CN101693514A - 具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的制备方法及应用方法 - Google Patents
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Abstract
一种具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的制备方法及应用方法。制备方法：1)选用5片相同的硅片清洗、烘干；2)涂PMMA胶；3)热压印；4)利用氧等离子体反应离子刻蚀，调整胶的厚度为10～20nm；5)真空蒸镀钛80～100nm和金50～60nm，钛作为粘附及牺牲层；6)真空蒸镀镍10～15nm作为粘附层；7)真空蒸镀铜1200～1250nm；8)电子束蒸发镍30～50nm；9)真空蒸镀金50～60nm；10)去胶剥离，悬浮微块阵列芯片释放。应用方法：1)清洗金块；2)由11-巯基羧酸在金块上形成单分子层；3)生物大分子标记金块；4)荧光检测。本发明制备出的芯片具有超顺磁特性，从而为生物修饰及生物磁分离创造了条件。
Description
技术领域
本发明涉及一种悬浮编码微块阵列芯片。特别是涉及一种能够制备出满足生物免疫检测的微量化、并行化及高通量化的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的制备方法及应用方法。
背景技术
近年来，微机电系统(MEMS)、集成电路(IC)技术、纳米技术、分子生物学、材料学等领域取得了无可争议的进步和突破，将这些技术结合起来形成功能强大的片上系统，为生物探测开创了新的突破口，生物芯片正符合这种强大的片上系统。生物芯片是近年来在生命科学研究领域中崭露头角的一项新技术，它通过使用半导体工业中的微加工和微电子技术，以及其他相关的技术，将现在庞大的分立式生物化学分析系统缩微到半导体芯片中，从而具有处理高速度、分析自动化、和高度并行处理能力的特点。生物芯片能制作成具有不同用途的全功能缩微芯片实验室，并具有下述一些主要优点，即分析的全过程自动化、生产成本低、分析速度可获得几千或几万倍的提高；同时，所需样品及化学药品的量可获得几百或几千倍的减少、极高的样品并行处理能力、仪器体积小、重量轻、便于携带。生物芯片从形态上可分为两大类：固相阵列芯片和悬浮阵列芯片。悬浮阵列又称为悬浮生物芯片或液相芯片，这种技术是20世纪90年代中期美国Luminex公司开发出的被喻为后基因组时代的芯片技术。该系统能够在一个试管或微孔中利用少量的样本同时进行100种不同的免疫分析。这种独特设计使得它拥有常规的蛋白质检测方法所不具备的特点：重复性好、通量大、灵活性好、灵敏度高、操作简便、液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，也更有利于探针和被检测物的反应。但它也有很多不足：采用两种不同的红色荧光素分子，按一定比例把微球染色达到生物探针编码，这种微球编码方式控制起来相对困难；这种有机染料的荧光信号往往会很快暗下来(即光漂白)，即荧光寿命短；两种染料的荧光(两种颜色)需要2种激光加以激发，造成设备昂贵、体积较大，数据处理费时；检测时，直观可视性差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种应用纳米热压印技术制备出满足生物免疫检测的微量化、并行化及高通量化的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的制备方法及应用方法。
本发明所采用的技术方案是：一种具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的制备方法及应用方法。
制备方法包括如下步骤：
1)选用5片相同的硅片清洗、烘干，具体是依次进行如下的过程：
去离子水枛SC1枛去离子水枛SC2枛去离子水枛HF溶液枛去离子水枛N2气吹干，其中：
SC1：15％NH3.H2O+15％H2O2+70％H2O，体积比
SC2：15％HCl+15％H2O2+70％H2O，体积比
DHF：HF∶H2O＝1∶10，体积比；
2)涂PMMA胶
在硅片上悬涂10％的质量浓度的PMMA/苯乙醚溶液，厚度用SPM测得为2μm，悬涂后，取下硅片放在170℃的烘箱中烘焙30min，使PMMA彻底固化；
3)热压印
采用的压力为40Bar，压印温度为190℃，比压印胶的玻璃化转变温度Tg＝120℃高出70℃，压力和温度同时加载时间为4-6min，脱模时温度为90℃；
4)利用氧等离子体反应离子刻蚀，调整胶的厚度为10～20nm；
5)真空蒸镀钛80～100nm和金50～60nm，其中钛作为粘附及牺牲层；
