CN101717434A - 锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1及其单克隆抗体和应用 - Google Patents

锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1及其单克隆抗体和应用 Download PDF

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CN101717434A CN200910213699A CN200910213699A CN101717434A CN 101717434 A CN101717434 A CN 101717434A CN 200910213699 A CN200910213699 A CN 200910213699A CN 200910213699 A CN200910213699 A CN 200910213699A CN 101717434 A CN101717434 A CN 101717434A
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mcdv
thr
leu
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张锐
翁少萍
何建国
区宇洁
董传甫
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Sun Yat Sen University
National Sun Yat Sen University
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National Sun Yat Sen University
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Abstract

本发明公开一种锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1及其单克隆抗体和应用，该锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过对MCDV进行研究分析，首次获得其结构蛋白1的氨基酸序列、核苷酸序列和单克隆抗体，并对该结构蛋白1进行了定位，为锯缘青蟹的病毒病研究提供了新的研究方向。本发明筛选到结构蛋白1的单克隆抗体可用于MCDV的监控，制备检测MCDV的病毒试剂盒，以及制备检测MCDV的病毒胶体金试纸。

Description

锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1及其单克隆抗体和应用
技术领域
本发明涉及青蟹养殖生物技术领域，尤其涉及锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1及其单克隆抗体和应用。
背景技术
锯缘青蟹(Scylla serrata，学名为Mud crab)，俗称青蟹，主要分布于印度洋-太平洋的热带、亚热带海域，是经济价值很高的食用蟹类，为名优养殖品种之一。
病毒病是锯缘青蟹养殖过程中的主要病原，其造成青蟹养殖业的严重经济损失，因此锯缘青蟹养殖过程中，对各类病毒病的研究是当前的重要课题。
2004年始在珠海发现患“嗜睡病”(SD)的锯缘青蟹同时存在两种病毒：锯缘青蟹双顺反子病毒(Mud crab dicistrivirus，MCDV)和呼肠孤病毒(mudcrab reovirus，MCRV)。
MCDV是水生甲壳动物中发现的单股正链RNA病毒ssRNA(+)，其单独存在就可以使锯缘青蟹致病，而且死亡率可达80％以上，因此对MCDV的感染机制和致病性进行研究，在青蟹养殖业中及时监测MCDV的发病情况，寻找有效的预防和防治方法，是当前锯缘青蟹养殖需要解决的重要问题。
双顺反子病毒(dicistrivirus)是一个新分类的病毒属，随着海洋病毒学的不断深入，越来越多的水生生物的双顺反子病毒被发现，但是其结构蛋白还未见研究，有关锯缘青蟹双顺反子病毒(MCDV)的结构蛋白的研究也未见有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种锯缘青蟹双顺反子病毒的结构蛋白1。
本发明的另一个目的在于提供上述锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1的单克隆抗体。
本发明的另一个目的在于提供上述单克隆抗体在制备检测MCDV病毒试剂盒或胶体金试纸中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
本发明人从同时存在于锯缘青蟹的两种病毒(MCDV和MCRV)中分离纯化出MCDV，电镜观察发现其直径为20～30nm，球形，无囊膜，呈二十面体对称，在CsCl中的浮力密度为1.32～1.36g/cm3，核酸性质分析发现此病毒基因组为单股正链RNA病毒ssRNA(+)。
本发明人对MCDV的基因组分析发现其包含有被基因间非编码区(IGR)隔开的两个开放读码框ORF1和ORF2，其中，ORF1编码非结构蛋白，ORF2编码结构蛋白。
本发明人对ORF2进行进一步地研究发现，ORF2由三个结构蛋白组成，分别是分子量为53KD的结构蛋白1(简称VP1)、分子量为35KD的结构蛋白2(简称VP2)和分子量为22KD的结构蛋白3(简称VP3)。
接着，本发明人对结构蛋白1进行了一系列的研究分析，如下所示：
1、氨基酸序列及其编码核苷酸序列
结构蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
编码结构蛋白1的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示。
