CN101705194A

CN101705194A - 一种链霉菌属菌株

Info

Publication number: CN101705194A
Application number: CN200910072731A
Authority: CN
Inventors: 王相晶; 向文胜; 姜玲
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2009-08-24
Filing date: 2009-08-24
Publication date: 2010-05-12

Abstract

本发明一种链霉菌属菌株，所述的链霉菌属菌株，是于2009年03月11日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为：CGMCC NO.2943，命名为NEAU 1069(Streptomycesavermitilis)的菌株。本发明的链霉菌属菌株除能产生多拉菌素，还能产生两种新大环内酯类化合物。且新大环内酯类化合物具有强的抗寄生虫及其虫卵的活性，可用以控制动物体内外寄生虫及其虫卵生存。对我国兽用抗寄生虫药物开发研究具有重要的意义。

Description

一种链霉菌属菌株

（一）技术领域

本发明涉及微生物科学，具体说就是一种链霉菌属菌株。

(二)背景技术

放线菌是自然界分布最广泛的微生物类群之一，而链霉菌(Streptanyces)是放线菌中最大的一个类群，也是抗生素的重要产生菌。目前，包括出现在专利中的种已经超过3000个，至1996年有效描述的种有464个和亚种45个。据统计，链霉菌产生的抗生素占抗生素的70％左右，占放线菌产生抗生素的90％以上。目前，国内外应用广泛的大环内酯类农用抗生素多拉菌素属双糖类化合物，是以环己氨羧酸(cyclohexanecarboxylic)为前体，通过基因重组的阿维链霉菌(streptomyces avermitilis)新菌株发酵而成的一种阿维菌素类抗生素，最早发现多拉菌素驱杀寄生虫的能力是在驱鼠继代的蛇形毛圆线虫和杀兔痒螨的动物模型中(参见Goudie，AC.等人，VeterinaryParasitology.49(1993)5-15)。多拉菌素为内外兼杀剂，对线虫、节肢动物均有良好的驱杀效果，与市售的伊维菌素类产品比较，其抗寄生虫范围更广泛、血药浓度高峰维持时间更长、半衰期也相对较长。而且多拉菌素在动物体内持效时间更长，是目前最具有开发潜力的兽用抗寄生虫药物之一。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种既能产生多拉菌素，又能产生两种新大环内酯类化合物的链霉菌属菌株。

本发明的目的是这样实现的：所述的链霉菌属菌株的16S rDNA序列为：

TCTGGCTCAGGACTAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAATACTCTCGCAGGCATCTGTGAGGGTTAAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGATACAATGAGCTGCGATACCGCAAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGTCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTTGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAG.

本发明的链霉菌属菌株除能产生多拉菌素，还能产生两种新大环内酯类化合物。且新大环内酯类化合物具有强的抗寄生虫及其虫卵的活性，可用以控制动物体内外寄生虫及其虫卵生存，对我国兽用抗寄生虫药物开发研究具有重要的意义。

(四)附图说明

图1为本发明油镜下观察的菌丝形态；

图2为本发明菌株的孢子；

图3为本发明DNA提取结果；

图4为本发明16S rDNA的PCR电泳结果。

(五)具体实施方式

下面对本发明作进一步说明。

实施例1：本发明一种链霉菌属菌株，所述的链霉菌属菌株，是于2009年03月11日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为：CGMCC NO.2943，命名为NEAU 1069(Streptomyces avermitilis)的菌株。所述的链霉菌属菌株的16SrDNA序列为：

该链霉菌16s rDNA序列是这样得到的：

(1).链霉菌基因组DNA的获取

在无菌条件下从培养好的菌落中挑取少量菌株菌落，加入1mL洗涤液(50mmol·L^-1 Tris，pH7.7；25mmol·L^-1 EDTA)，12000rpm离心5min，沉淀加入200μL丙酮溶液，混匀，冰浴5min，12000rpm离心2min，弃上清，沉淀加入500μL TE溶液(10mmol·L^-1 Tris-HCl，pH8.0；10mmol·L^-1 EDTA)，混匀，12000rpm离心5min。将沉淀重新悬于400μL裂解液(2％SDS；20mmol·L^-1NaAC；40mmol·L^-1Tris；10mmol·L^-1EDTA)，反复吹打混匀，冰浴5min，然后75℃温浴10min。加入100μL 5mol·L^-1的NaCl，14000rpm离心10min，上清液加入300μL的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀，12000rpm离心5min，上清液加入2倍体积的无水乙醇，14000rpm离心5min，DNA沉淀溶于500μL70％的乙醇，12000rpm离心2min，将沉淀在无菌超净台干燥30min，再溶于50μL TE中，-20℃保存备用。

