CN101721752A - 微盲孔支架承载基因物质的制备方法 - Google Patents

Abstract

微盲孔支架承载基因物质的制备方法，其特征在于在常温下溶解被承载的基因物质，并适量加入基因活性保护剂；使用超声微雾化加压喷涂设备进行喷涂，使基因物质进入到微盲孔内部并涂覆到支架表面。本发明采用微盲孔支架承载一种基因物质，使其在临床应用中，能够发挥基因物质快速内皮化作用，从提高治疗效果。首先，在常温下溶解被承载的基因物质，并适量加入基因活性保护剂，确保基因物质正常发挥作用。其次，应用超声波微雾化加压喷涂法，使基因物质顺利附着于微盲孔支架的表面；使每一枚支架表面的基因物质携带量可以控制，而且重复精度高。

Description

微盲孔支架承载基因物质的制备方法

技术领域

本发明涉及医疗器械装置及其承载基因物质的制备方法，属于生物医学材料和生物化学等领域。除涉及微盲孔支架(其制备方法见“金属支架表面微盲孔载药层的制作方法”专利号：ZL200610109422.8；)的外表涂覆基因物质——裸质粒的制备外，还包括基因物质的溶解及保护的方法，特别是微盲孔支架承载基因物质裸质粒的制备方法。

背景技术

医疗器械中的心血管支架介入治疗成形术，已经成为当前医学领域应用越来越广泛的方法。但单纯心血管支架植入术面临着一个严峻的挑战，即术后的生物相容性问题和组织再生问题；为解决上述问题，研究人员试验在心血管支架表面携带某种药物，包括生物活性物质，以使得更有利于临床的治疗效果。因此人们使用高分子聚合物作为承载过渡层，涂覆在心血管支架表面；然后使其与药物等目的物结合，通过界面释放以达到治疗的作用。但几年过去了，高分子聚合物作为载体的药物支架，被植入人体后脱落的不良反应时有发生，尤其是高分子聚合物在血液中的离散移动，会给患者造成新的远端血栓等。而表面带有微盲孔的心血管支架，它不仅可以直接装载药物和基因等粒子，而且自身的生物相容性较好，使得血管内皮细胞能快速地完成内皮化过程，可以起到很好的治疗作用。

在分子生物学飞速发展的今天，人们可以方便的获得各种基因物质，包括DNA、RNA等。这些物质已经在临床上得到了广泛的应用，其显示的疗效和安全性也是令人瞩目的。将含有某种具有临床意义的活性分子的编码基因物质，涂覆到微盲孔血管支架表面；在植入人体后，其所携带的基因物质可以进入植入部位的血管内皮细胞并表达出相应的分子活性，从而达到预期的治疗目的。目前所应用的涂覆方法，一般为浸泡法；即将微盲孔血管支架在基因物质溶液中进行浸泡，从而使基因物质粘附到支架表面。但这种方法存在着诸多的弊端，如溶液无法完全有效地进入支架的微盲孔内；单枚支架表面的基因物质携带量无法精确控制；操作过程重复精确度差，无法规模化加工等。本发明则为解决以上问题，提供了一种新的方法。

发明内容

为了解决基因物质涂层微盲孔支架制备过程中存在的各种问题，本发明提供了一种微盲孔支架承载基因物质的制备方法，采用超声微雾化加压射流涂层方法，能够使基因物质顺利地进入微盲孔内及支架表面，精确地控制每枚微盲孔血管支架所携带的基因物质的量。

本发明为解决其技术问题所采用的技术方案是：首先，将目标基因物质——裸质粒，用不会破坏其生物活性的超纯水、糖类进行溶解，再在溶液中加入对人体无害的维生素E、维生素C作为保护剂；从而使基因物质——裸质粒涂层支架能够顺利到达靶血管。其次，应用超声波使溶液雾化，超声波强度0.8，药物流量0.025ml/min，支架推进速度0.1cm/s，支架旋转速度250r/min，惰性气体压力1psi。经辅助计算机程序控制下进行高速喷涂后，使单枚支架的基因物质——裸质粒携带量在120-150μg范围之内，精确可调，重复精度高，可以实现规模化加工。

微盲孔支架承载基因物质的制备方法，其特征在于在常温下溶解被承载的基因物质，并适量加入基因活性保护剂；使用超声微雾化加压喷涂设备进行喷涂，使基因物质进入到微盲孔内部并涂覆到支架表面。

