CN101710123A - 一种检测环丙沙星残留的胶体金层析试纸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测环丙沙星胶体金层析试纸，包括硝酸纤维素膜、样品垫、胶体金结合垫、吸水垫和PVC背衬。在本发明中，采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液并利用其标记环丙沙星单克隆，同时在硝酸纤维素膜上包被环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物及羊抗鼠IgG抗体，分别构成检测区(T)和质控区(C)。当待测样品中含有环丙沙星时能够使检测区颜色发生变化，从而通过肉眼判定结果。本发明提供的胶体金层析试纸灵敏度高、检测迅速、价格低廉，可以用于现场检测水产品中环丙沙星的残留。

Description

一种检测环丙沙星残留的胶体金层析试纸及其制备方法

技术领域：

本发明涉及兽药残留的免疫化学快速检测领域，更具体地涉及一种检测环丙沙星胶体金层析试纸，以胶体金作为显色剂，快速检测水产品中环丙沙星的残留。

背景技术：

环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)又名环丙沙星氟哌酸，属于第三代氟喹诺酮类药物。环丙沙星能通过抑制细菌DNA螺旋酶的合成，起到杀菌作用。作为广谱抗菌药，环丙沙星具有极强的杀菌能力，因此环丙沙星被广泛的应用在人和水产动物的疾病治疗上。由于环丙沙星在水产品中的残留直接威胁了公共卫生安全，因此环丙沙星已经被欧盟、美国、中国等列为了水产养殖禁用药物。

目前，环丙沙星的检测方法主要包括微生物法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、酶联免疫竞争法(ELISA)等。这些检测方法不仅需要以实验室平台为依托，还需要有专门的实验人员进行操作。其中微生物法虽然要求不高，但是检测的灵敏度达不到国家标准。高效液相色谱法、毛细电泳法、酶联免疫竞争法(ELISA)虽然灵敏度高，能够进行大规模检测，但是所花费的时间长、需要特定的仪器，不利于在基层推广和使用。

胶体金免疫层析(Gold-immunochromatography assay，GICA)是当今最快速的免疫学检测技术之一。该方法不仅灵敏度高、操作简单、不需要专门的仪器和专业的检测人员，而且几分钟内就可用肉眼观察判断实验结果，特别适合于广大基层单位及质检人员进行现场检测。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、价格低廉的快速检测水产品中环丙沙星残留的胶体金层析试纸。

本发明将环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物和羊抗鼠IgG固化在硝酸纤维素膜上分别作为检测区(T)和质控区(C)。当样品中含有环丙沙星时，环丙沙星和环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物共同竞争胶体金标记的环丙沙星单克隆抗体，通过检测区(T)颜色的有无判断样品中是否含有环丙沙星。

阳性：当C区有颜色而T区没有颜色时判断为阳性以“+”表示。

阴性：当C区有颜色而T区有颜色时判断为阴性以“-”表示。

无效：当C区没有颜色时判断为无效。

本发明技术方案如下

提供一种检测环丙沙星残留的胶体金层析试纸，包括硝酸纤维素膜(1)、样品垫(4)、胶体金结合垫(3)、吸水垫(2)、PVC背衬(5)，所述的胶体金结合垫上包被有环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物，所述的环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物中的环丙沙星单克隆抗体是由杂交瘤细胞株JY-1(CCTCC NO.C200947)分泌获得。

本发明还提供一种检测环丙沙星残留的胶体金层析试纸的制备方法，包括如下步骤：

(1)将环丙沙星结合到牛血清白蛋白上，制备环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物；

(2)利用环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物免疫小鼠，将免疫小鼠的脾细胞和SP/O细胞进行融合、筛选、克隆，得到分泌环丙沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(3)提取小鼠IgG免疫山羊，得到羊抗鼠IgG；

(4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

(5)将环丙沙星单克隆抗体加入制备好的胶体金中，得到环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物；

(6)将制备的环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物稀释后，添加至胶体金结合垫，在37℃烘箱放置1小时；

(7)将环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物和羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上，制备检测区(T)和质控区(C)，并用牛血清白蛋白封闭，37℃烘干；

(8)在PVC背衬上按照顺序贴上硝酸纤维素膜(1)、吸水垫(2)、胶体金结合垫(3)和样品垫(4)，将样品垫(4)盖住胶体金结合垫(3)，最后切成小条，加上塑料盒成品，真空包装。

