JP2023524553A - キャリアシステム及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
-(例えば、化学的に)接着細胞を剥離し、培地に単一細胞懸濁液を作る。
-細胞を1mLあたり約1Mの細胞に濃縮する(遠心分離機で行われる)。
-培地を5-20%のDMSO(ジメチルスルホキシド)又は同等量で補液する。
-次いで、この混合液は、凍結用チューブ(すなわち、超低温保存バイアル)に加えられる。
-次いで、凍結用チューブは、毎分1℃で-70℃までゆっくり冷却させる(典型的に、これは、バイアルをイソプロパノールに浸漬し、-70℃の冷凍庫に入れることによって行われる)。
-その後、バイアルは、(冷凍庫又は液体窒素の中で)-70℃で保存される。
-解凍するとき、凍結されたバイアルは、解凍されるまで、37℃の温水浴槽に入れられる。
-次いで、新しい培地が加えられ、細胞はスピンダウンされ、再度新しい培地が加えられる。
-次いで、細胞は、フラスコ又はプレート又はディッシュに播種され、アッセイが実施される。
-本明細書に説明されるように、接着細胞を、基材に付着したキャリアに付着させる。
-任意に、本明細書に説明されるように、基材から液体中にキャリアを剥離する。代替的に、キャリアは、基材上に保持されてもよい。
-次いで、細胞は、1-2日間培養されるか、或いは直接凍結されるかのいずれかである(前者が、健康な細胞を維持するために好ましい)。
-キャリア、すなわち、細胞を搭載し、或いは細胞を担持する遊離キャリアを担持する基材は、5-20%のDMSOを含む培地でリフレッシュされている培地中にあり、液体1mLあたり約1Mの細胞が存在することを確認する。培地がリフレッシュされるとき、遠心分離機又は重力のいずれかは、キャリアを濃縮するために使用されてもよい。代替的に、本明細書に説明されるように、磁性キャリアが使用される場合、培地がリフレッシュされるとき、キャリアは、磁気的に引き下ろされ、或いは保持されてもよい。
-次いで、プロトコルは、細胞がアッセイにおいて使用する準備ができているキャリア上で受容されることを除いて、従来の細胞凍結と同様に行われることとなる。
-細胞は、凍結前に剥離される必要がない。
-細胞は、凍結後、播種され、或いは任意の基材に付着する必要がない。
-生きている、接着細胞を保存することができる。
-これは、研究者が(接着細胞を必要とする)実験を行いたいが、後の分析又は追加実験のためにいくつかのアッセイされた試料を保存したい場合に有用である。
-これは、人々が大きなバッチの細胞を培養し、長期間にわたって複数の実験を行いたいときに有用である。次いで、バッチ全体、又は複数の細胞をキャリアに付着させることができ、次いで、凍結される。次いで、人々が実験を行いたいとき、細胞の一部分又は全部を解凍し得る。これは、最小限の実験間のばらつき及びバイアスを保証する。従来、人々が行わなければならないことは、(複数回の継代、すなわち細胞が培養中に増えすぎたときに剥離し、再播種するサイクルを通じて)細胞を継続的に培養することであるが、突然変異及び変化は、これらの異なる継代ステップにわたって蓄積される。もう1つの既知の解決策は、実験前に新しいバッチを常に解凍することである。しかしながら、これは、(解凍、2日間の培養、剥離、再播種が必要であるので)労働集約的であるだけでなく、ばらつき及び潜在的にバイアスを導入する。
-本発明の実施形態は、人々が迅速なアッセイを行いたいときに有用である。本アプローチは、人々がアッセイの前に「解凍、2日間の培養、剥離、再播種」ステップを行う必要がないことを確認する。この状況では、細胞は、解凍され、実験/アッセイは、(剥離及び再播種ステップなしで)直接、或いは1-2日間の培養後のいずれかで開始され得る。
1.キャリアアレイは、ウェルプレート、フラスコ、又は任意の他の細胞培養容器に配置される。
2.剥離された細胞(単一細胞)は、培地と混合され、キャリアアレイ上に搭載される。
3.細胞は、沈降し、キャリアに付着することとなる(典型的に、最短2-3時間)。
4.水性培地は、犠牲層(剥離層)をゆっくりと溶解する。
5.接着細胞を有するキャリアは、液体中に剥離される。
6.細胞を有するキャリアは、移動し、アッセイされ、測定され、保存されるなどし得る。
-アッセイ試料は、キャリアに付着し、剥離層が活性化した後、磁場を使用し、キャリアを基材上に保持する。
-(付着していない細胞(すなわち、キャリアに付着していない任意の細胞)を除去し、培地をリフレッシュするために)(キャリア上の)アッセイ試料は、新しい容器又はウェルに移される。
-(インキュベーション又は細胞増殖のために)細胞が上を向く状態で、細胞を有するキャリアを容器の底に磁気的に引き下ろす。
-アッセイ試薬(例えば、薬剤)を添加する。
-(磁場を使用し、所定の位置にキャリアを固定して)液体を除去する。
-(液体が交換されるとき、磁場を使用し、所定の位置にキャリアを固定して)様々なアッセイ液(例えば、洗浄バッファ、標識抗体)を順次添加する。
-(磁場を使用して)キャリアを反転させ、ウェルの底を通して顕微鏡イメージングを行う。
1.剥離層によって基材に固定された粒子又はキャリアを含むアッセイのためのキャリアシステムであって、前記粒子又はキャリアは、アッセイ試料を受容するのに適しており、前記剥離層は、使用時に、生体適合性水溶液の存在下で前記基材から前記粒子又はキャリアを剥離するように構成されている、キャリアシステム。