6)真空蒸镀镍10～15nm作为粘附层；
7)真空蒸镀铜1200～1250nm；
8)电子束蒸发镍30～50nm；
9)真空蒸镀金50～60nm；
10)去胶剥离，悬浮微块阵列芯片释放。
所述的硅片为4英寸硅片。
步骤2所述的涂PMMA胶厚度均匀性误差小于1％。
步骤4所述的刻蚀参数为：腔体压力为35mTorr，射频功率为15W，O2流量为15sccm，在此条件下刻蚀速率为46-50nm/min。
应用方法，包括有如下步骤：
采用如下步骤进行悬浮编码微块阵列芯片荧光标记；
1)清洗金块
利用无水乙醇清洗金块3次，最后分散在无水乙醇中；
2)由11巯基羧酸在金块上形成单分子层
利用巯基与金原子强有力的结合力，在金块表面沉积一层MUA的单分子层，为下面生物大分子的标记提供羧基基团；
3)生物大分子标记金块
采用碳二亚胺为交联剂，采用鼠IgG为阳性对照标记，鸡IgG为阴性对照标记；
4)荧光检测
分别向鼠IgG标记的金块和鸡IgG标记的金块中加入所要检测的物质，荧光显微镜下观察，得到结果。
步骤2所述的在金块上形成单分子层的具体是：先配置5mM的MUA无水乙醇溶液，将清洗干净的金块分散在MUA的无水乙醇溶液中，室温浸泡24小时后，利用无水乙醇清洗3步骤3所述的标记金块是：将MUA化的金块浸泡在1.5mL的10μg/mL的阳性对照标记鼠IgG和阴性对照标记鸡IgG中，再向所述体系加入50μL的EDC水溶液，室温反应2小时后，利用PBS洗涤3次，最后分散在0.01M的PBS缓冲溶液中保存。
步骤4 所述的荧光检测具体是：分别向鼠IgG标记的金块和鸡IgG标记的金块中加入0.1mg/mL的10μLFITC-羊抗鼠IgG，室温反应30min后，PBS洗涤3次，于倒置荧光显微镜下观察，得到结果。
本发明的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的制备方法及应用方法，制备简单，制备出的芯片具有超顺磁特性，从而为生物修饰及生物磁分离创造了条件。因采用纳米热压印技术可以很容易实现大量的微通孔，所以本发明实现的地址数理论上可以成千上万，以荧光作为探针，结合微块金表面可以很容易实现生物分子修饰的悬浮阵列技术，最终可满足生物免疫检测的微量化、并行化及高通量化。
附图说明
图1是利用荧光显微镜观测到的已进行免疫检测的悬浮微块芯片的效果图，其中a、c、e、g为阳性控制组，b、d、f、h为阴性控制组；
图2是悬浮微块的版图；
图3是纳米热压印过程示意图
其中：(a)悬胶；(b)压印；(c)脱膜；(d)反应离子刻蚀；(e)分别淀积金属钛/金/镍/铜/镍/金；(f)去胶、剥离；
图4是制备出的悬浮微块阵列芯片；
图5是悬浮微块阵列芯片的振动样品磁强计(VSM)测试谱图。
具体实施方式
下面结合实施例附图对本发明的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的制备方法及应用方法做出详细说明。
本发明的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的制备方法及应用方法，采用微电子工业中的纳米热压印技术，在微块表面刻蚀出微通孔标记的数字符号，实现了微块的生物探针编码，极大的降低检测成本。应用时，针对不同检测物的核酸(互补链)或蛋白(如抗原抗体)以共价方式结合到特定编码的微块上，再加入被检测物(被测物可以是血清中的抗原、抗体或酶等)。在悬液中的微块与被检测物特异性地结合，借助荧光显微镜可以很清晰、直观的观察到微块表面微通孔标记的数字符号，达到对微金属块的生物探针解码。利用这种编码技术实现的地址数理论上可以成千上万，因为地址的多少取决于微块表面微通孔数的多少，而采用热压印技术可以很容易实现微通孔的低成本、大批量的制备。这种将荧光探针结合到微块金表面可以很容易实现生物分子修饰的悬浮阵列技术，最终可满足生物免疫检测的微量化、并行化及高通量化。
图2本发明的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的模具尺寸示意图，悬浮微块阵列芯片的压印图形可以是随意的，但为了编码方便，我们采用数字型的图形，即以13个圆孔组成的数字“8”为图形参考，其中每个圆孔都有两种编码方式，以我们这13个圆孔组成的数字“8”为图形参考的话，悬浮微块阵列芯片就有213种编码方式，假设每一种微块分别接一种特异性的生物抗体探针的话，那么通过这种编码方式的悬浮微块阵列芯片可以一次检出213种待检测的特异性生物抗原物质。考虑大多检测时并不需要一次检出那么多种待检测物，我们以四种编码的悬浮微块阵列芯片为代表进行制备，它们分别为“0块”、“1块”、“2块”、“3块”，所以制作了4种标记图形：0，1，2，3。
