CN101724555A - 一种利用连续型酶膜反应器制备的乳清蛋白降血压肽及其专用装置 - Google Patents

一种利用连续型酶膜反应器制备的乳清蛋白降血压肽及其专用装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用连续型酶膜反应器制备的乳清蛋白降血压肽及其专用装置。本发明所提供的连续型酶膜反应器，其组成包括：反应槽(4)、超滤膜组件(5)、循环系统(7)和收集槽(9)，所述反应槽(4)与所述超滤膜组件(5)通过循环系统(7)相连接，所述连续型酶膜反应器的组成还包括供料槽(6)，所述供料槽(6)与所述反应槽(4)通过管道相连接，所述管道上设置蠕动泵(10)。乳清蛋白经溶解、水合等预处理后，在上述连续性酶膜反应器中，采用蛋白酶解与膜分离耦联的技术制备降血压肽。酶膜反应器在运行过程中表现出良好的稳定性，连续工作12h其超滤量始终保持在90％以上。蛋白回收率达78％以上，ACE抑制率最高可达90.11％。

Description

一种利用连续型酶膜反应器制备的乳清蛋白降血压肽及其专用装置
技术领域
本发明涉及一种利用连续型酶膜反应器制备的乳清蛋白降血压肽及其专用装置。
背景技术
目前全球有近10亿人患高血压，到2025年还将有另外5亿人加入此寂静杀手的行列，高血压是21世纪对人体危害最大的慢性疾病。这种所谓的“富贵病”已经不再是西方国家的“专利”，甚至连部分经济相对落后的非洲国家也变成了高血压的“流行区”。现在，每年因为高血压引发心脏病而丧生的人数高达数百万。
从天然蛋白中提取具有营养性和生理活性的多肽，并将其运用到保健食品和强化营养的食品中，不但能够全面利用食品中的优质蛋白，并且能够提高蛋白原料的附加值。乳清蛋白作为干酪产品的副产物，目前已经被人们越来越重视，其水解产物的降血压活性已经得到广泛关注。新西兰的拉尔夫-克里斯蒂安·施洛特豪尔在专利01818725中利用多种酶水解乳清浓缩蛋白，得到了降血压多肽，证明了制备乳清蛋白源降血压肽的可行性，但其采用的是传统的酶解方式。查阅国内外专利及文献显示，目前已经有利用分步酶解技术酶解酪蛋白、苜蓿蛋白、大豆蛋白等制备活性肽的公开专利，但不能实现蛋白酶解与活性肽分离同步进行，酶用量大且不能回收利用，难以连续化生产。但是，利用连续型酶膜生物反应器水解乳清蛋白，并不断补料以生产乳清蛋白降血压肽的生产装置与工艺尚未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种连续型酶膜反应器及其应用。
本发明所提供的连续型酶膜反应器，其组成包括：反应槽4、超滤膜组件5、循环系统7和收集槽9，所述反应槽4与所述超滤膜组件5通过循环系统7相连接；所述连续型酶膜反应器的组成还包括供料槽6，所述供料槽6与所述反应槽4通过管道相连接，所述管道上设置蠕动泵10。
本发明的连续型酶膜反应器的组成还可包括反冲系统8，所述反冲循环系统8由管道、蠕动泵13、控制阀门14、压力表15和控制阀门16组成；所述控制阀门14和蠕动泵13依次设置在连接收集槽9出口与超滤膜组件5入口的管道上，所述压力表15和控制阀门16依次设置在连接超滤膜组件5出口与收集槽9入口的管道上；所述收集槽9与超滤膜组件5通过反冲循环系统8相连接。其中，在本发明的连续型酶膜反应器中收集槽9也作为反冲罐使用。
其中，所述反应槽4中设置有pH计1和搅拌子2，且所述反应槽4置于恒温水浴锅3中。所述循环系统7由管道、控制阀门11、蠕动泵12、压力表17和控制阀门18组成，所述控制阀门11、蠕动泵12依次设置在连接反应槽出口与超滤膜组件入口的管道上，所述压力表17和控制阀门18依次设置在连接超滤膜组件入口与连接反应槽出口的管道上。所述超滤膜组件5中的超滤膜可为中空纤维膜。
本发明所提供的连续型酶膜反应器可用于制备乳清蛋白降血压肽。
本发明的再一个目的是提供一种乳清蛋白降血压肽及其制备方法。
