CN101705207A - 一种羊水细胞培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明一种羊水细胞培养基属于生物化学领域。羊水细胞培养基是包含下列组份：基础培养，转铁蛋白，亚硒酸钠，胰岛素，三碘甲状腺氨酸，胰高血糖，碱性成纤维细胞生长因子，氢化可的松，睾酮，雌二醇，孕酮，添加抗氧化剂，抗氧化剂是维生素E和L-抗坏血酸的混合物，在羊水细胞培养基中添加体积百分比为4-15％的胎牛血清后，可用于羊水细胞培养，在较短的7、8天时间内可培养得到能够满足临床诊断和科研要求的大量的处于分裂期的羊水细胞。本发明羊水细胞培养效果有显著改进，克隆形成率和克隆生长速度明显增加，减少了培养时间，同时提高了细胞培养成功率，充分发挥了不同的抗氧化剂的维生素E和L-抗坏血酸的协同作用。

Description

一种羊水细胞培养基
技术领域
本发明一种羊水细胞培养基属于生物化学领域。
背景技术
产前诊断是优生学的重要组成部分，它是建立在遗传咨询基础上通过产前检测胎儿健康情况，对患有严重遗传病、先天畸形的患儿可以及早采取措施，减少人群中有害基因积累，以减少患儿出生，提高人口素质，因此具有十分重要的意义。产前诊断目前主要有孕早期绒毛组织取材、孕中期羊水和脐带血、孕妇外周血分离胎儿细胞及植入前诊断等方法，但孕中期羊水细胞检查仍是最主要的方法。这是因为与其它方法相比，羊水穿刺检查具有操作安全，妊娠流失率低于自然流产率以及诊断染色体异常较为可靠的优点。
羊水穿刺检查的主要对象为高龄(大于34岁)、不良接触史、既往畸胎弱智分娩史、既往染色体异常儿分娩史、夫妻之一核型异常、B超示畸型、家族性连锁遗传病史、近亲婚配等的孕妇。其中，高龄孕妇是主要检查对象，在国内占了整个检查对象的1/3。羊水细胞培养后通过染色体显带技术，能够辨别三体综合症、平衡易位、倒位以及性染色体异常等染色体方面的疾病。由于羊水中活细胞少，培养周期长，无菌要求高，稍不注意即致失败。即使培养成功，因分裂相少、形态不佳而达不到分析要求，无法进行进一步研究，使羊水产前诊断的应用到受限制。因此成功的羊水细胞培养，除需要严格的实验操作技术和经验外，培养基的组成也是非常关键的。羊水细胞可能是胎儿皮肤、消化道、呼吸道及泌尿生殖道脱落的细胞，其中只有小部分是有活力的细胞(约0.1％)，而活力细胞又以贴壁型细胞为主。如何能促其在体外培养中贴壁增殖，是成功培养羊水细胞的关键因素。
传统的羊水培养基组成是：基础培养基(RPMI1640、DMEM或F12)+小牛血清(胎牛血清)。但这种培养基培养的成功率低，成功率低于30％，而且平均培养周期长，培养周期需要20天，且分裂相少，不能有效用于羊水细胞检查；为了缩短羊水细胞培养周期，提高成功率，已有了改良型的培养基的研究报道，基本上是在基础培养基的基础上添加含有生长因子的提取物组成。如Chang HC(ChangHC，Jones OW，Masui H，Human amniotic fluid cells grown in ahormone-supplemented medium：suitability for prenatal diagnosis，Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.79，4795-4799(1982))。在DMEM与F12按1∶1混合的基础培养基(DMEM/F12)中添加10种促生长因子，分别为：转铁蛋白(transferrin)5mg/L、亚硒酸钠20nMol/L、胰岛素(insulin)10mg/L、三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine)0.1nMol/L、胰高血糖素(glucagon)1mg/L、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ug/L、氢化可的松(hydrocortisone)1nMol/L、睾酮(testosterone)1nMol/L、雌二醇(estradiol)1nMol/L、孕酮(progesterone)1nMol/L。Chang HC把含此10种促生长因子配方的培养基称为H培养基，而将此10种促生长因子含量增倍后的培养基称为H-1培养基。生长因子加倍的H-1培养基的培养效果要明显好于H培养基，H-1在培养基添加较低含量的胎牛血清的情况下，依然能够显著增加羊水细胞的克隆形成率和克隆生长速度，使培养成功率达到99％以上，培养周期缩短到10天左右。