该制备方法中所述的环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物是通过碳二亚胺法将环丙沙星偶联到牛血清白蛋白上。

所述的碳二亚胺法包括如下步骤：

(1)配制PH为5.0，含量为0.01mol/L的磷酸缓冲液；

(2)配制8mg/mL的牛血清白蛋白水溶液；

(3)配制20mg/mL的环丙沙星水溶液；

(4)配制240mg/mL的碳二亚胺水溶液；

(5)等体积比例混合上述的牛血清白蛋白水溶液、环丙沙星水溶液、碳二亚胺水溶液、磷酸缓冲液，在室温下反应2小时；

(6)将反应好的液体加入截留分子量14000的透析袋，用上述磷酸缓冲液透析48小时，至少换液一次；

(7)将透析好的液体，在-20℃预冷冻2-5小时，然后在-50℃下冷冻干燥，制成环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物固体粉末。

本发明的优点如下：

1)本发明的环丙沙星胶体金免疫层析试纸的检测限能够达到5ng/mL，比以往的环丙沙

星胶体金免疫层析试纸的检测限低1倍。

胶体金试纸的灵敏度与抗体自身的灵敏度有关。一般认为在一定范围内提高偶联物的偶联比率，能够显著提高制备抗体的效价及灵敏度。在本发明中，采用了改进的碳二亚胺法，制得的环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物的偶联比率高达30∶1。利用其免疫小鼠，制得的环丙沙星单克隆抗体的最低检测限能够达到1～5ng/ml。因此利用本发明的单克隆抗体制备的胶体金试纸也在一定范围内提高了灵敏度。

2)本发明的环丙沙星胶体金免疫层析试纸能够在5min中之内得出结果，比以往的环丙沙星胶体金免疫层析试纸的检测时间缩短1-5倍，从而提高了检测效率。

本发明采用了高亲和力抗体。亲和力越高表示抗原抗体的结合反应越快，抗原抗体复合物越不易解离，因此利用本发明中的抗体制备的胶体金-环丙沙星单克隆抗体能够更快速、紧密的结合环丙沙星，从而缩短胶体金试纸检测样品的时间。

3)本发明的环丙沙星胶体金免疫层析试纸只需要通过肉眼判断结果，不需要任何的仪器，从而大幅度的节约了检测成本。

综上所述，本发明环丙沙星胶体金免疫层析试纸具有灵敏度高、检测迅速、价格低廉等优点，适合进行现场检测。

附图说明

图1为环丙沙星偶联物的紫外扫描图谱

图2为胶体金的电镜扫描图片

图3为环丙沙星胶体金免疫层析试纸的示意图

图4为环丙沙星胶体金免疫层析试纸的检测结果示意图

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入发明的保护范围。

(1)本发明所用试剂：环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、培氟沙星，含量≥98.5％，购自浙江国邦药业有限公司；牛血清蛋白(BSA)、鸡卵血清白蛋白(OVA)、氯金酸、硝酸纤维素膜(NC)、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫、PVC背衬购于鼎国生物公司；乙基碳二亚胺(EDC)，纯度≥99.3％，购自上海延长生化科技发展有限公司；1640培养基(购自GIBCO公司)；胎牛血清(购自HYCLONE公司)；HAT(购自GIBCO公司)；小牛血清(购自HYCLONE公司)；二甲亚砜(购自SIGMA公司)，其它化学试剂购于上海国药有限公司。

(2)Balb/c小鼠，购自上海实验动物中心；SP2/0骨髓瘤细胞，购自中科院细胞库。

实施例1：环丙沙星胶体金免疫层析试纸的制备

一、环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物的制备

(1)称取8.5g的氯化钠、2.85g磷酸氢二钠、0.2g氯化钾，0.27g磷酸二氢钾加入950mL的蒸馏水，滴加盐酸调节pH(酸碱度)至5.0，再加入50mL的蒸馏水，配置成1000mL，浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲液。

(2)称取40mg的牛血清白蛋白加入5mL的磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)制成8mg/mL(0.12μmol/L)的牛血清白蛋白水溶液。

