CN102095863B - 用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒 - Google Patents
用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒，其特征在于，包括细胞因子的酶标抗体，所述的细胞因子为人淋巴组织趋化性细胞因子（6Ckine）、巨噬细胞源趋化因子（MDC）和β细胞素（BTC）。本发明首次提出包括人淋巴组织趋化性细胞因子（6Ckine）、β细胞素（BTC）和巨噬细胞源趋化因子（MDC）可成为慢性阻塞性肺病急性加重期诊断的主要指标。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
慢性阻塞性肺病(COPD)是一种以持续阻塞来自肺部的气流为特征的肺部疾病。该疾病是一种阻碍正常呼吸且诊断不足威胁生命的肺病，是无法完全可逆的。其主要的临床表现为，咳嗽，咳痰以及呼吸困难。随着病程的进展，可发展到走平路时亦感到气急。部分患者有喘息症状。此外尚有乏力、纳差和体重减轻等全身症状。急性发作期并发呼吸衰竭或由心衰竭可出现相应症状。由于其患病人数多，死亡率高，社会经济负担重，已成为一个重要的公共卫生问题。慢性阻塞性肺病目前居全球死亡原因的第4位，据世界卫生组织报道，至2020年慢性阻塞性肺病将位居世界疾病经济负担第5位。在我国，慢性阻塞性肺病同样是严重危害人民身体健康的重要慢性呼吸系统疾病，因此，探索具有诊断价值的新型简易生物标记物不仅有益于慢性阻塞性肺病急性加重期(AECOPD)患者的早期诊断和早期干预，还会带来巨大的社会效益和经济效益。
慢性阻塞性肺病的发病机制尚未完全明了。目前普遍认为慢性阻塞性肺病以气道、肺实质和肺血管的慢性炎症为特征。随着病情进展，可导致全身炎症，出现循环血液中细胞因子浓度异常增高等。目前诊断慢性阻塞性肺病急性加重的主要是依据症状体征以及肺部影像学的改变。因此，用于诊断慢性阻塞性肺病特别是慢性阻塞性肺病加重期、评价疗效的特征性生物标记物一直在开发探索中，以期监测慢性阻塞性肺病病程进展。近年来，随着人们对慢性阻塞性肺病的重新认识和不断重视，如何更加准确地诊断慢性阻塞性肺病以及急性加重期，以及如何优化现有预测指标指导该疾病的治疗等问题显得尤为紧迫。因此，从多角度探索和开发对该疾病具有早期诊断价值的生物标记物拥有十分广阔的前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够预测慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒，其特征在于，包括细胞因子及其酶标抗体，所述的细胞因子包括人淋巴组织趋化性细胞因子（6Ckine）、巨噬细胞源趋化因子（MDC）和β细胞素（BTC）。
所述的人淋巴组织趋化性细胞因子为单克隆鼠IgG抗体。所述的巨噬细胞源趋化因子为单克隆鼠IgG2B抗体。所述的β细胞素（BTC）为单克隆鼠IgG1抗体。
所述的人淋巴组织趋化性细胞因子的酶标抗体为多克隆羊抗人IgG抗体。所述的巨噬细胞源趋化因子的酶标抗体为多克隆鸡抗人IgY抗体。所述的β细胞素的酶标抗体为多克隆羊抗人IgG抗体。
所述的细胞因子还包括人皮肤T细胞虏获趋化因子（CTACK）、人上皮中性粒细胞活化肽78（ENA-78）、人巨噬细胞移动抑制因子（MIF）、白介素28A（IL-28A）、白介素29（IL-29）和酪氨酸激酶Axl（Axl）。
所述的人皮肤T细胞虏获趋化因子为单克隆鼠抗体IgG2抗体。所述的人上皮中性粒细胞活化肽78为单克隆鼠IgG1抗体。所述的人巨噬细胞移动抑制因子为单克隆鼠IgG1抗体。所述的白介素28A为单克隆鼠IgG2B抗体。所述的白介素29为单克隆鼠IgG2A抗体。所述的酪氨酸激酶Axl为单克隆鼠IgG1抗体。
所述的人皮肤T细胞虏获趋化因子的酶标抗体为多克隆羊抗鼠IgG抗体。所述的人上皮中性粒细胞活化肽78酶标抗体为多克隆羊抗人IgG抗体。所述的人巨噬细胞移动抑制因子的酶标抗体为多克隆羊抗人IgG抗体。所述的白介素28A的酶标抗体为多克隆羊抗人IgG。所述的白介素29的酶标抗体为多克隆羊抗人IgG抗体。所述的酪氨酸激酶Axl的酶标抗体为多克隆羊抗人IgG抗体。
所述的用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒还可以包括pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清。