如图3所示，本发明所述的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的制备方法，包括如下步骤：
1)选用5片相同的硅片清洗、烘干，本发明选用硅片为4英寸硅片，具体是依次进行如下的过程：
参考半导体工业标准(硅)湿法清洗工艺(RCA清洗工艺，由美国无线电公司的W.Kern和D.Puotinen于20世纪60年代提出)，并根据我们的实际需要采取所需的清洗工艺，如表1。在这里所指的清洗并不是仅仅去除表面的自然氧化层、颗粒杂质、金属离子、有机杂质，而是指去除不利于后续工艺步骤的表面状态(亲水性和疏水性)。
表1 采用的清洗方案
| 溶液 | 时间(Min) | 温度(℃) | 频率(KHz) | |
| 1 | 去离子水 | 10 | 27 | 700～1000 |
| 2 | SC1 | 15 | 80 | 700～1000 |
| 3 | 去离子水 | 10 | 27 | 700～1000 |
| 4 | SC2 | 15 | 80 | 700～1000 |
| 5 | 去离子水 | 10 | 27 | 700～1000 |
| 6 | HF溶液 | 0.5 | 27 | 700～1000 |
| 7 | 去离子水 | 10 | 27 | 700～1000 |
| 8 | N2气吹干 | 2 | 27 | 700～1000 |
注：SC1(15％NH3.H2O+15％H2O2+70％H2O，体积比)
SC2(15％HCl+15％H2O2+70％H2O，体积比)
DHF(HF∶H2O＝1∶10，体积比)
2)涂PMMA胶
在4英寸硅片上悬涂10％的质量浓度(WT)的PMMA/苯乙醚溶液。厚度用SPM测得为2μm。均匀性误差不大于1％。悬涂后，取下硅片放在170℃的烘箱中烘焙30min，以使PMMA彻底固化。
3)热压印(M1)
采用的压力为40Bar，压印温度为190℃，比压印胶(PMMA，Mw＝350,000)的玻璃化转变温度(Tg＝120℃)高70℃，压力和温度同时加载时间为5min左右，脱模时温度为90℃。
4)利用氧等离子体反应离子刻蚀(O2 RIE)调整胶的厚度为10～20nm，本发明的实施例采用厚度为15nm；
刻蚀参数为：腔体压力为35mTorr，射频功率为15W，O2流量为15sccm，在此条件下刻蚀速率大约为48nm/min。
5)真空蒸镀钛80～100nm和金50～60nm，其中钛作为粘附及牺牲层，本发明的实施例采用：真空蒸镀钛100nm、金50nm；
6)真空蒸镀镍10～15nm作为粘附层，本发明的实施例采用真空蒸镀镍15nm；
7)真空蒸镀铜1200～1250nm，本发明的实施例采用真空蒸镀铜1250nm：
8)电子束蒸发镍30～50nm，本发明的实施例采用电子束蒸发镍50nm：
9)真空蒸镀金50～60nm，本发明的实施例采用真空蒸镀金50nm；
10)去胶剥离，悬浮微块阵列芯片释放。
按照上述步骤成功制备了具有磁性和抗体双重靶向功能的悬浮微块阵列芯片如图4所示。其超顺磁特性如图5所示，从图5的VSM测试谱图中可以看出，室温下测得的悬浮微块阵列芯片，具有一条闭合的磁滞曲线，即磁化曲线和退磁曲线重合，且剩磁力和矫顽力在仪器精度允许范围内均为零，而且没有任何磁滞现象出现，即表现出超顺磁特性，从而为生物修饰及生物磁分离创造了条件。
本发明的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的应用方法，包括有如下步骤：
采用如下步骤进行悬浮编码微块阵列芯片荧光标记；
1)清洗金块
利用无水乙醇清洗金块3次，最后分散在无水乙醇中；
2)由11巯基羧酸(MUA)在金块上形成单分子层
利用巯基与金原子强有力的结合力，在金块表面沉积一层MUA的单分子层，为下面生物大分子的标记提供羧基基团。具体是，先配置5mM的MUA无水乙醇溶液，将清洗干净的金块分散在MUA的无水乙醇溶液中，室温浸泡24小时后，利用无水乙醇清洗3次，再用0.01M的PBS缓冲溶液清洗3次，最后分散在0.01M的PBS缓冲溶液中。
3)生物大分子标记金块
采用碳二亚胺(EDC)为交联剂，鼠IgG为阳性对照标记，鸡IgG为阴性对照标记；
采用EDC(碳二亚胺)为交联剂。具体是，将MUA化的金块浸泡在1.5mL的10μg/mL的鼠IgG(阳性对照)和鸡IgG(阴性对照)中，再向上述体系加入50μL的EDC水溶液(40mM)，室温反应2小时后，利用PBS洗涤3次，最后分散在0.01M的PBS(含0.5％BSA)缓冲溶液中保存。
4)荧光检测
分别向鼠IgG标记的金块和鸡IgG标记的金块中加入10μLFITC-羊抗鼠IgG(0.1mg/mL)，室温反应30min后，PBS洗涤3次，于倒置荧光显微镜下观察，结果如图1所示，其中a、c、e、g为阳性控制组，b、d、f、h为阴性控制组。