2、单克隆抗体的获得
本发明人首先采用全病毒(MCDV)作为抗原，进行体内免疫试验，然后采用HAT与HT选择杂交瘤细胞、间接ELISA法筛选阳性单克隆抗体，接着利用Western blot方法从阳性单克隆抗体中将结构蛋白1的单克隆抗体筛选出来，最终获得能识别MCDV结构蛋白1的单克隆抗体。
3、结构蛋白1的定位
本发明人在MCDV病毒分离纯化的基础上，对其三个结构蛋白的N端氨基酸进行了测序，并与MCDV的基因组序列对比和结构分析，在MCDV基因组中找到了三个结构蛋白的相应位置。
为了进一步对结构蛋白1精确定位，本发明人采用免疫电镜方法，观察上述Western blot结果中，结构蛋白1的单克隆抗体所识别的抗原决定簇的位置，电镜结果显示，该抗原决定簇定位于病毒粒子的边缘，从而实现了对MCDV结构蛋白1的精确定位。
本发明筛选到的MCDV结构蛋白1的单克隆抗体可用于MCDV的感染机制和致病性研究，用于青蟹养殖业中及时监测MCDV的发病情况，用于锯缘青蟹双顺反子病毒(MCDV)活体的中和作用，以及用于制备体外检测样品中是否存在MCDV病毒的试剂盒或胶体金试纸条。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明通过对MCDV进行研究分析，首次获得其结构蛋白1的氨基酸序列、核苷酸序列和单克隆抗体，并对该结构蛋白1进行了定位，为锯缘青蟹的病毒病研究提供了新的研究方向；
2.本发明筛选到结构蛋白1的单克隆抗体可用于MCDV监控和检测的多个方面。
附图说明
图1为实施例1中纯化MCDV的SDS-PAGE电泳图；
其中，M为蛋白marker，1～5为纯化的MCDV粒子，6为53KD的MCDV-VP1，7为35KD的MCDV-VP2，8为22KD的MCDV-VP3；
图2为实施例3中抗体识别蛋白的Western-blot鉴定电泳图；
其中，1～5为识别MCDV-VP1的阳性单克隆抗体，M为蛋白marker，箭头所指为53KD的MCDV-VP1；
图3为实施例3筛选的识别MCDV-VP1的阳性单克隆抗体间接免疫电镜图；
图4为实施例3筛选的识别MCDV-VP1的阳性单克隆抗体间接免疫电镜图；
图5为实施例4中阴性对照免疫电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1MCDV结构蛋白1的获得
本实施例通过对MCDV纯化、N端测序与分析，得到结构蛋白1的氨基酸序列和核苷酸序列，并对结构蛋白1进行生物学分析，预测其理化性质及保守功能结构域，为MCDV结构蛋白的功能研究奠定基础，其具体步骤如下所示。
1.MCDV的纯化
(1)称量病蟹的鳃样品约15g，液氮下迅速研磨至粉末状；
(2)将研好的粉末倒入250ml离心管中，按20倍体积的量加入PBS，匀浆；
(3)将匀浆后的病毒液4℃离心除渣：1000rpm离心20min；转向后3000rpm离心3min；上清转入新管，平衡后，12000～15000rpm高速离心1小时；
(4)收集上述离心上清液，再次44000rpm(200000×g)离心2小时或者33000rpm(150000×g)离心7～10小时，沉淀病毒；
(5)将沉淀的病毒粒子中加入0.5ml PBS分散过夜；
(6)制备CsCl密度梯度：分别用质量百分比浓度为15％、25％、35％和45％的CsCl溶液先轻后重依次加入SW41透明离心管中；
(7)将分散过夜的病毒粒子加入CsCl梯度的最上层，35000rpm超速离心10小时左右；
(8)吸出病毒条带，在35质量％蔗糖垫上，用PBS洗涤，35000rpm超速离心2小时；
(9)初步纯化的每条带的病毒液分别上第二次CsCl梯度，重复步骤(7)，(8)，所述CsCl梯度同步骤(6)；
(10)收集纯化病毒液，取其中5～10μl 4℃保存，以备及时测定病毒浓度和电镜观察，其余-80℃保存备用。
2.纯化MCDV的浓度测定、电镜观察和SDS-PAGE鉴定
取2～5μl上述新鲜纯化的病毒液，用紫外分光光度计粗略测定病毒浓度，结果为2.56μg/μl。
取5μl病毒悬液滴到喷有碳粉的铜网上，吸附1min，用滤纸吸干悬液；然后，用2％的磷钨酸溶液染色40秒，再用滤纸吸去多余染液；灯照烘干，用Philips-CM10透射电子显微镜观察病毒的形态、数量和种类，通过统计多个视野中两种病毒粒子的数量计算其纯度，本实施例纯化所得MCDV病毒液的纯度为99.99％。
取10μl上述新鲜纯化的病毒液，进行常规的SDS-PAGE电泳，观察电泳结果中的蛋白带型，结果如图1所示，纯化的MCDV经SDS-PAGE电泳，可见清晰的VP1、VP2、VP3三条蛋白带，与预期的MCDV的三个结构蛋白质相一致，分别命名为VP1、VP2和VP3，分子量分别为53KD、35KD和22KD。
实施例2MCDV结构蛋白1的序列测定及生物学分析
根据实施例1中的SDS-PAGE电泳结果，MCDV含有分子量为53KD的结构蛋白1(简称VP1)、分子量为35KD的结构蛋白2(简称VP2)和分子量为22KD的结构蛋白3(简称VP3)。
本实施例对结构蛋白1进行N端测序以及生物学分析。
按照本领域进行蛋白质N端氨基酸测序的常规操作，首先制备MCDV的PVDF膜上，选择PVDF膜上的结构蛋白1，进行N端氨基酸测序。
测序方法：EDMAN降解法。
测序仪器：美国Applied Biosystems公司的PROCISE491测序仪。
测序结果：
结构蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
编码结构蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示。
实施例3MCDV结构蛋白1的单克隆抗体的制备
本实施例首先采用全病毒也就是MCDV作为抗原，进行体内免疫试验，然后采用HAT与HT选择杂交瘤细胞、间接ELISA法筛选阳性单克隆抗体，接着利用Western blot方法从阳性单克隆抗体中将结构蛋白1的单克隆抗体筛选出来，最终获得5株能识别MCDV结构蛋白1的单克隆抗体，具体步骤如下所示。