实际培养过程中，我们发现虽然配制的含不同比例胎牛血清的分别在DMEM/F12、α-MEM、F12等常用的基础培养基基础上添加而成的H-1培养基都可以成功地培养出羊水细胞，但依然存在着克隆数目较低，克隆增殖较慢，收获的分裂相细胞仍较少等问题。因此当种植的羊水样品状况不佳时，即活性细胞较少，克隆数目只有1-2个，无法在短期内生成足够的分裂相细胞，此时需胰酶消化后传代培养，这无疑延长了细胞培养周期。因此H-1培养基的培养效果与临床检验单位的需求仍有一定差距，有必要对培养基配方进行改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够迅速有效地增加体外增殖的羊水细胞克隆数目和细胞增殖速度，缩短培养周期，获得分裂相染色体数目多的羊水细胞培养基及其配方。
本发明的目的是通过以下措施来达到的：研究表明，在羊水培养中增加抗氧化剂，降低活性氧ROS浓度，会促进羊水细胞的克隆和增殖，在培养基中添加经过优化组合的不同种类的抗氧化剂，降低培养基中的活性氧ROS浓度，以达到增加贴壁型羊水细胞克隆数目，提高细胞增殖速度的协同作用效果。
一种羊水细胞培养基是包含下列组份：
基础培养基                         DMEM/F12细胞培养基
转铁蛋白(transferrin)              10mg/L
亚硒酸钠                           40nMol/L
胰岛素(insulin)                    20mg/L
三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine)   0.2nMol/L
胰高血糖素(glucagon)               2mg/L
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)       20ug/L
氢化可的松(hydrocortisone)         2nMol/L
睾酮(testosterone)                 2nMol/L
雌二醇(estradiol)                  2nMol/L
孕酮(progesterone)                 2nMol/L
为了提高羊水细胞培养基的培养效果，增加细胞克隆数和分裂相细胞数，在上述组份的基础上，添加抗氧化剂。
抗氧化剂是维生素E和L-抗坏血酸两种抗氧化剂的混合物。
本发明添加维生素E 5mg-20mg/L和L-抗坏血酸25-60mg/L的混合物。
本发明添加维生素E和L-抗坏血酸的混合物有较好的效果，维生素E和L-抗坏血酸有显著的协同作用，可以显著增加细胞克隆生长速度和分裂相细胞数。而当维生素E为10mg/L、L-抗坏血酸50mg/L有最好的效果。
本发明在羊水细胞培养基中添加体积百分比为4-15％的胎牛血清后，可用于羊水细胞培养，在较短的7、8天时间内，可培养得到能够满足临床诊断和科研要求的大量的处于分裂期的羊水细胞。
本发明羊水细胞培养效果有显著改进，克隆形成率和克隆生长速度明显增加，减少了培养时间，同时提高了细胞培养成功率，充分发挥了不同的抗氧化剂的维生素E和L-抗坏血酸的协同作用，维生素E和L-抗坏血酸的相互促进的协同作用，在较短的时间内，可以培养得到大量的处于分裂期的羊水细胞，能够满足临床诊断和科研的要求.