本发明通过收集7例慢性阻塞性肺病急性加重期患者血浆、5例慢性阻塞性肺病稳定期患者血浆，以及5例正常人血浆。利用定量细胞因子芯片技术，该技术采用免疫学原理，通过抗体包被抗原，检测得到血浆内40种细胞因子，同时以稳定期慢性阻塞性肺病患者及正常人血清中蛋白表达水平作为衡量标准，筛选慢性阻塞性肺病急性加重期患者血清中上调或下调的细胞因子（p<0.05）。根据标准曲线计算得到每种细胞因子的浓度。应用SPSS 18.0软件，计算得到每种细胞因子在每组人群中的均值和标准差，对所得每组数据进行配对t检验，即分别比较慢性阻塞性肺病急性加重期组与稳定期慢性阻塞性肺病组和正常组的数据，认为p<0.05有统计学意义。最终确定慢性阻塞性肺病急性加重期患者血清蛋白谱中有3种细胞因子表达与慢性阻塞性肺病患者及正常人比较存在差异，包括2种细胞因子上调和1种细胞因子下调的联合表达改变（表1）。另有2种细胞因子与正常人比较存在差异，包括1种细胞因子上调，1种细胞因子下调（表2）；4种细胞因子与慢性阻塞性肺病患者比较存在差异，包括3种细胞因子下调，1种细胞因子上调（表3）。用两组数值的比值作为最终结果的表现形式。
表1 多种主要细胞因子在COPD急性加重期患者、COPD患者及正常人血清中的表达变化：
表2 辅助细胞因子在COPD急性加重期患者及正常人血清中的表达变化：
表3 辅助细胞因子在COPD急性加重期患者及COPD患者血清中的表达变化：
本发明的优点是：
1.本发明首次提出包括人淋巴组织趋化性细胞因子（6Ckine）、β细胞素（BTC）， 和巨噬细胞源趋化因子（MDC）可成为慢性阻塞性肺病急性加重期诊断的主要指标。另有人皮肤T细胞虏获趋化因子（CTACK）、人上皮中性粒细胞活化肽78（ENA-78）、人巨噬细胞移动抑制因子（MIF）、白介素28A（IL-28A）、白介素29（IL-29），和酪氨酸激酶Axl（Axl）等6种细胞因子可成为慢性阻塞性肺病急性加重期诊断的辅助指标。
2. 人淋巴组织趋化性细胞因子（6Ckine）、β细胞素（BTC）和巨噬细胞源趋化因子（MDC）作为预测指标较目前用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的肺功能指标及其他临床指标更为客观，而且测定此类蛋白表达水平简单易行可靠。
具体实施方式
下面结合实施例来具体说明本发明。
实施例
一种用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒，包含以下试剂：
1、人淋巴组织趋化性细胞因子（R&D Systems,型号MAB3661），及其酶标抗体（R&D Systems，型号BAF366）；
2、巨噬细胞源趋化因子（R&D Systems,型号MAB336），及其酶标抗体（R&D Systems,型号BAF336）；
3、β细胞素（R&D Systems,型号MAB261），及其酶标抗体（R&D Systems,型号BAF261）；
4、人皮肤T细胞虏获趋化因子（R&D Systems,型号MAB3761），及其酶标抗体（R&D Systems,型号BAF376）
5、人上皮中性粒细胞活化肽78（R&D Systems,型号MAB654），及其酶标抗体（R&D Systems,型号BAF254）
6、人巨噬细胞移动抑制因子（R&D Systems,型号MAB289），及其酶标抗体（R&D Systems,型号BAF289）
7、白介素28A（R&D Systems,型号MAB15871），及其酶标抗体（R&D Systems,型号BAF1587）
8、白介素29（R&D Systems,型号MAB15981），及其酶标抗体（R&D Systems,型号BAF1598）
9、酪氨酸激酶Axl（R&D Systems,型号MAB154），及其酶标抗体（R&D Systems,型号BAF154）
10、pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，将1.59克碳酸钠和2.93克碳酸氢钠加至1L蒸馏水中而得；
11、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，将0.2克磷酸二氢钾，2.9克十二水合磷酸氢二钠，8.0克氯化钠，0.2克氯化钾，0.5ml吐温-20加至1L蒸馏水中而得
12、血清蛋白稀释液，将0.1克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至100ml pH值为7.4的磷酸盐缓冲液而得。
13、终止液，2M硫酸溶液；
14、四甲基联苯胺底物溶液，为0.5ml四甲基联苯胺的无水乙醇溶液（10mg/5ml），10ml PH5.0底物缓冲液与32ul过氧化氢水溶液（0.75vol%）混合而得。其中，PH5.0底物缓冲液为含0.2M磷酸氢二钠和0.1M柠檬酸的蒸馏水溶液。
15、正常人血清；
16、阳性对照血清。
使用上述试剂盒，通过下述步骤分别检测9种细胞因子：
1．包被：用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液将细胞因子稀释至蛋白质含量为5ug/ml。加入0.1ml稀释后的细胞因子到聚苯乙烯板的反应孔中，于4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。
2．加样：将待检的慢性阻塞性肺病急性期患者血清样品用血清蛋白稀释液稀释3倍，将稀释后的待检血清样品0.1ml至上述已包被的反应孔中，在37℃孵育1小时，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟，同时做空白对照孔、用正常人血清做阴性对照孔，用阳性对照血清做阳性对照孔。