1.体内免疫试验
体内免疫试验的抗原采用MCDV，其操作采用本领域技术人员进行体内免疫试验时的常规操作，分别对BalB/C鼠和新西兰大白兔进行体内免疫试验，最后分别收集血液(BalB/C鼠和新西兰大白兔)，在室温下放置30min，待其凝固后，放置4℃过夜使血块收缩，有血清析出。次日，吸出血清，其余的血液于4℃1500g离心10min，取上清液即为抗血清，与前面的血清混合，分装，置-80℃保存。
上述制备的抗血清中含有多种抗体，下面采用HAT与HT选择杂交瘤细胞、和间接ELISA法将其中的阳性单克隆抗体筛选出来，也就是将MCDV的单克隆抗体筛选出来。
2.阳性单克隆抗体的筛选
本实施例的HAT与HT选择杂交瘤细胞、和间接ELISA法均采用本领域技术人员的常规操作，结果筛选到7株强阳性克隆。
3.抗体识别蛋白的Western-blot鉴定
本实施例采用本领域技术人员的常用的Western-blot方法，从上述7株强阳性克隆，筛选出能够识别MCDV-VP1的阳性克隆，最终得到5株可识别MCDV-VP1的阳性克隆。
Western-blot采用本领域技术人员的常规操作，5株可识别MCDV-VP1阳性克隆的Western-blot电泳图如图2所示。
实施例4MCDV结构蛋白1的免疫电镜定位
为了确定MCDV结构蛋白1在病毒粒子上的定位，本实施例采用实施例3制备所得MCDV结构蛋白1单克隆抗体作为一抗(1∶2000)，胶体金为二抗，对结构蛋白1进行间接免疫电镜的细胞定位。
本实施例只是选择了实施例3筛选到的可识别MCDV结构蛋白1的单克隆抗体中的任意两株，进行免疫电镜定位。
如图3和4所示(bars＝20nm)，负染后电镜下可以清楚的看到，高电子密度的黑色金颗粒有规律的围绕在病毒粒子的边缘，说明胶体金在MCDV单抗作为一抗的标记是特异性标记，而不是假阳性结果，此外从图上可以看出，MCDV结构蛋白1单克隆抗体其作用的抗原决定簇在病毒衣壳上。
阴性血清作为一抗或者直接用PBS作阴性对照，阴性对照如图5所示，没有金颗粒标记在病毒粒子上。
锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1及其单克隆抗体和应用序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中山大学
<120>锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1及其单克隆抗体和应用
<130>
<160>3
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1344
<212>DNA
<213>锯缘青蟹(Scylla serrata)
<400>1
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Tyr Leu Pro Tyr Gly Ser Asp Val Gln Ser Leu Glu Asn Val Leu Ser
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<210>3
<211>448
<212>PRT
<213>锯缘青蟹(Scylla serrata)
<400>3
Ser Lys Asp Arg Asp Leu Ser Lys Val Ser Pro Tyr Glu Asn Ile Pro
1               5                   10                 15
Ala Lys Gly Phe Thr His Gly Val Gly Phe Asp Tyr Gly Val Ser Thr
            20                  25                  30
Phe Ala Phe Pro Asp Asn Ala Ile Asp Pro Thr Ile Ala Asn Pro Glu
        35                  40                  45
Ser Ile Asp Glu Met Ser Ile Gln Tyr Leu Ala Ser Arg Pro Tyr Met
    50                  55                  60
Leu Asp Arg Tyr Thr Ile Lys Gly Gly Asn Thr Pro Ser Pro Ser Gly
65                  70                  75                  80
Thr Val Val Ala Asp Ile Pro Ile Ser Pro Val Asn Tyr Ser Leu Tyr
                85                  90                  95
Gly Ser Ile Ile Arg Asp Tyr Arg Thr Ile Phe Gly Ala Pro Val Ser
            100                 105                 110
Leu Ala Val Ala Met Ala Ser Trp Trp Arg Ala Lys Ile His Leu Asn
        115                 120                 125
Leu Gln Phe Ala Lys Thr Gln Tyr His Gln Cys Arg Leu Leu Val Gln
    130                 135                 140
Tyr Leu Pro Tyr Gly Ser Asp Val Gln Ser Leu Glu Asn Val Leu Ser