基材を提供するステップと、
前記基材上に剥離層を形成するステップと、
前記剥離層上でアッセイ試料を受容するための粒子又はキャリアを、前記粒子又はキャリアが前記基材に固定されているように、堆積させるステップと、
を含み、
前記剥離層は、使用時に、生体適合性水溶液の存在下で前記基材から前記粒子を剥離するように構成されている、
方法。
参考のため、本出願人によって出願された同時係属中の出願である、国際特許出願PCT/GB2019/053188の内容は、以下に再現される。これは、本発明の一実施形態におけるものと同様の、磁性キャリア、又は粒子の作製の詳細な説明を含み、本発明においてキャリアが剥離層に作製され、或いは付着する点を異にする。キャリアが剥離層上に作製される場合、剥離層を早期に活性化しないリソグラフィプロセスは、附属書類において説明されるものの代わりに使用される必要がある。そのような選択肢の1つは、附属書類に説明されるフォトレジストを、水性溶媒を使用せずに洗い流され得るフォトレジストに置き換えることである。PCT/GB2019/053188の図は、図面のシート5/13からシート13/13に記載される。
本発明は、磁性キャリア、及び磁性キャリアを製造する方法、ならびに磁性キャリアを使用する方法に関する。
印加磁場を使用し、個々の磁性キャリアに機械的な力を及ぼすための技術は、様々なバイオテクノロジー用途で活用されている。
本発明は、ここで参照が行われるべき添付の独立請求項に定義されるように、磁性キャリア、アッセイを実施するための複数の磁性キャリア、及び磁性キャリアを使用してアッセイを実施するための方法を提供する。本発明の好ましい或いは有利な特徴は、従属副請求項に記載されている。
ここで、本発明の具体的な実施形態は、添付の図面を参照しながら、例として説明される。
1.キャリアの上面と前記キャリアの対向底面との間に層構造を含み、前記層は、1つ又は複数の磁化層を含み、前記1つ又は複数の磁化層の横方向寸法の、前記1つ又は複数の磁化層の厚さ又は集合的な厚さに対する比率は、500よりも大きい、磁性キャリア。
Claims (37)
- 剥離層によって基材に固定されたキャリアを含むアッセイのためのキャリアシステムであって、前記キャリアは、アッセイ試料を受容するのに適しており、前記剥離層は、使用時に、生体適合性水溶液の存在下で前記基材から前記キャリアを剥離するように構成されている、キャリアシステム。
- 前記キャリアが前記基材と接触している間に、前記キャリア上で前記アッセイ試料を受容するように適合されている、請求項1に記載のキャリアシステム。
- 前記アッセイ試料は、前記生体適合性水溶液中に懸濁され、前記キャリアシステムが前記生体適合性水溶液と接触させているとき、前記アッセイ試料は、前記キャリア上で受容され、前記キャリアは、前記基材から剥離される、請求項1又は2に記載のキャリアシステム。
- 前記剥離層は、前記剥離層の活性化後、前記生体適合性水溶液が生体適合性を維持するように構成されている、請求項1乃至3のいずれか1項に記載のキャリアシステム。
- 前記剥離層は、水溶性である材料などの、水活性化可能である材料を含む、請求項1乃至4のいずれか1項に記載のキャリアシステム。
- 前記剥離層は、エタノールなどの非水溶媒中で活性化可能でない、請求項1乃至5のいずれか1項に記載のキャリアシステム。
- 前記剥離層は、デキストランなどの糖、又はポリビニルアルコール、又はポリ(アクリル酸)、又はポリ(乳酸コグリコール酸)のうちの少なくとも1つを含む、請求項1乃至6のいずれか1項に記載のキャリアシステム。
- 前記キャリアは、磁性材料を含む、請求項1乃至7のいずれか1項に記載のキャリアシステム。
- 前記キャリアは、前記キャリアの上面と前記キャリアの対向底面との間に層構造を含み、前記層は、1つ又は複数の磁化層を含む、請求項8に記載のキャリアシステム。
- 前記1つ又は複数の磁化層の横方向寸法の、前記1つ又は複数の磁化層の厚さ又は集合的な厚さに対する比率は、500よりも大きい、請求項9に記載のキャリアシステム。
- 前記キャリアの最小横方向寸法は、5マイクロメートルから200マイクロメートルの間である、請求項1乃至10のいずれか1項に記載のキャリアシステム。
- 前記キャリアは、リソグラフィにより規定される、請求項1乃至11のいずれか1項に記載のキャリアシステム。
- 前記キャリアは、SU-8フォトレジストなどの、フォトレジスト層を含む、請求項1乃至12のいずれか1項に記載のキャリアシステム。
- 前記キャリアの表面は、前記アッセイ試料を受容するために適合され、例えば、前記表面は、ポリマーがチオール基によって共有結合されている金キャップ層を含む、請求項1乃至13のいずれか1項に記載のキャリアシステム。
- 前記キャリアは、バーコード又は2次元コードから選択される読み取り可能なコードなどの、読み取り可能な情報を含む、請求項1乃至14のいずれか1項に記載のキャリアシステム。
- 複数のキャリアを含み、前記キャリアの各々は、前記剥離層によって前記基材に固定されている、請求項1乃至15のいずれか1項に記載のキャリアシステム。
- 前記基材に固定された前記キャリアが使用のために除去可能である滅菌包装を含む、請求項1乃至16のいずれか1項に記載のキャリアシステム。
- アッセイのためのキャリアシステムを製造する方法であって、
基材を提供するステップと、
前記基材上に剥離層を形成するステップと、
前記剥離層上でアッセイ試料を受容するためのキャリアを、前記キャリアが前記基材に固定されているように、堆積させるステップと、
を含み、
前記剥離層は、使用時に、生体適合性水溶液の存在下で前記基材から前記キャリアを剥離するように構成されている、
方法。 - 前記基材上に前記剥離層を形成するステップは、前記剥離層をスピンコーティングすることを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記剥離層上に前記キャリアを堆積させるステップは、例えば、リソグラフィプロセスによって、前記剥離層上に前記キャリアを作製することを含む、請求項18又は19に記載の方法。
- 前記剥離層は、使用時に、1時間から72時間の間の時間内に、前記生体適合性水溶液の存在下で前記基材から前記キャリアを剥離するように適合されている、請求項18乃至20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キャリアが前記基材と接触している間に、前記アッセイ試料は、前記キャリアによって受容される、請求項18乃至21のいずれか1項に記載のキャリアシステム。
- 表面が前記アッセイ試料を受容するのに適しているように、前記キャリアの前記表面を適合させるステップをさらに含む、請求項18乃至22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記剥離層上に前記キャリアを堆積させるステップの後に、エタノールに前記キャリアシステムを浸漬することによって前記キャリアシステムを滅菌するステップをさらに含む、請求項18乃至23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キャリアが前記基材に固定されている状態で、前記キャリアシステムを滅菌包装内に包装するステップをさらに含む、請求項18乃至24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キャリアを堆積させるステップは、磁気構造を形成することを含む、請求項18乃至25のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1乃至17のいずれか1項に記載の前記キャリアシステムを使用してアッセイを実施する方法であって、前記キャリアを剥離するために生体適合性水溶液を前記キャリアシステムに導入するステップを含む、方法。
- 試料が前記キャリアによって受容されるように、アッセイのための前記試料を前記キャリアに導入するステップをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- 前記キャリアが前記基材と接触している間に、前記試料は、前記キャリアによって受容される、請求項28に記載の方法。
- 前記アッセイ試料は、前記生体適合性水溶液中に懸濁される、請求項27乃至29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キャリアは、磁性材料を含み、前記方法は、前記キャリアに磁場を印加することをさらに含み、前記磁場は、前記剥離層が前記基材から前記キャリアを剥離した後でも、前記基材と接触している前記キャリアを保持するように作用する、請求項27乃至30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記磁場は、印加され、少なくとも5秒間、又は少なくとも1分間、又は少なくとも5分間、又は少なくとも30分間、前記基材と接触している前記キャリアを保持する、請求項31に記載の方法。
- 請求項1乃至17のいずれか1項に記載の前記キャリアシステムを使用する方法であって、キャリアが前記基材と接触している間に、試料が前記キャリアによって受容されるように、アッセイのための前記試料を前記キャリアに導入するステップと、前記キャリア上で受容された前記試料を保存するステップとを含む、方法。
- 保存のために前記キャリア上で受容された前記試料を凍結するステップを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記キャリア上で受容された前記試料を保存する前に、前記基材から前記キャリアを剥離するステップをさらに含む、請求項33又は34に記載の方法。
- アッセイを実施するための方法であって、
生体適合性水溶液の存在下で基材からキャリアを剥離するように構成されている剥離層によって前記基材に固定された前記キャリアを提供するステップと、
前記基材に固定された前記キャリアを、アッセイ試料が懸濁される生体適合性水溶液と接触させるステップと、
前記キャリアが前記基材と接触している間に、前記キャリア上で前記アッセイ試料を受容するステップと、
前記生体適合性水溶液によって前記剥離層の活性化によって、前記基材から前記キャリアを剥離するステップと、
を含む、方法。 - 前記アッセイ試料は、細胞、好ましくは接着細胞を含む、請求項1乃至36のいずれか1項に記載のキャリアシステム又は方法。
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