本发明所提供的乳清蛋白降血压肽是按照下述方法制备得到的：在本发明所提的连续型酶膜反应器中，利用蛋白酶酶解乳清蛋白，得到所述乳清蛋白降血压肽。
具体制备方法如下：将质量浓度为2％～8％的乳清蛋白溶液水化后加入所述连续型酶膜反应器的反应槽4中，然后将所述蛋白酶也加入反应槽4中，使乳清蛋白和蛋白酶进行酶解反应；利用蠕动泵12控制循环系统的循环流速为11.4～44.8L/h，使酶解反应液进入超滤膜组件5；所述超滤膜组件5中的超滤膜将酶解产物在线分离，得到的超滤液进入收集槽9，超滤膜截留物循环进入反应槽4中继续进行酶解-膜分离耦联反应；制备过程中供料槽6中装有质量浓度为2％～4％的乳清蛋白溶液，超滤开始后，利用蠕动泵10向反应槽4中连续补充乳清蛋白溶液；持续进行酶解-膜分离耦联反应3～10h，反应结束后将收集槽5中的超滤液干燥，即得到所述乳清蛋白降血压肽。
反应一段时间后，当超滤膜组件5中超滤膜的膜通量下降至少50％时，关闭蠕动泵10，12，关闭阀门11，打开阀门14，控制蠕动泵13直接循环超滤液，利用阀门18调节反冲压力，反冲一段时间后，恢复到前一状态下工作，使膜始终保持较好的运行状态且连续酶膜反应器不间断的工作。反冲系统的循环流速为20～100L/h，反冲压力为0.04～0.1MPa。
其中，对所述蛋白溶液进行水化的条件为：将所述乳清蛋白溶液调节pH值到7.0～8.5，然后在75℃～85℃的条件下搅拌15～20min。
所述乳清蛋白和蛋白酶进行酶解反应的反应温度为20～60℃；所述酶解反应中，蛋白酶的加入量为2000～4000U蛋白酶/g乳清蛋白(1U定义为40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的量)。
所述超滤膜组件5中超滤膜的截留分子量为3000～10000Da，超滤压力为0.02～1.0MPa。
制备过程中通过蠕动泵10向反应槽4中连续补充乳清蛋白溶液的量是通过测定每小时收集的超滤液的量来确定的，补料浓度则是通过测定超滤液中的蛋白质含量确定的，即出多少产物补多少量。
在上述制备过程中，持续进行的酶解-膜分离耦联反应的反应时间是通过延长监测时间，测定不同时间段产物的抗ACE活性及此时的产率决定的。当所得产物的ACE抑制率大于80％，且产率大于70％时，可停止反应。
上述酶膜反应器运行完毕后，对超滤膜组件5可以20～100L/h循环流速U，0.04～0.1MPa操作ΔP，运行反冲系统。经纯水反冲2h后，其膜通量恢复率为93.18％，经0.05M～0.5M NaOH溶液反冲处理后，其通量恢复率达98.89％。
本发明所提供的乳清蛋白降血压肽其血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性达到80％以上，蛋白回收率达70％以上。
采用本发明的方法生产的乳清蛋白降血压肽可以添加到各种大宗食品或直接作为保健品功能成分，用于食源性降血压食品及保健品的制制备。
本发明中所使用的蛋白酶具体可为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。
本发明中所使用的乳清蛋白具体可为乳清浓缩蛋白(WPC)或乳清分离蛋白(WPI)。
乳清浓缩蛋白(WPC)是通过物理分离技术如沉淀、过滤和离子交换等从液体乳清生产而来。
乳清分离蛋白(WPI)是通过物理和化学分离技术如过滤和离子交换生产而来的。
本发明将乳清蛋白经溶解、水化等预处理后，采用蛋白酶解与膜分离耦联的技术制备降血压肽。酶膜反应器在运行过程中表现出良好的稳定性，连续工作10h其超滤量未出现明显下降。蛋白回收率达70％以上，ACE抑制率达80％以上。此外，本发明的酶膜反应器中还设置有反冲装置，制备过程中，超滤膜工作一段时间后，可随时开启反冲装置利用超滤液对超滤膜进行反冲，使得体系产率维持在较高水平。本发明采用的补料、酶解-分离耦联的连续反应体系，可不断将反应产物移出，有效地消除了产物对蛋白酶活的抑制作用，减少了传统分步酶解反应的繁琐操作步骤，生产效率高；还可以实现蛋白酶循环利用、水解彻底，不仅可以大大提高蛋白酶的利用效率，且目标产物得率高、稳定性强；该方法能节约生产成本，缩短生产周期，更适合规模化工业生产。
与传统的酶解反应相比，本发明所提供的连续型酶膜生物反应器体系有着独特的优势：1、酶膜反应器是一种连续的反应体系，可连续将反应产物从反应区域移出，有效地消除产物对酶的抑制；2、酶可重复利用，有利于降低生产成本，提高生产效率；3酶采用流动机制，避免了固定化产生的不利影响，使酶始终处在最高的反应活性条件；4、酶膜反应不需要加热使酶灭活，因此不会因热反应生成有害物质；5、实现了对流传质，强化了传质速率，提高了反应速率；6设备费用及操作费用均低，运行过程简单，制备的降血压肽活性较高，酶膜反应器耐受性好，便于工业化生产；7、清洗方式简单，便于推广。
附图说明
图1为本发明所提供的连续型酶膜反应器的结构示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中所用的乳清浓缩蛋白(WPC)，购于HilmarTM公司，名称为HilmarTM 8000乳清浓缩蛋白，含82.5％的蛋白，5.4％的乳糖，5.0％的脂肪，5.0％的水分，3.4％的灰分。下述实施例中所用的乳清分离蛋白(WPI)也购于HilmarTM公司，名称为HilmarTM 9400。
下述实施例在本发明所提供的连续型酶膜反应器中进行，其结构示意图如图1所示，具体操作为：将一定浓度的乳清蛋白溶液加入到反应槽4中，调节反应槽4中蛋白溶液的pH值及温度，打开阀门11，18，利用蠕动泵12调节循环流速，此时关闭阀门14，利用阀门18调节跨膜压力，然后打开阀门16收集滤液；此时跨膜压力为(P17-P15)。超滤开始后，利用蠕动泵10调节物料供给速度，使反应槽中物料始终处于较为稳定的状态；反应一段时间后(膜通量下降到初始膜通量的50％以下)，关闭蠕动泵10，12，关闭阀门11，打开阀门14，控制蠕动泵13直接循环超滤液，利用阀门18调节反冲压力(P15-P17)，反冲一段时间后，恢复到最初状态下工作，使膜始终保持较好的运行状态且连续酶膜反应器不间断的工作。
实施例1、制备乳清蛋白降压肽
配制质量浓度为2％的乳清浓缩蛋白溶液，经水化后(水化条件为：将WPC溶液调节pH到7.5，然后在85℃的条件下水化连续搅拌20min)向连续型酶膜反应器的反应槽4中加入2L WPC溶液，控制反应槽温度为40℃，然后按照2000U蛋白酶/g乳清蛋白的比例将80kU碱性蛋白酶(购于北京市房山酶制剂总厂)加入反应槽4中进行酶解反应；打开阀门11，18，利用蠕动泵12调节循环流速为12.5L/h，此时关闭阀门14，利用阀门18调节跨膜压力为0.02MPa(即压力表17显示的压力)，使酶解反应液进入超滤膜组件3，超滤膜组件3中的超滤膜将酶解产物在线分离，超滤膜截留物循环进入反应槽4中继续进行酶解-膜分离耦联反应；制备过程中供料槽6中装有质量浓度为2％的乳清蛋白溶液，通过蠕动泵10不断向反应槽补充乳清蛋白溶液；持续进行酶解-膜分离耦联反应10h(连续收集10h，测定不同时段的超滤液的抗ACE活性，以确定最佳时段的抗ACE活性，活性的测定则取用的最高状态的产物进行测定。)，超滤膜通量的变化率为-4.82％～+5.05％，较为稳定。反应结束后将收集槽9中的超滤液在经冷冻干燥或喷雾干燥，即得到78.33g乳清蛋白降血压肽。蛋白回收率为78.33％，所得到的乳清蛋白降压肽的ACE抑制率最高可达81.25％。
ACE抑制活性测定参照文献(Cushman，D.W.，Cheung，H.S..Concentrations ofangiotensin-converting enzyme in tissues of the rat，BBA-Enzymology 1971；250(1)：261-265)的方法进行，并根据具体情况对反应体系进行了一定改进。