所述具体特征如下：微盲孔支架材质包括金属和非金属；可以是医用不锈钢、钛镍合金、钴铬合金及高分子材料。微盲孔支架包括球囊扩张型支架和自膨胀型支架，含用其它方法输送和扩张的金属和非金属支架；可以是应用球囊导管进行支架的输送和扩张。微盲孔支架包括激光雕刻支架、编织支架以及其它方法加工的植入人体的心血管支架。承载的基因物质是裸质粒；包括真核细胞和原核细胞来源的裸质粒，也包括非细胞来源的裸质粒；可以是非病毒载体的裸质粒DNA和质粒脂质体。裸质粒包括抗性质粒、降解质粒、侵入性质粒；它是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露的双链DNA。所加入基因活性保护剂，可以是溶液、糖类、维生素类。可以单独使用，也可以混合使用，浓度在1.0％-10％之间。其溶液可以是超纯水；也可以是任何一种无害液体，其中可加入一种糖，也可以加入多种糖。糖类包括单糖或多糖；可以是葡萄糖、蔗糖。在喷涂基因物质时可以单次单层，也可以多次多层。

微盲孔支架表面布满微孔，如果将支架直接浸入基因物质溶液，则微盲孔表面即刻被液体覆盖，由于液体张力的作用，使微盲孔内的空气无法排出，从而造成溶液无法进入微盲孔内；如图7所示。

另外，如果基因物质具有较好的水溶性，单纯将其涂覆的支架表面，在植入的过程中相当部分的基因物质将会在到达靶病变部位前被血液溶解。利用本发明提供的方法，在基因物质溶液中加入对人体无害的溶液、糖类、维生素类等保护物质，干燥后会为基因物质提供一种保护层。虽然保护剂在血液中也可以溶解，但其溶解速度并不是很快，完全可以使支架上携带的基因物质安全到达病变部位。将加入了溶液或糖类或维生素类的基因物质溶液进行超声波震荡，使其产生直径在微米级的小液滴(范围18-48μm)，这些液滴在惰性气体(氮气或氦气)施加的压力推动下快速射向旋转的微盲孔支架，便可顺利进入微盲孔内前尺寸迅速变小。在此过程中，支架的旋转非常重要，因为在旋转过程中，小液滴与支架表面存在一种剪切力，而这种剪切力是使小液滴进入微盲孔不可或缺的因素。

微盲孔血管支架载物原理：

1、超声雾化粒径大小。由图3中可知超声雾化粒径大小为25-120μm。

2、支架表面液膜厚度。支架筋宽和壁厚约为0.1mm，薄液膜在支架筋的每个面上形成如图6所示的球冠形液滴。液滴半径r可以通过Kalvin公式计算

$r=\frac{{2\mathrm{\σ}}_{\mathrm{ls}}{V}_{\mathrm{lm}}}{\mathrm{RT}\ln \left[{P/P}_s\right]}---\left(1\right)$

应用Young方程可以计算出润湿角θ

$\cos \mathrm{\θ}=\frac{{\mathrm{\σ}}_m-{\mathrm{\σ}}_{s1}}{{\mathrm{\σ}}_{\mathrm{ls}}}---\left(2\right)$

由图4可知，根据半径r和润湿角θ可以计算出球冠形液滴的高度，即液膜厚度。另一方面，液体的表面张力是决定液体能否在金属表面铺展开的重要因素，表面张力越小，接触角越小，则越易铺展，有助于液体的发挥。但表面张力过小，会导致液体的流失。

3、载物原理。超声喷涂机将溶解了基因物质雾化成直径为18-48μm的小液滴，每个小液滴中含有基因物质与溶剂分子，每一个基因物质均被众多溶剂分子包围，当液滴喷在支架表面时，基因物质分子可以分散进入微孔，如图5所示。

支架表面引入微盲孔的主要目的是载物，主要通过三个方面来实现：一、微盲孔本身直接装载一部分基因物质；二、增加了支架表面的粗糙度；三、提高了支架表面的自由能。在喷涂过程中，小液滴不断落在支架表面，由于微盲孔支架的表面能较大，基因物质容易被吸附，在支架表面形成了一层薄液膜，其薄液膜的厚度取决于液体的表面张力，液体表面张力的变化、支架各部位表面自由能的不同，液体内部会出现液体流动从新分布，基因物质均匀分布在孔外的支架表面；形成了如图6所示的状况。