145                 150                 155                 160
Gln Ile Ile Asp Ile Ser His Val Asp Glu Ser Gly Ile Asp Leu Cys
                165                 170                 175
Phe Pro Ser Ile Phe Thr Asn Lys Trp Met Arg Ser Tyr Asp Pro Ala
            180                 185                 190
Thr Glu Gly Tyr Thr Ala Gly Cys Ala Pro Gly Arg Ile Leu Ile Ser
        195                 200                 205
Val Leu Asn Pro Leu Ile Ser Ala Ser Thr Val Asn Asp Asp Ile Val
    210                 215                 220
Met Met Pro Trp Leu Thr Trp Glu Asn Leu Glu Leu Ala Glu Pro Gly
225                 230                 235                 240
Ser Leu Ala Lys Ala Ala Ile Gly Phe Asp Tyr Pro Ala Asp Ala Val
                245                 250                 255
Asp Glu Lys Trp Thr Ser Arg Glu Leu Pro Val Thr Gly Ser Ser Phe
            260                 265                 270
Asn Leu Phe Arg Asp Thr Thr Ile Val Leu Gly Ala Ser Thr Asn Ile
        275                 280                 285
Ser Asn Leu Val Leu Thr Asn Asp Asp Thr Gly Gly Asp Tyr Gln Ile
    290                 295                 300
Val Ser Thr Thr Pro Thr Gly Ser Tyr Val Ser Ala Val Thr Cys Pro
305                 310                 315                 320
Gln Gly Thr Tyr Thr Ile Thr His Asp Gly Val Gly Ala Thr Ile Ile
                325                 330                 335
Ser Asn Phe Pro Ile Leu Gly Ala Gly Glu Gly Pro Ser Phe Gln Ile
            340                 345                 350
Ser Ala Leu Arg His Gly Asp Lys Val Thr Ile Thr Glu Asp Pro Thr
        355                 360                 365
Lys Ile Asn Val Ser Gly Val Ser Phe Leu Thr Gly Thr Asn Ser Trp
    370                 375                 380
Lys Ala Ser Leu Lys Asp Ser Ser Gly Thr Leu Leu Gly Arg Leu Glu
385                 390                 395                 400
Tyr Asp Gly Thr Ser Phe Ser Ser Asp Ser Pro Ala Ser Leu Ile Pro
                405                 410                 415
Gly Lys Tyr Asn Val Glu Leu Asp Pro Ala Asp Asn Ser Ala Val Val
            420                 425                 430
Thr Ile Val Ala Asn Asn Ser Phe Gly Thr Ala Ser Leu Asp Thr His
        435                 440                 445

Claims (5)

1.一种锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种编码权利要求1所述结构蛋白1的DNA序列，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
3.一种与权利要求1所述结构蛋白1特异性结合的单克隆抗体。
4.权利要求3所述单克隆抗体在制备检测MCDV病毒试剂盒中的应用。
5.权利要求3所述单克隆抗体在制备检测MCDV病毒胶体金试纸条中的应用。
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