上述试剂：11巯基羧酸(MUA)Aldrich 95％；EDC，上海吉尔生化有限公司；
鼠IgG、鸡IgG、FITC-羊抗鼠IgG均购自北京鼎国。
Claims (8)
1.一种具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)选用5片相同的硅片清洗、烘干，具体是依次进行如下的过程：
去离子水枛SC1枛去离子水枛SC2枛去离子水枛HF溶液枛去离子水枛N2气吹干，其中：
SC1：15％NH3.H2O+15％H2O2+70％H2O，体积比
SC2：15％HCl+15％H2O2+70％H2O，体积比
DHF：HF∶H2O＝1∶10，体积比；
2)涂PMMA胶
在硅片上悬涂10％的质量浓度的PMMA/苯乙醚溶液，厚度用SPM测得为2μm，悬涂后，取下硅片放在170℃的烘箱中烘焙30min，使PMMA彻底固化；
3)热压印
采用的压力为40Bar，压印温度为190℃，比压印胶的玻璃化转变温度Tg＝120℃高出70℃，压力和温度同时加载时间为4-6min，脱模时温度为90℃；
4)利用氧等离子体反应离子刻蚀，调整胶的厚度为10～20nm；
5)真空蒸镀钛80～100nm和金50～60nm，其中钛作为粘附及牺牲层；
6)真空蒸镀镍10～15nm作为粘附层；
7)真空蒸镀铜1200～1250nm；
8)电子束蒸发镍30～50nm；
9)真空蒸镀金50～60nm；
10)去胶剥离，悬浮微块阵列芯片释放。
2.根据权利要求1所述的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述的硅片为4英寸硅片。
3.根据权利要求1所述的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的制备方法，其特征在于，步骤2所述的涂PMMA胶厚度均匀性误差小于1％。
4.根据权利要求1所述的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的制备方法，其特征在于，步骤4所述的刻蚀参数为：腔体压力为35mTorr，射频功率为15W，O2流量为15sccm，在此条件下刻蚀速率为46-50nm/min。
5.一种采用权利要求1制备的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的应用方法，其特征在于，包括有如下步骤：
采用如下步骤进行悬浮编码微块阵列芯片荧光标记；
1)清洗金块
利用无水乙醇清洗金块3次，最后分散在无水乙醇中；
2)由11-巯基羧酸在金块上形成单分子层
利用巯基与金原子强有力的结合力，在金块表面沉积一层MUA的单分子层，为下面生物大分子的标记提供羧基基团；
3)生物大分子标记金块
采用碳二亚胺为交联剂，采用鼠IgG为阳性对照标记，鸡IgG为阴性对照标记；
4)荧光检测
分别向鼠IgG标记的金块和鸡IgG标记的金块中加入所要检测的物质，荧光显微镜下观察，得到结果。
6.根据权利要求5所述的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的应用方法，其特征在于，步骤2所述的在金块上形成单分子层的具体是：先配置5mM的MUA无水乙醇溶液，将清洗干净的金块分散在MUA的无水乙醇溶液中，室温浸泡24小时后，利用无水乙醇清洗3次，再用0.01M的PBS缓冲溶液清洗3次，最后分散在0.01M的PBS缓冲溶液中。
7.根据权利要求5所述的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的应用方法，其特征在于，步骤3所述的标记金块是：将MUA化的金块浸泡在1.5mL的10μg/mL的阳性对照标记鼠IgG和阴性对照标记鸡IgG中，再向所述体系加入50μL的EDC水溶液，室温反应2小时后，利用PBS洗涤3次，最后分散在0.01M的PBS缓冲溶液中保存。
8.根据权利要求5所述的具有磁性的悬浮编码微块阵列芯片的应用方法，其特征在于，步骤4所述的荧光检测具体是：分别向鼠IgG标记的金块和鸡IgG标记的金块中加入0.1mg/mL的10μL FITC-羊抗鼠IgG，室温反应30min后，PBS洗涤3次，于倒置荧光显微镜下观察，得到结果。
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- 2009-10-23 CN CN200910308751A patent/CN101693514A/zh active Pending
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