4、动量冲量原理的应用。每个液滴在抵达支架表面时有一定速度v，据动量定理：Δmv＝FΔt  则F＝Δmv/Δt

液膜具有表面张力σ，产生一收缩力Fσ：Fσ＝σL

如F＞Fσ，则液滴可以克服表面张力进入微盲孔内。本发明的有益效果是，通过计算机程序控制，可以将基因物质有效地、精确的涂覆到微盲孔支架表面。自动化程度高，重复性好，可规模化加工。

附图说明

图1、图2是喷涂机(DES-2000)结构示意图；图3超声雾化粒径分布；图4润湿角θ；图5基因物质和溶剂混合液小液滴；图6载物过程中支架表面；图7微盲孔支架壁面上的液滴。其中，超声波高频震荡发生器1、溅射喷嘴接头2、喷嘴3、微盲孔支架4、支架夹具5、支架推进器6、涂层溶液池接头7、涂层溶液池8、溶液高压推进器。

具体实施方式

1、单层喷涂法

用超纯水配制2mg/ml的裸质粒DNA，充分溶解后加入蔗糖，使溶液中蔗糖浓度达到1.1％；将配制好的溶液装入涂层溶液池8，用四氟乙烯软管连接喷嘴接头2与涂层溶液池接头7；将微盲孔支架4安装在支架夹具5上；启动喷涂系统，对超声波发生器1的功率、支架推进器6的推进速度、涂层溶液推进器9的推进速度进行设定，使微盲血管孔支架4从喷嘴3下往返一次便达到预期的基因物质载量。

2、多层喷涂法

用超纯水配制2mg/ml的基因物质溶液，充分溶解后加入蔗糖，使溶液中蔗糖浓度达到1.1％；将配好的溶液装入涂层溶液池8，用四氟乙烯软管连接喷嘴接头2与涂层溶液池接头7；将微盲孔血管支架4安装在支架夹具5上；启动喷涂系统，对超声波发生器1的功率、支架推进器6的推进速度、涂层溶液推进器9的推进速度进行设定，使微盲孔支架4从喷嘴3下往返多次方可达到预期的基因物质载量。重复喷涂应在微盲孔支架4自然干燥后进行。

Claims (9)

1.微盲孔支架承载基因物质的制备方法，其特征在于在常温下溶解被承载的基因物质，并适量加入基因活性保护剂；使用超声微雾化加压喷涂设备进行喷涂，使基因物质进入到微盲孔内部并涂覆到支架表面。

2.根据权利1所述的微盲孔支架承载基因物质的制备方法，其特征在于微盲孔支架材质包括金属和非金属；可以是医用不锈钢、钛镍合金、钴铬合金及高分子材料。

3.根据权利1或2所述的微盲孔支架承载基因物质的制备方法，其特征在于微盲孔支架包括球囊扩张型支架和自膨胀型支架，含用其它方法输送和扩张的金属和非金属支架；可以是应用球囊导管进行支架的输送和扩张。

4.根据权利1或2所述的微盲孔支架承载基因物质的制备方法，其特征在于微盲孔支架包括激光雕刻支架、编织支架以及其它方法加工的植入人体的心血管支架。

5.根据权利1所述的微盲孔支架承载基因物质的制备方法，其特征在于基因物质是裸质粒；包括真核细胞和原核细胞来源的裸质粒，也包括非细胞来源的裸质粒；可以是非病毒载体的裸质粒DNA和质粒脂质体。它是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露的双链DNA，包括抗性质粒、降解质粒、侵入性质粒。

6.根据权利1所述的微盲孔支架承载基因物质的制备方法，其特征在于适量加入基因活性保护剂；可以是溶液、糖类、维生素类。

7.根据权利1或6所述的微盲孔支架承载基因物质的制备方法，其特征在于溶液可以是超纯水；也可以是任何一种无害液体；溶液中的糖类，可以是单糖或多糖；维生素类可以是维生素E或维生素C。

8.根据权利1或7所述的微盲孔支架承载基因物质的制备方法，其特征在于基因活性保护剂可以单独使用，也可以混合使用，浓度在1.0-10％之间。

9.根据权利1所述的微盲孔支架承载基因物质的制备方法，其特征在于在喷涂基因物质时可以单次单层，也可以多次多层。

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