CN101718791A

CN101718791A - 用于诊断慢性舒张性心力衰竭的试剂盒

Info

Publication number: CN101718791A
Application number: CN200910201045A
Authority: CN
Inventors: 姜红; 葛均波; 王向东; 张磊; 刘明
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2009-12-14
Filing date: 2009-12-14
Publication date: 2010-06-02

Abstract

本发明提供了一种具有预测慢性舒张性心力衰竭功能的试剂盒，其特征在于，由细胞因子及其酶标抗体，pH9.6碳酸盐缓冲液，pH7.4磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成，所述的细胞因子是包括生长因子、炎症相关因子、神经元营养因子，以及凝血因子等多种细胞因子类别在内的17种细胞因子。本发明可协助诊断慢性舒张性心力衰竭。

Description

用于诊断慢性舒张性心力衰竭的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种具有预测慢性舒张性心力衰竭功能的试剂盒。

背景技术

心力衰竭是由于心脏结构或功能性异常损害了心室充盈和射血能力而引起的一种复杂的临床综合征，是各种临床心血管疾病发展的终末阶段。因为高发病率及高死亡率，心衰已受到越来越多的关注。在美国，其总体发病率约为1.5％～2.0％，而在年龄≥65的人群当中，则高达6％～10％。我国一项随机调查研究结果显示，成人心衰的发病率也达到0.9％(男性为0.7％，女性为1.0％)，而且心衰患者的5年存活率仅为35％。另外，心衰的医疗费用正在逐年增长，据相关统计表明，美国每年仅仅因心力衰竭而导致的住院费用就超过一百亿美元。在典型的心力衰竭患者中，单纯以心脏舒张功能异常所致心力衰竭的发生率可高达40％，而舒张性心力衰竭往往发生于收缩性心力衰竭之前，早期检出和积极防治舒张性心力衰竭有可能减少晚期混合性心力衰竭的发病率。因此，探索具有诊断价值的新型简易生物标记物不仅有益于舒张性心力衰竭患者的早期诊断和早期干预，还会带来巨大的社会效益和经济效益。

舒张性心力衰竭患者的左室射血分数并不降低，但伴有心室舒张功能障碍。因此，多普勒超声学方法这一无创技术一直在开发探索中，以求辅助诊断左室射血分数正常性的心力衰竭。但是存在很多客观因素导致这些诊断方法有明显的局限性，如心脏负荷状态的不特异或短暂的改变、年龄变化、心率的变化或二尖瓣返流的存在等，都会对心脏的充盈模式产生影响和改变。目前研究发现，血清中脑钠素(BNP)水平在一定程度上有助于舒张性心力衰竭的诊断，但是，这种诊断方法也因BNP水平受到年龄等其他因素的影响而受到限制。近年来，随着人们对舒张性心力衰竭的重新认识和不断重视，如何更加准备地诊断舒张性心力衰竭，以及如何优化现有预测指标指导该疾病的治疗等问题显得尤为紧迫。因此，从多角度探索和开发对该疾病具有早期诊断价值的生物标记物拥有十分广阔的前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有预测慢性舒张性心力衰竭功能的试剂盒。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种具有预测慢性舒张性心力衰竭功能的试剂盒，其特征在于，由细胞因子及其酶标抗体，PH9.6碳酸盐缓冲液，PH7.4磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成；所述的细胞因子包括激活素A、激活素B、激活素C、激活素受体样激酶2、血管生成素、血管生成素4、血管生成素样因子、双向调节因子、胶质细胞源性神经营养因子Artemin、CD80抗原、肿瘤坏死因子受体超家族13C、C-C家族趋化因子受体3、C-C家族趋化因子受体6、血小板因子4、组织因子、富含半胱氨酸跨膜BMP调节因子1以及内皮-单核细胞激活多肽II。

所述PH9.6碳酸盐缓冲液为将1.59克碳酸钠和2.93克碳酸氢钠加至1L蒸馏水中而得。

所述PH7.4磷酸盐缓冲液为0.2克磷酸二氢钾，2.9克十二水合磷酸氢二钠，8.0克氯化钠，0.2克氯化钾，0.5ml吐温-20加至1L蒸馏水中而得。

所述血清蛋白稀释液为0.1克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至100ml PH7.4磷酸盐缓冲液而得。

所述终止液为2M硫酸溶液。

所述四甲基联苯胺底物溶液为0.5ml浓度为10mg/5ml的四甲基联苯胺的无水乙醇溶液，10ml PH5.0底物缓冲液与32ul浓度为0.75vol％的过氧化氢水溶液混合而得。其中，PH5.0底物缓冲液为含0.2M磷酸氢二钠和0.1M柠檬酸的蒸馏水溶液。