3．加辣根过氧化物酶标抗体：将细胞因子的酶标抗体用血清蛋白稀释液稀释3倍，在各反应孔中加入新鲜稀释的细胞因子的酶标抗体0.1ml，37℃孵育0.5小时后，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗3次，每次3分钟。
4．加底物液显色：在各反应孔中加入四甲基联苯胺底物溶液0.1ml，37℃下孵育10-30分钟。
5．终止反应：在各反应孔中加入终止液0.05ml。
6．结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。
将待检的慢性阻塞性肺病急性加重期患者血清样品孔的OD值除以阴性对照孔的OD值，得到患者的各细胞因子相对于正常人的表达比例，当此值大于或等于2.4代表该细胞因子表达增高，小于2.4代表该细胞因子表达降低。
当人淋巴组织趋化性细胞因子和β细胞素表达水平增高且巨噬细胞源趋化因子表达水平降低，说明该患者处于慢性阻塞性肺病急性加重期。
当出现人淋巴组织趋化性细胞因子表达水平增高、β细胞素表达水平增高以及巨噬细胞源趋化因子表达水平降低中的一种或两种情况时，说明该患者可能处于慢性阻塞性肺病急性加重期。
当人淋巴组织趋化性细胞因子、β细胞素未增高且巨噬细胞源趋化因子未降低，而出现人皮肤T细胞虏获趋化因子升高、人上皮中性粒细胞活化肽78降低、人巨噬细胞移动抑制因子降低、白介素28A降低、白介素29降低、酪氨酸激酶Axl升高中的至少一种情况时，说明患者可能处于慢性阻塞性肺病急性加重期。
Claims (7)
1.一种用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒，其特征在于，包括抗细胞因子的抗体及抗细胞因子的酶标抗体，所述的抗细胞因子的抗体包括抗人淋巴组织趋化性细胞因子的抗体、抗巨噬细胞源趋化因子的抗体和抗β细胞素的抗体。
2.如权利要求1所述的用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒，其特征在于，所述的抗人淋巴组织趋化性细胞因子的抗体为单克隆鼠IgG抗体，抗巨噬细胞源趋化因子的抗体为单克隆鼠IgG2B抗体，抗β细胞素的抗体为单克隆鼠IgG1抗体。
3.如权利要求1所述的用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒，其特征在于，抗人淋巴组织趋化性细胞因子的酶标抗体为多克隆羊抗人淋巴组织趋化性细胞因子IgG抗体，抗巨噬细胞源趋化因子的酶标抗体为多克隆鸡抗人巨噬细胞源趋化因子IgY抗体，抗β细胞素的酶标抗体为多克隆羊抗人β细胞素IgG抗体。
4.如权利要求1所述的用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒，其特征在于，所述的抗细胞因子的抗体还包括抗人皮肤T细胞虏获趋化因子的抗体、抗人上皮中性粒细胞活化肽78的抗体、抗人巨噬细胞移动抑制因子的抗体、抗白介素28A的抗体、抗白介素29的抗体和抗酪氨酸激酶Axl的抗体。
5.如权利要求4所述的用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒，其特征在于，所述的抗人皮肤T细胞虏获趋化因子的抗体为单克隆鼠IgG2抗体，抗人上皮中性粒细胞活化肽78的抗体为单克隆鼠IgG1抗体，抗人巨噬细胞移动抑制因子的抗体为单克隆鼠IgG1抗体，抗白介素28A的抗体为单克隆鼠IgG2B抗体，抗白介素29的抗体为单克隆鼠IgG2A抗体，抗酪氨酸激酶Axl的抗体为单克隆鼠IgG1抗体。
6.如权利要求4所述的用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒，其特征在于，抗人皮肤T细胞虏获趋化因子的酶标抗体为多克隆羊抗人皮肤T细胞虏获趋化因子IgG抗体，抗人上皮中性粒细胞活化肽78的酶标抗体为多克隆羊抗人上皮中性粒细胞活化肽78 IgG抗体，抗人巨噬细胞移动抑制因子的酶标抗体为多克隆羊抗人巨噬细胞移动抑制因子IgG抗体，抗白介素28A的酶标抗体为多克隆羊抗人白介素28A IgG，抗白介素29的酶标抗体为多克隆羊抗人白介素29 IgG抗体，抗酪氨酸激酶Axl的酶标抗体为多克隆羊抗人酪氨酸激酶Axl IgG抗体。
7.如权利要求1所述的用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒，其特征在于，所述的用于诊断慢性阻塞性肺病急性加重期的试剂盒还包括pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，血清蛋白稀释液，终止液，四甲基联苯胺底物溶液，正常人血清和阳性对照血清。
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