(3)称取100mg的环丙沙星加入5mL的磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)制成20mg/mL(60.4μmol/L)的环丙沙星水溶液。

(4)称取960mg碳二亚胺加入4mL磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)制成240mg/mL(1251.9μmol/L)的水溶液。

(5)在1.5mL的离心管中分别加入8mg/mL(0.12μmol/L)的牛血清白蛋白水溶液、20mg/mL(60.4μmol/L)的环丙沙星水溶液、240mg/mL(1251.9μmol/L)的碳二亚胺水溶液各0.25mL，再加入0.25mL的磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)，在室温下反应2小时。

(6)将反应好的液体加入透析袋(半周长22mm，截留分子量14000)中再放入装有1L磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)的烧杯中，透析48小时，每24小时换液一次。

(7)将透析好的液体，在-20℃预冷冻2小时，然后在-50℃下冷冻干燥，制成环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物固体粉末。

二、环丙沙星单克隆抗体的制备

(一)免疫

将环丙沙星-牛血清白蛋白粉末用磷酸缓冲液(PH为5.0，含量为0.01mol/L)稀释成为2mg/mL免疫原溶液，取100μL免疫原溶液(2mg/mL)加入100μL福氏完全佐剂，充分混匀后，取4周龄的Balb/c小鼠，采用腹部注射，进行免疫。

免疫两周后，取100μL免疫原溶液(2mg/mL)加入100μL福氏不完全佐剂，充分混匀后，采用腹部注射，进行免疫。

一周后，取100μL免疫原溶液(2mg/mL)进行尾静脉加强免疫。

十天后，取50μL免疫原溶液(2mg/mL)进行尾静脉注射，进行加强免疫。

(二)细胞融合及筛选

1、骨髓瘤细胞的复苏及培养：

融合前10天，将冷冻的SP2/0骨髓瘤细胞从-70℃冰箱中取出，立即放入37℃水浴融化，1000转/min离心3min，加入1640(含10％胎牛血清)培养液，置4.5％CO₂培养箱内培养。处于对数生长期的瘤细胞浑圆，透亮，大小均一，排列整齐，呈半致密分布，取处于对数生长期的骨髓瘤细胞供细胞融合用。

2、融合：

(1)在Balb/c小鼠最后一次免疫的第三天，无菌取脾脏过100目网筛，用RPMI1640(-)吹下形成单细胞悬液，用于细胞融合。

(2)Balb/c小鼠，无菌取出胸腺后，过100目网筛，用RPMI1640(-)吹下形成单细胞悬液。

(3)将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液分别离心3min，1000转/min，弃去上清液，脾细胞沉淀用预热到37℃的RPMI1640(-)重悬，胸腺细胞沉淀用少量预热到37℃的含1％HAT的1640(含10％胎牛血清)选择性细胞培养液重悬。

(4)取3×10⁷个处于对数生长期的骨髓瘤细胞，1000转/min离心3min，去上清液后，沉淀用RPMI1640(-)重悬。

(5)将脾细胞悬液与瘤细胞悬液混合均匀后，1000转/min离心3min，完全吸去上清液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀。

(6)将离心管置于37℃水浴中预热的盛水烧杯中，用吸管吸已经预热到37℃的聚乙二醇溶液1mL，将管尖插入管底，轻轻搅动细胞沉淀，并缓缓滴加聚乙二醇，在1min内加完。然后在37℃水浴中静置5min。

(7)滴加已经预热到37℃的RPMI1640(-)液40mL，前缓后快，然后1000转/min离心5min，弃去上清液。

(8)将细胞沉淀用3mL预热到37℃的1640(含10％胎牛血清)细胞培养液重悬，取2mL冻存于-70℃(9份1640(含10％胎牛血清)+1份二甲亚砜)，余细胞悬液里补加含有1％HAT的1640(含10％胎牛血清)选择性细胞培养液和小鼠胸腺细胞40mL，混合均匀后每孔100μL滴加到4个96孔板内。培养于CO₂浓度为4.5％和37℃恒温恒湿条件下的CO₂培养箱中。

(9)细胞融合2周后，杂交瘤细胞群落长到占96孔培养板的孔底1/3时开始用间接酶联免疫法检测。选取阳性值大于阴性值2倍，且阳性值大于0.5以上的细胞孔进行克隆，采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆，直到获得稳定分泌环丙沙星单克隆抗体的细胞株。选取其中一株细胞株命名为JY-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCCNO.200947。