(2).16s rDNA的PCR扩增

采用链霉菌通用引物：

上游：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

下游：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。

扩增体系(20μL)：上游引物：1μL(25pmol)

下游引物：1μL(25pmol)

链霉菌基因组DNA 1μL

dNTP 1μL(25mM)

10*ExTaq Buffer 1μL

ExTaq 0.3μL

DMSO 1μL

水 14.71μL(25pmol)

反应条件：94℃，3min；

72℃，10min；

10℃，forever

(3).测序：送交上海生工生物工程技术服务有限公司，利用ABI公司DNA测序仪(3730)测序，获得16s rDNA序列。

实施例2：本发明的链霉菌属菌株用于多拉菌素及两种新大环内酯类化合物的制备。

所述的两种新大环内酯类化合物的结构式分别为：

当X-Y...R为CH＝C...H时为新化合物1的结构；新化合物2的结构特征是X-Y...R为CH₂-CH...OH。

本发明还涉及结构表征如下化合物：化合物1

化合物1的物理化学性质如下：

性状(Appearance)：白色粉末

溶解性(Solubility)：易溶于氯仿、丙酮、甲醇

比旋度(Specific rotation)：[α]_D ²⁵+123.86(c 0.088，EtOH)；

分子式(Molecular formula)：C₃₅H₄₆O₆

本发明还涉及结构表征如下化合物：化合物2

化合物2的物理化学性质如下：

性状(Appearance)：白色粉末

溶解性(Solubility)：易溶于氯仿、丙酮、甲醇

比旋度(Specific rotation)：[α]_D ²⁵+66.35(c 0.104，EtOH)；

分子式(Molecular formula)：C₃₅H₄₈O₇

本发明不仅筛选到一株新链霉菌，并从该菌株中得到多拉菌素及两种新米尔贝霉素化合物，这对我国兽用抗寄生虫药物开发研究具有重要的意义。

本发明的菌株属于一株产多拉菌素及两种新化合物的菌株，对其进行了形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分及16SrDNA序列(DQ768097.1)等鉴定，并与其它菌株进行比较，鉴定为一新种链霉菌(Streptomyces)，命名为NEAU 1069(Streptomycesavermitilis)，此菌除能产生多拉菌素，还能产生两种新化合物。且新化合物对损害植物的螨类、动物体内外的寄生虫及猪体内线虫和体外血虱有很高的抑制活性。

菌落在高氏培养基表面生长紧密，菌落颜色随着时间的推移逐渐变深，即由白色最终变为灰色。在油镜下观察菌丝：基丝分枝，无横隔，不断裂；气丝分枝较多。透射电镜观察孢子：孢子丝分支，末端钩状，孢子柱形至椭圆形，表面带刺，如图2。从这些形态特征看，该菌种可归为阿维链霉菌。

菌株的鉴定：

配制高氏合成一号、脱脂奶粉、营养琼脂、葡萄糖天门冬素琼脂、营养酪氨酸、淀粉胺琼脂、燕麦粉琼脂、马铃薯等八种培养基各100ml，灭菌后铺平板，凝固后，用划线法涂上待观察的菌种孢子悬浮液。28℃下培养7、15和30d，记录培养特征。

菌种NEAU 1069(Streptomyces avermitilis)在八种培养基上的培养特征如表1示。

表1链霉菌在8种不同培养基上的培养特征比较

新化合物1、2的杀虫活性：

新化合物具有强的杀螨活性，能杀灭，例如寄生在果树、蔬菜和花上的四爪螨属、全爪螨属和锈螨属的成螨和卵。它们对于寄生于动物身上的硬蜱科、皮刺螨科和疥螨科也有活性。它们还能杀灭：动物体内外寄生物，如对牛体内的奥氏奥斯特线虫、琴形奥斯特线虫、柏氏血矛线虫捻转血矛线虫、似血矛线虫、艾氏毛圆线虫、蛇形毛圆线虫、肿空古柏线虫、点状古柏线虫栉状古柏线虫、匙形古柏线虫、菇拉巴德古柏线虫、牛仰口线虫、乳突类圆线虫和辐射食道口线虫等的成虫及幼虫均显示驱虫活性；对猪蛔虫、齿食道口线虫、长沟球首线虫、猪毛首线虫、兰氏类圆线虫、猪肺线虫、猪肾虫、鲍杰氏线虫等具有很好的驱除效果。对绵羊消化道线虫包括毛圆线虫、夏伯特线虫、奥斯特线虫、马歇尔线虫、钝刺细颈线虫、毛首线虫、捻转血矛线虫驱净率为95％。