具体实施方式
实施例1：不同配方的培养基培养效果比较
1、配制H-1培养基：1L装量的DMEM/F12细胞培养基，用950ml的注射水溶解后，添加NaHCO31.2g、15mM HEPES，添加10种生长因子，包括转铁蛋白(transferrin)10mg/L、亚硒酸钠40nMol/L、胰岛素(insulin)20mg/L、三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine)0.2nMol/L、胰高血糖素(glucagon)2mg/L、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ug/L、氢化可的松(hydrocortisone)2nMol/L、睾酮(testosterone)2nMol/L、雌二醇(estradiol)2nMol/L、孕酮(progesterone)2nMol/L。其后添加注射水定容至1000ml；配置8份H-1培养基。
2、配制DF-I1培养基：取H-1培养基1份，添加20mg/L的维生素E。
3、配制DF-I2培养基：取H-1培养基1份，添加L-抗坏血酸60mg/L。
4、配制DF-Ja培养基：取H-1培养基1份，添加5mg/L的维生素E和25mg/L的L-抗坏血酸。
5、配制DF-Jb培养基：取H-1培养基1份，添加20mg/L的维生素E和60mg/L的L-抗坏血酸。
6、配制DF-J1培养基：取H-1培养基1份，添加10mg/L的维生素E和50mg/L的L-抗坏血酸。
7、配制DF-I3培养基：取H-1培养基1份，添加5mg/L的维生素E。
8、配制DF-I4培养基：取H-1培养基1份，添加L-抗坏血酸25mg/L。
9、将各配制好的羊水细胞培养基添加体积百分比为4％的胎牛血清，成为羊水细胞完全培养基。
7、羊水细胞培养：收集10份羊水样品(为17-22周龄之间的羊水样品，每份约2-2.5ml，共23ml左右)，混合均匀，得到检测用羊水细胞收集样品I，比较不同培养基的培养效果。细胞培养、制片方法按以下步骤进行。
①在无菌条件下取羊水各2.5ml/管，共8管。
②以453g(1500rpm/min)室温离心10分钟。
③在无菌操作台上吸去上清液，每管约留1ml，吸管打散细胞。制成细胞悬液，再加入4ml培养基入管内，吸管轻混匀，移至25cm2方形一次性培养瓶中置含5％CO2的37℃温箱饱和湿度行开放式培养。
④6天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，此时换相应新鲜的羊水培养基5ml，24-48小时后，如细胞生长状况好，加入秋水仙素0.04-0.08ug/ml，(20ug/ml，7号针头垂直竖加2滴)4-6h左右行细胞学处理。
⑤收获细胞：倒出瓶中细胞液入10ml离心管，0.85％NaCl溶液冲洗细胞壁两遍，0.25％胰酶消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打下细胞453g(1500rpm/min)室温离心10分钟，去上清，约留0.5ml。
⑥低渗：加入37℃0.075M KCl 4-6ml，吸管吹打，37℃水浴3-5分钟。
⑦预固定：加入1.5ml甲醇∶冰醋酸＝3∶1固定剂，轻混匀37℃水浴5分钟453g(1500rpm/min)室温离心10分钟。去上清约留0.5ml。
⑧固定：加入3∶1固定剂8ml，轻混匀，37℃水浴10分钟，453g(1500rpm/min，eppendorf 5810R)室温离心10分钟。去上清，约留0.5ml。
⑨重复固定：同上。453g(1500rpm/min)室温离心10分钟，去上清，视管底细胞量加入适当几滴固定剂。
⑩滴片、烤片：每片1-2滴，75℃烤箱烘烤3小时。
Figure G2009101939622D0000051
培养结束染色体制片前统计细胞克隆总数，包括有分裂相的克隆总数，以及有效克隆的大小；制备染色体后统计分裂相细胞数目。
Figure G2009101939622D0000052
羊水细胞收集样品I培养8天后收获，进行染色体制片，结果见表1：
表1各配方培养基添加胎牛血后对羊水细胞的培养效果比较
Figure G2009101939622D0000053
Figure G2009101939622D0000061
注：
1、表1各培养基配方中的维生素E和L-抗坏血酸浓度是指添加胎牛血清前的浓度。
2、克隆大小判断标准为：在100倍倒置显微镜下判断观察，克隆≥1个视野判断为大克隆；克隆≤1/2个视野则判断为小克隆；介于两者之间的为中等克隆。
3、总克隆数＝有分裂相的总克隆数+无分裂相的克隆数；有分裂相总克隆数为大、中、小各克隆数目之和。
从结果可以看出，在H-1培养基基础上同时添加维生素E和L-抗坏血酸的培养基，包括DF-Ja、DF-Jb和DF-J1与只添加一种抗氧化剂的培养基(DF-I1、DF-I2、DF-I3和DF-I4)相比，总克隆数，包括有分裂相的总克隆数和分裂相细胞数目都有明显的增加，说明维生素E浓度在5-20mg/L范围以及L-抗坏血酸浓度在25-60mg/L的范围时两者有显著的协同作用，并且DF-J1培养基中的维生素E和L-抗坏血酸浓度是个优化值，有最好的培养效果.经优化后的羊水培养基的培养效果无论从总克隆数、分裂相细胞数目、细胞增殖速度方面都要比现有公开文献的H-1培养基有了大幅度提高.
实施例2：羊水细胞培养基配制
1)材料：转铁蛋白(transferrin)、胰岛素(insulin)、胰高血糖素(glucagon)、三碘甲状腺氨酸、氢化可的松、皮质醇、雄激素、雌二醇激素，SIMGA公司提供；DM/F12干粉培养基，GIBCO公司提供；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)冻干粉，上海博彩公司提供；丙酮酸钠、1，4-丁二胺二盐酸盐、亚硒酸钠、维生素、氨基酸、脱氧核苷和核苷、维生素E、L-抗坏血酸、酚红、葡萄糖等试剂皆为国产分析纯，广州威加试剂公司提供；
2)设备：渗透压检测仪、pH值检测仪；
3)配制方法
①100X氨基酸母液的配制：将培养基所需的L-氨基酸混合(谷氨酰胺单独配制并冷冻保存，不包括其中)，配制100倍氨基酸母液100ml。氨基酸的种类及其具体称量，根据配方表2，将称量好的氨基酸干粉混合，加入60ml注射用水后，在磁力搅拌下缓慢滴加1M HCl至氨基酸完全溶解，加注射用水定容至100ml并分装，4℃保存。
②(100X)维生素母液的配制：，根据配方表2具体配方，将十种维生素称配后，按顺序添加到注射用水中。每种维生素需完全溶解后再添加另一种，配成100X维生素母液100ml，分装，4℃保存。加入顺序为：D-泛酸钙、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺、核黄素、维生素H(生物素)、氯化胆碱、叶酸。
③L-谷氨酰胺母液的配制：根据配方表2，将所需用量的L-谷氨酰胺干粉称量后用注射用水溶解、分装，-20℃保存备用。
④(100X)VB12母液的配制：根据配方表2，将所需用量的VB12单独称量后用注射用水溶解、分装，4℃保存。
⑤无机盐母液的配制：根据配方表2，分别配制100X氯化钙母液、硫酸铜母液、硝酸铁母液、硫酸亚铁母液、氯化钾母液、氯化镁母液、硫酸镁母液、氯化钠母液、硫酸锌及磷酸盐母液各100ml，常温保存备用。
⑥1，4-丁二胺二盐酸盐母液的配制：根据配方表2配制100X 1，4-丁二胺二盐酸盐母液100ml，4℃保存。
⑦100X葡萄糖母液的配制：根据配方表2配制100X葡萄糖母液100ml，分装后4℃保存。
⑧酚红指示剂母液的配制：根据配方表2配制1000X酚红母液10ml，分装后4℃保存。
⑨10ml(106X)激素母液的配制：根据配方表2计算氢化可的松、皮质醇、雄激素、雌二醇激素用量，分别称量后混合，用无水乙醇(AR级)10ml溶解，配制成(106X)激素母液，分装后4℃保存。
⑩10ml(106X)三碘甲状腺氨酸母液的配制：根据配方表2计算三碘甲状腺氨酸用量，用1M NaOH 10ml溶解，配制成106X三碘甲状腺氨酸母液，分装后4℃保存。
100ml(100X)胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠母液的配制：根据配方表2分别计算胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠用量，称量后混合，用pH值为2.0酸化水100ml溶解，分装后4℃保存。
Figure G2009101939622D0000081
100ml(100X)胰高血糖素母液的配制：根据配方表2计算胰高血糖素用量，用pH值为10.0的碱化水溶液100ml溶解，分装后4℃保存。
Figure G2009101939622D0000082
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)母液的配制：根据一个包装的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)含量添加注射用水溶解，使bFGF浓度为终浓度的200倍，即4ug/ml，分装后-20℃保存。
Figure G2009101939622D0000083
(103X)胸苷、次黄嘌呤母液的配制：根据配方表2计算胸苷和次黄嘌呤用量，分别称量后混合，用100ml注射用水溶解后分装，-20℃保存。
10ml(103X)维生素E母液的配制：根据配方表2计算维生素E用量，用10ml无水乙醇溶解后分装，4℃保存。
Figure G2009101939622D0000085
10ml(105X)α硫辛酸母液的配制：根据配方表2计算α硫辛酸用量，用10ml无水乙醇溶解后分装，4℃避光保存。
Figure G2009101939622D0000086
100ml(100X)丙酮酸钠母液的配制：根据配方表2计算丙酮酸钠用量，用100ml注射用水溶解后分装，4℃保存。
Figure G2009101939622D0000087
100ml(100X)HEPES母液的配制：根据配方表2计算HEPES用量，用100ml注射用水溶解后分装，4℃保存。
Figure G2009101939622D0000088
100ml(100X)L-抗坏血酸母液的配制：根据配方表2计算维生素L-抗坏血酸用量，用100ml注射用水溶解后分装，4℃避光保存。
Figure G2009101939622D0000089
10ml(105X)亚油酸母液的配制：根据配方表2计算亚油酸用量，用10ml无水乙醇溶解后分装，4℃保存。
Figure G2009101939622D00000810
1000ml羊水细胞培养基的配制：在洁净的烧杯中加入700ml注射用水，在磁力搅拌下加入100X氨基酸母液10ml、100X维生素母液10ml、VB12母液10ml。其后分别缓慢滴加100X氯化钙母液、硫酸铜母液、硝酸铁母液、硫酸亚铁母液、氯化钾母液、氯化镁母液、硫酸镁母液、硫酸锌及磷酸盐母液各10ml、氯化钠母液8ml、1，4-丁二胺二盐酸盐母液10ml、葡萄糖母液10ml、酚红指示剂母液1ml、次黄嘌呤母液10ml、丙酮酸钠母液10ml、L-谷氨酰胺母液10ml、激素母液1ul、三碘甲状腺氨酸母液1ul、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠母液10ml、胰高血糖素母液10ml、bFGF母液5ml、维生素C母液10ml、亚油酸母液100ul、α硫辛酸母液100ul、维生素E母液1ml，加注射用水至980ml，随后加入碳酸氢钠1.2g、HEPES母液10ml，加1M NaOH或1M HCl数滴，使pH至7.2。检测溶液渗透压，根据渗透压值加入氯化钠母液(约1ml-2ml左右)，使最终的溶液渗透压保持在280-300mOSM之间。补充注射用水至1000ml，得羊水细胞培养基。
4)羊水细胞培养基加入体积百分比为4-15％的胎牛血清(FBS)，混匀后无菌过滤分装，得到可用于原代或传代培养的羊水细胞完全培养基，-20℃保存。
表2羊水细胞培养基配方
Figure G2009101939622D0000091
Figure G2009101939622D0000101
*氯化钠含量可根据渗透压值调整
实施例3：含不同比例胎牛血清(FBS)的羊水细胞完全培养基培养效果
收集8份羊水细胞样品(为18-21周龄之间的羊水样品，每份约2-4ml，共22ml左右)，混合均匀，制成检测用羊水细胞收集样品。将羊水细胞样品均分为三份后离心，吸去大部分上清，留1ml混匀接种于4ml按实施例2配制的含不同FBS比例的羊水细胞培养基中，比较添加不同体积百分比胎牛血清的羊水细胞完全培养基的培养效果。结果见表3。
表3含不同比例FBS的羊水细胞完全培养基培养效果比较
Figure G2009101939622D0000111
从表3可以看出，本发明中添加不同百分体积比胎牛血清的羊水细胞完全培养基之间培养效果并没有显著区别，皆可以在短期内收获大量的分裂相羊水细胞。

Claims (5)

1.一种羊水细胞培养基，包含下列组份：基础培养基，转铁蛋白，亚硒酸钠，胰岛素量，三碘甲状腺氨酸，胰高血糖素，碱性成纤维细胞生长因子，氢化可的松，睾酮，雌二醇，孕酮，其特征是在上述组份的基础上，添加维生素E和L-抗坏血酸两种抗氧化剂的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种羊水细胞培养基，其包含下列组份：其特征是
基础培养基                    DMEM/F12细胞培养基
转铁蛋白                      10mg/L
亚硒酸钠                      40nMol/L
胰岛素                        20mg/L
三碘甲状腺氨酸                0.2nMol/L
胰高血糖素                    2mg/L
碱性成纤维细胞生长因子        20ug/L
氢化可的松                    2nMol/L
睾酮                          2nMol/L
雌二醇                        2nMol/L
孕酮                          2nMol/L。
3.根据权利要求2所述的一种羊水细胞培养基，其特征是添加维生素E5mg-20mg/L和L-抗坏血酸25-60mg/L。
4.根据权利要求2所述的一种羊水细胞培养基，其特征是添加维生素E 10mg/L和L-抗坏血酸50mg/L的混合物。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的一种羊水细胞培养基，其特征是添加体积百分比为4-15％的胎牛血清。
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