具体方法如下：50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.3)，含300mmol/L NaCl；5mmol/LHHL(马脲酰组氨酰亮氨酸)(溶解于缓冲液中)；50mU/mL ACE(溶解于缓冲液中)。样品50μL与25μL ACE溶液混合，37℃反应10min。加入50μL HHL溶液，37℃反应30min后，加入150μL 1N HCl终止反应。实验重复三次。反应中马尿酸生成量采用HPLC法测定，色谱条件为：进样量20μL；柱条件C18(4.6×250mm，5mm；Phenomenex，Torrance，CA，USA)；流动相：水∶甲醇(0.1％TFA)＝5∶5；流速1mL/min；检测波长228nm。
ACE抑制率(％)＝(B-A)/(B-C)
其中，A为抑制反应的峰面积(样品)；B为完全反应的峰面积(对照)；C为先加入HCl的，ACE不与HHL反应的峰面积(空白))
反应完毕后，对超滤膜按照图1中所述的反冲装置，将超滤液转移出来后，在收集槽9中加入去离子水进行反冲清洗，反冲2h后，其膜通量恢复率为96.54％。此时的反冲条件为以34.2L/h循环流速U，0.04MPa操作ΔP，运行反冲系统。
实施例2、制备乳清蛋白降压肽
选取质量浓度为5％的乳清浓缩蛋白溶液，经水化后取2L加入到连续酶膜反应器的反应槽中，控制温度为50℃，按照2000U蛋白酶/g乳清蛋白的比例加入200kU碱性蛋白酶(购于北京市房山酶制剂总厂)；循环流速在34.2L/h，调节跨膜压力为0.08MPa，超滤膜截留分子量为10000Da，超滤过程不断补料(补料浓度为2.5％)。连续酶解10h后其膜通量的变化率为-4.58％～+3.78％，较为稳定。蛋白回收率为81.43％，得到的乳清蛋白降血压肽的ACE抑制率为83.18％。清洗方式采用实施例1中的清洗方式。
实施例3、制备乳清蛋白降压肽
选取质量浓度为8％的乳清分离蛋白溶液，经水化后取2L加入到连续酶膜反应器的反应槽中，按照2000U蛋白酶/g乳清蛋白的比例加入320kU碱性蛋白酶(购于北京市房山酶制剂总厂)；循环流速在44.2L/h，调节跨膜压力为0.08MPa，超滤膜截留分子量为10000Da，超滤过程不断补料(补料浓度为3％)。连续酶解10h后其膜通量的变化率为-11.82～+11.91％，较为稳定。蛋白回收率为85.21％，得到的乳清蛋白源降血压肽的ACE抑制率为81.08％。清洗方式采用实施例1中的清洗方式。
实施例4、制备乳清蛋白降压肽
选取质量浓度为5％的乳清浓缩蛋白溶液，经水化后取2L加入到连续酶膜反应器的反应槽中，按照3000U蛋白酶/g乳清蛋白的比例加入300kU碱性蛋白酶(购于北京市房山酶制剂总厂)；循环流速在38.2L/h，调节跨膜压力为0.08MPa，超滤膜截留分子量为6000Da，超滤过程不断补料(补料浓度为2.5％)。连续酶解10h后其膜通量的变化率为-6.51％～+3.88％，较为稳定。蛋白回收率为78.43％，得到的乳清蛋白源降血压肽的ACE抑制率为88.18％。清洗方式采用实施例1中的清洗方式。
实施例5、制备乳清蛋白降压肽
选取质量浓度为5％的乳清浓缩蛋白溶液，经水化后取2L加入到连续酶膜反应器的反应槽中，按照4000U蛋白酶/g乳清蛋白的比例加入400KU碱性蛋白酶(购于北京市房山酶制剂总厂)，循环流速在34.2L/h，调节跨膜压力为0.04MPa，超滤膜截留分子量为5000Da，超滤过程不断补料(补料浓度为3.5％)。连续酶解3h后其膜通量的下降程度为51.23％，然后利用超滤液对其在循环流速68.4L/h，反冲压力ΔP＝0.04MPa下反冲15min后，膜通量恢复率达91.23％。然后依据超滤3h，反冲1h，3.5％乳清浓缩蛋白的补料速度，最后连续反应超过12h后，蛋白回收率为79.13％，得到的乳清蛋白源降血压肽的ACE抑制率为90.11％。