实施例3：

1、化合物制备：发酵

(1)种子培养：培养基(葡萄糖20g，大豆粉15g，酵母粉5.0g，蒸馏水1000mL，pH值7.0)，用250mL的三角瓶每瓶分装25mL，然后用10mL无菌水将斜面的冰城链霉菌孢子洗下并制成孢子悬浮液，使其浓度为1×10⁷～1×10⁸个/mL。每瓶加2mL孢子悬浮液，置于摇床上，转速250r/min，28℃培养24h；

(2)发酵：采用液体摇瓶发酵，培养基(玉米粉10％，大豆粉1％，棉花籽粉1％，α-淀粉酶0.02％，NaCl 0.1％，K₂HPO₄ 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.1％，CaCO3 0.7％，环己烷羧酸盐0.1％，pH 7.0，加蒸馏水1000mL。于121℃下灭菌20min，分装于1000mL三角瓶，每瓶100mL。接种量8％(V/V)，摇床转速250r/min，28℃振荡培养12-13d。

2、化合物的分离

30L发酵液经200目筛网过滤，并且用水清洗虑饼，发酵液和清洗用的水全都弃掉，用10L甲醇浸提过滤后得到的滤渣，通过减压蒸馏的方法最后将甲醇溶液浓缩到大约2L，再将浓缩液用相同体积的EtOAc浸提3次，将得到的EtOAc相减压蒸馏会产生20g油状物质。

将所得油状物上硅胶柱(粒径200～300目)进行层析，分别用石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1-5∶5两种洗脱液混合进行梯度洗脱，得到了五个组分，将组分二上RP-18硅胶柱进行层析，用甲醇∶水＝80∶20-95∶5二种洗脱液混合进行梯度洗脱，会得到化合物1(18mg)；将组分三上RP-18硅胶柱进行层析，用甲醇∶水＝70∶30-90∶10二种洗脱液混合进行梯度洗脱，会得到化合物2(15mg).

其中化合物1的结构式为：

其中化合物2的结构式为：

3、抗虫活性测定

对猪体内外寄生虫及其虫卵的触杀作用：

将100头断奶仔猪分为五组，分别进行如下处理。第一组为高剂量组，皮下注射剂量为400μg/kg；第二组为中剂量组，皮下注射剂量为300μg/kg；第三组为低剂量组200μg/kg；第四组为对照组，不做任何处理。依试验前后猪体内外寄虫(卵)罹患数量进行比较来确定新化合物对驱杀猪体内线虫和体外血虱的效果。依据猪再感染寄生虫的时间，确定药物在猪体内的残效期。

新化合物1，和2在以300μg/kg的计量下能够有效驱杀猪体内线虫和体外血虱。对抑制线虫感染长达25d，对血虱抑制长达98d。

序列表

16S rDNA序列为：

TCTGGCTCAGGACTAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAATACTCTCGCAGGCATCTGTGAGGGTTAAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGATACAATGAGCTGCGATACCGCAAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGTCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTTGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAG。

Claims

1.一种链霉菌属菌株，其特征在于：链霉菌属菌株的16S rDNA序列为：

TCTGGCTCAGGACTAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCC

CTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTC

TGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAATACTCTCGCAGGCATCTGTGA

GGGTTAAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGT

AGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGG

ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGC

GAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTT

TCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTG

CCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGA

GCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCA

TTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGA

AATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGA

CGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG

TAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCA

TTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGG

GCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAA

GGCTTGACATACACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGG

TGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC

GCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGAC

CGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTC

TTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGATACAATGAGCTGCGATACCGCAAGGTGGAG

CGAATCTCAAAAAGTCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGT

TGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGT

ACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCT

TGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAG。