外周血粘附分子CD11a/CD18、CD11b/CD18的表达、下调ICAM-1mRNA的表达；抑制核转录因子NF-κB的转录活性；抑制caspase 3的激活与表达的药物中的用途。
本发明药物采用局灶性脑缺血标准动物模型(MCAO模型)，运用现代组织病理技术、流式细胞技术和分子生物学的方法，观察本发明药物减少脑梗死体积、保护神经细胞、抑制脑缺血后细胞凋亡及阻断梗死缺血区炎性反应的作用。试验证明，本发明药物中三味原料配伍使用，发挥了明显协同增效的作用，药效明确，且质量可控，为临床提供了一种治疗脑卒中药物的新选择。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明的上述基本技术思想前提下，还可以作出其它多种形式的修改、替换和变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明药物的制备：
a、黄芪饮片用30％乙醇提取，滤液过大孔树脂柱，30％乙醇洗脱，回收乙醇，得黄芪总皂苷；
b、丹参醇提物的制备：丹参饮片用8倍水加热提取，提取液过大孔树脂柱(D101)，50％乙醇洗脱，回收乙醇，得丹参总酚酸；药渣用95％乙醇回收提取，回收乙醇，得丹参总酮提取物，将丹参总酚酸和丹参总酮提取物混合，得丹参醇提物；
c、川芎饮片用80％乙醇溶剂浸提，回收溶剂得川芎油；
d、将a、b、c步骤的黄芪总皂苷、丹参醇提取物、川芎油按下述重量配比，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的药剂：黄芪总皂苷1kg、丹参醇提物1kg、川芎油0.5kg，黄芪总皂苷和丹参提取物加适当淀粉、糊精等相关辅料混匀后，制粒，干燥；川芎油用环糊精包埋后，干燥；将上述二者混匀，可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂。
实施例2本发明药物的制备
a、黄芪饮片用60％乙醇提取，滤液过大孔树脂柱，70％乙醇洗脱，回收乙醇，得黄芪总皂苷；
b、丹参醇提物的制备：丹参饮片用15倍水加热提取，提取液过大孔树脂柱，90％乙醇洗脱，回收乙醇，得丹参总酚酸；药渣用无水乙醇回收提取，回收乙醇，得丹参总酮提取物，将丹参总酚酸和丹参总酮提取物混合，得丹参醇提物；
c、川芎饮片用无水乙醇溶剂浸提，回收溶剂得川芎油；
d、将a、b、c步骤的黄芪总皂苷、丹参醇提取物、川芎油按下述重量配比，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的药剂：黄芪总皂苷50kg、丹参醇提物50kg、川芎油30kg，将川芎油、黄芪总皂苷和丹参提取物混溶后，加相关辅料制成滴丸。也可适当的助溶剂将川芎油、黄芪总皂苷和丹参提取物混溶后制成口服液。
实施例3本发明药物的制备
取实施例1制备的黄芪总皂苷6kg、丹参醇提物2.5kg、川芎油3kg，混合，按实施例1的方法制备成片剂。
实施例4本发明药物滴丸的制备
取聚乙二醇4000和聚乙二醇6000(比例为1∶1)，水浴熔融后加入干燥药粉(黄芪总皂苷干粉30g、丹参醇提物干粉25g、川芎油β-环糊精包埋无干粉15g，混合；药物与基质的配比为1∶2)，搅匀，熔融，迅速移至预热至恒温(85℃)的滴丸机储料灌中，以甲基硅油为冷却剂制备滴丸，滴头口径为2.5/5.0mm，冷却温度为10～15℃，滴速为每分钟30滴，滴制，滴完后洗涤，干燥，包装成成品。
实施例5本发明药物的质量控制方法
将实施例1、2制备的黄芪总皂苷、丹参醇提物、川芎油进行质量检测，结果如下：黄芪总皂苷中总皂苷的含量40～55％(以黄芪甲苷计)，丹参提取物中：丹参总酚酸中酚酸类成分的含量55～80％(以丹参酚酸B计)、丹参总酮中丹参总酮的含量50～80％(丹参酮IIA计)，川芎油中藁本内酯的含量40～60％。
制备的颗粒剂的药物质量要求：本品每1g含黄芪甲苷(C41H68O14)不得少于5mg，丹参酮IIA(C19H18O3)不得少于15mg，丹参酚酸B(C36H30O16)不得少于200mg，藁本内酯(C12H14O2)不得少于100mg。
以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。
试验例1本发明药物原料各有效部位配伍筛选试验
采用DPS统计软件进行3因素4水平的正交试验设计方案(见表4)，分别将各提取物混匀后给大鼠给药，参照文献制作MCAO模型。以24h脑梗死体积的为指标对提取物的配伍比例进行优化。结果见下表4：
表4组方配伍比例的三因素5水平
表5正交设计方差分析表(完全随机模型)
| 变异来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | p-值 |
| x(1) | 547.6496 | 3 | 182.5499 | 122.3666 | 0.0001 |
| x(2) | 289.4097 | 3 | 96.4699 | 64.6656 | 0.0001 |