(三)单克隆抗体的产生与纯化(原腹水制备)

取7周的Balb/c小鼠，每只注射0.5mL的降植烷。一周后腹腔接种用无血清培养基稀释处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只注射细胞数为5×10⁶个，间隔4天后，观察小鼠腹水情况，待小鼠腹部膨大，精神变差，濒临死亡时，采集腹水。将腹水离心，取上清液，测定效价，分装保存在-70℃。用硫酸铵沉淀法进行纯化，得到环丙沙星单克隆抗体。抗体亲和力达2.88×10⁹L/mol，属于高亲和力抗体。

三、羊抗鼠抗抗体的制备

以山羊作为免疫动物，以小鼠IgG抗体作为免疫原对山羊进行免疫，得到的抗体血清经纯化后得到羊抗鼠抗抗体。

四、环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物的制备

1.胶体金的制备

将0.01％氯金酸(HAu₂Cl₄)溶液100mL加热至沸腾，在高速搅拌的同时迅速加入1％柠檬酸三钠溶液3mL，继续加热直至溶液颜色变为亮红色，热源撤去后需继续搅拌10min。冷却至室温后得到胶体金溶液。

2.环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物的制备

取100mL的胶体金溶液，加入一定量的碳酸钾调节pH至8.5。取10mL调节好的胶体金溶液加入20μL环丙沙星单克隆抗体(1.284mg/mL)及1mL10％的牛血清白蛋白溶液，离心10000转/min，20min。取沉淀物备用。

3.制备胶体金结合垫

用点膜仪将制备好的环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物均匀地包被在胶体金结合点上，每20cm的胶体金结合加入400μL的环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物，37℃烘干密封保存备用。

4.硝酸纤维素膜的制备

用点膜仪将0.02mg/mL的环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物和0.02mg/mL的羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜(1)上作为检测区(T)和质控区(C)，再用含10％的牛血清白蛋白进行封闭。37℃，烘干。

5.免疫胶体金的组装

在PVC背衬(5)上按顺序贴上硝酸纤维素膜(1)、吸水垫(2)、胶体金结合垫(3)和样品垫(4)，将样品垫(4)盖住胶体金结合垫(3)。如图3所示。最后切成50mm×2mm的小条，加上塑料盒，真空包装。

实施例2：样品中环丙沙星残留的检测

一、样品前处理(鲫鱼、鲈鱼、鲑鱼、螃蟹、罗氏沼虾)

取5g的样品，加入30mL的乙腈作为提取液，高速组织捣碎机匀浆，充分振荡15min，4500转/min离心15min，取上清液。往残渣中加入提取溶剂30mL，重复上述操作1次，合并上清液。提取1mL的样品上清液，分别添加1mL的环丙沙星标准液(20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，1ng/mL)。

二、用制备的环丙沙星胶体金免疫层析试纸检测

将上述提取的上清液，滴入样品孔，3-5min后观察结果，超过10min结果无效。

三、结果分析

当样品添加环丙沙星标准液浓度高于10ng/mL时，检测区(T)不出现红色条带且质控区(C)出现红色条带，判定结果为阳性，如图4中B。当样品添加环丙沙星标准液浓度低于10ng/mL时，检测区(T)出现红色条带且质控区(C)也出现红色条带，判定结果为阴性，如图4中A。由于将环丙沙星标准液添加至上清液时，标准液浓度稀释了一倍，因此本发明的环丙沙星胶体金免疫层析试纸的最低检测限为5ng/mL。若试纸条出现如图4中C的情况，即质控区(C)无条带，表明试纸条已失效。

实验例3环丙沙星胶体金免疫层析试纸的特异性测定

分别取1mg/mL的恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、培氟沙星标准液加入环丙沙星胶体金免疫层析试纸，测定本发明的环丙沙星胶体金免疫层析试纸的特异性。结果表明：除了恩诺沙星的检测结果为阳性外，其余均为阴性。将恩诺沙星标准溶液倍比稀释为20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，1ng/mL的标准溶液，利用本发明的试纸检测，结果表明本发明的试纸对恩诺沙星的检测限为10ng/mL。说明本发明的环丙沙星胶体金免疫层析试纸的特异性强，且可以用于检测环丙沙星和恩诺沙星的残留。