Claims (10)

1.一种连续型酶膜反应器，其组成包括：反应槽(4)、超滤膜组件(5)、循环系统(7)和收集槽(9)，所述反应槽(4)与所述超滤膜组件(5)通过循环系统(7)相连接，其特征在于：所述连续型酶膜反应器的组成还包括供料槽(6)，所述供料槽(6)与所述反应槽(4)通过管道相连接，所述管道上设置蠕动泵(10)。
2.根据权利要求1所述的连续型酶膜反应器，其特征在于：所述连续型酶膜反应器的组成还包括反冲系统(8)，所述反冲循环系统(8)由管道、蠕动泵(13)、控制阀门(14)、压力表(15)和控制阀门(16)组成；所述收集槽(9)与超滤膜组件(5)通过反冲循环系统(8)相连接；所述控制阀门(14)和蠕动泵(13)依次设置在连接收集槽(9)出口与超滤膜组件(5)入口的管道上，所述压力表(15)和控制阀门(16)依次设置在连接超滤膜组件(5)出口与收集槽(9)入口的管道上。
3.根据权利要求1或2所述的连续型酶膜反应器，其特征在于：所述反应槽(4)中设置有pH计(1)和搅拌子(2)，且所述反应槽(4)置于恒温水浴锅(3)中；所述循环系统(7)由管道、控制阀门(11)、蠕动泵(12)、压力表(17)和控制阀门(18)组成，所述控制阀门(11)、蠕动泵(12)依次设置在连接反应槽出口与超滤膜组件入口的管道上，所述压力表(17)和控制阀门(18)依次设置在连接超滤膜组件入口与连接反应槽出口的管道上；所述超滤膜组件(5)中的超滤膜为中空纤维膜。
4.权利要求1-3中任一所述的连续型酶膜反应器在制备乳清蛋白降血压肽中的应用。
5.一种制备乳清蛋白降血压肽的方法，其特征在于：在权利要求1-3中任一所述的连续型酶膜反应器中，利用蛋白酶酶解乳清蛋白，得到所述乳清蛋白降血压肽。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：将质量浓度为2％-8％的乳清蛋白溶液水化后加入所述连续型酶膜反应器的反应槽4中，然后将所述蛋白酶也加入反应槽4中，使乳清蛋白和蛋白酶进行酶解反应；利用蠕动泵12控制循环系统的循环流速为11.4～44.8L/h，使酶解反应液进入超滤膜组件5；所述超滤膜组件5中的超滤膜将酶解产物在线分离，得到的超滤液进入收集槽9，超滤膜截留物循环进入反应槽4中继续进行酶解-膜分离耦联反应；制备过程中供料槽6中装有质量浓度为2％～4％的乳清蛋白溶液，超滤开始后，利用蠕动泵18向反应槽4中连续补充乳清蛋白溶液；持续进行酶解-膜分离耦联反应3～10h，反应结束后将收集槽5中的超滤液干燥，即得到所述乳清蛋白降血压肽。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：对所述乳清蛋白溶液进行水化的条件为：将所述乳清蛋白溶液调节pH值到7.0～8.5，然后在75℃～85℃的条件下搅拌15～20min；
所述乳清蛋白和蛋白酶进行酶解反应的反应温度为20～60℃；所述酶解反应中，蛋白酶的加入量为2000～4000U蛋白酶/g乳清蛋白；
所述超滤膜组件5中超滤膜的截留分子量为3000Da～10000Da，超滤压力为0.02～1.0MPa；
所述乳清蛋白为乳清浓缩蛋白或乳清分离蛋白；所述蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：在权利要求2或3所述的连续型酶膜反应器中制备乳清蛋白降血压肽，反应过程中，当超滤膜组件5中超滤膜的膜通量下降至初始膜通量的50％或50％以下时，开启反冲系统，利用超滤液对所述超滤膜进行反冲，反冲系统的循环流速为20～100L/h，反冲压力为0.04～0.1MPa。
9.权利要求5-8中任一所述方法制备得到的乳清蛋白降血压肽。
10.权利要求9所述的乳清蛋白降血压肽在制备降血压食品或保健品中的应用。
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