| x(3) | 134.3002 | 3 | 44.7667 | 30.0080 | 0.0001 |
| 模型误差 | 46.5131 | 6 | 7.7522 | 5.1964 | 0.0233 |
| 重复误差 | 47.7385 | 32 | 1.4918 |
表6极差分析结果
由方差分析表，模型误差显著水平＝0.0233＜0.05，有统计学意义。FA＝122.3666、PA＝0.0001＜0.01，FB＝64.6656、PB＝0.0001＜0.01，FC＝30.0080、PB＝0.0001＜0.01。由极差分析，A取水平2，B取水平2，C取水平3，故最优试验方案为A2B2C3。因此，进一步优选地，所述的黄芪总皂苷、丹参醇提取物、川芎油的重量配比为：黄芪总皂苷6份、丹参醇提物2.5份、川芎油3份。
试验例2本发明药物对MCAO模型大鼠神经细胞的保护
1、研究对象
SD雄性健康大鼠，6-8月龄，247只(133只用于脑梗死体积的检测，114只用于其余指标检测)，体重300±20g，均为清洁级动物，检疫合格，由成都中医药大学实验动物中心提供(批号：川动管8)。
2、试剂
戊巴比妥钠，中国医药(集团)上海化学试剂公司，批号：F20020915。
2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC)，北京生化制药厂，批号：20020352。
3、仪器及材料
高速涡轮牙钻机YK-4 北京医疗器械厂
双极电凝器 成都中医药大学药学院自制
Mias-2000图形分析系统 四川大学图像图形研究所
奥林巴斯BX50光学显微镜 日本
数码相机(Kodak，DC240USA) 美国
4、实验药物及给药方法
本发明药物(按实施例3制备)，由成都中医药大学药学院制备。配制成每ml含生药2克的药液备用。
环磷酰胺，上海华联制药有限公司生产，批号：20030124。
治疗组造模前8天开始灌胃，每天一次，中药组每次按临床剂量(1g/Kg)20倍(高剂量组)、10倍(中剂量组)、5倍(低剂量组)灌胃；环磷酰胺组15mg/Kg(给药剂量以体表面积按最小剂量计算，200g大鼠的系数为0.018)灌胃，造模后继续灌胃直至处死动物。模型对照组予生理盐水灌胃。
5、实验方法
5.1动物分组
5.1.1脑梗死体积检测动物分组
将133只大鼠随机分为：
正常组7只；假手术组21只；模型对照组21只；本发明药物高剂量组(20倍)21只；本发明药物中剂量组(10倍)21只；本发明药物低剂量组(5倍)21只；环磷酰胺组21只。
5.1.2相关病理检测动物分组
将114只大鼠随机分为：
正常组6只；假手术组18只；模型组18只；本发明药物高剂量组(20倍)18只；本发明药物中剂量组(10倍)18只；本发明药物低剂量组(5倍)18只；环磷酰胺组18只
5.2MCAO动物造模制作
电凝法闭塞大鼠右侧大脑中动脉制成MCAO模型。
灌胃8天后造模。参照王世忠等电凝法制作MCAO模型(王世忠，刘舒洁，梁玉，等.大鼠局灶性脑缺血模型制作技术的探讨.天津医科大学学报，1999，5(4)：72-73.)。
方法：SD大鼠经2％戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔注射麻醉，大鼠头部右侧卧位固定于鼠板。局部剪毛，常规消毒，于右眼外眦和右耳的中点纵形切开皮肤约1.5cm，沿颞骨缘解开颞肌筋膜，钝性分离颞肌，直至完全暴露颞骨的颞鳞和蝶骨大翼，在颧弓上方颞鳞与蝶骨大翼交界处进行钻孔，随后用血管钳向下方咬骨将孔扩大，做3-5mm2骨窗，以手术刀切开硬膜，暴露大脑中动脉，用微小双极电凝器电凝大脑中动脉(电流4毫安，时间2分钟)使之闭塞。缝合颞肌及皮肤，局部涂抹氧氟沙星。放回笼中饲养，大鼠苏醒后观察神经症状和体征。血管闭塞大鼠苏醒后表现为：(1)提尾时左前肢内收屈曲；(2)爬行时向左侧划圈。凡具有上述2项体征者提示模型成功。脑梗死体积检测造模过程中，共有3只大鼠死亡。模型组一只麻醉过量死亡，中剂量和环磷酰胺组各有一只血管破裂出血死亡。造模后至72小时无大鼠死亡。
5.3观察指标
5.3.1脑梗死体积
5.3.1.1组织标本的采集
分别于造模后24、48、72小时分三批处死大鼠。在处死大鼠时，24小时模型组、本发明药物中剂量组、环磷酰胺组各处死6只，本发明药物高剂量组、低剂量组各处死7只。48、72小时各组均处死大鼠7只。动物用戊巴比妥钠深度麻醉后处死，迅速取出鼠脑，置于-22℃冰箱快速冷冻15min。
5.3.1.2标本的处理
取冠状面均匀切成2mm厚脑片，迅速放入2％红四氮唑(TTC)溶液(37℃)中染色30min，然后用4％甲醛固定。24h后用数码相机(Kodak，DC240USA)拍照，输入计算机，用图像处理软件(Adobe，Photoshop7.0)计算梗死面积(粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死区)，各脑片梗死体积(梗死面积乘以厚度2mm)之和为总的梗死体积。
5.3.2相关病理检测
5.3.2.1标本的采集
分别于造模后24、48、72小时各处死6只大鼠。开颅取大脑右侧半球，称取80毫克额、顶部脑组织，放入经焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonat，DEPC)水处理过的1.5ml eppendorf管，置于-70℃低温保存备用，将其余脑组织入4％多聚甲醛液内固定2小时，脱水、浸蜡、包埋切片。
5.3.2.2组织病理学检查
常规石蜡制片，HE染色。
5.3.2.3尼氏体检测
5.3.2.3.1甲苯胺蓝染色方法显示尼氏体
(1)切片15-20μm，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱苯至蒸馏水洗。
(2)放入经预热至50℃的1％甲苯胺篮(toluidne blue)水溶液中，并在56℃温箱中染20min。
(3)蒸馏水洗。
(4)70％酒精约1min。
(5)95％酒精分化，镜下控制。以尼氏体显示清晰为度。
(6)无水酒精迅速脱水，二甲苯透明，中性塑胶封固。
5.3.2.3.2图像分析
采用Mias-2000高清晰度彩色病理图文报告系统对尼氏体染色结果进行半定量分析，放大倍数为200，检测正常组、伪手术组、模型组、本发明药物不同剂量组、环磷酰胺组在单位视野中尼氏体染色的积分光密度。以每例标本5个表达最强视野(×200)的积分光密度值作为该例的测量值。
5.4统计学处理
数据以Mean±SD表示，采用SPSS11.5统计软件，用One-Way ANOVA方差分析。
结果：
1.组织病理学检查
正常组、假手术大脑神经元细胞层次较多，排列紧密，细胞形态完整。
模型组可见大脑皮层大小不等的液化性坏死区，表现为坏死区内神经细胞消失，部分梗死区边缘可见鬼影细胞。梗死区内有程度不等的炎性细胞浸润。
2.本发明药物对模型大鼠脑梗死体积的影响
表7各时间点各组脑梗死体积变化
#，与模型组相比，P＜0.05；$，与高剂量组相比P＜0.05；●，与中剂量组相比P＜0.05；◆，与低剂量组相比P＜0.05；△，与24H相比，P＜0.05。▲与48H相比，P＜0.05。
由表7可见，本发明药物高、中、低剂量组及环磷酰胺组与模型组比较，24、48、72小时各时点梗死体积明显缩小，P＜0.05，48h、72h脑梗死体积较24h增加，P均＜0.05。本发明药物三个剂量组均能减小脑梗死体积，三组之间有量效关系，P均＜0.05。环磷酰胺组与本发明药物高剂量组疗效相近，P＞0.05。
3.本发明药物对模型大鼠尼氏体的影响
3.1尼氏体光镜
结果显示：正常组、假手术组大脑神经元胞质内可见细胞层次较多，排列紧密，细胞形态完整；可见深蓝色染色的块状或颗粒状尼氏体；模型组大脑神经元胞质内尼氏体部分或全部溶解或消失，随着时间的推移病理损害逐渐加重；本发明药物高剂量、中剂量、低剂量组神经元胞质内尼氏体部分溶解或消失。高剂量组、环磷酰胺组神经元胞质内尼氏体数目较中、低剂量组明显增多，呈颗粒状或块状，染色较均匀；大脑皮层外颗粒层和外锥体细胞层神经元胞质内可见染成深蓝色分布均匀呈块状或颗粒状的尼氏体，与模型组比较，尼氏体结构基本恢复正常。
3.2本发明药物对尼氏体积分光密度的影响
表8尼氏体积分光密度变化
*与正常组、假手术组相比P＜0.05；#，与模型组相比，P＜0.05；$，与高剂量组相比P＜0.05；●，与中剂量组相比P＜0.05；◆，与低剂量组相比P＜0.05；△，与24H相比，P＜0.05。▲与48H相比，P＜0.05。
由表8可见，正常组、假手术组尼氏体积分光密度比较，P＞0.05；模型组尼氏体积分光密度显著降低，与正常组、假手术组比较，P＜0.05。随着梗死时间的延长，尼氏体的积分光密度逐渐降低，48小时、72小时与24小时相比较，P＜0.05。本发明药物高、中、低剂量组、环磷酰胺组与正常组、假手术组比较，尼氏体的积分光密度明显降低，P＜0.05，本发明药物三个剂量组均能增加尼氏体的表达，三组之间有量效关系，P均＜0.05。环磷酰胺组与本发明药物高剂量组疗效相近，P＞0.05。
试验例2本发明药物对MCAO模型大鼠炎性细胞因子的影响
1研究对象
同试验例1
2试剂
TrizolR Reagent 美国Invitrogen公司(Lot 3111)
氯仿(分析纯) 成都化学试剂厂(批号：20020612)
异丙醇(分析纯) 成都化学试剂厂(批号：20021025)
乙醇(分析纯) 成都化学试剂厂(批号：20021206)
乙二胺四乙酸钠 成都化学试剂厂(批号：20030107)
冰醋酸 成都化学试剂厂(批号：20030217)
DEPC Sigma公司(Lot 2101)
琼脂糖 宝生物(大连)有限公司(Lot 0763)
TitanTM一步法RT-PCR试剂盒 TaKaRa公司(Lot BK2201)
TNF-α、ICAM-1、GAPDH寡核 上海捷倍思基因技术有限公司合成
苷酸引物
EB Sigma(Lot 3107)
Tris碱 成都云鸿科技发展有限公司(Lot BB0605)
3仪器及材料
SW-CJ-IFO型超净工作台 中国苏净集团泰安公司
3K18型高速冷冻离心机 美国Sigma公司
AE240型电子天平 美国Millipore
DU-7500紫外分光光度计 美国Beckman
凝胶成像分析系统 意大利BIO RAD
电泳系统GE-100 美国
梯度PCR仪 ThermoHybaid PX2
4实验药物及给药方法
同试验例2。
5实验方法
5.1动物分组
同试验例15.1.2。
5.2MCAO动物造模制作
同试验例15.2。
5.3RT-PCR检测TNF-αmRNA的表达
5.3.1总RNA提取
(1)取60～80mg脑组织置于1.5ml EP管中，加入Trizol试剂1ml，超声匀浆，室温静置5min。
(2)加入氯仿200μl，剧烈振荡混匀，静置10min。
(3)4℃，12000rpm离心10min。
(4)水相移入另一1.5ml EP管中，加入异丙醇500μl，振荡混匀，室温静置10min。
(5)4℃，12000rpm离心10min。
(6)弃上清，加入75％乙醇1ml，振荡混匀。
(7)4℃，9800rpm离心5min。
(8)弃上清，超静工作台上静置晾干。
(9)加入50μl无RNase纯水56℃水浴10min，置-70℃保存。
实验所用器材、溶液等均经0.1％DEPC处理。
5.3.2RNA质量鉴定
5.3.2.1紫外鉴定
取提取RNA溶液5μl，稀释100倍后加入Beckman比色杯中，紫外分光光度计测定RNA样品的A260与A280值，每个样品测3次，以平均OD值计算样品RNA的浓度和纯度。所测样品A260/A280比值在1.7～2.0之间，表示RNA较纯，RNA(μg/μl)＝A260×40×稀释倍数/1000。
5.3.2.2RNA琼脂糖凝胶电泳鉴定
(1)凝胶制备：称取0.4g琼脂糖，溶于20ml无RNase的1×TAE缓冲液中，微波炉加热溶解，待冷却至50℃时倒入制胶器，厚度0.5cm，室温放置30min以上，胶凝固后轻轻取出梳子。
(2)电泳：取未稀释RNA溶液5μl及6×加样缓冲液1μl，混匀后加样，1×TAE作为电泳缓冲液，80V电泳40min，EB染液中染色30min，将凝胶置于紫外灯下观察，若见18S及28S两条清晰条带，28S约为18S的两倍，则表明RNA未降解。
5.3.3RT-PCR(一步法)
5.3.3.1PCR引物的设计与合成
分别合成TNF-a及GAPDH(内参照)引物：
TNF-a上游引物：5’-CCA CCA CGC TCT TCT GTC TAC T-3’
TNF-a下游引物：5’-GGG CTA CGG GCT TGT CAC T-3’
GAPDH上游引物：5’-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3’
GAPDH下游引物：5’-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3’5.3.3.2RT-PCR
| 试剂 | 容积 | 终浓度(或加入的容积) |
| 10×one step RNA PCR Buffer | 5μl | 1× |
| 25mM MgCl2 | 10μl | 5mM |
| 10mM dNTP | 5μl | 1mM |
| RNase inhibitor(40unitsμl) | 1μl | 0.8unit/μl |
| AMV RTase XL(5unitμl) | 1μl | 0.1unit/μl |
| AMV-Optimized Taq(5units/μl) | 1μl | 0.15units/μl |
| Specific downstream PCR primer(10μM) | 2μl | 0.4μM |
| Specific upstream PCR primer(10μM) | 2μl | 0.4μM |
| 试剂 | 容积 | 终浓度(或加入的容积) |
| Experimental sample | 适量 | 1μg of total RNA |
| RNase free distilled water | 适量 | 加至反应体系总体积为50μl |
取总RNA1μg(根据样品RNA浓度计算加样量)，反应体系50μl。
加样完毕后混匀，再加入25μl矿物油封盖，进行RT-PCR。反应条件：cDNA合成和预变性：50℃逆转录30min，94℃2min进行一次循环。PCR扩增：94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共29个循环；最后以72℃延伸10min。TNF-α可扩增出长度为151bp的cDNA片断，GAPDH可扩增出长度为306bp的cDNA片断。
5.3.2.3琼脂糖凝胶电泳
如前所述制胶，取PCR产物5μl，6×加样缓冲液1μl，混匀后加入凝胶加样孔中，1×TAE作电泳缓冲液，80V电泳40min，EB染色液中染色30min，将凝胶置于紫外灯下观察。
5.3.2.4扫描分析测定表达量