实施例4：特性鉴定

为了验证本发明的有效性，进行了以下测定。

一、环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物的鉴定

通过紫外分光光度法对环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物进行鉴定。将环丙沙星-牛血清白蛋白稀释到1.6mg/mL，配制环丙沙星标准液和BSA标准液，在250～350nm间进行扫描。以环丙沙星-牛血清白蛋白的特征峰274nm，建立CIP和BSA的吸收值-浓度标准曲线，计算CIP-BSA中CIP的浓度。结合比＝(CIP浓度/CIP相对分子量)/(BSA浓度/BSA相分子量)。结果发现环丙沙星的峰值在270nm，牛血清白蛋白的峰值在278nm，环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物的峰值出现在274nm，通过对比发现偶联物的峰值发生了迁移，从而证明了偶联的成功。经过紫外扫描得到环丙沙星在274nm处的吸收值-浓度标准曲线方程为y＝14.724x+0.0332，R²＝0.9976，牛血清白蛋白的吸收值-浓度标准曲线方程为y＝0.5481x-0.0039，R²＝0.9997。将环丙沙星-牛血清白蛋白(1.6mg/mL)的吸光度与BSA(1.6mg/mL)的吸光度的差值代入环丙沙星标准曲线，即可得到环丙沙星的浓度。根据公式计算得出环丙沙星-牛血清白蛋白的偶联比率可达30∶1。见图1为环丙沙星偶联物紫外扫描图。

二、环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物粒径测定

制备的环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物中颗粒的大小是用透射电镜(TEM，应用HITACHI H28100)分析，在预先处理好的覆有Formvar膜(Ted Pella，Inc.)的200目的铜网上滴一滴胶体金溶液，阴干后即可进行测试。通过电镜扫描发现，制备的环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物大小均一、分布均匀，平均粒径在20nm。如图2所示。

Claims (4)

1.一种检测环丙沙星残留的胶体金层析试纸，包括硝酸纤维素膜(1)、样品垫(4)、胶体金结合垫(3)、吸水垫(2)、PVC背衬(5)，所述的胶体金结合垫上包被有环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物，其特征在于所述的环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物中的环丙沙星单克隆抗体是由杂交瘤细胞株JY-1(CCTCC NO.C200947)分泌获得。

2.一种如权利要求1所述的胶体金层析试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将环丙沙星结合到牛血清白蛋白上，制备环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物；

(2)利用环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物免疫小鼠，将免疫小鼠的脾细胞和SP/O细胞进行融合、筛选、克隆，得到分泌环丙沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(3)提取小鼠IgG免疫山羊，得到羊抗鼠IgG；

(4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

(5)将环丙沙星单克隆抗体加入制备好的胶体金中，得到环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物；

(6)将制备的环丙沙星单克隆抗体-胶体金标记物稀释后，添加至胶体金结合垫，在37℃烘箱放置1小时；

(7)将环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物和羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上，制备检测区(T)和质控区(C)，并用牛血清白蛋白封闭，37℃烘干；

(8)在PVC背衬上按照顺序贴上硝酸纤维素膜(1)、吸水垫(2)、胶体金结合垫(3)和样品垫(4)，将样品垫(4)盖住胶体金结合垫(3)，最后切成小条，加上塑料盒成品，真空包装。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物是通过碳二亚胺法将环丙沙星偶联到牛血清白蛋白上。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的碳二亚胺法包括如下步骤：

(1)配制PH为5.0，含量为0.01mol/L的磷酸缓冲液；

(2)配制8mg/mL的牛血清白蛋白水溶液；

(3)配制20mg/mL的环丙沙星水溶液；

(4)配制240mg/mL的碳二亚胺水溶液；

(5)等体积比例混合上述的牛血清白蛋白水溶液、环丙沙星水溶液、碳二亚胺水溶液、磷酸缓冲液，在室温下反应2小时；

(6)将反应好的液体加入截留分子量14000的透析袋，用上述磷酸缓冲液透析48小时，至少换液一次；

(7)将透析好的液体，在-20℃预冷冻2-5小时，然后在-50℃下冷冻干燥，制成环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物固体粉末。

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