本发明通过收集3例舒张性心力衰竭患者血清、3例单纯高血压患者血清，以及3例正常人血清。应用蛋白质芯片技术检测血清内507种细胞因子，同时以单纯高血压患者及正常人血清中蛋白表达水平作为衡量标准，筛选舒张性心力衰竭患者血清蛋白谱中上调或下调的细胞因子(p＜0.05)。最终确定舒张性心力衰竭患者血清蛋白谱中有17种细胞因子表达与高血压患者及正常人比较存在差异，包括14种细胞因子上调和3种细胞因子下调的联合表达改变(如表1所示)。

表1多种细胞因子在舒张性心衰患者、高血压患者及正常人血清中的表达变化

由上述研究得出本发明主要特点：

1.本发明首次提出包括生长因子、炎症相关因子、神经元营养因子，以及凝血因子等多种细胞因子类别在内的17种细胞因子或与其它临床指标组合可成为舒张性心力衰竭诊断的主要指标。

2.包括生长因子、炎症相关因子、神经元营养因子，以及凝血因子等多种细胞因子类别在内的17种细胞因子作为预测指标较目前用于诊断舒张性心力衰竭的超声指标及其他临床指标更为客观，而且测定此类蛋白表达水平简单易行可靠。

具体实施方式

下面结合实施例来具体说明本发明。

实施例

一种用于诊断慢性舒张性心力衰竭的试剂盒，由细胞因子及其酶标抗体，PH9.6碳酸盐缓冲液，PH7.4磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成。

所述的细胞因子是包括生长因子、炎症相关因子、神经元营养因子，以及凝血因子等多种细胞因子类别在内的17种细胞因子。

所述终止液为2M硫酸溶液。

所述四甲基联苯胺底物溶液为0.5ml四甲基联苯胺的无水乙醇溶液(10mg/5ml)，10mlPH5.0底物缓冲液与32ul过氧化氢水溶液(0.75vol％)混合而得。其中，PH5.0底物缓冲液为含0.2M磷酸氢二钠和0.1M柠檬酸的蒸馏水溶液。

上述试剂盒的使用方法如下：

1.包被：用0.05M PH9.6碳酸盐缓冲液将细胞因子稀释至蛋白质含量为1-10ug/ml。在每个聚苯乙烯的反应孔中加0.1ml，于4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用PH7.4磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。

2.加样：分别加一定血清蛋白稀释液稀释后的待检样品、正常人血清和阳性对照血清0.1ml至上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时后用PH7.4磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。

3.加辣根过氧化物酶标抗体：在各反应孔中加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标抗体0.1ml，37℃孵育0.5-1小时后用PH7.4磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。

4.加底物液显色：在各反应孔中加入四甲基联苯胺底物溶液0.1ml，37℃下孵育10-30分钟。

5.终止反应：在各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。若大于规定的阴性对照OD值2.1倍，即为阳性。

以正常对照品蛋白表达水平作为衡量标准，慢性舒张性心力衰竭患者血清蛋白谱表达量除以此标准，从而确定患者蛋白谱相对于正常人的表达比例。其中，大于或等于2.4为增高，小于2.4为降低。

Claims

1.一种具有预测慢性舒张性心力衰竭功能的试剂盒，其特征在于，由细胞因子及其酶标抗体，PH9.6碳酸盐缓冲液，PH7.4磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清组成；所述的细胞因子包括激活素A、激活素B、激活素C、激活素受体样激酶2、血管生成素、血管生成素4、血管生成素样因子、双向调节因子、胶质细胞源性神经营养因子Artemin、CD80抗原、肿瘤坏死因子受体超家族13C、C-C家族趋化因子受体3、C-C家族趋化因子受体6、血小板因子4、组织因子、富含半胱氨酸跨膜BMP调节因子1以及内皮-单核细胞激活多肽II。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PH9.6碳酸盐缓冲液为将1.59克碳酸钠和2.93克碳酸氢钠加至1L蒸馏水中而得。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PH7.4磷酸盐缓冲液为0.2克磷酸二氢钾，2.9克十二水合磷酸氢二钠，8.0克氯化钠，0.2克氯化钾，0.5ml吐温-20加至1L蒸馏水中而得。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述血清蛋白稀释液为0.1克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至100ml PH7.4磷酸盐缓冲液而得。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为2M硫酸溶液。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述四甲基联苯胺底物溶液为0.5ml浓度为10mg/5ml的四甲基联苯胺的无水乙醇溶液，10ml PH5.0底物缓冲液与32ul浓度为0.75vol％的过氧化氢水溶液混合而得。其中，PH5.0底物缓冲液为含0.2M磷酸氢二钠和0.1M柠檬酸的蒸馏水溶液。