凝胶成像分析系统对DNA含量进行密度扫描，并用对应的GAPDH扫描曲线下面积进行标准化，以其比值表示TNF-α表达量。
结果：
各组各时点TNF-αmRNA表达变化见表9。
表9MCAO模型大鼠TNF-αmRNA表达(％)
*与正常组、伪手术组相比P＜0.05；#，与模型组相比，P＜0.05；$，与高剂量组相比P＜0.05；●，与中剂量组相比P＜0.05；◆，与低剂量组相比P＜0.05。
由表9可见，正常组、假手术组的TNF-αmRNA表达很弱，正常组与假手术组之间比较P＞0.05。模型组TNF-αmRNA的表达显著升高，24小时达到峰值，48、72小时逐渐下降，三个时间点之间比较P＞0.05。本发明药物高、中、低三个剂量组与环磷酰胺组造模后24、48、72小时三个不同时点的TNF-αmRNA的表达明显下调，与相应时点模型组比较，P＜0.05。三个时点之间比较，TNF-αmRNA的表达有逐步下降的趋势，但未出现统计学意义；本发明药物三个剂量组均能降低TNF-αmRNA的表达，有量效关系，P＜0.05。环磷酰胺组与本发明药物高剂量组比较，P＞0.05，其作用强于本发明药物低、中剂量组，P＜0.05。
试验例3本发明药物对模型大鼠粘附分子的影响
细胞粘附分子(cell adhesion molecule，CAM)是一类调节细胞与细胞、细胞与细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)间相互结合、起粘附作用的膜表面糖蛋白。根据其编码基因结构同源性及产物的功能特点，可将其归纳为6个家族：整合素家族(integrin family)、选择素家族(selectin family)、免疫球蛋白超家族(immunoglobulin super-family，IGSF)、钙粘附素家族(cadherinfamily)、血管附着素家族(vascular addressin family)及CD44等粘附分子所属的尚未分类的家族。
本部分实验通过流式细胞术检测MCAO模型大鼠外周血CD11/CD18、RT-PCR检测ICAM-1mRNA的变化，以进一步研究本发明药物对外周血粘附分子和细胞间粘附分子的影响。
1研究对象
同试验例2。
2试剂
小鼠抗大鼠CD11a/CD18、CD11b/CD18单克隆抗体由法国Immunotech公司提供(Lot C0201、C0206)，红细胞破解液由美国B-D公司提供(Lot B2012)，其余主要试剂同试验例2。
3仪器及材料
同试验例2。
4实验药物及给药方法
同试验例2。
5实验方法
5.1动物分组
同试验例2。
5.2MCAO动物造模制作
同试验例2。
5.3观察指标
5.3.1流式细胞术检测CD11/CD18
分别取肝素抗凝全血100μl，各加1∶100稀释的小鼠抗大鼠CD11a/CD18、CD11b/CD18单克隆抗体20μl，摇匀后静置40分钟，加红细胞破解液2m1，静置10分钟，离心6分钟(1500r/min)，弃上清液，PBS洗2次，加1∶100稀释的二抗(羊抗鼠IgG-FITC标记)20μl，摇匀后避光放置30分钟，PBS洗2次，加100μl1％多聚甲醛固定后，样品上流式细胞仪，于中性粒细胞段开窗，用带有荧光标记的多型核粒细胞(polymorphonuclear cells，PMNs)占整个PMNs的百分数代表PMN CD11a/CD18、CD11b/CD18的表达水平。数据以Mean±SD表示，用SPSS11.5软件，采用方差分析(ANOVA)进行统计学处理。
5.3.2RT-PCR检测ICAM-1mRNA的表达
5.3.2.1总RNA提取
同试验例2 5.3.1。
5.3.2.2RNA质量鉴定
同试验例2 5.3.2。
5.3.2.3RT-PCR(一步法)
5.3.2.3.1PCR引物的设计与合成
分别合成ICAM-1及GAPDH(内参照)引物：
ICAM-1上游引物：5’-GGG TTG GAG ACT AAC TGG ATG A-3’
ICAM-1下游引物：5’-GGATCGAGC TCC ACT CGC TC-3’
GAPDH上游引物：5’-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3’
GAPDH下游引物：5’-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3’
5.3.2.3.2RT-PCR
| 试剂 | 容积 | 终浓度(或加入的容积) |
| 10×one step RNAPCR Buffer | 5μl | 1× |
| 25mM MgCl2 | 10μl | 5mM |
| 10mM dNTP | 5μl | 1mM |
| RNase inhibitor(40units μl) | 1μl | 0.8unit/μl |
| AMV RTase XL(5unitμl) | 1μl | 0.1unit/μl |
| AMV-Optimized Taq(5units/μl) | 1μl | 0.15units/μl |
| Specific downstream PCR primer(10μM) | 2μl | 0.4μM |
| Specific upstream PCR primer(10μM) | 2μl | 0.4μM |
| Experimental sample | 适量 | 1μg of total RNA |
| RNase free distilled water | 适量 | 加至反应体系总体积为50μl |
取总RNA1μg(根据样品RNA浓度计算加样量)，反应体系50μl。
加样完毕后混匀，再加入25μl矿物油封盖，进行RT-PCR。反应条件：
cDNA合成和预变性：50℃逆转录30min，94℃2min进行一次循环。PCR扩增：94℃变性45s，56.5℃退火1min，72℃延伸1min，共34个循环；最后以72℃延伸10min。ICAM-1可扩增出长度为181bp的cDNA片断，GAPDH可扩增出长度为306bp的cDNA片断。
5.3.2.3.3琼脂糖凝胶电泳
如前所述制胶，取PCR产物5μl，6×加样缓冲液1μl，混匀后加入凝胶加样孔中，1×TAE作电泳缓冲液，80V电泳40min，EB染色液中染色30min，将凝胶置紫外灯下观察。
5.3.2.4扫描分析测定表达量
凝胶成像分析系统对DNA含量进行密度扫描，并用对应的GAPDH扫描曲线下面积进行标准化，以其比值表示ICAM-1mRNA表达量。
结果：
1.本发明药物对模型大鼠CD11a/CD18表达的影响
本发明药物对模型大鼠CD11a/CD18表达的影响见表10。
表10多形核粒细胞CD11a/CD18的表达(％)
*与正常组、假手术组相比P＜0.05；#，与模型组相比，P＜0.05；$，与高剂量组相比P＜0.05；●，与中剂量组相比P＜0.05；◆，与低剂量组相比P＜0.05；△，与24H相比，P＜0.05。
由表10可见，正常组、假手术组CD11a/CD18的表达很弱，正常组与假手术组之间比较P＞0.05。模型组24小时CD11a/CD18的表达显著升高，48小时达到峰值，72小时开始下降，各时点与正常组、假手术组比较，P＜0.05，不同剂量的本发明药物及环磷酰胺可显著降低CD11a/CD18的表达，P＜0.05，本发明药物各剂量组对CD11a/CD18表达的影响存在量效关系，P＜0.05。高剂量组与环磷酰胺组比较，P＞0.05。
2.本发明药物对MCAO模型大鼠CD11b/CD18表达的影响
本发明药物对模型大鼠CD11b/CD18表达的影响见表11。
表11多形核粒细胞CD11b/CD18的表达(％)
*与正常组、假手术组相比P＜0.05；#，与模型组相比，P＜0.05；$，与高剂量组相比P＜0.05；●，与中剂量组相比P＜0.05；◆，与低剂量组相比P＜0.05；△，与24H相比，P＜0.05。▲与48H相比，P＜0.05。
由表11可见，正常组、假手术组CD11b/CD18的表达很弱，正常组与假手术组之间比较P＞0.05。模型组24小时CD11b/CD18的表达显著升高，48小时达到峰值，72小时开始下降，各时点与正常组、假手术组比较，P＜0.05。不同剂量的本发明药物及环磷酰胺可显著降低CD11b/CD18的表达，P＜0.05。本发明药物各剂量组对CD11b/CD18表达的影响存在量效关系，P＜0.05。高剂量组与环磷酰胺组比较，P＞0.05。
3.本发明药物对MCAO模型大鼠ICAM-1mRNA表达的影响
本发明药物对MCAO模型大鼠ICAM-1mRNA表达的影响见表12。
表12MCAO模型大鼠ICAM-1mRNA表达(％)
*与正常组、假手术组相比P＜0.05；#，与模型组相比，P＜0.05；$，与高剂量组相比P＜0.05；●，与中剂量组相比P＜0.05；◆，与低剂量组相比P＜0.05。
由表12可见，正常组、假手术组的ICAM-1mRNA表达很弱，正常组与假手术组之间比较P＞0.05。模型组24小时ICAM-1mRNA的表达显著升高并达到峰值，48、72小时逐渐下降，各时点与正常组、假手术组比较，差异有显著性，P＜0.05。不同剂量的本发明药物及环磷酰胺可显著降低ICAM-1mRNA的表达，P＜0.05。本发明药物各剂量组对ICAM-1mRNA表达的影响存在量效关系，P＜0.05。高剂量组与环磷酰胺组比较，P＞0.05。
试验例4本发明药物对MCAO模型大鼠炎性反应信号传导的影响
核因子κB(NF-κB)是从B淋巴细胞核抽提物中发现的一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异性结合的核蛋白因子，广泛存在于真核细胞中，参与许多基因表达的调控。近年来的研究发现，NF-κB还存在于脑血管内皮细胞、神经细胞和胶质细胞中，与脑缺血及再灌注损伤时的炎症机制密切相关。本部分研究通过NF-κB的变化进一步探讨本发明药物对脑缺血炎性反应信号传导的影响。
材料与方法
1、研究对象
同试验例2
2、试剂
NF-κB P65(Lot，C-20)rabbit polyclonal IgG Santa Cruz公司.
二抗及试剂盒购至北京中山生物技术有限公司。其余试剂同试验例12。
3、仪器及材料
同试验例2。
4.实验药物及给药方法
同试验例2。
5实验方法
5.1动物分组
同试验例2。
5.2动物造模制作
同试验例2。
5.3免疫组织化学术
5.3.1采用SP法(采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶染色及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原)。
(1)石蜡(3μm)切片脱蜡至水
(2)染色过程
3％H2O2室温下避光孵育10min
↓
蒸馏水水平摇床洗5min×2次
↓
PBS水平摇床洗5min×2次
↓
取出容器，室温冷却15～20min
↓
PBS水平摇床洗5min×3次
↓
10％正常山羊血清(1∶20PBS稀释)封片，37℃湿盒中孵育20min
↓
滤纸吸去封闭剂，加兔抗大鼠NF-κB多克隆抗体(1∶100)50μl
↓
37℃孵育60min
↓
PBS水平摇床洗5min×3次
↓
滴加二抗生物素标记的兔抗羊IgG
↓
37℃湿盒中孵育30min
↓
PBS水平摇床洗5min×3次
↓
加第二代辣根酶标记的链亲和素
↓
37℃湿盒中孵育30min
↓
PBS水平摇床洗5min×3次
↓
显微镜下DAB显色适时终止
↓
自来水充分冲洗30min
↓
Mayer’s苏木精轻微复染，显色完成后流水终止反应
↓
1％盐酸酒精10秒分色
↓
自来水冲洗5min×2次
↓
氨水溶液30～60秒
↓
自来水冲洗3～5min。
(3)脱水、透明、封片
70％、80％、90％、95％、100％酒精依次脱水各3min
↓
二甲苯I、二甲苯II透明各5min
↓
中性树脂胶封片。
每批染色均设立阴性空白对照(以PBS代替一抗)。胞核染色棕黄色者为NF-κB阳性细胞。
5.3.2图像分析
采用Mias-2000高清晰度彩色病理图文报告系统对NF-κB染色结果进行定量检测，放大倍数为400，检测正常组、伪手术组、模型组、本发明药物不同剂量组、环磷酰胺组在单位视野中NF-κB阳性的炎性细胞数及积分光密度。以每例标本5个表达最强的视野(×400)的阳性细胞数和积分光密度值作为该例的测量值。
结果：
1.NF-κB阳性的炎性细胞数变化
NF-κB阳性的炎性细胞数变化见表13。
表13NF-κB阳性的炎性细胞数变化
#，与模型组相比，P＜0.05；$，与高剂量组相比P＜0.05；●，与中剂量组相比P＜0.05；◆，与低剂量组相比P＜0.05；△，与24H相比，P＜0.05。▲与48H相比，P＜0.05。
由表13可见正常组、假手术组脑组织中未见核转位炎性细胞。阻断大脑中动脉后，NF-κB被激活。模型组24小时梗死区可见较多核转位炎性细胞，48、72小时逐渐升高，72小时与24小时比较，P＜0.05。使用药物干预后，NF-κB阳性细胞数显著减少，与各时点模型组比较，差异有显著性(P＜0.05)。
2.炎性细胞NFκB积分光密度变化
表14NF-κB积分光密度变化
*与正常组、假手术组相比P＜0.05；#，与模型组相比，P＜0.05；$，与高剂量组相比P＜0.05；●，与中剂量组相比P＜0.05；◆，与低剂量组相比P＜0.05；△，与24H相比，P＜0.05。▲与48H相比，P＜0.05。
由表14可见，正常组、假手术组NF-κB的表达都很弱，正常组与假手术组之间差异无显著性，提示NF-κB以非活性形式存在于细胞质中。阻断大脑中动脉后，NF-κB被激活。模型组24小时炎性细胞NF-κB积分光密度显著增高，48、72小时逐渐升高。本发明药物低、中、高三个剂量组梗死后24、48、72小时三个不同时点炎性细胞的核转位数显著减少，NF-κB的表达明显下调，与模型组比较差异有显著性(P＜0.05)；高剂量组与低剂量之间差异有显著性(P＜0.05)。环磷酰胺也能抑制模型大鼠不同时点炎性细胞NF-κB的核转位数与表达，其抑制作用强于本发明药物低剂量组，与本发明药物高、中剂量组比较，差异无显著性。
试验例5本发明药物对MCAO模型大鼠细胞凋亡的影响
细胞凋亡(apoptosis)是一种由基因控制的细胞自主性死亡，是真核细胞在生理或病理条件下接受到某种信号的刺激，启动其自身的遗传机制，通过内源性DNA内切酶的激动而发生自动化死亡的过程。
1.研究对象
同试验例2。
2.试剂
caspase3p20 goat polyclonal IgG 批号：L-18Santa Cruz公司。
二抗及试剂盒购至北京中山生物技术有限公司。
3仪器及材料
同试验例2。
4.实验药物及给药方法
同试验例2。
5实验方法
5.1动物分组
同试验例2。
5.2MCAO动物造模制作
同试验例2。
5.3免疫组织化学术
5.3.1采用SP法(采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶染色及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原)。
(1)石蜡(3μm)切片脱蜡至水
(2)染色过程
3％H2O2室温下避光孵育10min
↓
蒸馏水水平摇床洗5min×2次
↓
PBS水平摇床洗5min×2次
↓
取出容器，室温冷却15～20min
↓
PBS水平摇床洗5min×3次
↓
10％正常山羊血清(1∶20PBS稀释)封片，37℃湿盒中孵育20min
↓
滤纸吸去封闭剂，加羊抗大鼠多克隆抗体(1∶100)50μl
↓
37℃孵育60min
↓
PBS水平摇床洗5min×3次
↓
滴加二抗生物素标记的兔抗羊IgG
↓
37℃湿盒中孵育30min
↓
PBS水平摇床洗5min×3次
↓
加第二代辣根酶标记的链亲和素
↓
37℃湿盒中孵育30min
↓
PBS水平摇床洗5min×3次
↓
显微镜下DAB显色适时终止
↓
自来水充分冲洗30min
↓
Mayer’s苏木精轻微复染，显色完成后流水终止反应
↓
1％盐酸酒精10秒分色
↓
自来水冲洗5min×2次
↓
氨水溶液30～60秒
↓
自来水冲洗3～5min。
(3)脱水、透明、封片
70％、80％、90％、95％、100％酒精依次脱水各3min
↓
二甲苯I、二甲苯II透明各5min
↓
中性树脂胶封片。
每批染色均设立阴性空白对照(以PBS代替一抗)。胞浆染色棕黄色者为caspase3阳性的神经细胞。
5.3.2图像分析
采用Mias-2000高清晰度彩色病理图文报告系统对caspase3染色结果进行半定量检测，放大倍数为200，检测正常组、假手术组、模型组、本发明药物不同剂量组、环磷酰胺组在单位视野中caspase3积分光密度。每例标本切片选取5个表达最强视野(×200)，测定每个视野下caspase3阳性的神经细胞积分光密度。以每例标本5个视野的阳性细胞积分光密度值作为该例的测量值。
结果
Caspase3阳性神经细胞积分光密度变化见表15。
表15caspase3的表达变化
*与正常组、假手术组相比P＜0.05；#，与模型组相比，P＜0.05；$，与高剂量组相比P＜0.05；●，与中剂量组相比P＜0.05；◆，与低剂量组相比P＜0.05；△，与24H相比，P＜0.05。▲与48H相比，P＜0.05。
由表15可见正常组、假手术组caspase3的表达都很弱，正常组与假手术组之间差异无显著性。阻断大脑中动脉后，caspase3被激活。模型组24小时神经细胞caspase3积分光密度显著增高，48、72小时逐渐升高，各时点间比较P＜0.05。使用药物干预后，caspase3积分光密度显著降低，药物干预组与模型组比较P＜0.05。本发明药物高剂量组与环磷酰胺组比较P＜0.05。
实验结果表明：
(1)本发明药物能缩小脑梗死体积，保护神经元，对脑缺血损伤具有保护作用；高剂量的本发明药物的作用强度与环磷酰胺相似。
(2)本发明药物能显著下调TNF-αmRNA的表达，高剂量的本发明药物的作用强度与环磷酰胺相似。
(3)本发明药物可显著降低外周血粘附分子CD11a/CD18、CD11b/CD18的表达；同时还能显著下调ICAM-1mRNA的表达；高剂量的本发明药物的作用强度与环磷酰胺相似。
(4)本发明药物能抑制核转录因子NF-κB的转录活性；高剂量的本发明药物的作用强度与环磷酰胺相似。
(5)本发明药物及环磷酰胺能显著抑制caspase 3的激活与表达；高剂量本发明药物抑制caspase 3表达的作用强于环磷酰胺。
不同剂量的本发明药物及一定剂量的环磷酰胺通过下调TNF-αmRNA的表达，抑制NF-κB的激活与活性，降低ICAM-1mRNA和白细胞粘附分子CD11/CD18的表达，进而抑制其ICAM-1与CD11/CD18的结合，抑制其介导的白细胞与血管内皮细胞之间的粘附，减轻炎性细胞的聚集与浸润，减轻组织浸润，减轻缺血性脑损伤。另一方面，本发明药物与环磷酰胺通过下调TNF-αmRNA的表达，抑制了TNF-α诱导的脑缺血后细胞凋亡。同时还能直接抑制细胞凋亡的关键蛋白酶caspase 3，进而抑制脑缺血后神经细胞凋亡。
Claims (10)
1.一种治疗脑卒中的药物组合物，其特征在于：它是由黄芪总皂苷、丹参醇提取物、川芎油为活性成份配伍制备而成的药剂，其重量配比为：
黄芪总皂苷1-50份、丹参醇提物1-50份、川芎油0.5-30份。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：黄芪总皂苷、丹参醇提取物、川芎油的重量配比为：
黄芪总皂苷6-12份、丹参醇提物2.5-5份、川芎油1-3份。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：黄芪总皂苷、丹参醇提取物、川芎油的重量配比为：黄芪总皂苷6份、丹参醇提物2.5份、川芎油3份。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的药物组合物，其特征在于：所述的黄芪总皂苷中总皂苷的重量百分含量，以黄芪甲苷计为40～55％；所述的丹参醇提物中含有丹参总酚酸和丹参总酮，其中，丹参总酚酸中酚酸类成分的重量百分含量，以丹参酚酸B计为55～80％；丹参总酮中含丹参酮IIA的重量百分含量为40～80％；所述的川芎油中藁本内酯的重量百分含量为40～55％。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的药物组合物，其特征在于：所述的药剂是片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液或滴丸。
6.一种制备权利要求1-5任意一项所述的药物组合物的方法，它包括如下步骤：
a、黄芪饮片用30～60％乙醇提取，滤液过大孔树脂柱，30～70％乙醇洗脱，回收乙醇，得黄芪总皂苷；
b、丹参醇提物的制备：丹参饮片用8～15倍水加热提取，提取液过大孔树脂柱，50～90％乙醇洗脱，回收乙醇，得丹参总酚酸；药渣用95％～100％乙醇回收提取，回收乙醇，得丹参总酮提取物，将丹参总酚酸和丹参总酮提取物混合，得丹参醇提物；
c、川芎饮片用80％～100％乙醇溶剂浸提，回收溶剂得川芎油；
d、将a、b、c步骤的黄芪总皂苷、丹参醇提取物、川芎油按下述重量配比，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的药剂：黄芪总皂苷1-50份、丹参醇提物1-50份、川芎油0.5-30份。
7.权利要求1-5任一项所述的药物组合物在制备治疗脑卒中的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗缺血性脑卒中的药物。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗脑梗死的药物。
10.权利要求1-5任一项所述的药物组合物在制备具有缩小脑梗死体积、保护神经元、对脑缺血损伤保护作用；下调TNF-αmRNA的表达；降低外周血粘附分子CD11a/CD18、CD11b/CD18的表达、下调ICAM-1 mRNA的表达；抑制核转录因子NF-κB的转录活性；抑制caspase 3的激活与表达的药物中的用途。
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